În 1906 Tswett a publicat un

articol, în revista de specialitate

Berichte der deutschen botanischen
Gesellschaft în care descrie
separarea unor pigmenţi vegetali pe
un tub îngust de sticlă, umplut cu
carbonat de calciu. Pigmenţii de
diferite culori au fost astfel separaţi
de pe carbonat prin eluţie cu eter de
petrol.

Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

 Istoric

• Plinius cel Bătrân (23-79 după Cristos) în

Historia Naturalis, descrie un proces
egiptean (ca. 500 înainte de Cristos) de
separare a unor pigmenţi prin depunerea
soluţiei lor pe un material celulozic,
precum papirusul. Această tehnică poate fi
considerată a fi foarte aproape de
cromatografia pe hârtie.
• În 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hârtie şi include
ilustraţii ale cromatogramelor în lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.
• Richard Kuhn şi Edgar Lederer (1931, separarea a două componente din
carotenul cristalizat, privit până în acel moment drept un singur compus chimic,
prin cromatografie de adsorbţie.
• Martin şi Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiţie)
• Consden, Gordon, şi Martin (descrierea cromatografiei pe hârtie).
• 1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separă
compuşi gazoşi sau volatili pe o coloană îngustă umplută cu un adsorbent.
• Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se
separă compuşi prin trecerea unui solvent printr-un strat subţire de o grosime
submilimetrică, întins pe un suport precum placa de sticlă a fost dezvoltată în
anii „60.
• Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (high performance liquid
chromatography, HPLC), tehnică care se separă compuşi prin introducerea
probei într-o coloană îngustă încărcată cu adsorbent şi forţarea eluţiei sale prin
presiune a fost dezvoltată în deceniul al şaptelea.
• Cromatografia pe hârtie şi mai ales cea în strat subţire sunt încă utilizate, fiind
deseori preferate cromatografiei gaz-lichid şi cromatografiei lichide de înaltă
performanţă din cauza marii lor puteri în separarea efectivă, cu echipamente
ieftine şi costuri scăzute.
• Principala aplicaţie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de
compuşi în scopuri analitice sau preparative.
• Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea,
purificarea şi cuantificarea unor compuşi individual separaţi.
• În plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate în determinarea omogenităţii
unor substanţe chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea
produşilor de reacţie şi a proceselor care le însoţesc.
• Cromatografia cuprinde un grup important şi diversificat de metode care permit
cercetătorului separarea unor componenţi foarte apropiaţi (înrudiţi) dintr-un amestec
complex de substanţe (de componente), multe dintre aceste separări nefiind posibile
prin alte tehnici.
• În toate separările cromatografice proba este transportată într-o fază mobilă, care
poate fi un gaz, un lichid sau un fluid în stare supercritică. Aceasta fază mobilă
este forţată să traverseze o fază nemiscibilă, fază staţionară, care se găseşte într-o
coloană sau pe o suprafaţă solidă. Cele două faze sunt alese în aşa fel încât proba
să se distribuie între faza mobilă şi cea staţionară în proporţii diferite. Componentele
care sunt mai puternic reţinute de către faza staţionară se vor mişca şi vor curge mai
lent cu faza mobilă. Din contră, componentele uşor legate de către faza staţionară
vor traversa această fază mai rapid. Drept consecinţă a acestor diferenţe în
mobilitate, componentele probei se vor separa în benzi ori zone discrete, care
pot fi analizate calitativ şi/sau cantitativ.
• Termenul de migrare utilizat în cromatografie reprezintă o descriere generică a
mişcării moleculelor în cromatografie şi el nu trebuie confundat cu migrarea unei
specii ionice sub acţiunea unui câmp electric.
 Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloană
• Metodele cromatografice pot fi clasificate ţinând cont de două
criterii.
– Prima clasificare este bazată pe metoda fizică prin care fazele
mobilă şi staţionară vin în contact.
• Astfel, în cromatografia pe coloană, faza staţionară este
reţinută într-un tub îngust, prin care faza mobilă este forţată
să treacă.
• În cromatografia planară, faza staţionară este depusă pe un
suport, în interstiţiile unui material poros (de tipul hârtiei de
filtru, ca exemplu). În acest caz, faza mobilă se mişcă prin
faza staţionară datorită forţei capilare, sub influenţa forţei
gravitaţionale.
 Se poate remarca că echilibrele care apar în cazul celor
două tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,
teoriile dezvoltate în cazul uneia dintre cele două metode
putând fi formalizate asemănător şi uşor adaptate la cealaltă
tehnică cromatografică.
O clasificare mult mai fundamentată a metodelor cromatografice se bazează pe
tipul fazelor mobile şi staţionare şi tipul de echilibru stabilit în transferul soluturilor
între cele două faze.
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUŢIE PE COLOANĂ

• Prezentarea schematică a
modului prin care două
substanţe, notate A şi B
sunt separate prin
cromatografie de eluţie pe
o coloană, cu fază mobilă
lichidă. Eluţia implică
spălarea, trecerea speciilor
(substanţelor A şi B, în
speţă) prin coloană, la
adăugarea continuă de
solvent (fază mobilă)
proaspăt (a).
o porţiune unică de probă este
introdusă la capătul superior al coloanei
(timpul to), după care componentele probei
se distribuie independent, între cele două
faze.
(b) Semnalul înregistrat de către un detector în funcţie de
evoluţia eluţiei prin coloana prezentată în (a).
Introducerea unui volum adiţional de fază mobilă (de
eluent) forţează volumul de solvent care conţine o
parte a probei să coboare prin coloană, unde, se
stabileşte o nouă partiţie între faza mobilă şi cea
staţionară (timpul t1). Simultan cu aceasta se
stabileşte un nou echilibru și o nouă partiţie între
solventul proaspăt (faza mobilă nou adăugată) şi faza
staţionară la locul iniţial de adăugare a probei.
Adăugarea unor noi volume de solvent va avea ca
efect coborârea moleculelor de solut spre capătul de
jos al coloanei printr-o serie continuă de transferuri
între faza mobilă şi cea staţionară. Cum mişcarea
solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei
mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului
migrează în josul coloanei depinde de fracţia de timp
în care solutul este reţinut de către această fază.
Această fracţie este mică pentru componenta mai
puternic reţinută de către faza staţionară (compusul B,
din figură) şi este mare în cazul în care retenţia în faza
mobilă este mai adecvată (componenta A). În mod
ideal, diferenţele rezultate în vitezele diferite conduc la
separarea componentelor dintr-un amestec în benzi
sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t3 din
figură). Izolarea şi deci separarea speciilor A şi B este
urmarea trecerii unei cantităţi suficiente de fază mobilă
prin coloană şi care conduce la o separare individuală
de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate
(timpii t3 şi t4 din figură).
 DILUŢIA ANALITULUI
• Figura ilustrează o caracteristică
importantă a procesului de separare,
denumită diluţia analitului fenomen care
însoţeşte aproape întotdeauna separările
cromatografice. Astfel, mărimea zonei
originale care conţine analiţii din figură
este notabil mai mică decât cele două
zone care conţin componentele A şi B şi
care ajung în zona detectorului. Acest
fenomen semnificativ de diluare se
manifestă odată cu separarea
componentelor şi din această cauză,
detectorii utilizaţi pentru separarea
analiţilor trebuie adesea să prezinte o
sensibilitate mai mare decât cea care
ar fi dorită dacă procesul de separare
nu ar fi necesar.
 CROMATOGRAMELE
• Dacă un detector care răspunde la o
modificare de concentraţie a solutului este
plasat la capătul terminal al coloanei iar
semnalul său este reprezentat grafic în
funcţie de timp (sau de volumul de fază
mobilă adăugat) se obţin o serie de peak-uri,
prezentate în figură (b). Asemenea
reprezentări grafice poartă numele de
cromatograme, care sunt utilizate atât în
cromatografia analitică cât şi în cea
preparativă. Poziţia peak-urilor pe axa
timpului poate servi la identificarea
componentelor din probă, aria fiecăruia
conducând la determinarea cantitativă a
fiecărui component.
 EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE ŞI A LĂŢIMII ZONEI ASUPRA
REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE

• Figura alăturată prezintă

profilurile concentraţiilor
soluţilor A şi B la două etape
diferite de eluţie: o etapă timpurie
(momentul t1) şi o etapă spre final
(momentul t2).

Se poate spune ca specia B este mai puternic reţinută şi din această

cauză componentul B întârzie mai mult pe coloană pe parcursul migrării.
Această întârziere în coborâre conduce la creşterea distanţei dintre cele două
zone. La acelaşi interval de timp, are loc aceeaşi lărgire a zonelor celor două
componente, fenomen ce scade eficienţa coloanei cromatografice. Cum
lărgirea zonei este inevitabilă, se pot alege condiţiile în aşa fel ca acest
fenomen să se manifeste cât mai lent odată cu separarea benzilor. Astfel, o
separare completă şi de aici o rezoluţie bună, se realizează adesea în
condiţiile în care lungimea coloanei este suficient de mare.
 două metode de îmbunătăţire a separării în cazul unui amestec ipotetic
de două componente (figură, panel a).

• În figura alăturată (b)

condiţiile au fost modificate
astfel încât primul component
se deplasează mai repede în
josul coloanei cu viteză mai
mare în timp ce al doilea se
deplasează mai încet.
(c) : vitezele de împrăştiere a celor două
zone au fost micşorate. Ambele metode
conduc la o separare mai distinctă a celor
două componente
(a) cromatograma originală cu cele
Ambele metode conduc la o separare mai două peak-uri suprapuse;
distinctă a celor două componente îmbunătăţirea separării prin (b)
creşterea separării benzilor
cromatografice şi (c) prin scăderea
împrăştierii benzii cromatografice.
 Viteza de migrare a soluţÌlor

• Eficienţa unei coloane cromatografice

în separarea a doi soluţi depinde, în parte,
de vitezele relative cu care cei doi
compuşi sunt eluaţi. Aceste viteze sunt
determinate de magnitudinea
constantelor de echilibru ale procesului
prin care soluţii se distribuie independent
între faza mobilă şi cea staţionară.
 CONSTANTELE DE DISTRIBUŢIE

Adeseori, echilibrele de distribuţie implicate în cromatografie sunt descrise prin

ecuaţii care implică transferul unui analit între fazele mobilă şi staţionară. Astfel,
pentru speciile A de solut se poate scrie următorul echilibru al procesului de
adsorbţie-desorbţie:

Constanta de echilibru, K, pentru această reacţie este numită constantă de distribuţie, raport
de partiţie sau coeficient de partiţie Comisia de Nomenclatură Analitică a IUPAC pentru
cromatografie recomandă utilizarea termenului de constantă de distribuţie, Kc în loc de vechiul
termen în loc de vechiul termen de coeficient de partiţie sau raport de partiţie, K. Totuși, în literatura
de specialitate ambii termeni sunt încă utilizaţi. Constanta K este definită conform formulei:
CS reprezintă concentraţia molară a solutului din faza staţionară iar CM este
concentraţia molară din faza mobilă; în mod ideal, K este constantă în tot
domeniul de concentraţii a solutului, iar CS este proporţională cu CM.
Tipul de cromatografie în care se aplică ecuaţia poartă denumirea de
cromatografie lineară iar rezultanta ei este caracterizată printr-o simetrie de
tip Gauss a peak-urilor şi a timpilor de retenţie, parametrii care sunt
independenţi de cantitatea de analit supusă analizei. În general, studiile
teoretice se limitează la o astfel de cromatografie lineară.
 TIMPUL DE RETENŢIE

Figura alăturată reprezintă

generic o cromatogramă pentru o
probă ce conţine un singur analit.
Timpul necesar probei de a
parcurge distanţa dintre
momentul inoculării până la
detecţia semnalului său de
detector este numit timp de
retenţie, fiind simbolizat prin
tR. Peak-ul prezentat în partea
din stânga cromatogramei este
dat de speciile care nu sunt
reţinute de către coloană.
Adesea, proba sau faza mobilă
conţine specii ce nu sunt reţinute
pe parcursul migrării pe coloană.
Astfel de specii care nu
interacţionează cu faza
staţionară sunt de real folos în
identificarea peak-ului analitului
de interes.
Peak-ul mic din stânga reprezintă o specie care nu este reţinută pe
coloană şi a cărei semnal apare la detector aproape imediat după ce
eluţia a fost începută. Astfel, timpul său de eluţie (tM) este
aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile să treacă prin
coloană.

Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la

detector se notează cu tM şi se numeşte timp mort.
Viteza de migrare a speciilor nereţinute este în acelaşi
domeniu cu viteza de mişcare a moleculelor fazei
mobile.
• Viteza lineară medie de migrare a solutului
(ν ) este dată de relaţia:
• unde L este lungimea coloanei
împachetate.

În mod similar, viteza medie lineară de

mişcare a unei molecule de fază mobilă (u)
este dată de relaţia:

unde tM reprezintă timpul mort, timpul necesar pentru ca o moleculă

medie de fază mobilă să treacă prin coloană.
• De exemplu, dacă o coloană are un volum total de 100 ml iar faza
staţionară ocupă 40 ml, rezultă că faza mobilă ocupă un volum de 60 ml.
Dacă faza mobilă curge cu o viteză de 5 ml/min, se poate calcula că sunt
necesare 12 minute pentru ca faza mobilă să traverseze coloana, de la
injector la detectorul situat la capătul terminal al coloanei.
• Uneori, tM poate fi determinat prin identificarea unui mic peak la începutul
cromatogramei, rezultat dintr-o uşoară diferenţă dată de solventul care
provine din faza mobilă ce conţine proba adăugată.
• De asemenea tM poate fi determinat prin măsurarea timpului de eluţie a unei
probe care nu este reţinută absolut de loc de către faza staţionară. În cazul
unei răşini schimbătoare de ioni cationice, pentru a se determina tM, se
poate utiliza o proteină cu sarcină negativă.
• Se notabil de arătat că există şi alţi factori
precum lungimea şi diametrul tubului care
conectează injectorul şi detectorul la coloană
care pot afecta valorile tM.
• Practic, considerând o coloană împachetată de
25 cm lungime, cu un diametru interior de 1 cm,
volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= •r2
•L = 3,14 •0,52 •25cm). Dacă faza mobilă
ocupă 60% din volumul coloanei, volumul
spaţiului gol, care defineşte «timpul mort» este
egal cu 11,8 ml. El reprezintă volumul spaţiului
gol, denumit „void volume” = V0
 RELAŢIA DINTRE TIMPUL DE RETENŢIE ŞI CONSTANTA DE
DISTRIBUŢIE
În scopul prezentării relaţiei dintre timpul de retenţie al
solutului şi constanta sa de distribuţie, se poate exprima
viteza de migrare drept o fracţie a vitezei fazei mobile:

Această fracţie este egală cu numărul mediu de moli de solut din

faza mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut
din coloană, conform următoarei relaţii:
 Numărul total de moli de solut din faza mobilă este egal cu
concentraţia molară a solutului din faza mobilă, cM, multiplicată cu
volumul acestei faze, VM.
În mod similar, numărul de moli de solut din faza staţionară este
dat de produsul concentraţiei cS de solut din faza staţionară, multiplicat
cu volumul său din aceeaşi fază, VS.
Astfel se poate scrie:
 Prin substituirea ecuaţiei constantei
de distribuție în această ecuaţie se obţine
viteza de migrare a solutului ca funcţie de
constanta de distribuţie şi ca funcţie de
volumele fazelor staţionare şi mobile:

Cele două volume pot fi estimate prin metode specifice fiecărui tip de cromatografie.
VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENŢIE
Factorul de retenţie, sau factorul de capacitate reprezintă un
parametru important care este general utilizat în descrierea vitezelor
de migrare a soluturilor pe coloană. Pentru un solut A, factorul de
retenţie k’A este definit ca:

unde KA reprezintă constanta de distribuţie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatură Analitică recomandă denumirea de

factor de retenţie k', însă denumirea de factor de capacitate este încă
utilizat în literatura de specialitate.

Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă:

 În scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina k’A dintr-o
cromatogramă, se vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6,

= L (2 ) u= L (3 )
tR t
M

ceea ce conduce la:

rearanjarea acestei ecuaţii

După cum se observă în figură, tR şi

tM sunt uşor de obţinut dintr-o
cromatogramă. În condiţiile unui factor de
retenţie pentru un solut mult mai mic
decât unitatea, eluţia se realizează mai
rapid şi din această este dificil a se
determina timpii de retenţie cu acurateţe.
În condiţiile în care factorul de retenţie
este de ordinul zecilor (de exemplu 20
sau 30), timpii de eluţie devin anormal de
mari. Ideal, separarea se efectuează în
condiţiile unor factori de retenţie cuprinşi
între 2 şi 10.
 VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE
SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate
al unei coloane () pentru (9)
două specii, A şi B este
definit prin formula:
unde KB reprezintă constanta de distribuţie
a speciei B, mai puternic reţinută pe
coloană, în timp ce KA reprezintă
constanta de distribuţie a speciei A, mai
puţin reţinută pe coloană, şi mai rapid
eluată de pe aceasta. Prin definiţie,  este
întotdeauna mai mare decât unitatea.
• Prin substituirea ecuaţiei 5 şi a
ecuaţiei analoage pentru
solutul B în ecuaţia 9 se
obţine, după la rearanjare,
relaţia de legătură între factorul (10)
de selectivitate pentru cei doi
soluţi şi factorii lor de retenţie:
unde k'B şi k'A reprezintă factorii de retenţie
ai solutului B, respectiv A.

Substituţia în ecuaţia 8 pentru cei doi soluţi din ecuaţia 10 conduce la o expresie ce
permite determinarea experimentală lui  dintr-o cromatogramă:

factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la

rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea
unei coloane cromatografice
 Împrăştierea zonei şi eficienţa
coloanei
• Teoria dinamică, sau teoria cinetică a cromatografiei
explică cu succes în termeni cantitativi formele peak-
urilor cromatografice şi efectele diverselor variabile
implicate în lăţirea acestor peak-uri. O discuţie
detailată a acestei teorii se bazează pe mecanismul de
repartiţie aleatorie, putându-se da o imagine calitativă
a zonelor cromatografice şi care conduce la analiza
modului de împrăştiere a zonelor în condiţiile deplasării
moleculelor de solut de-a lungul unei coloane.
Înţelegerea acestor fenomene au ca rezultat
identificarea variabilelor ce conduc la creşterea
eficienţei coloanei şi la reducerea împrăştierii zonelor
cromatografice.
 FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

Figura 4

Figura 1
Figura 2
• Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogramă sau a benzilor pe
coloană (figurile de mai jos) relevă o similaritate a erorilor normale,
repartiţia realizându-se după un profil Gaussian, care sunt obţinute
în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de
frecvenţa repartiţiei a acestora.
În unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestând o
coadă (trenă) sau un front.
În primul caz, trena peak-ului care apare în dreapta cromatogramei
este prelungă, în timp ce frontul acestuia este abrupt.
În cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversată, adică
frontul este prelung în timp ce trena este extrem de scurtă. Cauza comună a
apariţiei frontului sau a trenei o reprezintă existenţa unei constante de
distribuţie neliniare. Frontul apare de asemenea în cazul eluării unei
cantităţi mari de probă pe coloană. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite
deoarece conduc la separări de proastă calitate şi la timpi de eluţie cu
reproductibilitate scăzută. În abordarea teoretică se consideră ca fenomenul
de front sau coadă cromatografică este absent sau minim.
• După cum se cunoaşte, curbele de erori normale pot fi
raţionalizate prin asumarea faptului că incertitudinea
asociată cu orice măsurătoare singulară reprezintă
însumarea unui număr mult mai mare de erori mici,
individuale nedetectabile şi de repartiţii întâmplătoare,
fiecare dintre acesta având o probabilitate egală, pozitivă
sau negativă. Cea mai comună manifestare a acestor
incertitudini este reprezentată de anularea uneia de către
cealaltă, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mică
probabilitate, însumarea poate conduce la un rezultat mai
mare sau mai mic decât media. Drept consecinţă,
distribuţia valorilor este simetrică, în jurul valorii medii. În
mod similar, forma Gaussiană a unei zone
cromatografice ideale poate fi atribuită combinării aditive
a mişcărilor întâmplătoare a moleculelor de solut în zona
cromatografică.
 Să considerăm comportamentul unei molecule de solut, care în timpul
migrării, trece prin mii de transferuri între faza staţionară şi cea mobilă. Timpul
petrecut în fiecare fază de transfer este deosebit de neuniform, depinzând de
câştigul accidental de energie termică din mediul înconjurător pentru a realiza
un transfer reversibil, în cealaltă fază. Astfel, în unele cazuri, timpul de şedere
într-o fază dată, poate fi tranzitoriu, în timp ce în alte faze perioada poate fi
relativ mai lungă. Cum molecula este eluată numai în timpul şederii sale în faza
mobilă, are ca rezultat, migrarea sa total neuniformă în josul coloanei. Din
cauza timpilor variabili de şedere, viteza medie cu care moleculele individuale
se mişcă relativ în faza mobilă variază în mod considerabil. Anumite particule
individuale traversează mai rapid în virtutea includerii lor accidentale în faza
mobilă, majoritatea timpului de eluţie. Altele, din contră, pot prezenta întârzieri
datorită includerii lor în faza staţionară, timp mai îndelungat decât timpul mediu
de eluţie. Consecinţa acestor procese aleatoare este o împrăştiere simetrică a
vitezelor în jurul valorii medii, iar acesta reprezintă comportamentul mediu al
moleculei.
Lăţimea benzii componentului separat creşte odată cu coborârea lui de-
a lungul coloanei, datorită faptului că o creştere a timpului de eluţie permite
manifestarea unei mai mari împrăştieri. Astfel, lăţimea zonei este în relaţie
directă cu timpul de şedere în coloană şi în relaţie inversă cu viteza de curgere
a fazei mobile.
 METODE DE DESCRIERE A EFICIENŢEI COLOANEI
În măsurarea cantitativă a
eficienţei unei coloane
cromatografice în general
sunt utilizaţi doi termeni
înrudiţi:
(1) înălţimea talerului
teoretic, H şi
(2) numărul de talere
teoretice, N. Cei doi
parametrii sunt asociaţi
prin ecuaţia:
N = L/H (1.12)
L, lungimea coloanei împachetate
(dată de obicei în centimetrii)
Eficienţa coloanelor cromatografice creşte
cu numărul de talere teoretice: cu cât
numărul de talere teoretice este mai mare
şi înălţimea talerului teoretic devine mai
mică. Sunt întâlnite diferenţe enorme în
eficienţa unei coloane, datorită diferenţelor
dintre tipul de coloană şi fazele mobilă,
respectiv staţionară, utilizate. În mod
curent, eficienţa unei coloane în termen de
număr de talere teoretice, poate varia între
câteva sute până la mii, iar domeniul
înălţimii talerelor variind între zecimi până
la miimi de centimetrii sau mai mici.
• Introducerea termenilor de înălţime a talerului şi a numărului de
talere este datorată studiilor teoretice ale lui Martin şi Synge care
au tratat coloana cromatografică similar coloanei de distilare, unde
au loc o multitudine de procese discrete dar continue, în straturi
înguste, denumite talere teoretice. S-a considerat că la nivelul
fiecărui taler, are loc un echilibru între faza mobilă şi cea staţionară.
Mişcarea solutului în josul coloanei a fost apoi tratată ca o treaptă
de transfer între faza mobilă în echilibru şi următorul taler situat mai
jos.

