Sunteți pe pagina 1din 506
Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919) În 1906 Tswett a publicat un articol, în revista de specialitate

Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

În 1906 Tswett a publicat un articol, în revista de specialitate

Berichte der deutschen botanischen

Gesellschaft în care descrie separarea unor pigmenţi vegetali pe un tub îngust de sticlă, umplut cu carbonat de calciu. Pigmenţii de diferite culori au fost astfel separaţi de pe carbonat prin eluţie cu eter de petrol.

Istoric

Plinius cel Bătrân (23-79 după Cristos) în

Historia Naturalis, descrie un proces egiptean (ca. 500 înainte de Cristos) de separare a unor pigmenţi prin depunerea soluţiei lor pe un material celulozic,

precum papirusul. Această tehnică poate fi

considerată a fi foarte aproape de cromatografia pe hârtie.

În 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hârtie şi include

ilustraţii ale cromatogramelor în lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.

Richard Kuhn şi Edgar Lederer (1931, separarea a două componente din carotenul cristalizat, privit până în acel moment drept un singur compus chimic, prin cromatografie de adsorbţie.

Martin şi Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiţie)

 

Consden, Gordon, şi Martin (descrierea cromatografiei pe hârtie).

1950

dezvoltarea

cromatografiei gaz-lichide

(GLC),

prin

care

se

separă

compuşi gazoşi sau volatili pe o coloană îngustă umplută cu un adsorbent.

Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se

separă compuşi prin trecerea unui solvent printr-un strat subţire de o grosime submilimetrică, întins pe un suport precum placa de sticlă a fost dezvoltată în anii 60.

Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (high performance liquid

chromatography, HPLC), tehnică care se separă compuşi prin introducerea probei într-o coloană îngustă încărcată cu adsorbent şi forţarea eluţiei sale prin presiune a fost dezvoltată în deceniul al şaptelea.

Cromatografia pe hârtie şi mai ales cea în strat subţire sunt încă utilizate, fiind

deseori preferate cromatografiei gaz-lichid şi cromatografiei lichide de înaltă performanţă din cauza marii lor puteri în separarea efectivă, cu echipamente ieftine şi costuri scăzute.

Principala aplicaţie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de compuşi în scopuri analitice sau preparative.

Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea,

purificarea şi cuantificarea unor compuşi individual separaţi.

În plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate în determinarea omogenităţii unor substanţe chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea produşilor de reacţie şi a proceselor care le însoţesc.

Cromatografia cuprinde un grup important şi diversificat de metode care permit cercetătorului separarea unor componenţi foarte apropiaţi (înrudiţi) dintr-un amestec complex de substanţe (de componente), multe dintre aceste separări nefiind posibile prin alte tehnici.

În toate separările cromatografice proba este transportată într-o fază mobilă, care poate fi un gaz, un lichid sau un fluid în stare supercritică. Aceasta fază mobilă este forţată să traverseze o fază nemiscibilă, fază staţionară, care se găseşte într-o coloană sau pe o suprafaţă solidă. Cele două faze sunt alese în aşa fel încât proba se distribuie între faza mobilă şi cea staţionară în proporţii diferite. Componentele care sunt mai puternic reţinute de către faza staţionară se vor mişca şi vor curge mai lent cu faza mobilă. Din contră, componentele uşor legate de către faza staţionară vor traversa această fază mai rapid. Drept consecinţă a acestor diferenţe în mobilitate, componentele probei se vor separa în benzi ori zone discrete, care pot fi analizate calitativ şi/sau cantitativ.

Termenul de migrare utilizat în cromatografie reprezintă o descriere generică a mişcării moleculelor în cromatografie şi el nu trebuie confundat cu migrarea unei specii ionice sub acţiunea unui câmp electric.

Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloană

• Metodele cromatografice pot fi clasificate ţinând cont de două criterii. Prima clasificare este bazată pe metoda fizică prin care fazele mobilă şi staţionară vin în contact. Astfel, în cromatografia pe coloană, faza staţionară este reţinută într-un tub îngust, prin care faza mobilă este forţată

să treacă.

În cromatografia planară, faza staţionară este depusă pe un suport, în interstiţiile unui material poros (de tipul hârtiei de filtru, ca exemplu). În acest caz, faza mobilă se mişcă prin

faza staţionară datorită forţei capilare, sub influenţa forţei

gravitaţionale.

Se poate remarca echilibrele care apar în cazul celor două tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,

teoriile dezvoltate în cazul uneia dintre cele două metode

putând fi formalizate asemănător şi uşor adaptate la cealaltă tehnică cromatografică.

O clasificare mult mai fundamentată a metodelor cromatografice se bazează pe

tipul fazelor mobile şi staţionare şi tipul de echilibru stabilit în transferul soluturilor

între cele două faze.

fazelor mobile şi staţionare şi tipul de echilibru stabilit în transferul soluturilor între cele două faze

ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUŢIE PE COLOANĂ

Prezentarea schematică a modului prin care două substanţe, notate A şi B sunt separate prin cromatografie de eluţie pe o coloană, cu fază mobilă lichidă. Eluţia implică

spălarea, trecerea speciilor

(substanţelor A şi B, în speţă) prin coloană, la adăugarea continuă de solvent (fază mobilă) proaspăt (a).

o porţiune unică de probă este introdusă la capătul superior al coloanei (timpul t o ), după care componentele probei se distribuie independent, între cele două

faze.

probei se distribuie independent, între cele două faze. (b) Semnalul înregistrat de către un detector în

(b) Semnalul înregistrat de către un detector în funcţie de evoluţia eluţiei prin coloana prezentată în (a).

Introducerea unui volum adiţional de fază mobilă (de eluent) forţează volumul de solvent care conţine o parte a probei coboare prin coloană, unde, se

stabileşte o nouă partiţie între faza mobilă şi cea

staţionară (timpul t 1 ). Simultan cu aceasta se stabileşte un nou echilibru și o nouă partiţie între solventul proaspăt (faza mobilă nou adăugată) şi faza staţionară la locul iniţial de adăugare a probei. Adăugarea unor noi volume de solvent va avea ca

efect coborârea moleculelor de solut spre capătul de

jos al coloanei printr-o serie continuă de transferuri între faza mobilă şi cea staţionară. Cum mişcarea solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului migrează în josul coloanei depinde de fracţia de timp

în care solutul este reţinut de către această fază.

Această fracţie este mică pentru componenta mai puternic reţinută de către faza staţionară (compusul B, din figură) şi este mare în cazul în care retenţia în faza mobilă este mai adecvată (componenta A). În mod ideal, diferenţele rezultate în vitezele diferite conduc la

separarea componentelor dintr-un amestec în benzi

sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t 3 din figură). Izolarea şi deci separarea speciilor A şi B este urmarea trecerii unei cantităţi suficiente de fază mobilă prin coloană şi care conduce la o separare individuală de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate

(timpii t 3 şi t 4 din figură).

individuală de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate (timpii t 3 şi t

DILUŢIA ANALITULUI

Figura ilustrează o caracteristică importantă a procesului de separare, denumită diluţia analitului fenomen care însoţeşte aproape întotdeauna separările

cromatografice. Astfel, mărimea zonei originale care conţine analiţii din figură este notabil mai mică decât cele două zone care conţin componentele A şi B şi care ajung în zona detectorului. Acest fenomen semnificativ de diluare se manifestă odată cu separarea componentelor şi din această cauză,

detectorii utilizaţi pentru separarea

analiţilor trebuie adesea prezinte o sensibilitate mai mare decât cea care ar fi dorită dacă procesul de separare

nu ar fi necesar.

să prezinte o sensibilitate mai mare decât cea care ar fi dorită dacă procesul de separare

CROMATOGRAMELE

• Dacă un detector care răspunde la o modificare de concentraţie a solutului este plasat la capătul terminal al coloanei iar semnalul său este reprezentat grafic în funcţie de timp (sau de volumul de fază

mobilă adăugat) se obţin o serie de peak-uri,

prezentate în figură (b). Asemenea reprezentări grafice poartă numele de cromatograme, care sunt utilizate atât în cromatografia analitică cât şi în cea preparativă. Poziţia peak-urilor pe axa timpului poate servi la identificarea componentelor din probă, aria fiecăruia conducând la determinarea cantitativă a

fiecărui component.

componentelor din probă, aria fiecăruia conducând la determinarea cantitativă a fiecărui component.

EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE ŞI A LĂŢIMII ZONEI ASUPRA REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE

A LĂŢIMII ZONEI ASUPRA REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE • Figura profilurile concentraţiilor soluţilor A şi B

Figura

profilurile concentraţiilor soluţilor A şi B la două etape diferite de eluţie: o etapă timpurie (momentul t 1 ) şi o etapă spre final (momentul t 2 ).

alăturată

prezintă

Se poate spune ca specia B este mai puternic reţinută şi din această cauză componentul B întârzie mai mult pe coloană pe parcursul migrării.

Această întârziere în coborâre conduce la creşterea distanţei dintre cele două zone. La acelaşi interval de timp, are loc aceeaşi lărgire a zonelor celor două componente, fenomen ce scade eficienţa coloanei cromatografice. Cum lărgirea zonei este inevitabilă, se pot alege condiţiile în aşa fel ca acest

fenomen se manifeste cât mai lent odată cu separarea benzilor. Astfel, o

separare completă şi de aici o rezoluţie bună, se realizează adesea în condiţiile în care lungimea coloanei este suficient de mare.

două metode de îmbunătăţire a separării în cazul unui amestec ipotetic de două componente (figură, panel a).

figura alăturată (b)

condiţiile au fost modificate astfel încât primul component se deplasează mai repede în

josul coloanei cu viteză mai

În

mare în timp ce al doilea se deplasează mai încet.

(c) : vitezele de împrăştiere a celor două

zone au fost micşorate. Ambele metode

conduc la o separare mai distinctă a celor două componente

Ambele metode conduc la o separare mai

distinctă a celor două componente

la o separare mai distinctă a celor două componente (a) cromatograma originală cu cele două peak-uri

(a) cromatograma originală cu cele două peak-uri suprapuse; îmbunătăţirea separării prin (b) creşterea separării benzilor

cromatografice şi (c) prin scăderea

împrăştierii benzii cromatografice.

Viteza de migrare a soluţÌlor

Eficienţa unei coloane cromatografice

în separarea a doi soluţi depinde, în parte, de vitezele relative cu care cei doi

compuşi sunt eluaţi. Aceste viteze sunt determinate de magnitudinea

constantelor de echilibru ale procesului

prin care soluţii se distribuie independent

între faza mobilă şi cea staţionară.

CONSTANTELE DE DISTRIBUŢIE

Adeseori, echilibrele de distribuţie implicate în cromatografie sunt descrise prin ecuaţii care implică transferul unui analit între fazele mobilă şi staţionară. Astfel,

pentru speciile A de solut se poate scrie următorul echilibru al procesului de

adsorbţie-desorbţie:

echilibru al procesului de adsorbţie - desorbţie : Constanta de echilibru , K, pentru această reacţie

Constanta de echilibru, K, pentru această reacţie este numită constantă de distribuţie, raport de partiţie sau coeficient de partiţie Comisia de Nomenclatură Analitică a IUPAC pentru cromatografie recomandă utilizarea termenului de constantă de distribuţie, K c în loc de vechiul termen în loc de vechiul termen de coeficient de partiţie sau raport de partiţie, K. Totuși, în literatura

de specialitate ambii termeni sunt încă utilizaţi. Constanta K este definită conform formulei:

. Constanta K este definită conform formulei: C S reprezintă concentraţia molară a solutului din

C S reprezintă concentraţia molară a solutului din faza staţionară iar C M este concentraţia molară din faza mobilă; în mod ideal, K este constantă în tot domeniul de concentraţii a solutului, iar C S este proporţională cu C M . Tipul de cromatografie în care se aplică ecuaţia poartă denumirea de

cromatografie lineară iar rezultanta ei este caracterizată printr-o simetrie de

tip Gauss a peak-urilor şi a timpilor de retenţie, parametrii care sunt independenţi de cantitatea de analit supusă analizei. În general, studiile teoretice se limitează la o astfel de cromatografie lineară.

Figura alăturată reprezintă generic o cromatogramă pentru o probă ce conţine un singur analit. Timpul necesar probei de a

parcurge distanţa dintre

momentul inoculării până la detecţia semnalului său de detector este numit timp de retenţie, fiind simbolizat prin t R . Peak-ul prezentat în partea din stânga cromatogramei este dat de speciile care nu sunt reţinute de către coloană. Adesea, proba sau faza mobilă

conţine specii ce nu sunt reţinute

pe parcursul migrării pe coloană. Astfel de specii care nu interacţionează cu faza staţionară sunt de real folos în

identificarea peak-ului analitului

de interes.

TIMPUL DE RETENŢIE

cu faza staţionară sunt de real folos în identificarea peak-ului analitului de interes. TIMPUL DE RETENŢIE

Peak-ul mic din stânga reprezintă o specie care nu este reţinută pe coloană şi a cărei semnal apare la detector aproape imediat după ce eluţia a fost începută. Astfel, timpul său de eluţie (t M ) este aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile să treacă prin coloană.

timpul necesar fazei mobile să treacă prin coloană . Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la

Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la

detector se notează cu t M şi se numeşte timp mort. Viteza de migrare a speciilor nereţinute este în acelaşi domeniu cu viteza de mişcare a moleculelor fazei

mobile.

• Viteza lineară medie de migrare a solutului (ν ) este dată de relaţia:

de migrare a solutului (ν ) este dată de relaţia: • unde împachetate. L este lungimea

unde

împachetate.

L

este

lungimea

coloanei

În mod similar, viteza medie lineară de

mişcare a unei molecule de fază mobilă (u) este dată de relaţia:

molecule de fază mobilă (u) este dată de relaţia : unde t M reprezintă timpul mort,

unde t M reprezintă timpul mort, timpul necesar pentru ca o moleculă medie de fază mobilă să treacă prin coloană.

De exemplu, dacă o coloană are un volum total de 100 ml iar faza

staţionară ocupă 40 ml, rezultă că faza mobilă ocupă un volum de 60 ml.

Dacă faza mobilă curge cu o viteză de 5 ml/min, se poate calcula sunt necesare 12 minute pentru ca faza mobilă să traverseze coloana, de la injector la detectorul situat la capătul terminal al coloanei.

Uneori, t M poate fi determinat prin identificarea unui mic peak la începutul cromatogramei, rezultat dintr-o uşoară diferenţă dată de solventul care provine din faza mobilă ce conţine proba adăugată.

De asemenea t M poate fi determinat prin măsurarea timpului de eluţie a unei probe care nu este reţinută absolut de loc de către faza staţionară. În cazul unei răşini schimbătoare de ioni cationice, pentru a se determina t M , se poate utiliza o proteină cu sarcină negativă.

că există şi alţi factori

precum lungimea şi diametrul tubului care conectează injectorul şi detectorul la coloană

care pot afecta valorile t M .

Se

notabil

de arătat

Practic, considerând o coloană împachetată de 25 cm lungime, cu un diametru interior de 1 cm, volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= r 2 L = 3,14 0,52 25cm). Dacă faza mobilă

ocupă 60% din volumul coloanei, volumul

spaţiului gol, care defineşte «timpul mort» este egal cu 11,8 ml. El reprezintă volumul spaţiului

gol, denumit void volume” = V 0

RELAŢIA DINTRE TIMPUL DE RETENŢIE ŞI CONSTANTA DE DISTRIBUŢIE

În scopul prezentării relaţiei dintre timpul de retenţie al solutului şi constanta sa de distribuţie, se poate exprima viteza de migrare drept o fracţie a vitezei fazei mobile:

de migrare drept o fracţie a vitezei fazei mobile: Această fracţie este egală cu numărul mediu

Această fracţie este egală cu numărul mediu de moli de solut din faza mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut din coloană, conform următoarei relaţii:

mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut din coloană, conform

Numărul total de moli de solut din faza mobilă este egal cu

concentraţia molară a solutului din faza mobilă, c M , multiplicată cu

volumul acestei faze,

În mod similar, numărul de moli de solut din faza staţionară este

dat de produsul concentraţiei c S de solut din faza staţionară, multiplicat cu volumul său din aceeaşi fază, V S . Astfel se poate scrie:

V M

.

din faza staţionară, multiplicat cu volumul său din aceeaşi fază, V S . Astfel se poate

Prin substituirea ecuaţiei constantei de distribuție în această ecuaţie se obţine viteza de migrare a solutului ca funcţie de constanta de distribuţie şi ca funcţie de volumele fazelor staţionare şi mobile:

ca funcţie de volumele fazelor staţionare şi mobile: Cele două volume pot fi estimate prin metode
ca funcţie de volumele fazelor staţionare şi mobile: Cele două volume pot fi estimate prin metode

Cele două volume pot fi estimate prin metode specifice fiecărui tip de cromatografie.

VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENŢIE

Factorul de retenţie, sau factorul de capacitate reprezintă un parametru important care este general utilizat în descrierea vitezelor de migrare a soluturilor pe coloană. Pentru un solut A, factorul de retenţie k’ A este definit ca:

solut A, factorul de retenţie k’ A este definit ca: unde K A reprezintă constanta de

unde K A reprezintă constanta de distribuţie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatură Analitică recomandă denumirea de factor de retenţie k', însă denumirea de factor de capacitate este încă utilizat în literatura de specialitate.

Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă:

este încă utilizat în literatura de specialitate. Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă :

În scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina cromatogramă, se vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6,

= t L R
=
t
L R

(2

L

t

M

u=

vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6, = t L R (2 L t

k’ A

(3

dintr-o

vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6, = t L R (2 L t

ceea ce conduce la:

vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6, = t L R (2 L t

rearanjarea acestei ecuaţii

rearanjarea acestei ecuaţii t M După cum se observă în figură, t R şi sunt uşor

t M

După cum se observă în figură, t R şi

sunt uşor de obţinut dintr-o

cromatogramă. În condiţiile unui factor de retenţie pentru un solut mult mai mic decât unitatea, eluţia se realizează mai rapid şi din această este dificil a se

mai rapid şi din această este dificil a se determina timpii de retenţie cu acurateţe .

determina timpii de retenţie cu acurateţe.

În condiţiile în care factorul de retenţie este de ordinul zecilor (de exemplu 20 sau 30), timpii de eluţie devin anormal de mari. Ideal, separarea se efectuează în

condiţiile unor factori de retenţie cuprinşi

între 2 şi 10.

VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate al unei coloane () pentru două specii, A şi B este definit prin formula:

(9)
(9)

unde K B reprezintă constanta de distribuţie a speciei B, mai puternic reţinută pe coloană, în timp ce K A reprezintă constanta de distribuţie a speciei A, mai puţin reţinută pe coloană, şi mai rapid eluată de pe aceasta. Prin definiţie, este întotdeauna mai mare decât unitatea.

(10)
(10)

unde k' B şi k' A reprezintă factorii de retenţie ai solutului B, respectiv A.

Prin substituirea ecuaţiei 5 şi a

ecuaţiei analoage pentru solutul B în ecuaţia 9 se obţine, după la rearanjare,

relaţia de legătură între factorul

de selectivitate pentru cei doi soluţi şi factorii lor de retenţie:

Substituţia în ecuaţia 8 pentru cei doi soluţi din ecuaţia 10 conduce la o expresie ce permite determinarea experimentală lui dintr-o cromatogramă:

experimentală lui  dintr-o cromatogramă : factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la
experimentală lui  dintr-o cromatogramă : factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la
experimentală lui  dintr-o cromatogramă : factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la

factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice

Împrăştierea zonei şi eficienţa

coloanei

Teoria dinamică, sau teoria cinetică a cromatografiei

explică cu succes în termeni cantitativi formele peak- urilor cromatografice şi efectele diverselor variabile implicate în lăţirea acestor peak-uri. O discuţie detailată a acestei teorii se bazează pe mecanismul de repartiţie aleatorie, putându-se da o imagine calitativă a zonelor cromatografice şi care conduce la analiza

modului de împrăştiere a zonelor în condiţiile deplasării

moleculelor de solut de-a lungul unei coloane. Înţelegerea acestor fenomene au ca rezultat identificarea variabilelor ce conduc la creşterea eficienţei coloanei şi la reducerea împrăştierii zonelor cromatografice.

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE Figura 1 Figura 4 Figura 2

Figura 1

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE Figura 1 Figura 4 Figura 2

Figura 4

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE Figura 1 Figura 4 Figura 2

Figura 2

Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogramă sau a benzilor pe

coloană (figurile de mai jos) relevă o similaritate a erorilor normale, repartiţia realizându-se după un profil Gaussian, care sunt obţinute în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de

frecvenţa repartiţiei a acestora.

în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de frecvenţa repartiţiei a acestora.
în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de frecvenţa repartiţiei a acestora.
în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de frecvenţa repartiţiei a acestora.

În unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestând o coadă (trenă) sau un front. În primul caz, trena peak-ului care apare în dreapta cromatogramei este prelungă, în timp ce frontul acestuia este abrupt. În cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversată, adică

frontul este prelung în timp ce trena este extrem de scurtă. Cauza comună a

apariţiei frontului sau a trenei o reprezintă existenţa unei constante de distribuţie neliniare. Frontul apare de asemenea în cazul eluării unei cantităţi mari de probă pe coloană. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite deoarece conduc la separări de proastă calitate şi la timpi de eluţie cu

reproductibilitate scăzută. În abordarea teoretică se consideră ca fenomenul de front sau coadă cromatografică este absent sau minim.

. În abordarea teoretică se consideră ca fenomenul de front sau coadă cromatografică este absent sau

• După cum se cunoaşte, curbele de erori normale pot fi raţionalizate prin asumarea faptului incertitudinea asociată cu orice măsurătoare singulară reprezintă

însumarea unui număr mult mai mare de erori mici, individuale nedetectabile şi de repartiţii întâmplătoare, fiecare dintre acesta având o probabilitate egală, pozitivă

sau negativă. Cea mai comună manifestare a acestor

incertitudini este reprezentată de anularea uneia de către cealaltă, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mică

probabilitate, însumarea poate conduce la un rezultat mai

mare sau mai mic decât media. Drept consecinţă, distribuţia valorilor este simetrică, în jurul valorii medii. În mod similar, forma Gaussiană a unei zone

cromatografice ideale poate fi atribuită combinării aditive a mişcărilor întâmplătoare a moleculelor de solut în zona cromatografică.

Să considerăm comportamentul unei molecule de solut, care în timpul

migrării, trece prin mii de transferuri între faza staţionară şi cea mobilă. Timpul

petrecut în fiecare fază de transfer este deosebit de neuniform, depinzând de câştigul accidental de energie termică din mediul înconjurător pentru a realiza un transfer reversibil, în cealaltă fază. Astfel, în unele cazuri, timpul de şedere într-o fază dată, poate fi tranzitoriu, în timp ce în alte faze perioada poate fi relativ mai lungă. Cum molecula este eluată numai în timpul şederii sale în faza mobilă, are ca rezultat, migrarea sa total neuniformă în josul coloanei. Din cauza timpilor variabili de şedere, viteza medie cu care moleculele individuale

se mişcă relativ în faza mobilă variază în mod considerabil. Anumite particule

individuale traversează mai rapid în virtutea includerii lor accidentale în faza mobilă, majoritatea timpului de eluţie. Altele, din contră, pot prezenta întârzieri datorită includerii lor în faza staţionară, timp mai îndelungat decât timpul mediu de eluţie. Consecinţa acestor procese aleatoare este o împrăştiere simetrică a

vitezelor în jurul valorii medii, iar acesta reprezintă comportamentul mediu al moleculei. Lăţimea benzii componentului separat creşte odată cu coborârea lui de- a lungul coloanei, datorită faptului o creştere a timpului de eluţie permite

manifestarea unei mai mari împrăştieri. Astfel, lăţimea zonei este în relaţie

directă cu timpul de şedere în coloană şi în relaţie inversă cu viteza de curgere a fazei mobile.

METODE DE DESCRIERE A EFICIENŢEI COLOANEI

În măsurarea cantitativă a eficienţei unei coloane cromatografice în general sunt utilizaţi doi termeni înrudiţi:

(1) înălţimea talerului teoretic, H şi (2) numărul de talere

teoretice,

N.

Cei

doi

parametrii

sunt

asociaţi

prin ecuaţia:

N = L/H (1.12)

L, lungimea coloanei împachetate

(dată de obicei în centimetrii)

Eficienţa coloanelor cromatografice creşte cu numărul de talere teoretice: cu cât

numărul de talere teoretice este mai mare

şi înălţimea talerului teoretic devine mai mică. Sunt întâlnite diferenţe enorme în eficienţa unei coloane, datorită diferenţelor dintre tipul de coloană şi fazele mobilă,

respectiv staţionară, utilizate. În mod curent, eficienţa unei coloane în termen de număr de talere teoretice, poate varia între câteva sute până la mii, iar domeniul

înălţimii talerelor variind între zecimi până

la miimi de centimetrii sau mai mici.