Teoria talerului teoretic a fost aplicată cu succes la forma Gaussiană a peak-urilor

cromatografice şi la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice.
Ea a fost în final abandonată totuşi, deoarece nu a reuşit sa răspundă la explicarea
modului de împrăştiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizaţi la
descrierea eficienţei unei coloane au fost păstraţi în teoria vitezei de migrare. Această
nomenclatură este uneori neadecvată din cauza tendinţei de a perpetua mitul
prezenţei unor talere în coloana cromatografică, la nivelul cărora se realizează
echilibrul între faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizează niciodată
deoarece faza mobilă este într-o permanentă şi constantă mişcare.
 DEFINIŢIA ÎNALŢIMII
TALERULUI
După cum se cunoaşte, lăţimea curbei Gaussiene este într-o
relaţie directă cu varianţa 2, sau cu deviaţia standard , a unei
măsurători. Cum benzile cromatografice sunt în general
considerate a avea astfel de formă, este convenabil să definim
eficienţa unei coloane în termen de varianţă pe unitate de
lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H, este dată de
relaţia:
 DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI

Definiţia talerului teoretic. H =  2/ L

 EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N

Determinarea deviaţiei standard  din peak-ul cromatografic: W = 4.

 Această definiţie a înălţimii talerului este ilustrată în figura de mai jos. După
cum se observă, coloana este împachetată pe o distanţă de L centimetrii, în
lungime (panelul a).

Reprezentarea
grafică a definiţiei
talerului teoretic.
H =  2/ L

În partea superioară a figurii (panelul b) este reprezentată schematic,

distribuţia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice împachetate, în
momentul în care analitul părăseşte coloana (acesta este din punct de
vedere al timpului, timpul de retenţie, tR). Modelul curbei este Gaussian,
iar localizările parametrilor L-l şi L + l sunt indicate prin linie punctată
verticală.
  Înălţimea talerului poate fi
 De notat faptul că L este dat
în centimetrii, iar varianţa, 2, este
explicitată în centimetrii pătraţi; H
reprezintă o distanţă lineară,
exprimată în centimetrii (ecuaţia
din slide-ul anterior).
gândită ca o porţiune de
coloană, situată la capătul
terminal care conţine fracţia de
analit situată între L-l şi L.
Cum aria, în domeniul normal
de eroare a curbei este limitată
de ±, fiind de aproximativ
68% din aria totală, înălţimea
talerului prin definiţie conţine
aproximativ 34% din analit.
 Evaluarea experimentală a lui H şi N
Figura alăturată reprezintă
o cromatogramă obișnuită în
funcţie de timp. Varianţa peak-ului
de solut poate fi obţinută printr-un
procedeu grafic simplu, şi are ca
unitate de măsură secunde la pătrat,
fiind în mod uzual notată cu 2,
pentru a o distinge de 2, care are ca
unitate de măsură centimetrii pătraţi.
Cele două deviaţii standard,  şi 
sunt legate prin relaţia:

unde L/tR reprezintă viteza lineară medie a

solutului, exprimată în centimetrii pe
secundă
Determinarea deviaţiei standard, ,
din peak-ul cromatografic: W = 4.

N = L/H (1.12)
 Figura ilustrează modul simplu de
aproximare al lui  şi  dintr-o
cromatogramă obţinută experimental.
Tangentele punctelor de inflexiune de pe
cele două părţi ale peak-ului
cromatografic sunt prelungite până la
intersectarea lor şi se formează astfel un
triunghi cu baza pe axa timpului a
cromatogramei. Aria acestui triunghi
reprezintă aproximativ 96% din aria
totală a peak-ului.
În evaluarea statistică, se consideră că aproximativ
96% din aria peak-ului Gaussian este inclusă în interiorul
suprafeţei cu o aproximaţie de plus sau minus două deviaţii
standard (±2) din valoarea sa maximă. Astfel, intercepţiile
arătate în figură se manifestă la aproximativ ±2 din
maximum, iar W = 4, unde W este mărimea bazei
triunghiului. Substituind această relaţie în ecuaţia 1.14 şi
rearanjând termenii, rezultă:

Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie

standard () în ecuaţia înălţimii talerului
(ecuaţia 1.13 ) conduce la:
 formula de calcul al numărului
de talere teoretice, N:
Prin substituţia formulei 1.16 în formula 1.12 urmată de rearanjarea termenilor,
se obţine formula de calcul al numărului de talere teoretice, N:

N = L/H (1.12)

În continuare, N
poate fi calculat din
măsurarea, la două
momente de timp, tR şi W;
iar pentru a obţine H,
lungimea coloanei
împachetate trebuie să fie
de asemenea cunoscută.
 O altă metodă de aproximare a lui N, şi care este
considerată de către unii practicieni mai sigură,
necesită determinarea a W1/2 (jumătate din lăţimea
bazei peak-ului), Iar numărul de talere este dat de
formula:

Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt general

utilizate în literatură şi în caracterizarea unor coloane
produse de către firmele de specialitate, ca măsură a
performanţei acestora. Din cauza faptului că aceşti
parametrii sunt semnificativi în compararea a două coloane,
este esenţial ca ei să fie determinaţi pentru acelaşi compus.
VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZĂ ÎMPRĂŞTIEREA ZONEI
CROMATOGRAFICE

împrăştierea zonei cromatografice este consecinţa unei rate finite

de procese de transfer de masă care se produc în timpul migrării
solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre
aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor variabile
experimentale, care permit astfel creşterea calităţii separării.

Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.
 EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI
MOBILE
Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienţei coloanei
depinde în mod clar de lungimea timpului în care faza mobilă este
în contact cu faza staţionară, care, la rândul ei, este depinde de
viteza de curgere a fazei mobile. Din această cauză, studiile
referitoare la eficienţa unor coloane sunt în general axate pe
determinarea lui H ca funcţie de viteza fazei mobile, u. Aceste date
sunt exemplificate de cele două curbe din figura următoare, una
caracterizând cromatografia de lichide, în timp ce a doua este
reprezentativă cromatografiei de gaze.
Ambele curbe prezintă un minim al înălţimii talerului teoretic, H
(ceea ce semnifică o eficienţă maximă) la viteze mici de curgere.
Această valoare minimă din cromatografia lichidă se manifestă în
general la viteze de curgere care sunt asemănătoare celei de
cromatografie de gaze şi deseori sunt atât de mici încât nu sunt
sesizabile în condiţiile normale de operare.
Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra înălţimii
talerului teoretic în cazul
(a) cromatografiei de lichide şi (b) gaz cromatografiei.
 Teoria vitezei de împrăştiere a zonei cromatografice
descrie cu acurateţe şi predicţionează forma diagramei H
în funcţie de u, grafic denumit adesea diagrama van
Deemter după numele descoperitorului ei. După cum se
observă în figura alăturată, vitezele de curgere pentru
cromatografia lichidă sunt semnificativ mai mici decât
cele utilizate în cazul celei gazoase.
Din această cauză, separările în gaz cromatografie
sunt mai rapide decât cele de cromatografie lichidă. Mai
mult, după cum arată figura, înălţimea talerului teoretic a
unei coloane de cromatografie lichidă are un alt ordin de
magnitudine fiind mult mai mică faţă de cel întâlnit în
cazul coloanelor utilizate în cromatografia de gaze. Din
această cauză, nu este practic a se utiliza coloane de
cromatografie lichidă care sunt mai lungi de 25-50 cm
(datorată presiunii picăturilor), în timp ce coloanele de
gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi.
În consecinţă, numărul total de talere şi astfel
eficienţa totală a coloanei sunt în general superioare în
cazul coloanelor de gaz cromatografie. În acest fel, o
primă comparaţie între gaz cromatografie şi cea lichidă
arată că prima metodă este capabilă de separări mai
rapide şi de mai mare eficienţă.
 RELAŢIA DINTRE ÎNĂLŢIMEA TALERULUI ŞI VARIABILELE
COLOANEI

• În cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumărate studii

teoretice şi experimentale având ca scop dezvoltarea relaţiilor
cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate în tabel,
asupra înălţimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel
elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaţia dintre
înălţimea talerului şi parametrii variabili ai coloanei care, aplicate
practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele
nu a rezolvat în totalitate şi nu au putut să explice interacţiile fizice
complexe care conduc la lăţirea zonei cromatografice. O serie dintre
aceste teorii, cu toată imperfecţiunile lor au fost des utilizate şi au
condus la creşterea performanţei coloanelor cromatografice.
• O astfel aproximare matematică a comportamentului coloanelor
cromatografice este ecuaţia van Deemter, care poate fi scrisă în
forma:
H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS + CM)u (1. 19)
• unde H este înălţimea talerului dată în centimetrii, u este viteza lineară a fazei
mobile dată în centimetrii pe secundă, în timp ce A, B, şi C sunt coeficienţi referitori
la fenomenele de curgere pe multiple căi, difuzie longitudinală şi transfer de masă
între faze. După cum se observă în ecuaţia 1.19, coeficientul C poate fi desfăcut în
doi coeficienţi: unul (CS), în relaţie cu faza staţionară, iar celălalt, (CM), relativ la
faza mobilă.
• Studii teoretice ulterioare au arătat că ecuaţia van Deemter este destul de exactă
în explicarea eficienţei coloanei cromatografice. Ecuaţia van Deemter conţine
termeni direct şi invers proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de viteza
fazei mobile.
 TERMENUL (A)
Împrăştierea zonei se manifestă
în parte datorită multitudinii de căi de
curgere pe care moleculele (sau ionii)
le pot găsi şi urma prin coloana
împachetată. După cum se observă
în figura alăturată, lungimea acestor
căi pot diferi semnificativ, astfel,
timpul de rezidenţă în coloană pentru
moleculele aceleaşi specii este de
asemenea variabil. Moleculele de
solut pot astfel atinge capătul colanei
într-un interval de timp care conduce
la împrăştierea zonei. Acest efect,
denumit în acelaşi timp difuzie în
vârtej este direct proporţional cu
diametrul particulelor cu care se
împachetează coloana Modalitatea de eluţie a două molecule printr-o
cromatografică şi este prezentat în coloană cromatografică.
Se poate nota că distanţa parcursă de molecula 2 este
coloana a treia din tabelul de mai mai mare decât cea parcursă de către molecula 1.
sus. Astfel, molecula 2 va ajunge la punctul B mai târziu
decât molecula 1.
 Împrăştierea prin curgere pe canale multiple poate fi
parţial compensată de difuziunea ordinară, care rezultă în
condiţiile în care moleculele sunt transferate printr-un curent
ce urmează o cale sau alta. Dacă viteza de curgere este
foarte mică, un număr mare de asemenea transferuri se
realizează iar fiecare moleculă în mişcarea sa în josul
coloanei urmează o altă cale de curgere, pierzând timpi
diferiţi pe fiecare direcţie de curgere.
Drept consecinţă, viteza cu care fiecare dintre molecule
se mişcă în josul coloanei tinde sa se apropie de medie. Se
poate spune că, la viteze mici ale fazei mobile moleculele nu
sunt semnificativ dispersate prin natura căilor multiple a
împachetării.

La viteze moderate sau mari, totuşi, nu este timp suficient

necesar pentru ca difuzia medie sa să realizeze iar împrăştierea
zonei se manifestă datorită lungimilor diferite ale căilor de curgere.
 TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINALĂ (B/u)

Difuzia longitudinală în cromatografia pe coloană este un proces de

împrăştiere a benzii în care soluţii difuzează dintr-un centru de concentrare spre
zone mai diluate, în faţa şi în spatele zonei cromatografice, unde se manifestă în
sensul şi în contra direcţiei de curgere a fazei mobile. După cum se observă în a
doua ecuaţie din tabelul 1.3, termenul de difuzie longitudinală este direct
proporţional cu coeficientul fazei mobile DM, constantă egală cu viteza de migrare
sub un gradient egal cu o unitate. Constanta  este denumită factor obstructiv fiind
în relaţie cu împiedicarea difuziei longitudinale de către modul de împachetare al
coloanei. Astfel, în cazul coloanelor împachetate valoarea aceste constante este de
aproximativ 0,6 în timp ce pentru coloane neîmpachetate valoarea sa este egală cu
unitatea.
Contribuţia difuziei longitudinale este invers proporţională cu viteza fazei
mobile. Această relaţie nu este surprinzătoare dacă avem în vedere că analitul este
în coloană pentru o perioadă mai mică la viteze de curgere înalte. În cazul unor
viteze mari de curgere, difuzia de la centru bandei spre margini se manifestă mai
redus cu cât timpul de staţionare este mai mic. Pantele negative la viteze de curgere
scăzute prezentate în cele două grafice din figura alăturată şi sunt consecinţe ale
difuziei longitudinale. Se poate nota că efectul este mai puţin pronunţat în
cromatografia de lichide din cauza faptului că aceşti coeficienţi de difuzie în lichide
au ordine de magnitudine mai mici decât cei găsiţi în cazul gazelor. De fapt, pentru
cele mai multe lichide, factorul B/u se apropie de zero în relaţie cu ceilalţi termeni
din ecuaţia 1.19. Astfel, minimul arătat în figura alăturată nu este uneori observat.
 COEFICIENŢII DE TRANSFER DE MASĂ (CS şi CM).

Necesitatea celor doi coeficienţi de transfer de masă CS şi CM din ecuaţia 1.19 apare
datorită faptului că echilibrul dintre fazele mobilă şi staţionară se stabileşte deosebit de lent
în coloana cromatografică deoarece ea operează întotdeauna în condiţii de neechilibru. În
consecinţă, moleculele de analit aflate în partea frontală a benzii cromatografice sunt
preluate în faţă, înainte de a avea timp pentru a se echilibra în faza staţionară şi astfel să fie
reţinute de această fază. În mod similar echilibrul nu se stabileşte la marginea situată la
trena benzii iar moleculele de analit sunt părăsite îndărătul fazei staţionare, datorită mişcării
rapide a fazei mobile.
Împrăştierea benzii din cauza efectelor de transfer de masa se manifestă din cauza
faptului că o multitudine de curenţi de curgere ai fazei mobile din coloană şi stratul care
înconjoară faza staţionară au dimensiuni finite. În consecinţă, este necesar un timp pentru ca
moleculele de solut aflate la interfaţă să difuzeze dintr-o fază în interiorul celelalte faze.
Acest timp „de lag” rezultă din persistenţa condiţiilor de neechilibru de-a lungul coloanei
cromatografice. De altfel, dacă vitezele de transfer de masă dintre cele două faze ar fi
infinite, fenomenul de împrăştiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.
Se poate nota că extensia benzii cromatografice produsă atât de împrăştierea
longitudinală cât şi de transferul de masă depinde de viteza de difuzie a moleculelor de
analitul în timp ce direcţia difuziei în cele două cazuri este diferită. Împrăştierea longitudinală
apare din tendinţa moleculelor de a se îndrepta într-o direcţie paralelă curgerii, în timp ce
împrăştierea datorată transferului de masă se manifestă din tendinţa moleculelor de a difuza
într-un plan perpendicular cu direcţia de curgere. Drept consecinţă, gradul de împrăştiere
longitudinală este în relaţie inversă cu viteza de curgere. Pentru împrăştierea datorată
transferului de masă, din contră, cu cât faza mobilă se mişcă mai repede, cu atât timpul
necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel, după cum arată ultimii doi termeni ai
ecuaţiei 1.19, efectul transferului de masă asupra înălţimii talerului este direct proporţional
cu viteza lineară, u, de mişcare a fazei mobile.
 •TERMENUL DE TRANSFER DE MASĂ ÎN FAZA STAŢIONARĂ (CSU).

Ecuaţia a treia din tabelul 1.3, arată că în condiţiile în care faza staţionară este un lichid imobilizat,
coeficientul de transfer de masă este proporţional cu o funcţie complexă, fs(k') a factorului de retenţie k', este
direct proporţională cu pătratul grosimii filmului de pe particulele suport df şi este invers proporţională cu
coeficientul de difuzie, DS a solutului în film. Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin
care aceşti factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la interfaţă sunt
transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea filmelor, moleculele trebuie să traverseze în medie
o distanţă mai mare sau mai mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de masă şi o creştere a înălţimii
talerului.
 Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin care aceşti
factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la
interfaţă sunt transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea
filmelor, moleculele trebuie să traverseze în medie o distanţă mai mare sau mai
mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor
traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de
masă şi o creştere a înălţimii talerului.

Termenul de transfer de masă în faza mobilă (CMu).

După cum arată ecuaţia a patra din tabelul 1.3,

coeficientul de transfer din faza mobilă CM este o
funcţie complexă, f(k') a factorilor de retenţie k', fiind
proporţional cu pătratul diametrului particulelor din
coloana împachetată dp şi invers proporţional cu
coeficientul de difuzie din faza mobilă, DM.
 EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAŢIEI
VAN DEEMTER

În figura alăturată este înfăţişat modul de

reprezentare a ecuaţiei van Deemter în cazul unui
set de date experimentale. În acest experiment,
analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de
benzil aflat într-o soluţie de hexan, care conţine
acetat de etil. Punctele situate pe curba de
deasupra reprezintă valorile experimentale în timp
ce curba cu linie continuă este reprezentarea
grafică a ecuaţiei van Deemter.
Diagrama van Deemter pentru o coloană de
cromatografie lichidă, împachetată. Punctele de
pe curba superioară sunt date experimentale.
Contribuţiile diverşilor termeni de viteze sunt
arătaţi pe curbele situate mai jos: A, efectul
datorat căilor multicanal de curgere; B/u,
difuzia longitudinală; Cu, transferul de masă
dintre cele două faze.
Curbele de sub această reprezentare arată contribuţia
efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinală şi
efectele combinate ale transferului de masă.
 METODE DE REDUCERE A ÎMPRĂŞTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana şi

diametrul coloanei reprezintă două variabile
importante controlabile care afectează eficienţa
unei coloane cromatografice. Efectul diametrului
particulelor este demonstrat prin datele
experimentale prezentate în figura alăturată în
timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat
diametrului coloanei, în ultimii ani au fost introduse
în practica cromatografică coloane din ce în ce mai
înguste.
În condiţiile în care faza mobilă este gazoasă,
viteza de difuziune laterală poate fi redusă
apreciabil prin scăderea temperaturii şi astfel a
coeficientului de difuzie DM. În consecinţă,
scăderea înălţimii talerului este dependentă de
temperaturi joase. Acest efect este în general
nesemnificativ în cazul cromatografiei lichide din
cauza faptului că difuzia este lentă, astfel că
La fazele staţionare lichide, grosimea stratului de
termenul de difuzie longitudinală are un efect mic lichid adsorbit poate fi minimalizată deoarece CS din
asupra înălţimii talerului. ecuaţia 1.19 este proporţional cu pătratul acestei
variabile, df (ecuaţia a treia din tabelul 1.3).
 OPTIMIZAREA PERFORMANŢELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloană cromatografică este optimizată prin variaţia experimentală a

condiţiilor, până când componentele amestecului sunt separate în mod clar,
într-un timp minim. Optimizarea experimentelor are ca scop (1) reducerea
împrăştierii zonei cromatografice ori (2) alterarea vitezelor de migrare ale
componentelor din amestecul de separat. După cum s-a arătat, împrăştierea
zonei este crescută prin aceleaşi variabile cinetice care conduc la creşterea
înălţimii talerelor coloanei cromatografice. Pe de altă parte, vitezele de
migrare, pot fi modificate prin schimbarea acelor variabile care afectează
factorii de retenţie şi selectivitate ai soluţilor.
 1. REZOLUŢIA COLOANEI

Rezoluţia, RS a unei coloane

cromatografice conduce la
măsurarea cantitativă a abilităţii
sale în separarea a doi analiţi.
Semnificaţia acestui termen este
ilustrat în figura alăturată, care
prezintă cromatogramele a două
specii moleculare, A şi B, pe trei
coloane ce posedă rezoluţii
diferite. Rezoluţia unei coloane
este definită ca:
o rezoluţie de 1,5 conduce la o
separare practic completă a
celor două componente, în timp
ce o rezoluţie de 0,75 nu. La o
rezoluţie de 1, zona A conţine
aproximativ 4% din specia B,
iar zona B conţine o cantitate
similară din solutul A. La o
rezoluţie de 1,5, suprapunerea
este de aproximativ 0,3%.

Rezoluţia pentru o fază

staţionară dată poate fi crescută
prin lungirea coloanei, astfel
crescând numărul de talere.
Consecinţa nefavorabilă la
adăugarea de talere o
reprezintă creşterea timpului
necesar separării
cromatografice.
 Efectul factorilor de retenţie şi selectivitate asupra rezoluţiei cromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaţie matematică între rezoluţia unei coloane şi
factorii de retenţie, k’A şi k’B, a factorului de selectivitate , şi numărul de talere, N,
care alcătuiesc o coloană cromatografică în cazul a doi soluţi.
Considerând că cei doi soluţi, A şi B au timpi de retenţie apropiaţi unul de celălalt,
se poate aproxima că:
WA = WB  W

ecuaţia 1.20 poate fi

scrisă sub forma:

Ecuaţia 1.17 permite

exprimarea lui W în termeni de
(tR)B şi N, care pot astfel
substituiţi în ecuaţia anterioară,
rezultând:
 Substituind ecuaţia 1.8 şi rearanjând-o, se obţine exprimarea lui RS în termeni de factori de
retenţie pentru A şi B, după cum urmează:

În continuare prin eliminarea k’A din această ecuaţie prin

substituţia ecuaţiei 1.10, rezultă:

Adesea este necesar a se calcula numărul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluţie dorită. O exprimare a acestei cantităţi este obţinută prin
rearanjarea ecuaţiei 1.21 ceea ce conduce la:
 Formele simplificate ale ecuaţiilor 1.21 şi 1.22 sunt uneori întâlnite în
condiţiile în care acestea se aplică unor perechi de soluţi ale căror constante
de distribuţie sunt aproape similare

unde k' reprezintă media dintre k‟A şi k‟B.

 Efectul rezoluţiei asupra timpului de retenţie
Înainte de a considera în detaliu semnificaţia ecuaţiilor derivate mai sus, este util să
se dezvolte o ecuaţie care să prezinte caracteristicile de performanţă a unei coloane,
adică timpul necesar pentru o completă separare a solutului A de solutul B.
În mod clar, ceea ce este dorit în cromatografie este o rezoluţie posibilă înaltă în cel
mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste două proprietăţi nu pot fi maximalizate în
aceleaşi condiţii, motiv pentru care totdeauna trebuie găsit un compromis.
Timpul pentru desăvârşirea separării este determnat de viteza vB
a solutului care se mişcă mai lent este dată de ecuaţia 2.
Aceasta este:

Combinând această expresie cu ecuaţiile

1.6 şi 1.12, rezultă, după rearanjare:

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peak-

ul B la capătul coloanei în condiţiile în care viteza
fazei mobile este u.
În cazul în care ecuaţia de mai sus este
combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii,
rezultă:
Variabilele care afectează performanţele unei coloane cromatografice
Ecuaţiile alăturate sunt semnificative deoarece
servesc drept ghid în alegerea condiţiilor care
sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul
cromatografiei pentru a atinge într-un timp
determinat scopul propus cu rezultate clare.

În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare dorită trebuie avut în vedere că

parametrii fundamentali, , k' şi N (sau H) pot fi ajustaţi mai mult sau mai puţin
independent. Astfel, parametrii  şi k' pot fi variaţi mai simplu prin varierea temperaturii
sau a compoziţiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de împachetare a coloanei reprezintă
o modalitate mai puţin convenabilă. După cum s-a arătat, este posibil a se modifica N prin
schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a
fazei mobile, a mărimii dimensiunilor particulelor de împachetare, a vâscozităţii fazei
mobile (prin modificarea DM sau DS), şi a grosimii filmului de lichid adsorbit conţinut în
faza staţionară .

Variaţia în numărul de talere, N

O cale evidentă de creştere a rezoluţiei o reprezintă creşterea numărului de talere din

coloană (ecuaţia 1.21). Totuși urmând această cale, metoda este mai puţin economică din
punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea în afara cazului în care
creşterea în N este realizată mai degrabă prin reducerea în H decât prin lungirea coloanei.
 Variaţia în înălţimea talerului, H
O îmbunătăţire semnificativă a rezoluţiei poate fi realizată fără nici un cost de timp suplimentar
dacă înălţimea talerului se reduce.
Se poate nota că scăderea mărimii particulelor de împachetare a coloanei conduce la o
îmbunătăţire marcantă a lui H.
Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea înălţimii talerului poate fi de
asemenea realizată prin reducerea vâscozităţii solventului, mărindu-se astfel coeficientul fazei
mobile.
Variaţia în factorul de retenţie
Adesea, o separare poate fi îmbunătăţită semnificativ prin manipularea factorului de retenţie,
k‟B. Creşterea lui k‟B creşte în general rezoluţia (crescând însă timpul de eluţie). Pentru a determina
domeniul optim al valorilor pentru k‟B, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și
în forma:

unde Q şi Q' conţin restul de termeni ai celor două ecuaţii.

Figura alăturată este o
reprezentare grafică RS/Q ori
(tR)B/Q' în funcţie de k’B,
considerând că Q şi Q' rămân
aproximativ constante. Se
vede clar că valorile lui k’B
mai mari de 10 nu trebuie
alese deoarece ele conduc la
o mică creştere în rezoluţie
dar cu o creştere marcantă a
timpului necesar separării.
Valoarea minimă a timpului
de eluţie se manifestă la o
valoare a k’B de aproximativ
2. Astfel, în multe cazuri,
valoarea optimă a k’B se
stabileşte luând în calcul atât
rezoluţia cât şi timpul necesar
separării, adică într-un Efectul factorului de retenție k’B asupra rezoluţiei
domeniu cuprins între 1 până RS şi a timpului de eluţie (tR)B. Se consideră că Q
la 5. şi Q’ rămân constante la variaţia factorului k’B.
 În mod uzual, cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei de separare o reprezintă
optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creşterea
temperaturii.
Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziţiei solventului permite deseori
manipularea lui k' obţinându-se astfel separări superioare. Efectele dramatice produse
prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat în figura de mai jos.

Efectul variaţiei solventului

asupra separării cromatografice.
Analiţi: (1) 9,10-antraquinonă; (2)
2-metil-9,10-antraquinonă; (3) 2-
etil-9,10-antraquinonă; (4) 1,4-
dimetil-9,10-antraquinonă; (5) 2-
t-butil-9,10-antraquinonă.

Se observă că o mică modificare a rapoartelor metanol/apă

conduce de la separări cromatografice nesatisfăcătoare (a şi b) la
separări unde fiecare peak al oricărui component este bine separat
(c şi d). În multe scopuri, Cromatograma arătată în (c) pare a fi cea
mai bună după cum arată raportul dintre rezoluţia adecvată în
intervalul de timp.
 Variaţia în factorul de selectivitate

În condiţiile în care  atinge unitatea, optimizarea lui k' şi creşterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare
satisfăcătoare a doi soluţi, într-un timp rezonabil. Sub aceste circumstanţe, trebuie identificată o posibilitate de creştere a
factorului de selectivitate , cu menţinerea lui k' într-un domeniu optim de 1-10. În acest context sunt posibile o serie de
opţiuni de lucru. Astfel, scăderea oportunităţii în perspectiva şi avantajul (comodităţii) aceste opţiuni includ: (1) schimbarea
compoziţiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea
compoziţiei fazei staţionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice.
Un exemplu de utilizare a opţiunii (1) a fost raportat în cazul separării anisolului (C6H5OCH3), de benzen. Cu o fază
mobilă conţinând un amestec metanol:apă 50%, k' pentru cei doi soluţi a fost raportată de 4,5 şi respectiv 4,7, în timp ce  a
fost egal cu numai 1,04. Înlocuirea fazei apoase cu una care ca conţinut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 şi 4,7 şi la o
valoare  de 1,20. Dacă suprapunerea celor două peak-uri a fost semnificativă în primul caz, în cel de al doilea caz
suprapunerea a fost neglijabilă.
Pentru separări care implică acizi sau baze ionizabile, modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la
manipularea valorilor  fără a schimbare majoră în k' ceea ce conduce la separări mai eficiente.
O metodă mai puţin convenabilă dar deseori foarte eficientă în creşterea  simultan cu o menţinere aproape
constantă a valorilor lui k' în domeniul optim este cea de alterare a compoziţiei chimice a fazei staţionare. Pentru
aceasta, cele mai multe laboratoare care realizează separări cromatografice frecvente posedă mai multe coloane care pot fi
interschimbabile cu un minim de efort.
O creştere a temperaturii generează deseori o creştere în k' dar această operaţiune are un efect mic asupra valorilor
lui  în cazul cromatografiei lichid-lichid ori cromatografiei lichid-solid. În opoziţie, în cazul cromatografiei de schimb
ionic, efectul temperaturii poate fi suficientă în cazul explorării acestei opţiuni, înainte de schimbarea împachetării coloanei.
În fine, o altă metodă de creştere a rezoluţiei este încorporarea în faza staţionară a unor specii care complexează sau
interacţionează cu unul sau mai mulţi componenţi aflaţi în proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opţiuni o
reprezintă impregnarea cu săruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o îmbunătăţire a separării olefinelor ca o
consecinţă a formării unor complexe între ionii de argint şi compuşii organici nesaturaţi.
 Trena cromatografică

Formarea trenelor cromatografice reprezintă o problemă reală şi inevitabilă la majoritatea separărilor în

cromatografia lichidă. Cercetătorii din domeniu au depus eforturi în dezvoltarea unor noi materiale (suporturi
cromatografice) şi deşi acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut elimina acest fenomen. Procesul de
formare a trenei cromatografice poate cauza atât probleme cantitative cât şi calitative în procedurile de
cromatografie lichidă, fiind importantă o monitorizare a formării lor astfel încât să nu se compromită rezultatul
analizei.
Analizând în detaliu o cromatogramă se poate observa că aproape toate peak-urile cromatografice au o
oarecare trenă mai mult sau mai puţin lungă. Deşi multe dintre coloanele de cromatografie lichidă actuale sunt
mai puţin problematice decât predecesoarele lor, totuşi aceasta problemă nu a fost încă eliminată.
Se consideră că un peak are trena sau ca este asimetric atunci când forma sa deviază de la cea ideala,
Gaussiană. A doua jumătate eluată a peak-ului este mai largă decât prima, iar lăţimea sa tinde sa se expandeze
spre baza. Deşi pot apărea cozi ale peak-urilor si in jumătatea frontala a acestora, acestea sunt totuşi rare in
comparaţie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot influenta calitatea separării este bine ca panta trenei sa
fie cuantificata. Exista doua mecanisme de măsurare universale a peak-urilor. Lucrătorii din industria farmaceutica
folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea Tail factor), conform formulei 1.26.

unde a si b reprezintă lăţimea jumătăţii frontale si respectiv jumătăţii

posterioare măsurate la 5% din înălţimea peak-ului (figura alăturată).
Majoritatea celorlalţi practicieni folosesc factorul de asimetrie (As).

unde “a” si “b” sunt măsurate la 10% din înălţimea peak-ului cromatografic din figura alăturată.
 Pentru valori mai mici de 2, As şi USP Tf sunt aproximativ aceleaşi, precum se poate
observa şi in tabelul de mai jos. ce reprezintă măsurătorile factorului de asimetrie şi ale
factorului de trenare USP pentru acelaşi peak, în cazul figurii de mai jos.

Măsurătorile factorului de asimetrie (As)

şi ale factorului de trenare USP (Tf) pentru
acelaşi peak.

Valoarea măsurată
Peak-ul din figura alăturată
As Tf

1,0 1,0 1,0

1,2 1,3 1,2

1,5 1,7 1,4

2,0 2,5 1,9

3,0 3,8 2,9 Exemple de peak-uri asimetrice şi

4,0 5,5 3,5 factorul de asimetrie calculat pentru
fiecare.

În condiţiile în care coloana cromatografică este nouă, majoritatea

producătorilor prezintă criterii de trenare (factorul As) cuprinse între
valorile 0,9 (puţin frontal) şi 1,2 (puţin trenat). Majoritatea utilizatorilor
care folosesc probe reale încearcă să obţină un factor de asimetrie, nu
mai mare de 1,5- 2. În general, când As este mai mare decât 2, există
probleme de separare, şi se cercetează cauza acestora.
 Figura alăturată ne furnizează o serie de indicii asupra
potenţialelor probleme create de trena peak-urilor, prin comparaţia
unui peak ce are As = 1 cu un altul ce posedă As = 4. Astfel,
comparând aria peak-urilor, se observă o diferenţă elocventă; deşi ea
este aceeaşi înălţimea peak-ului cu As = 4 este de trei ori mai mică
comparativ cu înălţimea primului peak. În condiţiile analizelor de urme,
înălţimea peak-ului devine un factor critic în determinarea limitei
minime de cuantificare, iar trenarea peak-ului conduce la rezultate clar
inferioare.
Formarea trenelor este de asemenea problematică în cazul in
care peak-urile minore se ascund în cele majore. Acest fenomen este
nedorit în condiţiile analizei unor metaboliţi ori în identificarea unor
impurităţi.
Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de
rutină, trebuie de obicei să asigure o bună rezoluţie a liniei de bază a
tuturor peak-urilor iar timpul de rulare să fie cât mai mic posibil. Figura
alăturată arată că rezoluţia liniei de baza a peak-urilor cu trenă
necesită un timp mai lung de rulare comparativ cu peak-urile ce nu au
trenă sau care au o trenă scurtă. Aşadar, peak-urile cu trenă nu doar
reduc calitatea cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea
de a cuantifica componente prezente în probă.
Cauzele apariţiei trenei cromatografice se datorează mai ales
faptului existenţei mai multor mecanisme de separare, unul dintre
acestea fiind supra-implicat. O serie dintre practicieni au tendinţa de a
considera separările în fază inversă, pe coloane C18, de exemplu
drept procese pure de retenţie hidrofobă. Această consideraţie poate fi
adevărată dacă faza staţionară ar fi constituită numai din grupări C18.
totuşi, aproximativ jumătate din suprafaţa de silice este nelegată ceea
ce conduce la permisiunea de expunere a grupărilor silanol (Si–OH)
care pot interacţiona cu proba.
 Particulele de silice care formează suportul solid sunt realizate din polimer de siliciu
şi oxigen. Ca şi carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura internă a lui cuprinde patru
atomi de oxigen ataşaţi la fiecare atom de siliciu în structura polimerului tridimensional. La
suprafaţă, polimerul se termină cu grupări de silanol Figura de mai jos prezintă diferitele
configuraţii posibile ale grupărilor silanolice.

Interacţii posibile la suprafaţa suportului de silice

Practicienii descriu în mod curent suprafaţa ca posedând grupări libere silanolice (a)
dar sunt de altfel prezenţi atomi de siliciu cu două grupări hidroxil în configuraţie geminală
(b). Dacă grupările silanolice sunt poziţionate una, alături de alta, se pot realiza legături de
hidrogen cu o grupare adiacentă (c). Grupările libere de silanol sunt mai acide decât
grupările geminale ori asociate ele interacţionând mai puternic cu soluţi bazici având ca
rezultat formarea unei trene deseori asociată cu separarea unor soluţi bazici. În alte cazuri,
urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel (d). Ionii
metalici pot acţiona ca situsuri schimbătoare de ioni sau, când grupările silanol libere sunt
adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie şi mai acid (e).
 In trecut, coloanele împachetate cu silice tip A conţineau toate aceste forme de silanol
prezentate în figură, totuşi, în ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obţinere de suporturi de
silice de puritate înaltă (silicea de tip B), ce conţine un număr redus de grupări silanol libere la
suprafaţă şi sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puţin acide. Astfel de coloane ce conţin
silice de tip B au o tendinţă mult mai mică de a genera peak-uri cu trenă.
Reducerea formării trenelor în coloane de tip.A, înseamnă de obicei modificarea fazei mobile
pentru a include componente ce concură la suprimarea trenei. Adăugarea de trietilamină în faza
mobilă reprezintă o metodă curentă în reducerea formării trenelor cromatografice. Folosită la o
concentraţie de 20mM sau mai mare în faza mobilă, trietilamina poate reduce semnificativ trenarea
picurilor în coloane de tip A. În cazul utilizării de silice de tip B trenarea peak-urilor reprezintă o
problemă mult mai rară. În condiţiile utilizării exclusiv de coloane de tip B, rareori se adaugă
trietilamină la faza mobilă. Ca regulă generală, pH-ul scăzut al fazei mobile (pH < 3) acţionează de
asemenea ca un supresor al ionizării silanolului, care mai departe conduce la reducerea formării
trenelor cromatografice.
 Problema generală a eluţiei

Figura alăturată ilustrează o

cromatogramă ipotetică a unui amestec de
şase componenţi separaţi teoretic în trei
perechi de componente care au constante de
distribuţie şi factori de retenţie net diferiţi. În
cromatograma (a), condiţiile au fost ajustate
astfel încât factorii de retenţie pentru
componentele 1 şi 2 (k'1 şi k'2 ) sunt în
domeniul optim, de cuprins între 2 şi 5.
Factorii corespunzători pentru ai celorlalte
componente sunt, totuşi, departe de valorile
optime. Astfel, pentru peak-urile 5 şi 6 care
apar numai după un interval de timp extrem
de mare şi de asemenea care sunt difuzate,
este dificil de a fi identificate cu certitudine.
După cum se observă în cromatograma (b), schimbarea condiţiilor pentru optimizarea
separării componentelor 5 şi 6, îngrămădesc peak-urile primelor patru componente în zone
cu o rezoluţie nesatisfăcătoare. Totuşi, în acest caz timpul de eluţie este ideal.
În cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiţii în care valorile lui k'
pentru componentele 3 şi 4 au valori optime. Separarea celorlalte două perechi, din nou, nu
este complet satisfăcătoare.
 Fenomenul ilustrat în figură este întâlnit
aproape permanent, din acest motiv s-a denumit
problema generală a eluţiei. O soluţie comună în
rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a
valorilor ale k' după cum a fost prezentat mai înainte.

Aceste modificări pot fi realizate într-o manieră în trepte ori continuă. Astfel, pentru
amestecul prezentat în figură, condiţiile de la început pot fi cele care conduc la
cromatograma (a). Imediat după eluţia componentelor 1 şi 2, este necesară schimbarea
condiţiilor astfel încât să se ajungă la cele optime pentru separarea compuşilor 3 şi 4 (după
cum se observă în cromatograma c). Odată cu apariţia peak-urilor acestor compuşi, eluţia
poate fi realizată în condiţiile utilizate în cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de
proceduri conduc la rezolvarea satisfăcătoare a peak-urilor tuturor componenţilor din
amestec într-un interval minim de timp.
În cazul cromatografiei lichide, variaţiile în k' sunt produse prin variaţia în compoziţie a
fazei mobile în timpul eluţiei (eluţie în gradient sau programarea solventului).
Pentru gaz cromatografie, creşterea temperaturii (programarea temperaturii) serveşte
la atingerea condiţiilor optime necesare separării.
relaţii de legătură (1)
relaţii de legătură (2)
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI

Cromatografia a reprezentat şi reprezintă o primă metodă de separare intim

legată de specii moleculare înrudite chimic, ce poate fi utilizată în identificări calitative
şi determinări cantitative ale speciilor separate. În continuare vor fi prezentate
caracteristicile generale ale cromatografiei, ca metodă de realizare a unei analize.
Analize calitative
O cromatogramă furnizează numai o singură parte de informaţie cantitativă despre
fiecare specie din probă, adică timpul său de retenţie ori poziţia pe faza staţionară după o
anumită perioadă de eluţie. În plus, datele pot de asemenea să fie derivate din cromatograme
proces implicând faze mobile şi staţionare diferite ori diverse temperaturi de eluţie. Până
acum cantitatea de informaţii oferite de prin cromatografie sunt mici comparativ cu cea
obţinută prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria de masă. În plus, datele spectrale,
lungime de undă sau de frecvenţă pot fi mult mai înalt specifice care pot reprezenta un
omolog al cromatografiei (tR).Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate în sensul că
metodele cromatografice îşi pierd din importanţă în cazul aplicaţiilor calitative.
Într-adevăr, cromatografia este o metodă deseori utilizată în recunoaşterea prezenţei sau absenţei unor componente
din amestecuri care conţin un număr limitat de specii posibile a căror identitate este cunoscută. De exemplu, 30 sau mai mulţi
aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi detectate cu un mare grad de certitudine prin metoda cromatografică. Totuşi pentru
a confirma identitatea este necesară o investigaţie chimică sau spectroscopică a compuşilor izolaţi. Se poate nota că totuşi, o
identificare pozitivă spectroscopică a speciei prezente într-un complex de compuşi ar fi imposibilă fără o separare
cromatografică anterioară. Astfel, cromatografia este deseori o metodă precursoare în analizele spectroscopice calitative.
Este important a se nota însă că o cromatogramă nu poate conduce la o identificare pozitivă a speciilor prezente în
probe, dar poate da indicaţii sigure asupra absenţei unei serii de compuşi din respectivul analit. Astfel dacă proba nu produce
un peak cu un timp de retenţie asemănător unui standard analizat în aceleaşi condiţii se poate spune că acel compus luat în
analiză este absent (sau este prezent la concentraţii sub limita de detecţie a metodei).
 Analize cantitative

Cromatografia îşi datorează în principal dezvoltarea din

ultimii ani, în parte, vitezei sale, simplicităţii şi preţului său
relativ scăzut, aplicabilităţii aproape generalizate ca o metodă
de separare. Nu se poate totuşi afirma că ea va deveni
generală decât în condiţiile în care ar fi utilizată la obţinerea
de informaţii utile cantitative asupra speciilor separate. Este
important totuşi a se discuta despre o serie de aspecte
cantitative care se aplică la toate tipurile de cromatografie.
Cromatografia cantitativă pe coloană se bazează pe
compararea înălţimii sau ariei peak-ului de analit şi prin
compararea acestuia cu unul sau mai multe standarde. În
cazul cromatografiei planare, aria acoperită de speciile
separate serveşte ca şi un parametru analitic. Dacă condiţiile
sunt corect controlate, aceşti parametrii vor varia linear cu
concentraţia.
 Analize bazate pe înălţimea peak-ului

Înălţimea peak-ului cromatografic este obţinută prin măsurarea liniei de

bază pe de o parte şi a perpendicularei peak-ului, coborâtă prin vârf. Acest tip
de măsurare se realizează,într-un timp rezonabil şi cu o precizie de măsurare
bună. Este important a se nota că,totuşi înălţimile peak-urilor sunt invers
proporţionale cu lăţimile lor. Astfel, acurateţea rezultatelor obţinute din
măsurarea înălţimii este obţinută numai dacă nu apar variaţii în condiţiile de
eluţie a coloanei, care să nu altereze lăţimea peak-ului în perioada de eluţie a
probei şi a standardelor. Variabilele care trebuiesc urmărite cu grijă sunt
temperatura coloanei, viteza de curgere a eluentului prin coloană şi viteza de
încărcare (injecţie) a probei. În plus, trebuie avut grijă să se evite a
supraîncărcarea coloanei. Efectul injecţiei probei este în mod particular critic
în cazul primelor peak-uri ale cromatogramei. Injecţia neadecvată a probei
conduce la erorile relative de 5% până la 10%.
 Analize bazate pe aria peak-ului

Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de împrăştiere date de

variabilele menţionate mai sus. Din acest punct de vedere, totuşi, valorile
ariilor sunt variabile analitice mult mai satisfăcătoare comparativ cu înălţimile
peak-urilor. Pe de altă parte, înălţimile peak-urilor sunt mult mai uşor de
măsurat în cazul peak-urilor înguste.
Majoritatea instrumentelor moderne sunt echipate cu integratoare
electronice digitale care permit estimarea cu precizie a ariei peak-ului
cromatografic. Dacă asemenea instrumente nu sunt disponibile, se poate
apela la metoda manuală, metodă simplă care permite o bună estimare a
peak-urilor simetrice. Aceasta implică calcularea ariei prin înmulţirea înălţimii
peak-ului cu valoarea lăţimii determinată la jumătate din înălţimea lui. Alte
metode implică utilizarea unui planimetru sau decuparea peak-ului
cromatografic şi cântărirea lui, determinând astfel greutatea lui în relaţie cu o
arie cunoscută de hârtie de înregistrare. În general, tehnicile de integrare
manuală conduc la erori de 2-5%, pe când integrările digitale sunt de un ordin
de magnitudine mai precise.
 Calibrări şi standarde

Cea mai sigură metodă de analiză cromatografică cantitativă implică prepararea unei
serii de standarde prin diluţia unei soluţii stoc ce posedă o compoziţie aproximativ
asemănătoare cu cea a probei necunoscute. Cromatogramele pentru standarde obţinute
astfel sunt apoi reprezentate în funcţie de concentraţia lor. Curba rezultată care obligatoriu
trece prin origine este utilizată la determinările de concentraţie a compusului care se
dozează. În mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a obţine rezultate cu o mai
mare acurateţe.
Cea mai importantă sursă de erori în analize efectuate prin metoda mai sus
menţionată este dată de incertitudinea legată de volumul probei; uneori, viteza de injecţie,
reprezintă de asemenea un factor de eroare. În mod curent probele sunt mici (de
aproximativ 1 µl), iar incertitudinile legate de injectarea în condiţii reproductive a unui volum
cu o seringă de aceleaşi mărime poate conduce la scăderea cu procente semnificative a
erorilor. Această situaţie este des-întâlnită în cromatografia gaz-lichid, unde proba trebuie
sa fie injectată într-un dispozitiv special încălzit, unde fenomenul de evaporare care apare
la nivelul acului seringii poate fi deosebit de crescut, conducând astfel la variaţii mari ale
volumului injectat. Erorile volumului de probă pot fi reduse, cu probabil 1-2% din medie, prin
utilizarea unei valve rotative.
 Metoda cu standard intern

Precizia cea mai mare în cromatografia cantitativă este obţinută prin utilizarea
standardelor interne deoarece incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate.
În această procedură, se măsoară cu atenţie o substanţă, denumită standard intern,
care este introdusă în fiecare standard sau probă, raportul dintre ariile (ori înălţimea)
peak-urilor analitului şi a standardului intern servind drept parametru analitic. Pentru ca
această metodă sa aibă succes, este ca peak-ul standardului intern să fie bine separat
de peak-urile celorlalte componente din probă (Rs > 1,25); peak-ul standard trebuie, pe
de altă parte, sa apară în apropierea peak-ului analitului. Cu un standard intern adecvat,
se poate creşte precizia faţă de alte metode, utilizate frecvent.