• Introducerea termenilor de înălţime a talerului şi a numărului de

talere este datorată studiilor teoretice ale lui Martin şi Synge care au tratat coloana cromatografică similar coloanei de distilare, unde au loc o multitudine de procese discrete dar continue, în straturi

înguste, denumite talere teoretice. S-a considerat că la nivelul

fiecărui taler, are loc un echilibru între faza mobilă şi cea staţionară. Mişcarea solutului în josul coloanei a fost apoi tratată ca o treaptă de transfer între faza mobilă în echilibru şi următorul taler situat mai

jos.

Teoria talerului teoretic a fost aplicată cu succes la forma Gaussiană a peak-urilor cromatografice şi la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice. Ea a fost în final abandonată totuşi, deoarece nu a reuşit sa răspundă la explicarea

modului de împrăştiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizaţi la

descrierea eficienţei unei coloane au fost păstraţi în teoria vitezei de migrare. Această nomenclatură este uneori neadecvată din cauza tendinţei de a perpetua mitul

prezenţei unor talere în coloana cromatografică, la nivelul cărora se realizează echilibrul între faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizează niciodată

deoarece faza mobilă este într-o permanentă şi constantă mişcare.

DEFINIŢIA ÎNALŢIMII

TALERULUI

După cum se cunoaşte, lăţimea curbei Gaussiene este într-o

relaţie directă cu varianţa 2 , sau cu deviaţia standard , a unei măsurători. Cum benzile cromatografice sunt în general considerate a avea astfel de formă, este convenabil definim eficienţa unei coloane în termen de varianţă pe unitate de lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H, este dată de relaţia:

de varianţă pe unitate de lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H , este dată de

DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI

DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI Definiţia talerului teoretic. H =  2/ L

EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N

EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N Determinarea deviaţiei standard  din peak-ul cromatografic:
EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N Determinarea deviaţiei standard  din peak-ul cromatografic:

Determinarea deviaţiei standard din peak-ul cromatografic: W = 4.

Această definiţie a înălţimii talerului este ilustrată în figura de mai jos. După

cum se observă, coloana este împachetată pe o distanţă de L centimetrii, în lungime (panelul a).

o distanţă de L centimetrii, în lungime (panelul a). Reprezentarea grafică a definiţiei talerului teoretic. H

Reprezentarea

grafică a definiţiei

talerului teoretic. H = 2 / L

În partea superioară a figurii (panelul b) este reprezentată schematic,

distribuţia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice împachetate, în

momentul în care analitul părăseşte coloana (acesta este din punct de vedere al timpului, timpul de retenţie, t R ). Modelul curbei este Gaussian, iar localizările parametrilor L-lşi L + lsunt indicate prin linie punctată verticală.

De notat faptul L este dat

în centimetrii, iar varianţa, 2 , este explicitată în centimetrii pătraţi; H

reprezintă o distanţă lineară, exprimată în centimetrii (ecuaţia din slide-ul anterior).

Înălţimea

talerului

gândită ca o porţiune de coloană, situată la capătul terminal care conţine fracţia de

analit situată între L-lşi L. Cum aria, în domeniul normal de eroare a curbei este limitată de ±, fiind de aproximativ

68% din aria totală, înălţimea

talerului prin definiţie conţine aproximativ 34% din analit.

fi

poate

Evaluarea experimentală a lui H şi N

Evaluarea experimentală a lui H şi N Figura al ăturată reprezintă o cromatogramă obișnuită în funcţie

Figura alăturată reprezintă o cromatogramă obișnuită în funcţie de timp. Varianţa peak-ului de solut poate fi obţinută printr-un procedeu grafic simplu, şi are ca unitate de măsură secunde la pătrat, fiind în mod uzual notată cu 2 , pentru a o distinge de 2 , care are ca unitate de măsură centimetrii pătraţi. Cele două deviaţii standard, şi sunt legate prin relaţia:

standard,  şi  sunt legate prin relaţia : unde L / t R reprezintă viteza

unde L/t R reprezintă viteza lineară medie a solutului, exprimată în centimetrii pe

secundă

medie a solutului, exprimată în centimetrii pe secundă Determinarea deviaţiei standard,  , din peak-ul

Determinarea deviaţiei standard, , din peak-ul cromatografic: W = 4.

N = L/H

(1.12)

Figura ilustrează modul simplu de aproximare al lui  şi  dintr-o cromatogramă obţinută experimental.

Figura ilustrează modul simplu de

aproximare al lui şi dintr-o

cromatogramă obţinută experimental. Tangentele punctelor de inflexiune de pe cele două părţi ale peak-ului cromatografic sunt prelungite până la intersectarea lor şi se formează astfel un

triunghi cu baza pe axa timpului a cromatogramei. Aria acestui triunghi reprezintă aproximativ 96% din aria totală a peak-ului.

În evaluarea statistică, se consideră că aproximativ 96% din aria peak-ului Gaussian este inclusă în interiorul suprafeţei cu o aproximaţie de plus sau minus două deviaţii

standard (±2) din valoarea sa maximă. Astfel, intercepţiile

arătate în figură se manifestă la aproximativ ±2din maximum, iar W = 4, unde W este mărimea bazei triunghiului. Substituind această relaţie în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă:

în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă : Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie standard ( 
în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă : Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie standard ( 
în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă : Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie standard ( 
în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă : Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie standard ( 

Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie

standard () în ecuaţia înălţimii talerului (ecuaţia 1.13 ) conduce la:

formula de calcul al numărului

de talere teoretice, N:

Prin substituţia formulei 1.16 în formula 1.12 urmată de rearanjarea termenilor, se obţine formula de calcul al numărului de talere teoretice, N:

de calcul al numărului de talere teoretice , N : N = L/H (1.12) În continuare,
de calcul al numărului de talere teoretice , N : N = L/H (1.12) În continuare,

N = L/H (1.12)

al numărului de talere teoretice , N : N = L/H (1.12) În continuare, N poate

În

continuare,

N

poate fi calculat din măsurarea, la două momente de timp, t R şi W;

iar pentru a obţine H,

lungimea

coloanei

împachetate trebuie fie de asemenea cunoscută.

t R şi W ; iar pentru a obţine H, lungimea coloanei împachetate trebuie să fie

O altă metodă de aproximare a lui N, şi care este considerată de către unii practicieni mai sigură, necesită determinarea a W 1/2 (jumătate din lăţimea bazei peak-ului), Iar numărul de talere este dat de formula:

peak-ului), Iar numărul de talere este dat de formula: Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt

Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt general utilizate în literatură şi în caracterizarea unor coloane produse de către firmele de specialitate, ca măsură a performanţei acestora. Din cauza faptului că aceşti parametrii sunt semnificativi în compararea a două coloane, este esenţial ca ei fie determinaţi pentru acelaşi compus.

VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZĂ ÎMPRĂŞTIEREA ZONEI CROMATOGRAFICE

împrăştierea zonei cromatografice este consecinţa unei rate finite de procese de transfer de masă care se produc în timpul migrării solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor variabile experimentale, care permit astfel creşterea calităţii separării.

Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.

calităţii separării. Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.

EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI

MOBILE

Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienţei coloanei

depinde în mod clar de lungimea timpului în care faza mobilă este în contact cu faza staţionară, care, la rândul ei, este depinde de viteza de curgere a fazei mobile. Din această cauză, studiile referitoare la eficienţa unor coloane sunt în general axate pe determinarea lui H ca funcţie de viteza fazei mobile, u. Aceste date sunt exemplificate de cele două curbe din figura următoare, una caracterizând cromatografia de lichide, în timp ce a doua este reprezentativă cromatografiei de gaze. Ambele curbe prezintă un minim al înălţimii talerului teoretic, H (ceea ce semnifică o eficienţă maximă) la viteze mici de curgere. Această valoare minimă din cromatografia lichidă se manifestă în general la viteze de curgere care sunt asemănătoare celei de

cromatografie de gaze şi deseori sunt atât de mici încât nu sunt sesizabile în condiţiile normale de operare.

Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra înălţimii talerului teoretic în cazul (a) cromatografiei

Efectul

vitezei

de

curgere

a

fazei

mobile

asupra

înălţimii

talerului teoretic în cazul (a) cromatografiei de lichide şi (b) gaz cromatografiei.

Teoria vitezei de împrăştiere a zonei cromatografice descrie cu acurateţe şi predicţionează forma diagramei H în funcţie de u, grafic denumit adesea diagrama van

Deemter după numele descoperitorului ei. După cum se

observă în figura alăturată, vitezele de curgere pentru

cromatografia lichidă sunt semnificativ mai mici decât cele utilizate în cazul celei gazoase. Din această cauză, separările în gaz cromatografie

sunt mai rapide decât cele de cromatografie lichidă. Mai

mult, după cum arată figura, înălţimea talerului teoretic a

unei coloane de cromatografie lichidă are un alt ordin de magnitudine fiind mult mai mică faţă de cel întâlnit în cazul coloanelor utilizate în cromatografia de gaze. Din această cauză, nu este practic a se utiliza coloane de cromatografie lichidă care sunt mai lungi de 25-50 cm (datorată presiunii picăturilor), în timp ce coloanele de gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi. În consecinţă, numărul total de talere şi astfel eficienţa totală a coloanei sunt în general superioare în cazul coloanelor de gaz cromatografie. În acest fel, o primă comparaţie între gaz cromatografie şi cea lichidă arată că prima metodă este capabilă de separări mai rapide şi de mai mare eficienţă.

şi cea lichidă arată că prima metodă este capabilă de separări mai rapide şi de mai

RELAŢIA DINTRE ÎNĂLŢIMEA TALERULUI ŞI VARIABILELE COLOANEI

În cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumărate studii

teoretice şi experimentale având ca scop dezvoltarea relaţiilor cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate în tabel, asupra înălţimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel

elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaţia dintre

înălţimea talerului şi parametrii variabili ai coloanei care, aplicate practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele nu a rezolvat în totalitate şi nu au putut explice interacţiile fizice

complexe care conduc la lăţirea zonei cromatografice. O serie dintre

aceste teorii, cu toată imperfecţiunile lor au fost des utilizate şi au condus la creşterea performanţei coloanelor cromatografice.

O astfel aproximare matematică a comportamentului coloanelor

cromatografice este ecuaţia van Deemter, care poate fi scrisă în

forma:

H = A + B/u + Cu

= A + B/u + (C S + C M )u

(1. 19)

unde H este înălţimea talerului dată în centimetrii, u este viteza lineară a fazei mobile dată în centimetrii pe secundă, în timp ce A, B, şi C sunt coeficienţi referitori la fenomenele de curgere pe multiple căi, difuzie longitudinală şi transfer de masă între faze. După cum se observă în ecuaţia 1.19, coeficientul C poate fi desfăcut în doi coeficienţi: unul (C S ), în relaţie cu faza staţionară, iar celălalt, (C M ), relativ la faza mobilă.

• Studii teoretice ulterioare au arătat că ecuaţia van Deemter este destul de exactă în explicarea eficienţei coloanei cromatografice. Ecuaţia van Deemter conţine termeni direct şi invers proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de viteza fazei mobile.

Deemter conţine termeni direct şi invers proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de viteza fazei mobile.

TERMENUL (A)

Împrăştierea zonei se manifestă în parte datorită multitudinii de căi de curgere pe care moleculele (sau ionii) le pot găsi şi urma prin coloana împachetată. După cum se observă în figura alăturată, lungimea acestor

căi pot diferi semnificativ, astfel,

timpul de rezidenţă în coloană pentru moleculele aceleaşi specii este de asemenea variabil. Moleculele de solut pot astfel atinge capătul colanei

într-un interval de timp care conduce la împrăştierea zonei. Acest efect, denumit în acelaşi timp difuzie în vârtej este direct proporţional cu

diametrul particulelor cu care se

împachetează coloana cromatografică şi este prezentat în coloana a treia din tabelul de mai

sus.

este prezentat în coloana a treia din tabelul de mai sus. Modalitatea de eluţie a două

Modalitatea de eluţie a două molecule printr-o coloană cromatografică. Se poate nota că distanţa parcursă de molecula 2 este mai mare decât cea parcursă de către molecula 1. Astfel, molecula 2 va ajunge la punctul B mai târziu decât molecula 1.

Împrăştierea prin curgere pe canale multiple poate fi parţial compensată de difuziunea ordinară, care rezultă în condiţiile în care moleculele sunt transferate printr-un curent ce urmează o cale sau alta. Dacă viteza de curgere este foarte mică, un număr mare de asemenea transferuri se realizează iar fiecare moleculă în mişcarea sa în josul coloanei urmează o altă cale de curgere, pierzând timpi

diferiţi pe fiecare direcţie de curgere.

Drept consecinţă, viteza cu care fiecare dintre molecule se mişcă în josul coloanei tinde sa se apropie de medie. Se poate spune că, la viteze mici ale fazei mobile moleculele nu sunt semnificativ dispersate prin natura căilor multiple a

împachetării.

La viteze moderate sau mari, totuşi, nu este timp suficient necesar pentru ca difuzia medie sa realizeze iar împrăştierea zonei se manifestă datorită lungimilor diferite ale căilor de curgere.

TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINALĂ (B/u)

Difuzia longitudinală în cromatografia pe coloană este un proces de împrăştiere a benzii în care soluţii difuzează dintr-un centru de concentrare spre

zone mai diluate, în faţa şi în spatele zonei cromatografice, unde se manifestă în

sensul şi în contra direcţiei de curgere a fazei mobile. După cum se observă în a doua ecuaţie din tabelul 1.3, termenul de difuzie longitudinală este direct proporţional cu coeficientul fazei mobile D M , constantă egală cu viteza de migrare sub un gradient egal cu o unitate. Constanta este denumită factor obstructiv fiind în relaţie cu împiedicarea difuziei longitudinale de către modul de împachetare al

coloanei. Astfel, în cazul coloanelor împachetate valoarea aceste constante este de

aproximativ 0,6 în timp ce pentru coloane neîmpachetate valoarea sa este egală cu unitatea. Contribuţia difuziei longitudinale este invers proporţională cu viteza fazei mobile. Această relaţie nu este surprinzătoare dacă avem în vedere analitul este în coloană pentru o perioadă mai mică la viteze de curgere înalte. În cazul unor

viteze mari de curgere, difuzia de la centru bandei spre margini se manifestă mai

redus cu cât timpul de staţionare este mai mic. Pantele negative la viteze de curgere scăzute prezentate în cele două grafice din figura alăturată şi sunt consecinţe ale difuziei longitudinale. Se poate nota efectul este mai puţin pronunţat în cromatografia de lichide din cauza faptului că aceşti coeficienţi de difuzie în lichide au ordine de magnitudine mai mici decât cei găsiţi în cazul gazelor. De fapt, pentru

cele mai multe lichide, factorul B/u se apropie de zero în relaţie cu ceilalţi termeni din ecuaţia 1.19. Astfel, minimul arătat în figura alăturată nu este uneori observat.

cu ceilalţi termeni din ecuaţia 1.19 . Astfel, minimul arătat în figura alăturată nu este uneori
cu ceilalţi termeni din ecuaţia 1.19 . Astfel, minimul arătat în figura alăturată nu este uneori

COEFICIENŢII DE TRANSFER DE MASĂ (C S şi C M ).

COEFICIENŢII DE TRANSFER DE MASĂ ( C S şi C M ). Necesitatea celor doi coeficienţi

Necesitatea celor doi coeficienţi de transfer de masă C S şi C M din ecuaţia 1.19 apare datorită faptului echilibrul dintre fazele mobilă şi staţionară se stabileşte deosebit de lent

în coloana cromatografică deoarece ea operează întotdeauna în condiţii de neechilibru. În consecinţă, moleculele de analit aflate în partea frontală a benzii cromatografice sunt preluate în faţă, înainte de a avea timp pentru a se echilibra în faza staţionară şi astfel fie reţinute de această fază. În mod similar echilibrul nu se stabileşte la marginea situată la trena benzii iar moleculele de analit sunt părăsite îndărătul fazei staţionare, datorită mişcării

rapide a fazei mobile.