Metoda de normalizare a ariei

O altă abordare care conduce la scăderea incertitudinilor legate de injectarea probei

este metoda de normalizare a ariei. În acest caz, este necesară eluţia completă a tuturor
componentelor probei. În metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate,
după corecţia tuturor acestor arii cu diferenţele dintre răspunsul detectorului la tipurile
diferite de compuşi, în timp de concentraţia analitului este determinată din raportul
acestor arii la aria totală a tuturor peak-urilor.
Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiţiile în aşa fel ca toţi compuşii
din amestec să fie eluaţi din coloană într-o perioadă de timp rezonabilă, motiv pentru
care metoda de normalizare are aplicaţii limitate.
 CROMATOGRAFIA DE
PARTIŢIE
Dintre toate tipurile de procedee cromatografice lichide, cromatografia de partiţie este cea mai
utilizată tehnică de separare. Dacă în trecut cele mai multe aplicaţii se adresau compuşilor neionici,
celor polari cu masă moleculară moderată (de obicei mai mică de 3000) astăzi dezvoltarea unor
metode (procedee de derivatizare ori de tehnicile bazate pe perechi de ioni) au extins separările
prin partiţie şi la compuşi ionici.
Cromatografia de partiţie poate fi subdivizată în cromatografie lichid-lichid şi cromatografie cu
fază legată. Diferenţa între cele două tehnici constau în metoda prin care faza staţionară intră în
interacţie cu particulele suport, împachetate. În cromatografia lichid-lichid, faza lichidă staţionară
este reţinută pe suprafaţa particulelor împachetate prin adsorbţie fizică. În schimb, în cazul
cromatografiei de fază legată, faza staţionară este legată chimic la suprafaţa particulelor de suport.
Primele tipuri de cromatografie de partiţie au fost exclusiv de tip lichid-lichid; acum totuşi metoda cu
fază legată a devenit predominantă datorită multor dezavantaje ale sistemelor lichid-lichid. Unul
dintre aceste dezavantaje îl reprezintă pierderea fazei staţionare prin disoluţia ei î faza mobilă, care
astfel necesită reacoperirea periodică a particulelor suport. În plus, problemele de solubilitate ale
fazei staţionare interzic utilizarea fazei lichide împachetate în cazul eluţiei în gradient.
Cromatografia de partiţie cu
fază legată
Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de
partiţie cu fază legată sunt preparate din silice rigidă ori au o
compoziţie pe bază de silice. Aceste solide sunt formate din particule
uniforme, poroase, cu consistenţă mecanică de gel, cu diametru de 3,
5, ori 10 μm. Suprafaţa acestora este formată din silice total
hidrolizată (proces realizat prin fierberea silicei în HCl, 0,1 M timp de
una-două zile, proces prin care rezultă grupări silanol, chimic
reactive, de forma:
OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si

Structura suprafeţei de silice.

 În mod caracteristic, suprafeţele de silice activată, conţin aproximativ 8
μmoli/m2 de grupări hidroxilice. O structură mult utilizată în cromatografia cu
fază legată o reprezintă siloxanii, compuşi rezultaţi prin reacţia dintre suprafaţa
hidroxilată cu un organoclorosilan, după reacţia:

Modalitatea de sinteză a unui siloxan;

R reprezintă o grupare alchil ori o
grupare alchil-substituită.
Din cauza efectelor sterice suprafaţa acoperită prin silanizare este
limitată la cel mult 4 μmoli/m2 după cum se observă în figura de mai jos.

Structura tridimensională a unui derivat

siloxanic.

Grupările Si-OH nereacţionate conduc din păcate la o polarizare nedorită a

suprafeţei, care are ca efect apariţia trenei peak-ului cromatografic, mai ales în cazul
soluţilor bazici. Scăderea acestui efect se realizează prin dezactivare cu clortrimetilsilan,
care, având o masă moleculară mai mică, se poate lega la grupările libere hidroxilice ale
silanolului.
 TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE ÎN CROMATOGRAFIA CU FAZĂ LEGATĂ

În funcţie de polaritatea relativă a fazelor mobilă şi staţionară, se pot distinge două

tipuri de cromatografii cu fază legată. Primele lucrări de cromatografie lichidă s-au bazat
pe faze staţionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de
silice ori de alumină; în continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori iso-
propil eterul, servesc apoi drept fază mobilă. Fiind raportată prima, această tehnică
cromatografică de partiţie a fost denumită cromatografie cu fază normală. În
cromatografia cu fază inversă, faza staţionară este nepolară, deseori o hidrocarbură, în
timp ce faza mobilă este relativ polară (apă, metanol, acetonitril, etc.).

Relaţiile dintre polaritate şi timpii de

eluţie în cazul cromatografiei cu fază
normală (a, b) şi cea cu fază inversă (c,
d) în cazul a trei componenţi. a)
polaritate scăzută a fazei mobile; b)
polaritate medie fazei mobile; c)
polaritate înaltă a fazei mobile; d)
polaritate medie fazei mobile.
În cromatografia cu fază normală, componentul cel mai puţin polar este eluat
primul, deoarece, în sens relativ, este cel mai solubil în faza mobilă; creşterea
polarităţii fazei mobile va avea ca efect scăderea timpului de eluţie. În opoziţie, în
metoda cu fază inversă, componentul cel mai polar apare primul, iar creşterea
polarităţii fazei mobile creşte timpul de eluţie. Aceste relaţii sunt ilustrate în de mai
sus.
 Suporturile cromatografice cu fază
legată sunt clasificate drept cu fază
inversă dacă structura de suprafaţă a
suportului are un caracter nepolar, şi
drept cu fază normală în condiţiile în
care suportul conţine grupări funcţionale
polare. În cromatografia de înaltă
presiune cel puţin trei sferturi din
Structura chimică a grupărilor organice
experimente se realizează pe coloane
silil prezente în structura fazelor
împachetate cu fază inversă.
staţionare, utilizate în cromatografia
Structura grupărilor organice silil
planară cu fază legată. Simbolurile sunt
ale fazei staţionare diferă prin mărime,
explicitate mai jos.
rigiditate planaritate şi grad de
nesaturare după cum se observă în
figura alăturată.

Acestea includ trimetilsilil (C1), n-octildimetilsilil (C8), n-octadecildimethilsilil

(C18), 2-ciclohexiletildimetilsilil (CHE), 2-(3-ciclohexenl)etildimetilsilil (CHNE),
fenildimetilsilil (Ph), 2-feniletildimetilsilil (PE), 2-(2-naftil)etildimetilsilil (NE) şi 2-(3-
pirenil)etildimetilsilil (PYE). Cele mai comune grupări radicalice care îmbracă
suportul de siloxan este catena C8 (n-octil) ori catena C18 (n-octildecil).
 DEVELOPAREA ÎN CROMATOGRAFIA DE PARTIŢIE

Procesul de eluţie a componentelor probei de pe suportul

cromatografic de către faza mobilă (solvent) este denumit developare.
Această metodă tinde a fi mai complexă în cromatografia lichidă decât în
cea gazoasă deoarece în faza mobilă lichidă componentele
interacţionează atât cu faza staţionară, cât şi cu cea mobilă, în contrast
cu gaz cromatografia unde faza mobilă se comportă ca şi un gaz ideal,
necontribuind în procesul de separare; ea serveşte numai transportului
componentelor probei prin faza staţionară. În acest fel, în gaz-
cromatografie, separările nu sunt semnificativ afectate de către faza
mobilă, indiferent dacă aceasta este reprezentată de heliu, azot, ori
hidrogen. În contrast evident cu fenomenul întâlnit în cazul gaz-
cromatografiei, succesul unei separări prin partiţie lichidă este adesea
profund dependent de compoziţia fazei mobile.
 SELECŢIA COLOANEI ÎN SEPARĂRILE PRIN CROMATOGRAFIE DE PARTIŢIE

Succesul cromatografiei cu fază mobilă interactivă, necesită o balanţă optimă a forţelor

intermoleculare care implică cei trei participanţi activi în procesul de separare: faza mobilă, faza
staţionară şi solutul. Aceste forţe intermoleculare sunt descrise calitativ în termeni de polaritate
relativă a fiecăruia dintre cei trei reactanţi. Polarităţile diverselor grupe funcţionale cresc în
ordinea: hidrocarburi < eteri < esteri < cetone < aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este
cel mai polar compus dintre toţi compuşii care conţin grupările funcţionale prezentate mai
sus.
Deseori, în alegerea unei coloane pentru separări cromatografice de partiţie, polaritatea fazei
staţionare este aproximativ aleasă, în concordanţă cu cea a analitului, în timp ce faza mobilă
aleasă pentru eluţie prezintă o diferenţă considerabilă din punct de vedere al polarităţii. Această
abordare este în general mai de succes decât cea în care polarităţile solutului şi a fazei mobile sunt
alese diferit de faza staţionară. În acest caz, faza staţionară deseori nu poate competiţiona eficient
pentru componentele probei, timpii de retenţie devenind prea scurţi în aplicaţiile practice. O altă
extremă o reprezintă situaţia în care polarităţile solutului şi a fazei staţionare sunt prea similare şi
total diferite de cea a fazei mobile. În această situaţie timpii de eluţie devin deosebit de mari.
Se poate concluziona că polarităţile solutului, fazei mobile şi fazei staţionare trebuiesc
cunoscute şi selectate cu grijă pentru a conduce la o separare de partiţie eficientă, într-un interval
de timp rezonabil. Din nefericire, teoriile interacţiilor dintre faza mobilă şi cea staţionară pentru
oricare component sunt i imperfecte motiv pentru care acestea pot doar ghida analistul în alegerea
fazei staţionare pentru un tip general, după care, este necesar a se realiza o serie de experimente
preliminarii, de identificare a fazei optime până la obţinerea unei separări satisfăcătoare. Dacă se
constată că rezoluţia tuturor componentelor ale amestecului este imposibilă, se alege un alt tip de
coloană.
 Selecţia fazei mobile în cromatografia de partiţie

În prezentarea teoretică au fost descrise trei metode de creştere a rezoluţiei de

separare în cromatografia pe coloană, fiecare fiind bazată pe varierea unuia dintre cei
trei parametrii (N, k', şi α) prezentaţi în ecuaţia 1.21. În cromatografia lichidă, factorul
de retenţie, k', este experimental, cel mai uşor de manipulat dintre toţi aceşti trei
factori deoarece există o dependenţă puternică între a acestei constante funcţie de
compoziţia fazei mobile. Performanţele optime ale factorului de retenţie, k', trebuie să
fie cuprinse într-un domeniu ideal cuprins între 2 şi 5, totuşi, pentru amestecuri
complexe acest domeniu este extins la 0,5 - 20 în scopul de a furniza timp suficient
oricărui component din amestec să fie eluat.
Uneori, ajustarea lui k' singură, nu este suficientă pentru a produce o separare
clară a peak-urilor, fără suprapunere; în acest caz trebuie să se recurgă la variaţia
factorilor de selectivitate α. În acest caz modul cel mai simplu de modificare a
factorului de selectivitate α îl reprezintă alterarea cu grijă a compoziţiei fazei mobile,
pentru a păstra factorul de retenţie, k' într-un domeniu rezonabil. Un alt mod alternativ
de schimbare a factorului de selectivitate α îl reprezintă alegerea unui suport
cromatografic diferit.
 EFECTUL TĂRIEI SOLVENTULUI ASUPRA FACTORILOR DE RETENŢIE

Solvenţii care interacţionează puternic cu soluţii sunt deseori numiţi solvenţi

„tari” ori solvenţi polari. În scopul descrierii cantitative a polarităţii solvenţilor au
fost introduşi o serie de indecşi.
Dintre aceştia, cel mai utilizat index în cromatografia de partiţie îl reprezintă
P', indexul de polaritate, introdus de către Snyder în 1978. Parametrul P' se
bazează pe măsurători de solubilitate a substanţei de interes în trei solvenţi:
dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan (un dipol proton acceptor tare)
şi alcool etilic (un dipol proton donor foarte tare). Indexul de polaritate este o
măsură numerică a polarităţii relative a unui număr divers de solvenţi. Tabelul 2.1
prezintă o listă de indecşi de polaritate, alături de alte proprietăţi fizico-chimice
pentru un număr de solvenţi care sunt utilizaţi în cromatografia de partiţie.
Se poate nota că acest index poate varia de la 10,2 pentru solventul cel mai
polar, apa, la -2 pentru compuşii înalt nepolari de tipul fluoroalcanilor. Orice alt
index de polaritate dorit se va încadra între aceste limite, fiind realizat prin
amestecul a doi solvenţi adecvaţi. În acest fel se obţine indexul de polaritate P'AB
a amestecului format din solvenţii A şi B. Acesta este dat de relaţia:

P'AB = ΦAP'A +ΦB P'B

unde P'A şi P'B reprezintă indecşii de polaritate ai celor doi solvenţi, iar Φ, fracţia volumetrică a
fiecărui solvent.
 Proprietăţile celor mai utilizate faze mobile cromatografice.

Index de Punct de Index de polaritate,

Solvent Vâscozitate [cP] b Tăria eluentului c, [εo]
refracţie a fierbere [oC] P'

Fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 <-2 -0,25

Ciclohexan 1,423 0,90 81 0,04 -0,2
n-Hexan 1,372 0,30 69 0,1 0,01
1-Clorbutan 1,400 0,42 78 1,0 0,26
Tetraclorură de carbon 1,457 0,90 77 1,6 0,18
Eter i-propilic 1,365 0,38 68 2,4 0,28
Toluen 1,494 0,55 110 2,4 0,29
Eter etilic 1,350 0,24 35 2,8 0,38
Tetrahdrofuran 1,405 0,46 66 4,0 0,57
Cloroform 1,443 0,53 61 4,1 0,40
Etanol 1,359 1,08 78 4,3 0,88
Acetat de etil 1,370 0,43 77 4,4 0,58
Dioxan 1,420 1,2 101 4,8 0,56
Metanol 1,326 0,54 65 5,1 0,95
Acetonitril 1,341 0,34 82 5,8 0,65
Nitrometan 1,380 0,61 101 6,0 0,64
Etilenglicol 1,431 16,5 182 6,9 1,11
Apă 1,333 0,89 100 10,2 mare

a valoarea este calculată la o temperatură de 25oC

b centipoid-ul este unitatea de măsură, comună, a vâscozităţii în sistem internaţional, 1 cP = 1 mN·· s ··m-2.
c valorile tăriei solventului sunt calculate pe suport de alumină, Al 0 ; pentru silice, SiO valoarea εo se multiplică
2 3 2
cu un factor de 0.8.
 S-a arătat anterior că cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei cromatografice a
două specii o reprezintă manipularea factorului de retenţie k', care poate fi variat prin
schimbarea indexului de polaritate a solventului. În cazul prezentat mai sus, ajustarea lui
P' este realizată prin utilizarea unei faze mobile ce conţine un amestec format din doi
solvenţi. De obicei, o schimbare grosieră cu două unităţi a indexului de polaritate P'
conduce la o creştere de zece ori a factorului de retenţie k'. În cazul separării prin
cromatografie de fază normală se poate scrie relaţia:

unde k'2 şi k'1 reprezintă valorile iniţiale şi finale pentru un solut, în timp ce P'1 şi P'2 sunt valorile corespunzătoare ale lui P'.

În cazul coloanelor cromatografice cu fază inversă relaţia este:

Se poate accentua că deși aceste ecuaţii sunt aproximative, ele pot fi

utilizate cu succes.
 . APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIŢIE
Suporturile cu fază inversă când se utilizează în conjuncţie cu solvenţii foarte polari (deseori apoşi), se
apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichidă. Datorită aplicabilităţii mari, avantajoase şi
uşoare, în condiţiile în care factorul de retenţie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt
frecvent aplicate înaintea altor separări exploratorii în cazul utilizării unor noi tipuri de probe.
Figura de mai jos ilustrează două dintre miile de aplicaţii ale cromatografiei cu fază legată.

Abordarea sistematică a separării a şase steroizi. (a) şi (b) utilizarea apei pentru a ajusta
valoarea factorului de retenţie k'. Efectele variaţiei factorul de selectivitate α sunt arătate în
(b), (c), (d), şi (e). Coloană: 0,4 x 150 mm împachetată cu suport C8, particule de fază inversă,
5 μm. Temperatura: 50°C. Viteza de curgere: 3.0 cm3/min. Detector: UV 254 nm. Compuşi: (1)
prednisonă, (2) cortizonă (3) hidrocortizonă, (4) dexametazonă, (5) corticosteronă; (6)
cortoexolonă.
Două aplicaţii ale
cromatografiei de partiţie cu
fază legată. a) Analiza unor
aditivi într-o băutură
nealcoolică. Coloană cu suport
polar legat (nitril). Eluţie
izocratică. b) Analiza unor
insecticide organofosforice.
Coloană cu fază legată C8,
eluţie în gradient. Detecţie UV,
254 nm.
 Formarea unor derivaţi ai probei
În unele cazuri este util a se converti componenţii probei în derivaţi înaintea sau
uneori când se întreprinde o separare cromatografică. Acest tratament este de dorit în
condiţiile în care se doreşte (1) reducerea polarităţii speciilor astfel că se poate utiliza mai
degrabă cromatografia de partiţie decât cea de adsorbţie ori de schimb ionic, (2) creşterea
răspunsului detectorului şi astfel creşterea sensibilităţii pentru toate ori pentru o serie de
componente ale probei şi (3) intensificarea selectivă a răspunsului la detector pentru o
serie de componente ale probei.

Cromatograma derivaţilor ortoftalaldehidici ai 30 de aminoacizi de importanţă fiziologică. Coloană:

C18, 5 m de fază inversă. Solvent A: Na2HP04, 0,05 M, pH 7,4, CH30H/Tetrahidrofuran/H20.
Detector de fluorescenţă: excitaţie 334 nm; emisie 425 nm.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ
Cromatografia de excluziune sterică, denumită de asemenea cromatografie de gel premeaţie sau gel
filtrare reprezintă o tehnică de separare de real folos în laborator, fiind aplicată în particular la separarea
speciilor cu masă moleculară mare. Suportul cromatografic împachetat utilizat în cromatografia de excluziune
sterică este alcătuit din particule mici, de aproximativ 10 μm de silicat ori particule de polimeri care conţin reţele
de pori uniformi într-un solut şi molecule de solvent difuzate în interiorul acestor pori. În interiorul porilor
moleculele sunt efectiv blocate, fiind mişcate prin curgerea fazei mobile. Domeniul de timp de rezidenţă în
interiorul porilor depinde de mărimea efectivă a moleculelor de analit. Moleculele care sunt mai mari decât
media mărimii porilor suportului cromatografic sunt excluse şi astfel ele nu vor fi reţinute, aceste specii fiind
primele eluate. Moleculele care au un diametru semnificativ mai mic decât dimensiunile porilor pot penetra
(permea) în labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic, fiind astfel captate, pentru un timp mult mai
îndelungat, fiind ultimele eluate. Între cele două extreme sunt moleculele intermediare a căror domeniu de
permeare în pori depinde de diametrele lor. Faţă de acest grup de molecule are loc fracţionarea, fenomen direct
legat de diametrul lor şi în unele cazuri de forma moleculară a lor. Se poate spune că separările prin gel
permeaţie, de excluziune pe baza masei moleculare diferă de alte procese de separare prin considerentul că nu
există interacţii fizice sau chimice între analit şi faza staţionară. Din această cauză, este necesară eliminarea
oricărei interacţii deoarece acestea conduc la scăderea eficienţei cromatografice. De asemenea trebuie notat că
în cazul acestui proces de separare există o limită superioară a timpului de retenţie din cauza faptului că nici o
specie de analit nu se reţine mai mult decât cel care permează total faza staţionară. De reţinut că în cazul
separării biomoleculelor în sisteme apoase, cromatografia de excluziune de denumeşte cromatografie de gel
filtrare, în timp ce separarea compuşilor în sisteme neapoase este denumită cromatografie de gel permeaţie.
Metoda cromatografică de excluziune din gel (numită de asemenea cromatografie de sitare moleculară)
exploatează masa moleculară ca proprietatea fizică în scopul realizării separării. Astfel pot fi separate molecule
din domeniul a 100 până la cele de mai multe milioane de daltoni. Este clar că o tehnică prin care se separă
molecule cu masă moleculară cuprinsă între 10000 şi 100000 este deosebit de populară printre cercetătorii
biochimişti. Gel cromatografia a avut şi are o importanţă majoră în purificarea a miilor de proteine, acizi nucleici,
enzime, polizaharide ori a altor biomolecule. În plus, tehnica poate fi aplicată la determinări de mase moleculare
ori la analize cantitative ale interacţiilor moleculare.
 Suporturi în cromatografia de gel filtrare

Faza staţionară este constituită din particule inerte care conţin pori mici cu dimensiuni
controlate. Examinarea microscopică a acestor particule arată un interior spongios. O soluţie care
conţine molecule cu diferite mase moleculare este trecută prin coloană sub influenţa unui solvent în
continuă curgere. Moleculele de solut care sunt mai mari decât porii nu vor putea pătrunde în
interiorul sferelor de gel din cauza împiedicărilor sterice datorate dimensiunii acestora în
comparaţie cu spaţiul din interiorul sferelor. Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte
mari este astfel semnificativ redus. Ca rezultat, ele nu vor fi încetinite în curgerea lor prin coloană şi
vor fi eluate astfel ca o singură bandă (zonă). Moleculele mici sunt capabile să difuzeze în şi în
afara sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele
staţionând un timp îndelungat în interiorul sferelor, în consecinţă fiind întârziată eluţia lor din
coloană. Moleculele cu dimensiuni intermediare migrează prin coloană cu viteză cuprinsă între cea
a moleculelor mari şi cele mici. Astfel, ordinea de eluţie a diverselor molecule de solut este
oarecum în relaţie directă cu dimensiunile lor moleculare.

Au fost elaborate două tipuri de suporturi pentru cromatografia de excluziune pe baza

mărimii moleculelor: microsfere de polimer şi particule ce au la bază silice, ambele având
diametre cuprinse între 5 şi 10 μm. Ultimele au avantajul unei rigidităţi crescute ceea ce
conduce la o împachetare mai uşoară, permiţând utilizarea lor la presiuni crescute, stabilitate
deosebit de mare, care permite utilizarea lor împreună cu un mare număr de solvenţi, inclusiv
cu apa, o echilibrare mai rapidă într-un nou solvent şi o stabilitate înaltă la temperaturi ridicate.
 Cele mai timpurii separări efectuate prin tehnica de cromatografie de excluziune moleculară s-
au realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil benzen, similar în structură cu copolimerii sulfonici
ai acestor copolimeri. Mărimea porilor acestor polimeri e controlată prin cantitatea de agent de
reticulare, în speţă de cantitatea de divinilbenzen utilizată în reacţia de polimerizare. Drept
consecinţă, au fot creaţi o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor, sub formă comercială.
Dacă la început gelurile de stiren-divinilbenzen erau hidrofobe, şi astfel neutilizabile în prezenţa
unei faze mobile apoase, astăzi sunt disponibile geluri hidrofile, ceea ce face posibilă utilizarea lor
în solvenţi apoşi pentru separarea unor molecule mari, hidrosolubile precum zaharurile. Aceste
geluri hidrofile sunt derivaţi sulfonaţi ai divinibenzenului ori sunt poliacrilamidice.
În acest moment sunt disponibile comercial suporturi de sticlă poroasă ori particulele de silice
ce au domeniu de mărime al porilor cuprins între 40 şi 2500 Å. În scopul reducerii absorbţiei
nespecifice, suprafeţele acestor particule sunt deseori modificate prin reacţii cu substituenţi
organici. De exemplu, suprafaţa unui suport hidrofil prezintă structura următoare:

Structura unui suport hidrofil, pe bază de silice

 Proprietăţile unor matrix-uri pe bază de polistiren-divinilbenzen şi silice utilizate în
cromatografia de excluziune pe baza mărimii masei moleculare. Limita de excluziune a
masei moleculare se referă la domeniul la care nu se manifestă nici o reţinere.

Tipul de suport cromatografic Mărimea pariculei, Domeniul de limită al Limita de excluziune a masei
μm porilor, Å moleculare

polistiren-divinilbenzen 10 102 700

103 (de la 0,1 la 20) x 104
104 (de la 1 la 20) x 104
105 (de la 1 la 20) x 105
106 (de la 5 >20) x 106
Silice 10 125 (de la 0,2 la 5) x 104
300 (de la 0,03 la 1) x 105
500 (de la 0,05 la 5) x 105
1000 (de la 5 la 20) x 105

În practica biochimică sunt utilizate cu preponderenţă geluri bazate pe

patru tipuri de bază: dextran, poliacrilamidă, agaroză şi amestecuri de
poliacrilamidă cu dextran.
Primele geluri dezvoltate au fost pe bază de dextran, un polizaharid natural reticulat cu
epiclorhidrină, comercializat sub denumirea de Sephadex

Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoză legate prin legături (α-1 -6) şi
legături α-1,3 care conferă legături ramificate. El este biosintetizat de către o enzimă produsă de
către bacteria Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F. Dextranul este reticulat la multiplele
sale extremităţi printr-o reacţie cu epiclorhidrină, ceea ce conduce la obţinerea unor sfere de gel cu
porozităţi diferite.
Numărul dat fiecărui tip de gel se referă la capacitatea de îmbibare cu soluţie apoasă (water
regain) multiplicată cu 10. Sephadex-ul este oferit în diverse mărimi ale particulelor denumite
coarse, medium, fine şi superfine. Gelurile pe bază de dextran nu pot fi preparate decât pentru
limite de excluziune mai mici de 600000 daltoni, deoarece mica reticulare existentă în structura lor
nu este suficientă pentru a preveni colapsul particulelor. În schimb, prin reticularea dextranului cu
NN'- metilen bisacrilamidă, este posibilă utilizarea acestor geluri la fracţionări cu domenii mai mari.
Aceste geluri sunt denumite Sephacryl.
Gelurile pe bază de poliacrilamidă sunt produse prin copolimerizarea acrilamidei cu NN'-
metilen bisacrilamidă, ultimul fiind şi agent de reticulare. Denumirea comercială a acestor geluri
este Bio-Gel P. Mediile pe bază de Bio-Gel sunt media sunt disponibile în 10 limite de excluziune,
în domeniul 1800 la 400000 daltoni.
Gelurile pe bază de agaroză prezintă avantajul unor deosebit de mari limite de excluziune.
Agaroza, componentul polizaharidic neutru al agarului, este compusă din unităţi alternative de
galactoză şi anhidro-galactoză (Figura următoare).
 Agaroza este un material gelificant a căror mărime a porilor este mai mare
decât cei ai dextranului reticulat ori ai poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid
neutru, fracţie de agar.
Ea este compusă din polimer linear de D-galactopiranoză legate β-1→4 la 3,6
anhidro-L-galactopiranoză, care este legată α -1→3. În condiţiile în care
polizaharidul este dizolvat prin fierbere şi apoi este răcit, el formează legături de
hidrogen inter- şi intramoleculare. Mărimea porilor este controlată prin
concentraţia de agaroză. Structura gelului este stabilizată mai mult prin legături de
hidrogen decât prin legături încrucişate covalente.
 Gelurile pe bază de agaroză sunt furnizate sub denumirea comercială de Bio-Gel A şi Sepharose
ori Superose. Sepharose CL este o Sepharose reticulată prin reacţia dextranului cu 2,3-
dibromopropanol în condiţii alcaline, ceea ce conduce la obţinerea unui gel de agaroză cu o stabilitate
termică şi chimică crescută.

Un pas înainte în tehnologia de gel filtrare s-a realizat în momentul introducerii gelurilor
compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel preformat, precum de
exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se realizează între alil dextran şi N,N'-
metilen bisacrilamidă ori mai recent, Superdex.

Structura probabilă a polimerului Sephacryl HR

 Structura Superdex-ului

Gelurile combinate de poliacrilamidă şi agaroză sunt furnizate sub denumirea

comercială de Ultragel. Acestea sunt compuse din poliacrilamidă reticulată în ochiurile
căreia se află agaroză. Ca şi în cazul Superdex, gelul de poliacrilamidă conferă un
grad înalt de separare în timp ce agaroza menţine rigiditatea gelului ceea ce conduce
la marele avantaj al creşterii vitezelor de curgere.
În definirea performanţelor unui gel şi a comportamentului unui solut este necesară
cunoaşterea unor proprietăţi fizice ale acestora.
 Limita de excluziune. Ea este definită ca masa moleculară a celei mai mici molecule care
nu poate difuza în interiorul volumului de matrix de gel. Toate moleculele mai mari decât
această masă vor fi eluate rapid, într-o singură zonă. Limita de excluziune a unui gel tipic,
Sephadex G-50, este de 30000 Da. Toate moleculele din solut care posedă mase moleculare
mai mari de această valoare vor trece prin coloană direct, fără a fi reţinute în porii sferelor de
gel.
Domeniul de fracţionare. În cazul Sephadex G-50 domeniul de fracţionare este cuprins
între 1500 şi 30000 Da. Moleculele de solut din acest domeniu, se vor separa oarecum într-o
relaţie lineară, în funcţie de masa lor moleculară.
Capacitatea de îmbibare (water regain şi bed volume). Mediile de gel cromatografie sunt
oferite cel mai adesea în formă deshidratate fiind umflate apoi în solvent, de obicei apă,
înainte de utilizare. Cantitatea de apă necesară obţinerii unui gram de gel este cunoscută sub
denumirea de water regain. În cazul Sephadex G-50, această valoare este de 5 pentru 0,3 g.
Această valoare nu include apa din jurul particulelor de gel şi astfel nu poate fi utilizată la o
estimare exactă a volumului final al coloanei împachetate de gel. Cele mai multe companii
care comercializează astfel de produse furnizează, în plus la water regain, valoarea volumului
particulelor, bed volume. Această valoare reprezintă volumul final de gel în condiţiile umflării
(îmbibării) a unui gram de gel uscat în apă. Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9
până la 11 ml/g gel uscat. În seria Sephadex-ului, denumită seria G, numerele G se referă la
cantitatea de apă care este necesară pentru înmuierea gelului, având grade diferite de
reticulare, deci diferite mărimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran, posedă un
water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat în timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin
dextran reticulat are un water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat.
Forma şi mărimea particulei de gel. În condiţii ideale, particulele de gel sunt sferice,
pentru a furniza un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mărimea particulelor
este definită prin mărimea ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei particulei.
Gradul de rezolţie oferit de viteza de curgere prin coloană depinde de dimensiunile
particulelor de gel. Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300 μm) oferă viteze de
curgere înalte dar o separare cromatografică cu rezoluţie scăzută. În caz opus se află
particulele de gel cu dimensiuni foarte mici ("superfine," 400 mesh, 10 la 40 μm). Cele mai
utilizate mărimi de particule reprezintă un compromis între rezoluţie şi viteză de curgere
fiind de 100 la 200 mesh (50 la 150 μm).
Volumul spaţiului gol (void volume). Acesta reprezintă spaţiul total din jurul particulelor
de gel într-o coloană împachetată. Valoarea volumului spaţiului gol se determină prin
măsurarea volumului de solvent necesar eluării unui solut care este complet exclus din
matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi calibrate în scopul determinării acestui
parametru prin eluţia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o masă moleculară medie
de 2000000 daltoni.
Volumul de eluţie. Acest volum reprezintă volumul de tampon de eluţie necesar
îndepărtării unui anumit solut, particular, dintr-o coloană împachetată.
 Ilustrarea fenomenului de separare prin gel filtrare.

Astfel, după împachetarea coloanei cu mediu

suport ce este alcătuit din particule sferice de gel [1],
proba este aplicată pe coloană [2].
Tamponul (faza mobilă) şi proba se mişcă de-a
lungul coloanei [3]. Moleculele difuzează în şi în
afara porilor matrix-ului (fenomen descris de
asemenea drept partiţia probei între faza mobilă şi
cea staţionară). Moleculele mai mici se vor dispersa
mai mult in interiorul porilor matrix-ului şi vor rămâne
un timp mai îndelungat pe coloană. Cum tamponul
trece continuu prin coloană, moleculele mai mari
decât porii matrix-ului sunt incapabile să difuzeze în
interiorul acestora, trecând astfel prin coloană, fără a
fi reţinute. Moleculele mai mici difuzează în interiorul
porilor şi sunt astfel întârziate în trecerea lor de-a
lungul coloanei [4]. Moleculele mai mari părăsesc
primele coloana, urmate de moleculele mai mici, în
ordinea mărimii lor [5]. Întregul proces de separare
are loc la un volum total al tamponului care trece prin
coloană (echivalent cu volumul de suport
împachetat).
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

În abordarea teoretică a procesului de cromatografie se ia în considerare faptul că solutul

trece printr-un strat cromatografic prin intermediul fazei mobile. Faza staţionară acţionează în
sensul întârzierii deplasării solutului prin strat. Soluţi diferiţi sunt întârziaţi cu timpi diferiţi. În
cromatografia de partiţie, această întârziere este datorată partiţionării solutului între faza mobilă şi
cea staţionară.
Viteza cu care solutul traversează stratul cromatografic este proporţională cu o fracţie de timp,
calculată pe bază statistică, în care moleculele sunt reţinute în faza mobilă. Această fracţie de timp
pierdut în faza mobilă este determinată ca raportul volumelor de fază mobilă respectiv staţionară,
alături de un coeficient de partiţie. Acest coeficient de partiţie a solutului între faza mobilă şi cea
staţionară guvernează comportamentul cromatografic al solutului, prin ecuaţia fundamentală a
cromatografiei de partiţie. O multitudine de teorii au fost emise în încercarea de caracterizare a
acestui coeficient de partiţie în cazul gel filtrării.
Prima abordare teoretică a comportării gelurilor în cromatografie este cea realizată, în anul
1961 de către P. Flodin (1961). El consideră partiţia moleculelor de solut între particulele de gel şi
lichidul interstiţial ca un întreg efect steric şi punctează că în mediul înconjurător imediat apropiat
de catene reticulate de gel suport matrix-ul de gel ocupă cea mai mare parte a spaţiului. În aceste
condiţii, moleculele mari nu pot penetra în aceste regiuni, în timp ce moleculele mici pot trece
bariera reticulată şi astfel se pot apropia mult mai intim. Aceste restricţii sterice, după Flodin, împart
gelul în regiuni permise şi regiuni interzise moleculelor de solut. Cu cât moleculele de solut sunt
mai mari în dimensiuni, cu atât numărul de regiuni interzise din reţeaua matrix-ului este mai mare.
În regiunile permise, concentraţia de solut este considerată a fi identică cu cea din lichidul
interstiţial. Această teorie conduce la definirea constantei K drept un volum disponibil la o specie
moleculară dată.
 Pentru a realiza o separare prin gel filtrare mediul suportul (mediul) este împachetat într-o
coloană sub formă de perle în strat împachetat (packed bed). Mediul este reprezentat de un matrix
poros în formă de particule sferice care trebuie a fi alese în funcţie de stabilitatea lor chimică şi
fizică ori pe baza proprietăţii de a fi inerte (prin pierderea proprietăţilor de reactivitate sau
adsorptivitate). Coloana împachetată este echilibrată cu tampon cu rolul de a se distribui în porii
matrix-ului şi în spaţiul dintre particule. Lichidul situat în interiorul porilor este uneori definit drept
fază staţionară care se află în echilibru cu lichidul din afara particulelor denumit fază mobilă. Se
poate nota că probele se eluează în condiţii isocratice, nefiind necesară utilizarea tampoanelor
diferite în timpul separării. În mod normal, o treaptă de spălare se realizează prin trecerea unui
tampon la sfârşitul oricărei separări pentru a facilita îndepărtarea oricărei molecule care ar fi putut fi
reţinute pe coloană şi pentru a pregăti coloana pentru o nouă separare. Figura de mai jos prezintă
cei mai utilizaţi termeni utilizaţi în descrierea unei separări cromatografice prin gel filtrare.

Termeni uzuali utilizaţi în gel filtrare.

Ilustrarea termenilor utilizaţi în gel filtrare
 Pentru a caracteriza comportamentul unui solut fără a avea o referinţă la
dimensiunile geometrice ale coloanei sunt utilizate frecvent o serie de variabile.
Ve
• Volumul relativ de eluţie, Vo, unde Vo reprezintă volumul spaţiului gol
(denumit şi volumul mort), reprezintă volumul de eluţie pentru o substanţă
care este complet exclusă din gel Vo este identic cu volumul lichidului
interstiţial dintre sferele de suport cromatografic. În unele cazuri inversul
volumului relativ de eluţie, R, constanta de retenţie este de asemenea
utilizată în caracterizarea unei substanţe. Constanta de retenţie, R este un
parametru interesant, deoarece ea este apropiată de viteza relativă de
migrare utilizată în cromatografia pe strat subţire.

Măsurarea volumului de eluţie, Ve.

 Ve
• Valoarea este uşor de calculat. Ea este oarecum
Vo

dependentă de modul de împachetare al coloanei. O

operare la presiune înaltă care conduce la un void
volume mic poate să crească uneori valoarea acestui
parametru. Această variaţie are totuşi o importanţă
minoră.
Ve
• Raportul Vt (unde Vt reprezintă volumul total al patului de
gel), este de asemenea uşor de determinat.
Măsurătoarea volumului total a patului de gel se
realizează, prin umplerea tubului până la nivelul original
al stratului de gel împachetat cu apă, determinându-se
astfel acest volum. Se poate adăuga că, în comparaţie
cu raportul Ve, variaţia raportului VeVt este mai mică.
Vo
 CURBELE DE SELECTIVITATE

Utilizarea domeniului de masă moleculară

pentru împachetare în cazul cromatografiei de
excluziune moleculară este convenţional
reprezentată în figura alăturată, unde în panelul (a)
e prezentată o curbă de calibrare.
În acest caz, masa moleculară, care este
într-o relaţie directă cu mărimea moleculelor de
solut, este plotată (reprezentată) în funcţie de
volumul de retenţie VR, unde VR este produsul
dintre timpul de retenţie şi viteza de curgere
volumetrică. Se poate nota că scara este
logaritmică. Limita de excluziune defineşte masa
moleculară a speciilor care depăşesc domeniul de
retenţie şi la care nu se manifestă nici o reţinere
pe coloana cromatografică. Toate speciile care au
o masă moleculară mai mare decât limita de
excluziune nu sunt reţinute de suport şi vor fi
eluate împreună, rezultând astfel un peak comun,
peak-ul A, din panelul (b). limita de permeaţie Odată cu scăderea masei moleculare comparativ cu
reprezintă astfel masa moleculară sub care limita de excluziune, moleculele de solut vor staţiona din
moleculele de solut pot penetra complet în ce în ce mai mult, în medie, în interiorul porilor şi apoi se
interiorul porilor de gel. Totalitatea moleculelor sub vor deplasa mai lent. Această situaţie se manifestă în
această masă moleculară sunt atât de mici încât regiunea de permeaţie selectivă, unde are loc fracţionarea
ele vor fi eluate ca o singură bandă, D, din panelul solutului, ceea ce conduce la separarea pe benzi
individuale a componentelor acestuia. Acest caz este
(b). prezentat în panelul (b), peak-urile B şi C.
Curbele de selectivitate pentru Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade
şi Superdex 200 prep grade.
 REZOLUŢIA DE SEPARARE ÎN CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Succesul unei separări prin cromatografie de excluziune sterică depinde în primul

rând de alegerea condiţiilor care conduc la o selectivitate suficientă şi la o contracarare a
lăţirii peak-ului, fenomen ce se manifestă în timpul separării. După selecţia mediului de gel
filtrare cu o selectivitate corectă, volumul probei şi dimensiunile coloanei devin parametrii
critici ce afectează rezoluţia de separare.
Rezoluţia finală, gradul de separare între peak-uri este influenţată de o multitudine de
factori: raportul dintre volumul probei şi volumul coloanei, viteza de curgere, dimensiunile
coloanei, mărimea particulelor suportului cromatografic, distribuţia mărimii particulelor,
densitatea de împachetare, porozitatea particulelor şi vâscozitatea fazei mobile. Succesul
undi separări prin cromatografie de excluziune moleculară depinde în cea mai mare
măsură de alegerea condiţiilor care să conducă la o selectivitate suficientă alături de
contracararea efectelor de împrăştiere a peak-ului în timpul separării.
Rezoluţia este funcţie de selectivitatea mediului
suport cromatografic şi de eficienţa acestuia în
producerea unor peak-uri cât mai înguste (cu o
împrăştiere minimă a peak-ului) după cum este ilustrat
în figura alăturată.
Eficienţa unei coloane împachetate este definită
drept capacitatea acesteia de a produce peak-uri
înguste şi simetrice în timpul eluţiei. Eficienţa este un
parametru deosebit de important în mod particular în
cromatografia de excluziune moleculară deoarece
separarea are loc numai într-un volum de tampon egal
cu volumul coloanei, tampon ce traversează coloana.
 VOLUMUL PROBEI ŞI DIMENSIUNILE COLOANEI

Volumul probei este exprimat ca procente din volumul total al coloanei

împachetate. Utilizarea unor probe cât mai mici conduce la evitarea
suprapunerii dacă peak-urile sunt prea apropiate. Figura de mai jos arată cum
influenţează volumul probei în cazul fracţionării de rezoluţie înaltă
 Pentru fracţionări cu mare rezoluţie a probei este recomandat un volum
de probă egal cu 0,5–4% din volumul total al coloanei, acesta depinzând de
tipul de mediu utilizat. Pentru cele mai multe aplicaţii, este preferabil ca
volumul probei să nu depăşească 2% pentru a avea o rezoluţie maximă.
Funcţie specificitatea probei este posibil să se introducă un volum mai mare
de probă, în particular când peak-urile de interes sunt bine rezolvate. Din
această cauză, volumul probei poate fi determinat numai pe cale
experimentală.
În cazul separărilor analitice ori în cazul separării unor probe complexe
este avantajos a se începe cu un volum egal cu 0,5% din volumul total al
coloanei. Un volum al probei mai mic de 0.5% nu creşte în mod normal
rezoluţia. Pentru a creşte capacitatea de separare prin gel filtrare, proba poate
fi concentrată. Este preferabil a nu utiliza probe cu o concentraţie mai mare de
70 mg/ml proteină, datorită efectelor de vâscozitate care astfel să conducă la
interferenţe în separare. Diluţia probei este inevitabilă datorită fenomenului de
diluţie care se manifestă la trecerea probei prin coloană. În scopul de a
minimaliza diluţia probei, este preferabil a utiliza maximul volum al acesteia
pentru a obţine rezoluţia maximă necesară între peak-urile de interes.
 Înălţimea patului cromatografic, împachetat în coloană afectează atât
rezoluţia cât şi timpul necesar eluţiei. Rezoluţia în gel filtrare creşte cu
pătratul rădăcinii înălţimii patului cromatografic. O dublare a înălţimii stratului
cromatografic conduce la o creştere a rezoluţiei cu un echivalent de 2 =
1,4 (40%). În cazul fracţionărilor de înaltă rezoluţie, sunt de preferat
coloanele lungi care vor da cele mai bune rezultate în timp ce o înălţime a
patului de gel cuprinsă între 30–60 cm va conduce la rezoluţii satisfăcătoare.
O înălţime suficientă a stratului de gel alături de o viteză scăzută de curgere
dau suficient timp tuturor moleculelor intermediare să difuzeze în şi în afara
porilor matrix-ului cromatografic conducând astfel la rezoluţii bune. Dacă este
necesară o coloana este foarte lungă, înălţimea efectivă a patului de gel
poate fi crescută prin utilizarea mai multor coloane care conţin aceleaşi
suport cromatografic, cuplate în serie.
 SELECŢIA SUPORTULUI CROMATOGRAFIC

Selecţia corectă a gelului suport reprezintă o etapă critică în succesul unei separări gel
cromatografice. Cele mai multe experimente de excluziune moleculară pot fi clasificate în separări de grup
şi în fracţionări de înaltă rezoluţie.
Separările de grup pot fi divizate, funcţie de solut, în două grupe: fracţionări se soluţi cu masă
moleculară relativ mică şi fracţionări se soluţi cu masă moleculară relativ mare. Exemplele specifice ale
acestora sunt desalifierea soluţiilor de proteine sau îndepărtarea unor molecule mici de contaminanţi din
extracte de proteine sau acizi nucleici. Pentru separările de grup, gelul trebuie ales astfel încât sî conducă
la o excluziune completă a moleculelor cu masă moleculară mare în void volume. În acest scop sunt
recomandate Sephadex G-25, Bio-Gel P-6, şi Sephacryl S-100HR pentru cele mai multe separări de grup.
Mărimea recomandată a particulelor este de 100 - 200 mesh ori particule cu un diametru de 50 - 150 μm.
Fracţionarea implică separarea gupelor de soluţi cu mase moleculare similare dintr-un amestec
multicomponent. În acest caz, gel trebuie ales astfel ca domeniul de fracţionare să includă masele
moleculare dorite a se separa din solut. Dacă amestecul de solut conţine macromolecule cu mase
moleculare de până la 120000, cele mai potrivite suporturi cromatografice sunt Bio-Gel P- 150, Sephacryl
S-200 HR ori Sephadex G-150. În cazul utilizării Bio-Gel P-100, Sephadex G- 100 sau Sephacryl S- 100
HR o serie de proteine din probă cu masă moleculară mai mare vor elua în void volume. Pe de altă parte,
dacă se utilizează dacă se utilizează Bio-Gel P-200, Bio-Gel P-300 ori Sephadex G-200 acestea vor
scădea atât rezoluţia cât şi viteza de curgere. În cazul în care domeniul de masă moleculară a amestecului
de solut este necunoscut, este necesară o selecţie empirică a suportului cromatografic. În cazul celor mai
multe fracţionări se recomandă utilizarea suporturilor cromatografice de 100-200 ori 200-400 mesh (20-80
μm ori 10-40 μm). În cazul gelurile celor mai fine este recomandabil a se selecta o viteză de curgere
optimă. Pentru separări critice, gradele superfine oferă cea mai bună rezoluţie dar vitezele de curgere sunt
foarte scăzute.
APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Cromatografia de excluziune moleculară este subdivizată în gel filtrare şi în

cromatografie de gel permeaţie. Prima utilizează solvenţi apoşi suporturi cromatografice
hidrofile. Cel de al doilea tip de cromatografie este bazat pe solvenţi organici neapoşi şi
suporturi cromatografice hidrofobe. Aceste metode sunt complementare în sensul că una
este aplicabilă pentru probe solubile în apă, în timp ce a doua este aplicabilă substanţelor
solubile în solvenţi mai puţin polari.
Una dintre cele mai utilizate aplicaţii ale excluziune pe baza mesei moleculare este
separarea unor molecule cu masă moleculară mare, produşi naturali, de speciile de
molecule cu masă moleculară mică ori de separarea lor de săruri.