Împrăştierea benzii din cauza efectelor de transfer de masa se manifestă din cauza faptului o multitudine de curenţi de curgere ai fazei mobile din coloană şi stratul care înconjoară faza staţionară au dimensiuni finite. În consecinţă, este necesar un timp pentru ca moleculele de solut aflate la interfaţă să difuzeze dintr-o fază în interiorul celelalte faze. Acest timp de lag” rezultă din persistenţa condiţiilor de neechilibru de-a lungul coloanei

cromatografice. De altfel, dacă vitezele de transfer de masă dintre cele două faze ar fi

infinite, fenomenul de împrăştiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta. Se poate nota extensia benzii cromatografice produsă atât de împrăştierea longitudinală cât şi de transferul de masă depinde de viteza de difuzie a moleculelor de analitul în timp ce direcţia difuziei în cele două cazuri este diferită. Împrăştierea longitudinală apare din tendinţa moleculelor de a se îndrepta într-o direcţie paralelă curgerii, în timp ce

împrăştierea datorată transferului de masă se manifestă din tendinţa moleculelor de a difuza

într-un plan perpendicular cu direcţia de curgere. Drept consecinţă, gradul de împrăştiere longitudinală este în relaţie inversă cu viteza de curgere. Pentru împrăştierea datorată transferului de masă, din contră, cu cât faza mobilă se mişcă mai repede, cu atât timpul necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel, după cum arată ultimii doi termeni ai ecuaţiei 1.19, efectul transferului de masă asupra înălţimii talerului este direct proporţional

cu viteza lineară, u, de mişcare a fazei mobile.

TERMENUL DE TRANSFER DE MASĂ ÎN FAZA STAŢIONARĂ (C S U).

TRANSFER DE MASĂ ÎN FAZA STAŢIONARĂ ( C S U ). Ecuaţia a treia din tabelul

Ecuaţia a treia din tabelul 1.3, arată că în condiţiile în care faza staţionară este un lichid imobilizat, coeficientul de transfer de masă este proporţional cu o funcţie complexă, fs(k') a factorului de retenţie k', este direct proporţională cu pătratul grosimii filmului de pe particulele suport df şi este invers proporţională cu coeficientul de difuzie, D S a solutului în film. Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin care aceşti factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la interfaţă sunt transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea filmelor, moleculele trebuie traverseze în medie o distanţă mai mare sau mai mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de masă şi o creştere a înălţimii talerului.

Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin care aceşti factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la

interfaţă sunt transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea

filmelor, moleculele trebuie traverseze în medie o distanţă mai mare sau mai mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de masă şi o creştere a înălţimii talerului.

Termenul de transfer de masă în faza mobilă (C M u).

După cum arată ecuaţia a patra din tabelul 1.3,

coeficientul de transfer din faza mobilă C M este o funcţie complexă, f(k') a factorilor de retenţie k', fiind proporţional cu pătratul diametrului particulelor din coloana împachetată dp şi invers proporţional cu

coeficientul de difuzie din faza mobilă, D M .

EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAŢIEI VAN DEEMTER

În figura alăturată este înfăţişat modul de reprezentare a ecuaţiei van Deemter în cazul unui

set de date experimentale. În acest experiment,

analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de benzil aflat într-o soluţie de hexan, care conţine acetat de etil. Punctele situate pe curba de deasupra reprezintă valorile experimentale în timp

ce curba cu linie continuă este reprezentarea

grafică a ecuaţiei van Deemter.

este reprezentarea grafică a ecuaţiei van Deemter. Diagrama van Deemter pentru o coloană de cromatografie

Diagrama van Deemter pentru o coloană de cromatografie lichidă, împachetată. Punctele de

pe curba superioară sunt date experimentale.

Contribuţiile diverşilor termeni de viteze sunt arătaţi pe curbele situate mai jos: A, efectul datorat căilor multicanal de curgere; B/u, difuzia longitudinală; Cu, transferul de masă

dintre cele două faze.

Curbele de sub această reprezentare arată contribuţia

efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinală şi

efectele combinate ale transferului de masă.

METODE DE REDUCERE A ÎMPRĂŞTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana şi diametrul coloanei reprezintă două variabile importante controlabile care afectează eficienţa unei coloane cromatografice. Efectul diametrului particulelor este demonstrat prin datele experimentale prezentate în figura alăturată în timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat diametrului coloanei, în ultimii ani au fost introduse în practica cromatografică coloane din ce în ce mai înguste. În condiţiile în care faza mobilă este gazoasă, viteza de difuziune laterală poate fi redusă apreciabil prin scăderea temperaturii şi astfel a coeficientului de difuzie D M . În consecinţă, scăderea înălţimii talerului este dependentă de temperaturi joase. Acest efect este în general

nesemnificativ în cazul cromatografiei lichide din

cauza faptului difuzia este lentă, astfel termenul de difuzie longitudinală are un efect mic asupra înălţimii talerului.

are un efect mic asupra înălţimii talerului. La fazele staţionare lichide, grosimea stratului de

La fazele staţionare lichide, grosimea stratului de lichid adsorbit poate fi minimalizată deoarece C S din ecuaţia 1.19 este proporţional cu pătratul acestei variabile, d f (ecuaţia a treia din tabelul 1.3).

OPTIMIZAREA PERFORMANŢELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloană cromatografică este optimizată prin variaţia experimentală a

condiţiilor, până când componentele amestecului sunt separate în mod clar,

într-un timp minim. Optimizarea experimentelor are ca scop (1) reducerea împrăştierii zonei cromatografice ori (2) alterarea vitezelor de migrare ale componentelor din amestecul de separat. După cum s-a arătat, împrăştierea zonei este crescută prin aceleaşi variabile cinetice care conduc la creşterea

înălţimii talerelor coloanei cromatografice. Pe de altă parte, vitezele de migrare, pot fi modificate prin schimbarea acelor variabile care afectează factorii de retenţie şi selectivitate ai soluţilor.

1. REZOLUŢIA COLOANEI

Rezoluţia, R S a unei coloane cromatografice conduce la măsurarea cantitativă a abilităţii sale în separarea a doi analiţi.

Semnificaţia acestui termen este

ilustrat în figura alăturată, care prezintă cromatogramele a două specii moleculare, A şi B, pe trei

coloane ce posedă rezoluţii

diferite. Rezoluţia unei coloane este definită ca:

moleculare, A şi B, pe trei coloane ce posedă rezoluţii diferite. Rezoluţia unei coloane este definită
moleculare, A şi B, pe trei coloane ce posedă rezoluţii diferite. Rezoluţia unei coloane este definită

o rezoluţie de 1,5 conduce la o separare practic completă a celor două componente, în timp ce o rezoluţie de 0,75 nu. La o

rezoluţie de 1, zona A conţine

aproximativ 4% din specia B, iar zona B conţine o cantitate similară din solutul A. La o rezoluţie de 1,5, suprapunerea este de aproximativ 0,3%.

fază

staţionară dată poate fi crescută

prin lungirea coloanei, astfel crescând numărul de talere. Consecinţa nefavorabilă la adăugarea de talere o reprezintă creşterea timpului

separării

cromatografice.

necesar

Rezoluţia

pentru

o

la adăugarea de talere o reprezintă creşterea timpului separării cromatografice . necesar Rezoluţia pentru o

Efectul factorilor de retenţie şi selectivitate asupra rezoluţiei cromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaţie matematică între rezoluţia unei coloane şi factorii de retenţie, k’ A şi k’ B , a factorului de selectivitate , şi numărul de talere, N, care alcătuiesc o coloană cromatografică în cazul a doi soluţi. Considerând cei doi soluţi, A şi B au timpi de retenţie apropiaţi unul de celălalt, se poate aproxima : W A = W B W

ecuaţia scrisă sub forma: 1.20 poate fi
ecuaţia
scrisă sub forma:
1.20
poate
fi

Ecuaţia 1.17 permite exprimarea lui W în termeni de (t R ) B şi N, care pot astfel substituiţi în ecuaţia anterioară, rezultând:

lui W în termeni de ( t R ) B şi N , care pot astfel
lui W în termeni de ( t R ) B şi N , care pot astfel

Substituind ecuaţia 1.8 şi rearanjând-o, se obţine exprimarea lui R S în termeni de factori de retenţie pentru A şi B, după cum urmează:

de retenţie pentru A şi B, după cum urmează : În continuare prin eliminarea k’ A
de retenţie pentru A şi B, după cum urmează : În continuare prin eliminarea k’ A

În

continuare

prin

eliminarea

k’ A

din

această

: În continuare prin eliminarea k’ A din această prin ecuaţie substituţia ecuaţiei 1.10 , rezultă
: În continuare prin eliminarea k’ A din această prin ecuaţie substituţia ecuaţiei 1.10 , rezultă

prin

ecuaţie

substituţia ecuaţiei 1.10, rezultă:

prin ecuaţie substituţia ecuaţiei 1.10 , rezultă : Adesea este necesar a se calcula numărul de
prin ecuaţie substituţia ecuaţiei 1.10 , rezultă : Adesea este necesar a se calcula numărul de

Adesea este necesar a se calcula numărul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluţie dorită. O exprimare a acestei cantităţi este obţinută prin

rearanjarea ecuaţiei 1.21 ceea ce conduce la:

dorită. O exprimare a acestei cantităţi este obţinută prin rearanjarea ecuaţiei 1.21 ceea ce conduce la:

Formele simplificate ale ecuaţiilor 1.21 şi 1.22 sunt uneori întâlnite în condiţiile în care acestea se aplică unor perechi de soluţi ale căror constante de distribuţie sunt aproape similare

ale căror constante de distribuţie sunt aproape similare unde k' reprezintă media dintre k ‟ A
ale căror constante de distribuţie sunt aproape similare unde k' reprezintă media dintre k ‟ A

unde k' reprezintă media dintre kA şi k‟ B .

Efectul rezoluţiei asupra timpului de retenţie

Înainte de a considera în detaliu semnificaţia ecuaţiilor derivate mai sus, este util se dezvolte o ecuaţie care prezinte caracteristicile de performanţă a unei coloane,

adică timpul necesar pentru o completă separare a solutului A de solutul B.

În mod clar, ceea ce este dorit în cromatografie este o rezoluţie posibilă înaltă în
În mod clar, ceea ce este dorit în cromatografie este o rezoluţie posibilă înaltă în cel
mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste două proprietăţi nu pot fi maximalizate în
aceleaşi condiţii, motiv pentru care totdeauna trebuie găsit un compromis.
Timpul pentru desăvârşirea separării este determnat de viteza v B
a solutului care se mişcă mai lent este dată de ecuaţia 2.
Aceasta este:
Combinând această expresie cu ecuaţiile
1.6 şi 1.12, rezultă, după rearanjare:
cu ecuaţiile 1.6 şi 1.12, rezultă, după rearanjare: unde ( t R ) B este timpul

unde (t R ) B este timpul necesar pentru a aduce peak- ul B la capătul coloanei în condiţiile în care viteza

fazei mobile este u.

În cazul în care ecuaţia

combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii, rezultă:

de

mai

sus

este

u . În cazul în care ecuaţia combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii, rezultă :
u . În cazul în care ecuaţia combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii, rezultă :
u . În cazul în care ecuaţia combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii, rezultă :

Variabilele care afectează performanţele unei coloane cromatografice

Ecuaţiile alăturate sunt semnificative deoarece servesc drept ghid în alegerea condiţiilor care sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul cromatografiei pentru a atinge într-un timp determinat scopul propus cu rezultate clare.

într-un timp determinat scopul propus cu rezultate clare. În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare
într-un timp determinat scopul propus cu rezultate clare. În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare

În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare dorită trebuie avut în vedere parametrii fundamentali, , k' şi N (sau H) pot fi ajustaţi mai mult sau mai puţin independent. Astfel, parametrii şi k' pot fi variaţi mai simplu prin varierea temperaturii sau a compoziţiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de împachetare a coloanei reprezintă o modalitate mai puţin convenabilă. După cum s-a arătat, este posibil a se modifica N prin schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a fazei mobile, a mărimii dimensiunilor particulelor de împachetare, a vâscozităţii fazei mobile (prin modificarea D M sau D S ), şi a grosimii filmului de lichid adsorbit conţinut în faza staţionară .

Variaţia în numărul de talere, N

O cale evidentă de creştere a rezoluţiei o reprezintă creşterea numărului de talere din coloană (ecuaţia 1.21). Totuși urmând această cale, metoda este mai puţin economică din punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea în afara cazului în care creşterea în N este realizată mai degrabă prin reducerea în H decât prin lungirea coloanei.

Variaţia în înălţimea talerului, H

O îmbunătăţire semnificativă a rezoluţiei poate fi realizată fără nici un cost de timp suplimentar dacă înălţimea talerului se reduce. Se poate nota că scăderea mărimii particulelor de împachetare a coloanei conduce la o îmbunătăţire marcantă a lui H. Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea înălţimii talerului poate fi de asemenea realizată prin reducerea vâscozităţii solventului, mărindu-se astfel coeficientul fazei mobile.

Variaţia în factorul de retenţie

Adesea, o separare poate fi îmbunătăţită semnificativ prin manipularea factorului de retenţie, k‟ B . Creşterea lui k‟ B creşte în general rezoluţia (crescând însă timpul de eluţie). Pentru a determina domeniul optim al valorilor pentru k‟ B , este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și în forma:

, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și în forma: unde Q şi Q' conţin restul
, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și în forma: unde Q şi Q' conţin restul
, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și în forma: unde Q şi Q' conţin restul
, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și în forma: unde Q şi Q' conţin restul

unde Q şi Q' conţin restul de termeni ai celor două ecuaţii.

Figura alăturată este o

reprezentare grafică R S /Q ori (t R ) B /Q' în funcţie de k’ B , considerând Q şi Q' rămân aproximativ constante. Se

vede clar valorile lui k’ B mai mari de 10 nu trebuie alese deoarece ele conduc la o mică creştere în rezoluţie dar cu o creştere marcantă a

timpului necesar separării.

Valoarea minimă a timpului de eluţie se manifestă la o valoare a k’ B de aproximativ 2. Astfel, în multe cazuri, valoarea optimă a k’ B se stabileşte luând în calcul atât rezoluţia cât şi timpul necesar separării, adică într-un domeniu cuprins între 1 până la 5.

adică într-un domeniu cuprins între 1 până la 5. Efectul factorului de retenție k’ B asupra

Efectul factorului de retenție k’ B asupra rezoluţiei R S şi a timpului de eluţie (t R ) B . Se consideră că Q şi Q’ rămân constante la variaţia factorului k’ B .

În mod uzual, cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei de separare o reprezintă optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creşterea temperaturii. Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziţiei solventului permite deseori manipularea lui k' obţinându-se astfel separări superioare. Efectele dramatice produse prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat în figura de mai jos.

Efectul variaţiei solventului

asupra separării cromatografice. Analiţi: (1) 9,10-antraquinonă; (2) 2-metil-9,10-antraquinonă; (3) 2-

etil-9,10-antraquinonă; (4) 1,4-

dimetil-9,10-antraquinonă; (5) 2-

t-butil-9,10-antraquinonă.

Se observă că o mică modificare a rapoartelor metanol/apă conduce de la separări cromatografice nesatisfăcătoare (a şi b) la separări unde fiecare peak al oricărui component este bine separat (c şi d). În multe scopuri, Cromatograma arătată în (c) pare a fi cea mai bună după cum arată raportul dintre rezoluţia adecvată în intervalul de timp.

Variaţia în factorul de selectivitate

În condiţiile în care atinge unitatea, optimizarea lui k' şi creşterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare satisfăcătoare a doi soluţi, într-un timp rezonabil. Sub aceste circumstanţe, trebuie identificată o posibilitate de creştere a

factorului de selectivitate , cu menţinerea lui k' într-un domeniu optim de 1-10. În acest context sunt posibile o serie de

opţiuni de lucru. Astfel, scăderea oportunităţii în perspectiva şi avantajul (comodităţii) aceste opţiuni includ: (1) schimbarea compoziţiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea

compoziţiei fazei staţionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice. Un exemplu de utilizare a opţiunii (1) a fost raportat în cazul separării anisolului (C 6 H 5 OCH 3 ), de benzen. Cu o fază mobilă conţinând un amestec metanol:apă 50%, k' pentru cei doi soluţi a fost raportată de 4,5 şi respectiv 4,7, în timp ce a

fost egal cu numai 1,04. Înlocuirea fazei apoase cu una care ca conţinut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 şi 4,7 şi la o

valoare de 1,20. Dacă suprapunerea celor două peak-uri a fost semnificativă în primul caz, în cel de al doilea caz suprapunerea a fost neglijabilă. Pentru separări care implică acizi sau baze ionizabile, modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la manipularea valorilor fără a schimbare majoră în k' ceea ce conduce la separări mai eficiente. O metodă mai puţin convenabilă dar deseori foarte eficientă în creşterea simultan cu o menţinere aproape

constantă a valorilor lui k' în domeniul optim este cea de alterare a compoziţiei chimice a fazei staţionare. Pentru

aceasta, cele mai multe laboratoare care realizează separări cromatografice frecvente posedă mai multe coloane care pot fi interschimbabile cu un minim de efort. O creştere a temperaturii generează deseori o creştere în k' dar această operaţiune are un efect mic asupra valorilor lui în cazul cromatografiei lichid-lichid ori cromatografiei lichid-solid. În opoziţie, în cazul cromatografiei de schimb ionic, efectul temperaturii poate fi suficientă în cazul explorării acestei opţiuni, înainte de schimbarea împachetării coloanei.