De exemplu, un gel cu o limită de excluziune de câteva mii, poate separa clar,

proteine de aminoacizi şi de peptide cu masă moleculară mică.
O altă aplicaţie a cromatografiei de gel permeaţie o reprezintă separarea unor
omologi ori a unor oligomeri. Această aplicaţie este ilustrată în figura de mai jos, unde este
prezentată separarea unor acizilor graşi din domeniul de masă moleculară 116 - 344 pe un
suport pe bază de polistiren, împachetat, cu o limită de excluziune de 1000.
 Sephadex-ul poate fi utilizat de asemenea în cromatografia de
excluziune moleculară pentru separare în prezenţa unor solvenţi
organici precum dimetilformamida, în cazul Sephadex G-10 ori a unor
amestecuri de apă cu alcooli cu catenă scurtă, în cazul Sephadex G-
10, G-25 şi G-50.
Sephadex LH-20 este un suport special conceput pentru
separările compuşilor naturali care necesită prezenţa unor solvenţi
organici pentru a le menţine solubilitatea. El este utilizat de asemenea
la separarea unor molecule precum sterolii, terpenoidele, lipidele şi
peptidele cu masă moleculară mică (până la 35 resturi de aminoacizi).
Toţi aceşti compuşi sunt uzual separaţi prin cromatografie de partiţie
lichid-lichid sau prin cromatografie de absorbţie. Funcţie de solvenţii
aleşi, acest mediu suport poate separa de asemenea componente prin
partiţie între faza staţionară şi faza mobilă.
Sephadex LH-20 poate prezenta o selectivitate înaltă pentru
compuşi aromatici într-o serie de solvenţi şi poate fi utilizat atât în
scopuri analitice cât şi în cele industriale. El este utilizat atât în scopuri
analitice cât şi în cele industriale, la separarea unor specii moleculare
înrudite. Datorită proprietăţilor sale unice acest mediu suport poate fi
utilizat atât în timpul purificării iniţiale cât şi în faza finală de finalizare a
purificării, de exemplu la separarea diastereomerilor. Funcţie de
solvenţii aleşi, Sephadex LH-20 poate de asemenea separa
componente prin partiţie între matrix şi solvent organic. Sephadex LH-
20 manifestă atât proprietăţi hidrofilie cât şi hidrofobe, ceea ce-i oferă
selectivitate specială şi astfel are cu o multitudine de aplicaţii.
Separările de grup: componentele probei sunt separate în două grupuri majore, funcţie de
domeniul mărimii lor. O separare de grup poate fi utilizată la îndepărtarea contaminanţilor cu
masă moleculară mare sau mică (cum ar fi îndepărtarea roşului de fenol din fluidele, mediile,
de cultură, desalifiere sau la schimbare a tampoanelor de lucru.
Fracţionarea de înaltă rezoluţie a biomoleculelor: componentele probei sunt separate ân
funcţie de diferenţele în masă moleculară. Fracţionarea de înaltă rezoluţie poate fi utilizată în
izolarea unuia sau mai multor componente, la separarea monomerilor din agregate, la
determinarea masei moleculare ori la realizarea analizelor de distribuţie a masei. Gel filtrarea
poate fi de asemenea utilizată la facilitarea reîmpachetării proteinelor denaturate prin controlul
intim (atent) în schimbarea condiţiilor de tamponare.

O cromatogramă care ilustrează

separarea de grup. Proba: ● =
hemoglobină, x = NaCl. Volumul
probei: a) = 10 ml, b) = 400 ml.
Hemoglobina este elutată în void
volumul coloanei (de exemplu, 370 ml)
în timp ce clorura de sodiu este eluată
cu un volum total de lichid (860 ml).
Aproape tot volumul de pori este utilizat
în desalifiere. Coloana de 85 X 4 cm
diametru interior este împachetată cu
Sephadex G-25 Medium.
 FRACŢIONAREA CU REZOLUŢIE ÎNALTĂ A
MACROMOLECULELOR

DETERMINAREA MASEI MOLECULARE PRIN

ANALIZE DE DISTRIBUŢIE

Curbă de calibrare pentru determinarea masei moleculare a

proteinelor prin cromatografie de excludere sterică.
Suportul cromatografic este Sephadex G-100.
 CROMATOGRAFIA PLANARĂ LICHID-LICHID
Principial, în cromatografia de partiţie lichid-lichid sunt utilizate două faze lichide, o fază legată
la un suport inert, denumită fază staţionară şi o altă fază lichidă, denumită fază mobilă care
traversează faza staţionară şi care distribuie componente solutului, între aceste două faze.
Componentele solutului prezintă solubilitate în cele faze. Procesul care se produce este deseori
complicat de apariţia unor fenomene de adsorbţie a substanţelor şi a fazei mobile de către suportul
inert. Cromatografia de partiţie se poate realiza pe coloane de pudră de celuloză, dar cele mai
comune şi utilizate metode sunt cele care utilizează ca suport hârtia (cromatografia pe hârtie) ori un
strat subţire de silicagel sau alumină depus pe un suport solid de tipul sticlei, foliei de aluminiu sau
din material plastic (cromatografia pe strat subţire, thin-layer chromatography, TLC). Celuloza, ca şi
alţi polimeri naturali ori sintetici, poate lega o cantitate mare de apă. Astfel procesul de separare
cromatografică va implica partiţia componenţilor probei între apa (solventul apos) legată de suportul
inert (faza staţionară) şi solventul de developare (faza mobilă). Frecvent, unul din componentele de
developare îl reprezintă apa. În condiţiile în care între apă şi componentul organic există fenomenul
de nemiscibilitate, este adăugat un al treilea component (solvent) care este capabil să se amestece
atât cu apa cât şi cu primul component organic, pentru a se crea o singură fază organică de
solvent. Este cazul etanolului din sistemul apă:etanol:nitrometan, unde etanolul este capabil să se
dizolve atât în apă cât şi în solventul organic, de exemplu.
Metodele de cromatografie planară includ cromatografia pe strat subţire, cromatografia pe
hârtie şi electrocromatografia. Oricare dintre acestea se realizează utilizează un strat subţire relativ
plat care reprezintă el însuşi suportul cromatografic (de exemplu, hârtia) ori pe suprafaţa căruia se
află depus acest suport. Faza mobilă se deplasează prin faza staţionară sub acţiunea forţei de
capilaritate, a forţei gravitaţionale ori sub un gradient de potenţial. Cromatografia planară este
uneori denumită cromatografie bidimensională deşi această definiţie nu este strict corectă deoarece
faza staţionară posedă o înălţime finită.
 Cromatografia pe strat subţire

Din punct de vedere teoretic al tipurilor de fază mobilă şi staţionară utilizate în

cromatografia pe strat subţire, există o similare deosebită cu cromatografia lichidă pe coloană.
O caracteristică importantă a cromatografiei pe strat subţire (thin layer chromatography, TLC) o
reprezintă faptul că ea serveşte drept ghid în dezvoltarea condiţiilor optime de realizare a
separării prin cromatografie lichidă pe coloană. Avantajele utilizării acestui procedeu îl reprezintă
viteza şi preţul scăzut ale experimentelor exploratorii pe strat subţire. O serie de
experimentatori, de fapt, efectuând experimente de cromatografie pe strat subţire îşi formează o
opinie în efectuarea experimentelor următoare pe coloană. În plus, la utilizarea acestei metode
la dezvoltarea metodelor cromatografice pe coloană, TLC a devenit o metodă comună în
industria medicamentului, pentru determinarea purităţii produselor. Tabelul 2.10 arată domeniile
curente de utilizare ale cromatografiei pe strat subţire.
Ea este răspândită în laboratoarele clinice şi reprezintă baza multor studii biochimice şi
biologice. În plus, metoda este larg utilizată în laboratoarele industriale. Drept consecinţă a
acestei largi arii de aplicare, s-a estimat că numărul de analize efectuate prin cromatografie pe
strat subţire este cel puţin egal cu cel realizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă.
În mod clasic separările prin cromatografie pe strat subţire sunt realizate pe suporturi din
sticlă, folie de aluminiu ori plastic care sunt acoperite cu un strat subţire şi aderent de de
particule fine; acest strat reprezintă suportul inert.
Particulele sunt similare celor utilizate în cromatografia de adsorbţie, partiţie normală sau
inversă, cromatografie de excluziune moleculară. Fazele mobile sunt similare celor utilizate în
cromatografia lichidă de presiune înaltă.
Domeniile actuale de aplicare ale cromatografiei pe strat subţire

Domenii de aplicare Tipul de analize

Aplicaţii clinice Lipide
Studii metabolice
Screening-ul unor medicamente
Control antidrog (antidopping)
Aplicaţii industriale Dezvoltarea proceselor şi optimizarea lor
Monitorizarea unor procese
Validarea unor procese
Industrie alimentară Controlul calităţii
Aditivi (de exemplu, vitamine)
Pesticide
Teste de stabilitate (expirare)
Medicină legală Detectarea unor documente false
Investigaţii în otrăviri
Analize de vopsele
Aplicaţii farmaceutice Teste de control al uniformităţii
Analiza identităţii sau purităţii
Teste de stabilitate
Analize de mediu Apă
Sol
Analize de reziduuri
 SUPORTURI CROMATOGRAFICE

Suporturile utilizate în cromatografia pe strat subţire sunt comercializate în două

forme, pentru cromatografie pe strat subţire convenţională şi cromatografie pe strat subţire
de înaltă performanţă. Primele posedă un strat subţire de 200-250 μm înălţime cu care
conţine particule cu o dimensiune de 20 μm sau mai mari. Suporturile de înaltă performanţă
posedă un suport cromatografic de 100 μm înălţime cu diametrul particulelor de 5 μm sau
mai mici. Suporturile de înaltă performanţă, după denumire, conduc la separări precise, în
interval de timp scurt. Astfel suporturile cromatografice convenţionale posedă 2000 de
talere teoretice pe o distanţă de 12 cm, într-un timp de developare ce cca. 25 minute.
Suporturile cromatografice de înaltă performanţă prezintă 4000 de talere teoretice pe o
distanţă de 3 cm. care necesită circa 10 minute pentru dezvoltare. Suporturile de înaltă
performanţă au însă dezavantajul unei capacităţi reduse în ceea ce priveşte volumul probei
adăugate.
 În mod diferit de cromatografia lichidă de presiune înaltă şi de gaz cromatografie unde faza
mobilă reprezintă un parametru ce poate fi uşor menţinut la o viteză specificată, în cromatografia
pe strat subţire viteza fazei mobile nu poate fi în general controlată în afară de cazul în care se
utilizează tehnica de developare cu curgere forţată. Viteza de curgere este afectată de natura
suportului cromatografic (porozitate, împachetare, mărimea particulelor, etc.) cât şi de proprietăţile
fazei mobile (vâscozitate, tensiune de suprafaţă, presiunile de vapori ale solvenţilor, etc.). În
general viteza scade în timpul dezvoltării plăcii cromatografice (figura de mai jos).
Datorită fenomenului de creştere a rezistenţei fazei staţionare faţă de curgerea fazei mobile, în
condiţiile utilizării unor suporturi de cromatografie pe strat subţire de performanţă înaltă, se pot
obţine rezultate superioare numai în cazul unor distanţe scurte de developare.
În condiţiile menţinerii altor parametrii constanţi, rezoluţia Rs a doi compuşi este mai
dependentă de poziţia lor relativă pe cromatogramă (RF) decât de distanţa de migrare a frontului
(distanţa de developare).

Relaţia dintre distanţa de

developare şi timpul de
developare în condiţiile utilizării
unui suport de silicagel HPTLC
silicagel 60. Faza mobilă:
toluen/acetat de etil (1) şi acetat
de etil/metanol/apă/acid formic (2).
 PERFORMANŢELE SUPORTURILOR DE
CROMATOGRAFIE PE STRAT
R =
SUBŢIRE
F

Majoritatea termenilor şi relaţiilor care caracterizează cromatografia pe coloană, pot

fi adaptaţi, uşor, cu mici modificări, cromatografiei pe strat subţire. Un termen nou,
factorul de retardare, RF este necesar a se prezenta în contextul cromatografiei pe strat
subţire.
Cromatografia pe strat subţire pentru un singur
solut este prezentată în formă de cromatogramă
figura de mai jos. Factorul de retardare pentru un
singur solut este dat de relaţia:

unde dR şi dM reprezintă distanţele lineare

măsurate de la linia de start până la
mijlocul spotului respectiv până la frontul
de solvent. Valorile pentru RF pot varia de
la 1 pentru soluţii care nu sunt întârziaţi şi
care migrează odată cu frontul până la o
valoare apropiată de 0, pentru soluţii care
nu interacţionează cu faza mobilă. Trebuie
notat că dacă spoturile nu sunt simetrice,
cum de altfel se întâmplă frecvent,
măsurarea dR se efectuează de la linia de
start până în punctul de maximă intensitate
al spotului.
 Variabilele care influenţează factorul de retenţie

Pentru a obţine cele mai corecte valori ale RF, este nevoie de o precizie mare şi o mare
reproductibilitate. Cei mai importanţi factori de care depinde exactitatea (determinare magnitudinii
RF), includ grosimea stratului de suport, deci a fazei staţionare, contaminarea (conţinutul în umiditate)
a fazelor mobilă şi staţionară, temperatura, gradul de saturaţie a camerei de developare cu vapori de
fază mobilă ori mărimea probei. Un control complet al acestor factori variabili nu sunt în general
controlabili în condiţii practice. Ameliorarea parţială a acestor efecte poate fi deseori realizată totuşi
prin substituirea cu un factor relativ de retenţie RX a factorului de retardare, RF care reprezintă
raportul dintre distanţa parcursă de analit şi distanţa parcursă de o substanţă standard.

Aplicaţii ale cromatografiei pe strat subţire

Datele obţinute dintr-o singură cromatogramă de obicei nu furnizează informaţii suficiente

pentru a permite identificarea diverselor specii prezente într-un amestec din cauza variabilităţii
valorilor RF cu mărimea probei, stratul subţire cromatografic şi condiţiile existente în timpul
cromatografierii. În plus, întotdeauna există posibilitatea ca doi soluţi diferiţi să manifeste
proprietăţi cromatografice asemănătoare, cu valori RF identice sau foarte apropiate în condiţiile
de separare date.
Autentificarea unei substanţe prin utilizarea unei standard.

O metodă care deseori furnizează date importante în tentativa identificării

unor componente din probă este cea de aplicare pe placa cromatografică a
unui spot cu conţine un compus din specia căutată purificată ce este probabil
prezentă în cea necunoscută. Se compară apoi valorile RF între spotul
substanţei necunoscute cu cel al standardului. Valorile identice ale celor două
RF furnizează o dovadă solidă a identităţii celor două componente ale probei
(figura de mai jos). Totuşi, confirmarea este întotdeauna necesară. Un test uşor
de confirmare este de a repeta experimentul cu faze mobile şi staţionare
diferite cât şi cu reactivi de vizualizare diferiţi.

Separarea unor derivaţi xantinici pe un

suport de cromatografie pe strat subţire
tip C-18 de fază inversă. Faza mobilă:
metanol/ K2HPO4, 0,l M (55:45 v/v).
Detecţie: vapori de iod. Timpul de separare
cromatografică: 1 oră, valorile RF:
teobromină, 0,68; teofilină, 0,56; cafeină,
0,44; 3-izobutil-1-metil xantină, 0,21.
 Cromatografia planară bidimensională
Figura de mai jos ilustrează separarea unor aminoacizi dintr-un amestec prin
cromatografiere în două dimensiuni. Proba se plasează în colţul unei plăci cromatografice de
formă pătrată. Cromatografierea se realizează în direcţie ascendentă, în solventul A. Acest
solvent este apoi îndepărtat prin evaporare iar placa cromatografică este rotită cu 90o, după
care se cromatografiază ascendent cu solventul B.

Cromatogramă bidimensională pe strat subţire

(silica gel) a unor aminoacizi. Solventul A:
toluen/2-clor etanol/piridină. Solvent B:
cloroform/alcool benzilic/acid acetic.
Aminoacizi: (1) acid aspartic, (2) acid
glutamic, (3) serină, (4) β-alanină, (5) glicine,
(6) alanină, (7) metionină, (8) valine, (9)
izoleucină şi (10) cisteină.
 Analize cantitative

O estimare semicantitativă a cantităţii de component prezent

poate fi obţinută prin compararea ariilor spoturilor cu cea a
standardelor. Date mai exacte pot fi obţinute prin răzuirea
spotului de pe placa cromatografică, urmată de extracţia sa de
pe aceasta după care se recurge la măsurarea printr-o analiză
fizico-chimică convenabilă. A treia metodă este cea care se
realizează prin scanarea cu ajutorul unui densitometru şi care se
pretează la determinări ale radiaţiei emise de spot, prin
fluorescenţă ori prin reflecţie
 Cromatografia planară în laboratorul clinic

În laboratoarele clinice, estimarea acizilor

liberi în fluidele biologice şi ţesuturi prin
cromatografiei în strat subţire conduce la
AMINOACIZI punerea unor diagnostice în maladii
congenitale ale metabolismului
aminoacizilor, cistinuria clasică, cistinuria
heterozigotă, aminoacidopatii, sindrom
Alport,.etc.

În scopuri clinice, măsurarea acizilor biliari

ACIZI BILIARI din specimene biologice (bilă, ser, conţinut
duodenal şi extracte fecale proaspete)
conduce la punerea unui diagnostic în
cazul unor maladii hepatice şi intestinale
 Multe maladii sunt însoţite de intensificarea eliminării unor diverse
CARBOHIDRAŢI zaharuri în probele biologice. Detecţia şi identificarea lor constituie o
etapă importantă în stabilirea diagnosticului.
profilurile lipidice se modifică în diverse patologii, ceea ce conduce la
interesul crescut în determinarea lor în diagnosticul clinic.
Investigarea lipidelor serice, în special a esterilor de colesterol reprezintă
LIPIDE o valoare mare în diagnosticul unor maladii hepato-funcţionale ori în maladiile
legate de metabolismul lipidic. În maladiile legate de stocarea lipidelor,
acumularea de colesterol se manifestă la nivelul sângelui şi a ţesuturilor. O
hiperlipidemie este corelată cu factorii de risc în maladiile cardiovasculare.
Analiza lipidelor serice este de asemenea importantă în maladiile pielii.

Fosfolipidele sunt lipide polare şi includ fosfogliceridele şi

sfingolipidele. Acestea sunt constituenţi amfipatici ai membranei,
jucând un rol esenţial în sinteza lipoproteinelor plasmatice.
Determinarea fosfolipidelor este deosebit de importantă în
biomedicină. Fosfolipidele de suprafaţă au o influenţă importantă în
FOSFOLIPIDE comportamentul mecanic al plămânilor. Studiile clinice la sarcinilor de
risc crescut apelează deseori la determinarea satusului de maturitate a
plămânului fetal. Măsurarea fosfolipidelor din fluidul amniotic precum a
raportului lecitină/sfingomielină se realizează prin analize de
cromatografie pe strat subţire, predicţionând astfel maturitatea
plămânului fetal.
 Porfirinele sunt derivaţi tetrapirolici cu o structură porfinică,
fiind intermediari chimici în sinteza hemoglobinei, mioglobinei ori
a altor pigmenţi respiratori, precum citocromii. Detecţia şi
identificarea porfirinelor şi ai precursorilor acestora în probele
PORFIRINE biologice sunt de o importanţă terapeutică uriaşă. Ele sunt
analizate în chimia clinică în scopul diagnosticării unui grup de
maladii denumite porfirinemii, rezultate ale alterării biosintezei
hemului. Acumularea şi supraproducţia a acestor produşi
intermediari în ţesuturi, sânge, urină ori în fecale indică blocarea
metabolică în sinteza hemului. Aceste maladii sunt asociate cu
manifestări acute şi/sau cutanate.
Prostaglandine reprezintă una dintre cele mai biologic active
familii de compuşi. Ele sunt acizi graşi C20 nesaturaţi cu un inel
PROSTAGLANDINE ciclopentan. Derivaţii care conţin această structură
(prostaglandine, prostacicline şi tromboxani) sunt cunoscuţi sub
denumirea comună de prostanoizi. Prostaglandine se manifestă
la concentraţii de ordinul nanogramelor până la cel al
picogramelor, în ţesutul uman şi în fluidele corporale. Ele au
diverse acţiuni biologice iar rolul lor fiziologic complet nu este încă
bine cunoscut.
 Hormonii steroizi joacă un rol vital în organismul uman, fiind
definiţi prin funcţia lor biologică. Nivelurile hormonilor steroizi
activi ser şi produşii lor de eliminare din urină sunt de mare
semnificaţie clinică. Hormonii glucocorticoizi contribuie la
activitatea adipogenică în serul uman. Maladia Addisons este
cauzată de deficienţă glucocorticoidică în timp ce în sindromul
Cushings se constată o secreţie masivă. Concentraţiile de
steroizi estrogenici din urina umană sunt importante în timpul
sarcinii.. Progesterona este de asemenea implicată în
HORMONI STEROIZI pregătirea şi menţinerea sarcinii. Niveluri crescute ale pregnan-
3α, 20α-diol şi allopregnan-3α, 20α-diol urinare au fost
observate în sarcinile timpurii. Creşterea 6β-hidroxicortizolului
urinar este observată în timpul sarcinii ori în cazuri de
hiperadrenocorticism. Aldosterona urinară este analizată în
scopul identificării pacienţilor suferinzi de hiperaldosteronism.
Excreţia urinară de metaboliţi andro- şi glucocorticoizi este
studiată la pacienţi suferinzi de cancer gastric în timp ce
excreţia de dehidroepiandresteronă, şi în particular
eticolanolonă reprezintă un marker în cancerul de sân.
 ALŢI COMPUŞI DE INTERES CLINIC

 Gangliozidele reprezintă un grup variat de glicosfingolipide compuse dintr-o catenă

lungă de bază şi acid gras, care împreună formează partea ceramidică (N-
acilsfingozina). Aceasta este legată de un carbohidrat. Gangliozidele sunt caracterizate
de prezenţa uneia sau mai multor unităţi de acid sialic în catena oligozaharidică.
Compuşii de bază sunt acidul N-acetilneuraminic (Neu5Ac) şi acidul N-glicolilneuraminic
(Neu5Gc), despre care se cunoaşte că joacă roluri cruciale în diverse funcţii biologice.
Gangliozidele sunt localizate pe partea externă a membranei plasmatice, reprezentând
un mic procent din lipidele totale. Ele au fost de asemenea identificate în asociere cu
organitele celulare. Gangliozidele au un rol important în recunoaşterea celulă-celulă,
adeziune celulară, modularea proliferării şi difernţierii celulare, fiind expresate la niveluri
înalte pe suprafaţa celulelor umane, cel mai adesea în ţesuturile nervoase.
 STUDII DE BIODISPONIBILITATE
Există o experienţă deosebită în utilizarea cromatografiei pe stat subţire în analiza
medicamentelor ori a drogurilor din probe biologice din medicină, toxicologie, farmacologie,
medicină legală, etc. Analizele de medicamente ori droguri se realizează în probe biologice diverse:
sânge, urină, salivă, conţinut gastric, ţesuturi, etc. iar tipul şi cantitatea de probă luată în analiză
este funcţie de substanţa care se doreşte a fi determinată. De exemplu, în screening-ul abuzului de
medicamente se utilizează urina deoarece modalitatea de achiziţie a specimenului este non-
invazivă iar cele mai multe medicamente pot fi detectate chiar după o durată rezonabilă de timp de
la ingestie.
Analiza drogurilor în laboratoare clinice se realizează prin numeroase tehnici precum
imunoanaliza, metode cromatografice ori de spectrometrie de masă; alegerea optimă de analiză
depinde de cost, efort uman ori tipul de medicament. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia
pe strat subţire cu suport de silicagel este deosebit de utilizată în cazul programelor de screening
pentru medicamente. Toate probele care se analizează, sunt supuse unei trepte de pre-purificare,
înaintea trimiterii lor la analizele cromatografice. S-a dezvoltat o metodă computerizată de
identificare a post cromatografică a tipurilor de compuşi, procesul fiind utilizat la studiile de
screening a unor noi medicamente. Programul computerizat prelucrează datele cromatografice
obţinute experimental cu cele obţinute pentru medicamente ori droguri cunoscute ori a metaboliţilor
acestora regăsiţi în ser, urină, ori alte specimene.

Cromatografia pe strat subţire rămâne cea mai utilizată tehnică în studiile de

toxicologie şi în programele de screening de abuz de drog/medicament.
Sistemele de eluţie recomandate sunt: acetat de etil/metanol/hidroxid de
amoniu pentru opioizi şi droguri de bază, cloroform/acetonă pentru
barbiturice şi alte droguri acide, heptan/eter etilic/acid acetic şi
cloroform/metanol/hidroxid de amoniu pentru canabinoizi.
 APLICAŢII MODERNE ALE CROMATOGRAFIEI PLANARE

Cromatografia pe strat subţire reprezintă metoda cea mai utilizată

metodă de detecţie, separare şi monitorizare a fosfolipidelor şi a
glicosfingolipidelor precum şi a unor compuşi de sinteză ori a unor metaboliţi
ai acestora. În particular, procedeul cromatografic pe strat subţire acoperit
cu anticorpi monoclonali a contribuit la dezvoltarea analizelor structurale a
glicosfingolipidelor. Există o serie de dificultăţi în extracţia lipidelor prin
utilizarea suporturilor cromatografice pe strat subţire de performanţă înaltă
deoarece contaminarea silicagelului şi datorită scurgerii stratului subţire de
silicagel în timpul tratamentului. Dacă glicosfingolipidele sunt transferate de
pe placa HPTLC pe o membrană de plastic cu proprietăţi hidrofobe, această
dificultate este surmontată.
Folosind avantajul unei bune separări a lipidelor pe un suport HPTLC şi
de imobilizare a acestora pe o membrană s-a dovedit că transferul optim se
realizează pe membrane de difluorură de poliviniliden (PVDF), comparativ
cu membranele de nitroceluloză, utilizate iniţial care s-au dovedit a avea o
eficienţă de transfer scăzută, fără reproductibilitate. Membranele de PVDF
sunt foarte stabile la încălzire şi la diferiţi solvenţi organici iar în plus reţin
lipidele cu o eficienţă deosebită.
Reprezentarea schematică a metodei de transfer
de pe suportul cromatografic pe o membrană
sintetică, TLC blotting
 Această metodă a fost de numită tehnica de transfer de pe suportul
cromatografic, pe membrane sintetice, TLC blotting. Procedeul este
utilizat în studiul complexelor lipidice şi este aplicabil în cercetarea
biochimică a lipidelor. Printre utilizările procedeului amintim:
 Purificări de laborator a complexelor lipidice;
 Analize de spectrometrie de masă a complexelor lipidice, pe
membrane PVDF;
 Analize de legare a microorganismelor pe membrane cu un lipid
imobilizat;

STUDIUL INTERACŢIILOR LIPID–PROTEINĂ PE MEMBRANE, CU UN LIPID

IMOBILIZAT.
IMUNOCOLORAREA MEMBRANELOR DE DIFLUORURĂ DE POLIVINILIDEN.

Antigenii lipidici pot fi imunocoloraţi, direct pe membrană. După transfer,

membranele de difluorură de poliviniliden sunt imersate într-o soluţie de albumină
serică bovină pentru a bloca legarea nespacifică a proteinelor după care se
incubează peste noapte în soluţia anticorpului primar. Legarea primului anticorp la
antigenul lipidic se detectează prin reacţia cu un al doilea anticorp (de obicei IgM
anti-şoarece) ce este cuplat cu peroxidază. Tratamentul cu substrat al acestei
enzime conduce la produşi coloraţi care se vor evidenţia specific la locul de legare
al primului anticorp. Limita inferioară de detecţie pe membrane de PVDF este de
aproximativ 1/5 din antigen, din cea de detectare pe placa cromatografică ceea ce
indică faptul că glicosfingolipidul este concentrat numai pe o parte a membranei
alături de faptul că nu se manifestă nici un fenomen de natură chimică în timpul
procesului de transfer.
 TLC BLOTTING ÎN PURIFICAREA COMPLEXELOR LIPIDIC

A fost dezvoltată o tehnică de purificare a glicosfingolipidelor şi a

fosfolipidelor, care utilizează tehnica de TLC blotting de pe plăcile de
cromatografie pe strat subţire de performanţă înaltă. Astfel, glicosfingopidele
sau fosfolipidele separate pe plăci HPTLC sunt evidenţiate cu un reactiv pe
bază de primuline (C21H14N3NaO3S3, alte denumiri comerciale Direct Yellow 59,
Primuline Yellow, etc.) care permite detecţia cu mare sensibilitate a
componentelor lipidice (figura de mai jos.). Primulinele sunt derivaţi de
dehidrotiotoluidină, formaţi printr-o reacţie de fuziune cu para toluidină şi sulf, la
temperatură înaltă.
 ANALIZE TLC BLOTTING/SPECTROMETRIE DE MASĂ

ANALIZE DE LEGARE A MICROORGANISMELOR PE MEMBRANE CU LIPID

IMOBILIZAT

STUDII ALE INTERACŢIEI LIPID-PROTEINĂ PE MEMBRANE, CU LIPID

IMOBILIZAT
 Gel-filtrarea pe strat subţire

Caracterizarea structurală a părţii carbohidrat a unei glicoproteine implică

determinarea a mărimii unităţii zacharidice. Acest parameteru este uzual calculat din
compoziţia şi masa moleculară a glicopeptidelor care sunt obţinute după degradarea
proteolitică a glicoproteinei intacte. Masa moleculară este în mod obişnuit estimată prin
metode precum echilibrul de sedimentare prin ultracentrifugare şi cromatografia de gel
filtrare.
Tehnica de gel filtrare pe strat subţire a devenit o alternativă atractibilă de
determinare a maselor moleculare a glicopeptidelor datorită vitezei, adaptabilităţii la
cantităţi mici de probă, marii puteri de rezoolvare, posibilităţii de utilizare a unor solvenţi
denaturanţi, şi a utilizării unei aparaturi ieftine. Această tehnică a fost dezvoltată pentru
estimarea masei moleculare a unor proteine (> 12.000 daltoni) utilizând solvenţi
nedenaturanţi ori denaturanţi.
 CROMATOGRAFIA CU FAZĂ INVERSĂ PE COLOANĂ A PROTEINELOR
Cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă reprezintă o tehnică bine stabilită de izolare,
analiză şi de elucidare a structurii peptidelor şi proteinelor. Utilizarea sa în izolarea unei proteine ori
de purificare a prezentat un maximum de interes în purificarea unor proteine până în momentul
dezvoltării unor suporturi de cromatografie de schimb ionic ori de interacţie hidrofobă de înaltă
eficienţă, care în momentul de faţă sunt apte a realiza nivele de rezoluţie echivalente cu cele
obţinute prin cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă, fără a prezenta riscul de denaturare
a probei şi astfel de pierdere a activităţii biologice. Cu toate acestea există o multitudine de aplicaţii
în care denaturarea poate fi neglijată ori pot fi tolerate concentraţii crescute de modificator organic
(este cazul analizelor de puritate, studii structurale ori purificări micropreparative înaintea
microsecvenţierii). Tehnica este deseori utilizată în biotehnologie în monitorizarea unor procese,
studii de puritate sau de determinări ale stabilităţii.
 Principiul separării în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază
inversă
Aplicarea unui gradient de solvent este în mare superioară eluţiei izocratice deoarece se
realizează într-un cadru de timp rezonabil iar împrăştierea peak-ului este redusă, ceea ce creşte
sensibilitatea metodei. În eluţia în gradient în cazul cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază
inversă, proteinele sunt reţinute esenţial pe baza caracterului lor hidrofob. Mecanismul de retenţie
poate fi considerat atât un fenomen de adsorbţie a solutului la suprafaţa fazei staţionare hidrofobe
cât şi un proces de partiţie între faza mobilă şi cea staţionă.
În primul caz, retenţia este legată de suprafaţa totală interfacială a suportului împachetat de
fază inversă, fiind exprimat prin coeficientul de adsorbţie, KA. Retenţia se bazează pe asocierea
hidrofobă între solut şi liganzii hidrofobi de pe suprafaţă. Prin creşterea tăriei solventului a fazei
mobile, forţele de atracţie sunt din ce în ce mai reduse proces ce conduce la eluţia solutului.
Procesul poate fi privit ca fiind condus în mod entropic şi endotermic, de exemplu, atât ΔS cât şi ΔH
sunt pozitive. Prin relaţia dintre factorul de capacitate a solutului k‟ şi proprietăţile fazelor mobilă şi
staţionară, teoria solvofobică permite predicţia efectulului modificatorului organic a fazei mobile,
tăria ionică, reactivul de împerechere a ionului, tipul de ligand al suportului împachetat precum şi
alte variabile ce implică retenţia cromatografică a proteinelor.
În al doilea caz se consideră o partiţionare a solutului între fazele mobilă şi staţionară, ultima
fiind văzută ca o fază încărcată hidrofob. Acest sistem se aseamănă cu un sistem bifazic n-
octanol/apă a cărui selectivitate este exprimată prin coeficintul de partiţie P a solutului. În esenţă,
procesul efectiv este în mare parte dependent de organizarea moleculară a catenei n-alchil a
catenei legate în structura suportului de fază inversă în stare solvatată, de mărimea şi conformaţia
solutului.
 Retenţia proteinei în cazul cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă
este guvernată în principal de suprafaţa proteinei şi nu de chimia suprafeţei
suport. Deşi o serie de proteine prezintă o pierdere a activităţii în timpul
cromatografiei de înaltă rezoluţie cu fază inversă, altele îşi menţin total
activitatea biologică. Astfel, forţele hidrofobe necesare legării de faza inversă
competiţionează cu cele necesare menţinerii structurii secundare şi terţiare a
proteinei. Prin constrângeri sterice, hidrofobe şi ionice aceste proprietăţi
structurale definesc o suprafaţă cromatografică sau o „amprentă” a proteinei
care la rândul ei defineşte legarea de faza inversă. Acest concept al ataşării
multipunctuale a proteinei la suprafeţele de adsorbent este consecventă cu o
amprentă cromatografică relativ mare pentru o proteină comparativ cu cea a unei
molecule mici.
 Componentul organic al fazei mobile
Cei mai populari solvenţi organici sunt acetonitrilul, 1-propanolul şi 2-propanolul (alcoolul
izopropilic). Propanolii sunt mult mai vâscoși decât acetonitrilul, ceea ce conduce la o mai mare
presiune pe coloană însă acest fenomen nu este important în condiţiile în care se utilizează viteze
de curgere mici şi coloane cromatografice scurte. Concentraţia de acetonitril necesară eluţiei unei
proteine este considerabil mai mare decât concentraţia echivalentă de 2-propanol, aproximativ
jumătate faţă de primul solvent. S-a evidenţiat de asemenea că acetonitrilul este în mod intrinsec
mult mai denaturant decât alcoolii, procesul de recuperare fiind deseori mai mare când se utilizează
faze mobile care conţin propanol, în special în cazul în care se separă o serie de proteine precum
ovalbumina. Acetonitrilul şi 2-propanolul pot fi îngheţaţi în amestecuri gheaţă carbonică/amestecuri
de alcooli şi astfel proba poate fi liofilizată. Toţi solvenţii trebuie să fie de cea mai înaltă caltate
posibilă.
 Aditivi minori la faza mobilă
Componenţii minori cei mai utilizaţi în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă sunt
acizii perfluoroalcanoic (acid trifluoroacetic - TFA şi acidul heptafluorobutiric, de exemplu). Aceştia
par a disocia - solubiliza proteinele în majoritatea solvenţilor organici utilizaţi în mod curent. TFA
este preferat în comparaţie cu alţi acizi disociatori deoarece este complet volatil şi nu va coroda
coloana de oţel. TFA acţionează de asemenea ca un agent de împerechere de ioni, slab hidrofob.
Cele mai multe coloane utilizate în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă sunt pe bază
de silice şi pe lângă supresia ionizării silanolului în condiţii acide (şi în consecinţă eliminarea
interacţiilor ionice) ele sunt mult mai stabile la valori scăzute de pH. Totuşi, trebuie avut în vedere
că multe polipeptide îşi vor pierde structura terţiară la aceste pH-uri.
 Cromatografia cu fază inversă oferă două capabilităţi importante în purificarea şi izolarea unor
proteine sau peptide pentru analizele de proteomică, după cum urmează:
• Înaltă rezoluţie.
• Compatibilitate cu spectroscopia de masă.
Proteinele şi peptidele ce diferă printrun singur rest de aminoacid pot fi deseori separate prin
cromatografie de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC), după cum se observă în figura de
mai jos.
Literatura ştiinţifică conţine multe exemple de separare a unor polipetide similare precum
separarea factorului insulin-like de creştere ce diferă printr-o metionină oxidată de analogul
neoxidat ori a interleukin-2 muteinelor ce diferă printr-o substituţie la un singur aminoacid. În alt
caz, s-au separat variante de insulină care posedă uşoare diferenţe în secvenţa de aminoacizi.

Separarea variantelor de insulină (în ordinea

de eluţie: pui, bovină, ovină, de iepure, de om,
porcină, de şobolan tip I şi de şobolan tip II).
Insulina de iepure conţine o reonină, iar cea
de om o serină, o diferenţă de o grupare metil
într-o proteină de 5300 daltoni. Condiţii de
separare prin RP-HPLC: coloană C4, separare
în gradient de acetonitril cuprins între 27% şi
30% acetonilitril in H2O, în prezenţa a 0,1%
TFA, viteză de curgere 1,5 ml/min.
 Mecanismul separării polipeptidelor prin cromatografie cu fază inversă

Cromatografia cu fază inversă separă polipeptide printr-un mecanism de adsorbţie,

cu toate că în cazul moleculelor mici, acestea sunt separate printr-un mecanism de
echilibru care distribuie moleculele între fazele staţionară şi mobilă în timpul trecerii
lor prin coloană, în timp ce polipeptidele mici fiind prea mari pentru a pătrunde în
faza staţionară hidrofobă, sunt adsorbite de suprafaţă şi desorbite odată cu
creşterea concentraţiilor de fază mobilă (figura de mai jos).

Mecanismul retenţiei de proteine prin RPC. Proteinele pătrund în coloană şi sunt adsorbite la
suprafaţa hidrofobă. Datorită mărimii lor, numai o porţiune a acestor proteine „braţul
hidrofob” se leagă la adsorbent. La adăugarea unor concentraţii precise de solvent organic
proteinele sunt eliberate şi părăsesc suprafaţa coborând de-a lungul colonei.
 În momentul injectării pe coloană, polipeptidele se leagă la suprafaţa
adsorbentului şi se desorb numai când solventul organic atinge o concentraţie
specifică şi unică. Odată desorbite, ele vor interacţiona foarte slab cu suprafaţa
adsorbentului fiind astfel eluate le-a lungul coloanei. Polipeptidele pot fi
imaginate ca o „aluviune” pe faza staţionară, cu cea mai mare parte a moleculei
expusă la faza mobilă şi numai o parte a moleculei, denumită picior hidrofob, în
contact cu suprafaţa de fază inversă.
Diferenţele în „braţul hidrofob” al polipeptidelor rezultă din secvenţa de
amioacizi şi din diferenţele de conformaţie (fenomen discutat în cazul
hidrofobicităţii proteinelor). Desorbţia are loc într-o fereastră îngustă de
concentraţie al unui modificator organic. Astfel, retenţia polipeptidelor este
completă până la atingerea unei concentraţii critice de modificator organic când
acestea sunt rapid desorbite. Sensibilitatea desorbţiei unui polipeptid la o
concentraţie precisă de modificator organic conduce la selectivitatea RPC în
separarea polipeptidelor, în peak-uri în general înguste. Peptidele mici se
desorb mai rapid odată cu schimbarea concentraţiei de modificator organic
decât moleculele mici, totuşi, ele se desorb mai gradual decît proteinele ceea
ce sugerează un mecanism hibrid de separare.
 CROMATOGRAFIA CU PERECHI DE IONI

Cromatografia cu perechi de ioni este un tip de cromatografie de fază inversă

utilizată la separarea şi determinarea unor specii ionice. Faza mobilă în cromatografia
cu perechi de ioni este constituită din tampoane apoase care conţin un solvent
organic precum metanolul ori acetonitrilul şi un compus ionic care conţine un
contraion cu sarcină opusă analitului. Contraionul este un ion care se combină cu ionii
analitului pentru a forma o pereche de ioni, neutră, specie care se reţine pe un suport
de fază inversă.

Sisteme cromatografice cu fază inversă pentru perechi de ioni.

Tipul fazei
Proba Faza mobilă Contraion
staţionare
Amine HClO4, 0,1 M /H2O/acetonitril CIO4- FLa
H2O/CH3OH/H2SO4 C12H25SO3- FL
Acizi carboxilici pH 7,4 (C4H9)4N+ FL
pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb

Acizi sulfonici H20/C3H7OH (C16H33)(CH3)3N+ FL

pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb
pH 3,8 Bis-(2-etilhexil)fosfat Lc
Coloranţi pH 2-4;H20/CH3OH (C4H9)4N+ FL
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBȚIE
Cromatografia de adsorbţie, ori cromatografia lichid-solid, reprezintă forma clasică a
cromatografiei lichide, care a fost introdusă, pentru prima dată, de către Tswett, la începutul
secolului douăzeci. În ultimii ani ea a fost adaptată, devenind o metodă importantă în cromatografia
lichidă de înaltă presiune (HPLC).
În cromatografia de adsorbţie compuşii ce se doresc separaţi sunt adsorbiţi pe suprafaţa unui
material solid, fiind apoi desorbiţi din solidul adsorbent prin eluţie cu un solvent. Separarea
compuşilor depinde de balanţa relativă dintre afinitatea compuşilor pentru adsorbent şi solubilitatea
lor în solventul utilizat. Afinităţile relative ale compuşilor ce se doresc separaţi sunt funcţie de natura
chimică a substanţei, de natura solventului şi de natura adsorbentului. Studiile de cromatografie au
arătat că adsorbenţii cei mai utilizaţi sunt silicagelul, cărbunele, celuloza, amidonul, gelurile de
fosfat de calciu, hidroxilapatita şi sucroza. Cei mai utilizaţi solvenţi sunt: hexanul, benzenul, eterul
de petrol, eterul etilic, cloroformul, clorura de metilen, diverşi alcooli (alcoolii etilic, propilic, n-butilic
şi t-butilic), diverse tampoane apoase ori soluţii de săruri, unele în combinaţii cu solvenţi organici.

Cromatografia de adsorbţie: A = adsorbent, S = probă,

ES = solvent de eluţie. (1) aplicarea probei la capătul
superior al coloane cromatografice; (2) adsorbţia
probei pe suportul adsorbent. (3) adăugarea de solvent
de eluţie;. (4) şi (5) fracţionarea parţială a
componentelor 2 si 3; (6) fracţionarea completă a
probei; (7) şi (8) Separarea tuturor celor trei
componente la diverse stadii de eluţie; (9) eluţia
primului component de pe coloană.
 Adsorbenţii solizi utilizaţi în mod obişnuit sunt alumina, silicagelul, cărbunele,
celuloza, amidonul, gelurile de fosfat de calciu, hidroxilapatita şi sucroza. În
cromatografia modernă fazelele staţionare cel mai mult utilizate în sunt silicea şi
alumina, ultima dintre acestea fiind cea mai preferată în cele mai multe aplicaţii
datorită capacităţii sale înalte de încărcare cu probă şi datorită domeniului larg de
forme utilizabile. Solvenţii obişnuit utilizaţi sunt: hexanul, benzenul, eterul de
petrol, dietil eterul, cloroformul, clorura de metilen, diverşi alcooli (etil, propil, n-
butil şi t-butil alcooli), alături de diferite tampoane apoase şi săruri, unele în
combinaţie cu solvenţii organici.
 Cu puţine excepţii, caracteristicile de adsorpţie a două substanţe se pot
compara, ordinea timpilor de retenţie fiind: olefine < hidrocarburi aromatice <
halide, sulfuri <eteri < nitro-compuşi < esteri ≈ aldehide ≈ cetone < alcooli ≈ amine
< sulfone < suloxizi <amide <acizi carboxilici (suprafeţele de silice şi alumină sunt
înalt polare, eluţiile efectuându-se în mod obişnuit cu faze mobile oarecum mai
puţin polare. Astfel, o serie de cercetători tratează cromatografia de adsorpţie
drept un tip de cromatografie de fază normală.
 APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE ADSORBŢIE

Tehnica cromatografie de adsorbţie este cea mai fezabilă pentru compuşi nepolari
care posedă mase moleculare mai mici de 5000.
Cu toate că există o suprapunere între cromatografia de adsorbţie şi cea de
partiţie, metodele tind a fi complementare.