În fine, o altă metodă de creştere a rezoluţiei este încorporarea în faza staţionară a unor specii care complexează sau interacţionează cu unul sau mai mulţi componenţi aflaţi în proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opţiuni o reprezintă impregnarea cu săruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o îmbunătăţire a separării olefinelor ca o consecinţă a formării unor complexe între ionii de argint şi compuşii organici nesaturaţi.

Trena cromatografică

Formarea trenelor cromatografice reprezintă o problemă reală şi inevitabilă la majoritatea separărilor în cromatografia lichidă. Cercetătorii din domeniu au depus eforturi în dezvoltarea unor noi materiale (suporturi cromatografice) şi deşi acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut elimina acest fenomen. Procesul de formare a trenei cromatografice poate cauza atât probleme cantitative cât şi calitative în procedurile de cromatografie lichidă, fiind importantă o monitorizare a formării lor astfel încât nu se compromită rezultatul analizei. Analizând în detaliu o cromatogramă se poate observa aproape toate peak-urile cromatografice au o oarecare trenă mai mult sau mai puţin lungă. Deşi multe dintre coloanele de cromatografie lichidă actuale sunt mai puţin problematice decât predecesoarele lor, totuşi aceasta problemă nu a fost încă eliminată. Se consideră că un peak are trena sau ca este asimetric atunci când forma sa deviază de la cea ideala, Gaussiană. A doua jumătate eluată a peak-ului este mai largă decât prima, iar lăţimea sa tinde sa se expandeze spre baza. Deşi pot apărea cozi ale peak-urilor si in jumătatea frontala a acestora, acestea sunt totuşi rare in comparaţie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot influenta calitatea separării este bine ca panta trenei sa fie cuantificata. Exista doua mecanisme de măsurare universale a peak-urilor. Lucrătorii din industria farmaceutica folosesc factorul de trenare, USP T f (Unided State Pharmacopeea Tail factor), conform formulei 1.26.

State Pharmacopeea Tail factor ), conform formulei 1.26 . unde a si b reprezintă lăţimea jumătăţii

unde a si b reprezintă lăţimea jumătăţii frontale si respectiv jumătăţii posterioare măsurate la 5% din înălţimea peak-ului (figura alăturată). Majoritatea celorlalţi practicieni folosesc factorul de asimetrie (As).

practicieni folosesc factorul de asimetrie (As). unde “ a ” si “ b ” sunt măsurate
practicieni folosesc factorul de asimetrie (As). unde “ a ” si “ b ” sunt măsurate

unde asi bsunt măsurate la 10% din înălţimea peak-ului cromatografic din figura alăturată.

Pentru valori mai mici de 2, As şi USP Tf sunt aproximativ aceleaşi, precum se poate observa şi in tabelul de mai jos. ce reprezintă măsurătorile factorului de asimetrie şi ale factorului de trenare USP pentru acelaşi peak, în cazul figurii de mai jos.

Măsurătorile factorului de asimetrie (As) şi ale factorului de trenare USP (Tf) pentru acelaşi peak.

Peak-ul din figura alăturată

Valoarea măsurată

 

As

Tf

1,0

1,0

1,0

1,2

1,3

1,2

1,5

1,7

1,4

2,0

2,5

1,9

3,0

3,8

2,9

4,0

5,5

3,5

2,5 1,9 3,0 3,8 2,9 4,0 5,5 3,5 Exemple de peak- uri asimetrice şi factorul de

Exemple de peak-uri asimetrice şi factorul de asimetrie calculat pentru fiecare.

În condiţiile în care coloana cromatografică este nouă, majoritatea producătorilor prezintă criterii de trenare (factorul As) cuprinse între valorile 0,9 (puţin frontal) şi 1,2 (puţin trenat). Majoritatea utilizatorilor care folosesc probe reale încearcă să obţină un factor de asimetrie, nu mai mare de 1,5- 2. În general, când As este mai mare decât 2, există probleme de separare, şi se cercetează cauza acestora.

Figura alăturată ne furnizează o serie de indicii asupra potenţialelor probleme create de trena peak-urilor, prin comparaţia

unui peak ce are As = 1 cu un altul ce posedă As = 4. Astfel,

comparând aria peak-urilor, se observă o diferenţă elocventă; deşi ea este aceeaşi înălţimea peak-ului cu As = 4 este de trei ori mai mică comparativ cu înălţimea primului peak. În condiţiile analizelor de urme, înălţimea peak-ului devine un factor critic în determinarea limitei minime de cuantificare, iar trenarea peak-ului conduce la rezultate clar

inferioare.

Formarea trenelor este de asemenea problematică în cazul in care peak-urile minore se ascund în cele majore. Acest fenomen este nedorit în condiţiile analizei unor metaboliţi ori în identificarea unor impurităţi. Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de

rutină, trebuie de obicei asigure o bună rezoluţie a liniei de bază a tuturor peak-urilor iar timpul de rulare fie cât mai mic posibil. Figura alăturată arată că rezoluţia liniei de baza a peak-urilor cu trenă necesită un timp mai lung de rulare comparativ cu peak-urile ce nu au trenă sau care au o trenă scurtă. Aşadar, peak-urile cu trenă nu doar reduc calitatea cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea de a cuantifica componente prezente în probă. Cauzele apariţiei trenei cromatografice se datorează mai ales faptului existenţei mai multor mecanisme de separare, unul dintre acestea fiind supra-implicat. O serie dintre practicieni au tendinţa de a considera separările în fază inversă, pe coloane C18, de exemplu

drept procese pure de retenţie hidrofobă. Această consideraţie poate fi

adevărată dacă faza staţionară ar fi constituită numai din grupări C18. totuşi, aproximativ jumătate din suprafaţa de silice este nelegată ceea ce conduce la permisiunea de expunere a grupărilor silanol (SiOH) care pot interacţiona cu proba.

ceea ce conduce la permisiunea de expunere a grupărilor silanol (Si – OH) care pot interacţiona

Particulele de silice care formează suportul solid sunt realizate din polimer de siliciu şi oxigen. Ca şi carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura internă a lui cuprinde patru atomi de oxigen ataşaţi la fiecare atom de siliciu în structura polimerului tridimensional. La suprafaţă, polimerul se termină cu grupări de silanol Figura de mai jos prezintă diferitele configuraţii posibile ale grupărilor silanolice.

configuraţii posibile ale grupărilor silanolice. Interacţii posibile la suprafaţa suportului de silice

Interacţii posibile la suprafaţa suportului de silice

Practicienii descriu în mod curent suprafaţa ca posedând grupări libere silanolice (a) dar sunt de altfel prezenţi atomi de siliciu cu două grupări hidroxil în configuraţie geminală (b). Dacă grupările silanolice sunt poziţionate una, alături de alta, se pot realiza legături de hidrogen cu o grupare adiacentă (c). Grupările libere de silanol sunt mai acide decât grupările geminale ori asociate ele interacţionând mai puternic cu soluţi bazici având ca rezultat formarea unei trene deseori asociată cu separarea unor soluţi bazici. În alte cazuri, urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel (d). Ionii metalici pot acţiona ca situsuri schimbătoare de ioni sau, când grupările silanol libere sunt adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie şi mai acid (e).

In trecut, coloanele împachetate cu silice tip A conţineau toate aceste forme de silanol

prezentate în figură, totuşi, în ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obţinere de suporturi de

silice de puritate înaltă (silicea de tip B), ce conţine un număr redus de grupări silanol libere la suprafaţă şi sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puţin acide. Astfel de coloane ce conţin silice de tip B au o tendinţă mult mai mică de a genera peak-uri cu trenă. Reducerea formării trenelor în coloane de tip.A, înseamnă de obicei modificarea fazei mobile

pentru a include componente ce concură la suprimarea trenei. Adăugarea de trietilamină în faza

mobilă reprezintă o metodă curentă în reducerea formării trenelor cromatografice. Folosită la o concentraţie de 20mM sau mai mare în faza mobilă, trietilamina poate reduce semnificativ trenarea picurilor în coloane de tip A. În cazul utilizării