O aplicaţie caracteristică a
cromatografiei de adsorbţie în
separarea cis- şi trans-pirazolinelor.
Coloană: 100 x 0.3 cm, suport silice
peliculară. Fază mobilă: clorură de
metilen/izooctan 50%. Temperatura:
ambiantă. Viteză de curgere: 0,225
mL/min. Detector: UV, 254 nm.
 CROMATOGRAFIA PE HIDROXIAPATITĂ

O condiţie necesară în oricare strategie de purificare a proteinelor o reprezintă

combinarea tehnicilor care exploatează diferite principii de separare în
scopul atingerii purificării celei mai înalte utilizând un număr cât mai redus
de trepte de purificare. În general, combinări ale unor tehnici precum
cromatografia de schimb ionic, cromatografia de interacţie hidrofobă, cromatografia
de afinitate, cromatografia de afinitate cu metal chelat, cromatografia de excluziune
moleculară şi cromatografia de fază inversă oferă cele mai versatile abordări în
design-ul unui protocol de purificare a proteinelor. Aceasta este datorată faptului că
metodele de separare au la bază principii bine caracterizate şi predictibile. Pentru o
multitudine de raţiuni, cromatografia pe hidroxilapatită (HAP) a căpătat numai o
popularitate marginală ca metodă de purificare a proteinelor. Ea prezintă
comportament cromatografic nepredictibil, o capacitate relativă mică de încărcare a
probei şi proprietăţi de manipulare relativ dificile. Pentru aceste raţiuni, HAP este
deseori considerată drept ultima alegere in metodologia de separare a proteinelor.
Pe de altă parte, cum procesele de adsorbţie-desorbţie a proteinelor diferă
semnificativ de alte tehnici precum de exemplu cromatografia de schimb ionic,
uneori este posibil de a obţine fracţionări a căror calitate nu poate fi realizată prin
alte tehnici cromatografice, unde deseori tehnicile cromatografice convenţionale pot
fi de nefolosit.
 Fosfatul de calciu a fost deseori utilizat în purificarea proteinelor şi a enzimelor cu succese
diferite încă de la începutul cercetării ştiinţifice în domeniu, de către Brucke (1861) în purificarea
pepsinei. În anul 1956, Tiselius şi colaboratorii (1956) au arătat că un suport cromatografic mai
adsorbent de proteine este realizat prin conversia brushitei, Ca3(PO4)2, la hidroxiapatită,
Ca5(PO4)3OH, (Ca10(PO4)6(OH)2) prin fierbere într-o soluţie de NaOH 1% timp de 1 oră. În
continuare, cristalele fine de hidroxiapatită pot fi separate prin decantare înainte de
împachetarea coloanei. Hidroxiapatita leagă mai puternic proteinele native, dar capacitatea de
retenţie scade semnificativ în cazul proteinelor supuse procesului de denaturare. Retenţia
proteinelor pe suportul de hidroxiapatită nu este uşor predictibil, precizabil. Deşi hidroxiapatita
leagă atât proteine acide cât şi pe cele bazice nu se poate vorbi de un mecanism simplu
de cromatografie prin schimb ionic în comportamentul cromatografic observat. Structura
de suprafaţă a cristalelor de hidroxiapatită este reprezentată de un mozaic de situsuri de
adsorbţie pozitive (ionii de calciu) şi negative (ionii fosfat). Adsorbţia unor componenţi
anionic se realizează la domeniul de sarcini pozitive reprezentat de ionii de calciu (situs C), în
timp ce domeniile de sarcini negative ce cuprind ionii fosfat (situsurile P) pot fi considerate drept
schimbătoare de cationi. Se poate considera astfel HAP drept o tehnică cromatografică de
"pseudo-afinitate" sau drept o metodă de cromatografie de schimb ionic de tip "mixt". La valori de
pH neutre şi alcaline, suprafaţa de hidroxiapatită este încărcată negativ datorită grupărilor fosfat.
 MECANISMUL LEGĂRII PROTEINELOR LA HIDROXIAPATITĂ
Mecanismul legării proteinelor la hidroxiapatită şi de eluţie de pe aceasta a fost
explicitat de către Gorbunoff. El se manifestă prin:
(1) complexarea specifică a grupărilor carboxil proteice cu locii de calciu ale cristalelor
de hidroxiapatită (de exemplu complexe, [HACa-OOC - proteină]) şi prin
(2) atracţia nespecifică dintre grupările amino încărcate pozitiv ale proteinelor şi
sarcinile negative ale hidroxiapatitei (complexe de tipul [HAPO3---H3+N-proteină]).
Astfel, suprafaţa cristalelor de hidroxiapatită prezintă un mozaic de situsuri pozitive (de
calciu) şi negative (de fosfat), suprafaţa coloanei de hidroxiapatită poate fi văzută ca
negativă la un pH egal cu 6.8, la care coloanele de HAP se manipulează în general,
datorită neutralizării parţiale a locilor pozitivi de calciu de către ionii fosfat (figura de mai
jos).

Legarea proteinei la hidroxiapatită. A reprezintă o

proteină bazică în timp ce B este o proteină acidă.
Parantezele duble indicată fenomenul de repulsie în
timp ce liniile punctate sunt legăturile ionice. Săgeata
triunghiulară indică legăturile coordinati
 În aceste condiţii, eluţia de pe coloană poate fi afectată atât ca rezultat
al interacţiilor nespecifice ionice de (de tipul Debye-Huckel) ori ca rezultat
al dezlocuirii specifice ale grupărilor proteice de pe situsul C al
hidroxiapatitei cu care au fost complexate. Din aceste consideraţii rezultă
că:
 Proteinele bazice pot fi eluate de pe mediile de hidroxiapatită cu soluţii
cu molarităţi foarte scăzute (de exemplu 0,005M) de săruri de Ca2+ şi de
Mg2+,
 Proteinele cu valori ale pI cuprinse între 5 şi 8, cu soluţii de MgCl2 1,0
M, şi,
 Proteinele acide cu soluţii fosfat 0,3 M.

În general, HAP este realizată prin eluţie în gradient linear (deseori creat în
domeniul 10 până la 400 mM) tampon fosfat, la un de pH 6,8, alcătuit din
amestecuri echimoleculare de fosfaţi sodiu ori potasiu mono şi dibazici.
Deoarece hidroxiapatita este stabilă numai la valori ale pH-ului mai mari de 5,
tampoanele de eluţie cu pH acid nu trebuiesc să fie utilizate.
 APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI PE HIDROXIAPATITĂ

În tehnicile de cromatografie pe hidroxiapatită, coloana este de obicei echilibrată, în timp ce

proba este aplicată la o concentraţie mică de tampon fosfat la un pH de 6,8. Proba de pe coloană
este apoi developată cu un gradient de concentraţie de tampon fosfat. În funcţie de aplicaţie, în
unele cazuri, un foarte îngust gradient (de exemplu între 0,02 la 0,05 M fosfat) conduce la rezultate
excelente, în timp ce în alte situaţii este necesar un gradient mare, cuprins de exemplu între 0,02 şi
0,35 M fosfat pentru a separare optimă. Figura următoare. ilustrează tehnica de purificare a
ovomucoidului comercial prin cromatografie pe coloană de HAP.

Purificarea ovomucoidului
comercial pe o coloană de
hidroxiapatită. Treapta I conţine
material inactiv cu un maximum de
absorbţie la 260 nm; pe parcursul
treptei a II a se separă ovomucoidul
în formă activă; volumul III conţine
lizozim; ulima treaptă - IV conduce
la separarea unor impurităţi, de
tipul tripsinei şi chimotripsinei.
 Ovomucoidul comercial conţine o multitudine de impurităţi precum
lizozim, ovoinhibitor, conalbumină şi ovalbumină. Profilul cromatografic din
figură arată că la aplicarea a două probe de ovomucoid la o coloană de
HAP echilibrată cu 0,001 M NaCl, spălarea coloanei cu NaCl 0,001 M,
urmată de eluţia în trepte cu 0.01 M PO4, pH 6,8 (pentru a elua
ovomucoidul, o glicoproteină cu o structură deschisă), 0;5 M NaCl (pentru a
elua proteinele bazice precum lizozimul şi ovoinhibitororul) şi 0,5 M PO4
(pentru a epuiza coloana de alte proteine acide) conduce la obţinerea
ovomucoidului într-o formă înalt purificată.

ghid de utilizare a HAP în cromatografie

 În cazul amestecurilor de proteine în mare parte bazice sau dacă se doreşte reţinerea
proteinelor bazice fără o pierdere a proteinelor acide, coloanele se echilibrează cu fosfat,
0,001 M, pH 6.8.
 În scopul separării unor amestecuri de proteine în general acide în special în cazul
glicoproteinelor (sau dacă una din proteinele pe care dorim a se reţine este acidă, în timp ce
este posibilă pierderea unor proteine neutre şi acide, se utilizează coloane echilibrate cu NaCl
(NaCl 0,001 M netamponat).
 Se utilizează coloane echilibrate cu MgCl2 sau CaCl2 (MgCl2 0,001 M sau CaCl2
netamponate) numai pentru proteinele acide care nu se leagă la coloane echilibrate cu NaCl.
 Dacă proba a fost încărcată, coloana trebuie să se spele utilizând acelaşi tampon care a
fost utilizat la echilibrarea coloanei. În general în procedurile de eluţie este necesar a se
urmări separarea proteinelor în ordinea: proteinele bazice se eluează întâi, apoi proteinele
neutre şi în final cele acide.
 :
 Dacă se urmăreşte purificarea unor proteine individuale se utilizează în general
sistemul de tampon fosfat, la o concentraţie potrivită (cu sau fără prezenţa unei alte
săruri). Deoarece NaCl nu reuşeşte de multe ori să elueze multe proteine neutre ori
acide, este necesar deseori a se crea un gradient de NaCl, de obicei cuprins între 0,01 -
0,5 M NaCl, în cazul purificării proteinelor bazice de pe HAP.
 În unele cazuri, deoarece atât NaCl cât şi sulfatul de amoniu nu afectează eluţie
proteinelor neutre sau acide pe HAP, o probă proteică provenită de pe o coloană de
schimb ionic developată cu un gradient de NaCl poate fi încărcată direct pe o coloană
de HAP. În acest context se poate exemplifica purificarea proteazelor din
microorganisme halofile prin cromatografie pe HAP în prezenţa unei soluţii de NaCl de o
concentraţie de 3,4 M. Alte exemple de purificare a proteinelor pe coloană de HAP sunt
reprezentate de izoformele ceruloplasminei umane, anticorpi monoclonali, tubulină,
histone din cromatină, fumarazele citosolice şi mitocondriene din drojdia de bere, etc.
Hidroxiapatita a fost utilizată cu succes în prezenţa detergenţilor neionici (de
exemplu, Triton X-100) pentru purificarea proteinelor membranare precum şi a proteinei
transportoare ADP/ATP, proteinei transportoare a ionului fosfat, a ubiquinol:citocrom c
reductaza ori a citocrom c oxidaza.
 CROMATOGRAFIA DE INTERACŢIE HIDROFOBĂ.

Adsorbţia proteinelor prin cromatografie de interacţie hidrofobă (Hydrophobic Interaction

chromatography, HIC) este favorizată de concentraţii înalte de săruri care structurează apa. În mod
echivalent, contribuţia sărurilor a fost aplicată şi altor clase de adsorbenţi amfifilici ce nu sunt
analogi direcţi HIC.
În 1990, Porath a introdus termenul de cromatografia de adsorbţie promovată de condiţiile
saline (salt-promoted adsorption chromatography, SPAC) pentru a regrupa aceste tehnici
cromatografice ce necesită concentraţii înalte de săruri pentru a determina adsorbţia unei proteine.
Cromatografia de adsorbţie tiofilică (thiophilic adsorption chromatog-raphy, TAC),
cromatografia donor–acceptor de electron (electron donor–acceptor chromatography, EDAC) şi
cromatografia de interacţie hidrofobă (HIC) au fost aşadar incluse în această familie. Efectul sării
asupra adsorbţiei proteinei a fost explicat ca fiind rezultatul unor creşteri nefavorabile ale energiei
libere, ΔG, pentru proteinele nelegate în prezenţa unor concentraţii înalte de săruri. Consecinţa
termodinamică a acesteia o reprezintă favorizarea legării proteinei la un ligand din cauza unei arii
de suprafaţă mai mică a complexului expus solventului şi a cosolventului, altfel spus, forma legată a
proteinei este termodinamic mai stabilă. Eluţia proteinei de pe matrice este apoi realizată simplu,
prin suprimarea sării din tamponul de adsorbţie. În HIC, interacţiile hidrofobe se manifestă între
zone hidrofobe aflate pe suprafaţa proteinei şi liganzii hidrofobi, legaţi la suport.
Primele geluri cu aplicaţii practice pentru HIC au prezentat un caracter mixt, hidrofob.
Adsorbenţii neutrii (alchil şi aril eteri) au fost apoi preparaţi, ultimii conducând la introducerea
suporturilor octil- şi fenil- activate, curent utilizate în acest moment.
 Porath şi colaboratorii au descoperit adsorbţia tiofilică pe suporturi
mercaptoetanol–divinil sulfon agaroză (geluri T). Mecanismul de adsorbţie a fost
interpretat ca implicând ataşarea proteinei în două puncte, la β-mercaptoetanol şi la
braţul de spaţiere divinlsulfonic, posibil printr-o interacţie electron donor–acceptor tiofilic.
Studii ulterioare au demonstrat caracteristici similare de adsorbţie la geluri activate cu
epiclorhidrină la care s-a cuplat 2-mercaptopiridină. S-a mai arătat că adsorbţia
promovată de condiţiile saline a fost eficientă în favorizarea adsorbţiei proteinelor pe un
gel cyanocarbon substitut, tricyanoaminopropen–divinil hidroxipropilsulfon agaroză
(DVS–TCP gel) prin intermediul unor interacţii electron donor–acceptor.
Toate gelurile sus-menţionate necesită concentraţii mari de săruri structurale de apă
pentru a favoriza legarea proteinelor, cu toate că mecanismele de interacţie sunt diferite:
adsorbţie specifică hidrofobă, interacţie tiofilică, respectiv interacţie electron donor–
acceptor.

Cromatografia de interacţie hidrofobă posedă avantajul că hidrofobicitatea

proteinelor conduce la separarea lor pe baza interacţiilor hidrofobe dintre liganzi
hidrofobi imobilizaţi şi regiunile nepolare de pe suprafaţa proteinelor. Adsorbţia
creşte odată cu creşterea concentraţiei de sare în faza mobilă iar eluţia se
realizează prin scăderea concentraţiei de sare a eluentului. Din acest motiv, se
poate utiliza şi termenul de „adsorbţie dependentă de sare” pentru acest tip de
cromatografie.
 Diferitele tipuri de eluţie pot fi utilizate pentru purificarea amestecurilor complexe de proteine
care ar fi dificil de separat utilizând alte tehnici cromatografice. De fapt, HIC a fost utilizată cu
succes în scopuri de separare pe baza existenţei unor caracteristici complementare de legare faţă
de alte tehnici de cromatografiere a proteinelor. Van Oss şi colaboratorii au arătat că forţele van der
Waals sunt factorii majori ce contribuie la interacţiile hidrofobe („forţe interfaciale”) în ciuda
mecanismului complex implicat. Astfel, alterarea structurală a biomoleculelor este minimă şi
activitatea lor biologică este menţinută prin utilizarea HIC, dată interacţiei mai slabe decât
cea regăsită în cazul interacţiei afine, schimbului de ioni sau a cromatografiei de fază
inversă (RPC). HIC reprezintă o cale alternativă de exploatare a proprietăţilor hidrofobe a
proteinelor, realizată într-un mediu mai polar şi mai puţin denaturant decât RPC, după cum această
tehnică necesită utilizarea unor solvenţi nepolari pentru eluţia proteinelor datorită legării puternice la
adsorbent.
Cromatografia de interacţie hidrofobă a fost descrisă pentru prima dată de către Tiselius în
1948, care a notat faptul că o serie de compuşi precum coloranţii pot fi reţinuţi de către hârtia de
filtru în prezenţa unor soluţii de sulfat ori de fosfat, fenomen denumit cu expresia de cromatografie
de extracţie cu ajutorul sărurilor (salting-out chromatography). După cum şi numele o sugerează,
HIC este o tehnică de separare bazată pe interacţiile dintre proteine şi o fază staţionară
insolubilă, nepolară imobilizată. HIC este complementară cromatografiei de schimb ionic şi
cromatografiei de excludere moleculară, iar împreună cu tehnicile de separare mai sus
enumerate reprezintă cele trei mecanisme distincte şi generale de retenţie disponibile unui
biochimist pentru purificarea proteinelor în aplicaţiile proteomice. Cromatografia lichidă de
înaltă performanţă cu fază inversă (RPC) poate fi aplicată serial la fracţiile colectate după HIC şi
cromatografia de schimb ionic pentru purificarea ulterioară sau de îndepărtare a sărurilor.
 Cu toate că atât HIC cât şi cromatografia cu fază inversă sunt metode de separare bazate pe
interacţia proteinelor cu grupările hidrofobe ale fazei staţionare sunt bine de cunoscut diferenţele
fundamentale ce există între ele. În HIC, interacţiile slabe hidrofobe dintre proteine şi faza nepolară
staţionară sunt mediate prin concentraţii mari de săruri antichaotrope (Figura de mai jos) în timp
ce în cromatografia de fază inversă (RPC) aceste interacţii sunt mediate prin intermediul
modificatorilor organici.

Reprezentarea schematică a principiului de

separare prin HIC. După cum sărurile neutre conduc la
precipitarea proteinelor, concentraţiile mari de săruri
conduc la apariţia unor interacţii între zonele
hidrofobe de pe suprafaţa proteinelor ceea ce are ca
rezultat precipitarea acestora din soluţiile apoase.
Totuşi, prin creşterea concentraţiei de săruri chiar
până la punctul de precipitare, prin utilizarea unor
concentraţii mai diluate de proteină şi prin expunerea
soluţiei proteice la o matrice slab hidrofobă
imobilizată, proteinele se leagă la matricea de pe
coloană mai uşor decât să precipite. Sub aceste
condiţii proteinele îşi menţin conformaţia nativă (de
exemplu proprietatea biologică). Aceasta este o
consideraţie importantă în condiţiile purificării unor
enzime, eficienţa separării putând fi realizată prin
monitorizarea activităţii lor.
 Mai puţin probabil în cazul RPC, unde fazele mobile şi organice au tendinţa
de a deplia (dezmembra, denatura) proteinele, faza staţionară împachetată şi
condiţiile de operare ale HIC sunt alese astfel încât menţin proteinele în
conformaţiile lor native, biologic active. În HIC, liganzii slab hidrofobi (comparativ
cu împachetările din RPC), cum ar fi grupările nepolare cu catenă scurtă fenil ori
octil, sunt ataşate chimic la matrice hidrofile, când se manifestă interacţii distincte
între proteine şi suprafaţa fazei staţionare, prin utilizarea unei faze mobile ce
conţine săruri antichaotrope de tărie ionică mare. Contrar RPC, în cazul HIC sunt
utilizate densităţi scăzute de ligand pe matricea împachetată (deseori o zecime
faţă de suporturile utilizate în RPC).
În decursul ultimilor ani, HIC a fost dezvoltată de către mulţi cercetători iar
astăzi reprezintă o tehnică bine stabilită şi deosebit de utilă în tehnicile de
separare cromatografică din laborator sau în procesele industriale de purificare a
proteinelor. Dezvoltarea unui număr mare de faze staţionare diferite a condus la o
creştere a aplicaţiilor HIC în purificarea unor biomolecule, precum proteine serice,
proteine nucleare, hormoni, proteine recombinante şi enzime.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE TIOFILICĂ

Importanţa atomilor de sulf pentru în cromatografia de adsorbţie prin intermediul

unui ligand a fost recunoscută acum 40 de ani. Adsorbţia aromatică a fost atunci un
fenomen studiat şi s-a descoperit că ea este mediată prin imobilizarea de grupări 2,4-
dinitrofenil în timp ce un efect sinergistic de adsorbţie a fost evidenţiat în condiţiile în
care ligantul a conţinut un atom de sulf în locul unuia de oxigen, aflat în apropierea
inelului aromatic. Aceasta a fost una dintre primele indicaţii că atomul de sulf, ca parte a
ligandului are un efect de adsorbţie a solutului. Tăria acestei interacţii a apărut
dependentă de substituenţii electrofili şi nucleofili ai inelului aromatic; în fapt, s-a dovedit
că adsorbţia are la bază formarea de complexe electron donor–acceptor.
Asocierea dintre sorbenţii tiofili şi separarea imunoglobulinelor s-a realizat odată cu
demonstrarea acestei proprietăţi de către Porath şi colaboratorii (1985) şi a făcut
posibilă fracţionarea proteinelor plasmatice prin cromatografie pe sorbenţi, derivaţi din
agaroză, realizaţi în urma reacţiei dintre divinilsulfonă şi 2-mercaptoetanol. După
aceasta, acest mod de separare a fost deseori aplicat în purificarea anticorpilor
deoarece sorbentul prezintă specificitate clară pentru acest tip de proteine. Această
descoperire a reprezentat o etapă importantă în dezvoltarea metodelor de separare a
anticorpilor implicând, drept liganzi cromatografici, o mare varietate de structuri chimice
care conţin atomi de sulf şi de azot, având diferite nivele de selectivitate.
 Structural, cei mai obişnuiţi sorbenţi pentru cromatografia de adsorbţie tiofilică derivă din
aşa-numitul gel B; care conţine liganzi lineari, cu doi atomi de sulf. Aceşti derivaţi au fost găsiţi
destul de buni în legarea selectivă a imunoglobulinelor, în prezenţa unor concentraţii mari de
săruri formatoare de structură a apei, denumite de altfel „săruri liotrope”, de tipul sulfatului de
amoniu sau sulfatului de sodiu. Din punct de vedere al acestei trăsături, cromatografia de
adsorbţie tiofilică se aseamănă cu cromatografia de interacţie hidrofobă: adsorbţia este
favorizată de concentraţii mari de săruri, eluţia realizându-se în condiţiile în care concentraţia lor
este redusă. Totuşi, în cazul cromatografiei de adsorbţie tiofilică nu se pot manifesta asocieri
hidrofobe sau interacţii ionice cu sorbenţii tiofilici deoarece structurile tio-etilsulfonice nu posedă
o hidrofobicitate pronunţată, pe de o parte şi nu conţin sarcini electrice, pe de altă parte.
Cromatografia de adsorbţie tiofilică, descrisă de către Porath, s-a arătat a fi de real folos în
purificarea anticorpilor monoclonali şi în general în fracţionarea proteinelor.
Matricele tiofilice de afinitate sunt cuplate cu ajutorul unor liganzi cu următoarea
structură chimică:

(M)atrice-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-X-Y
unde M reprezintă matricea de agaroză iar X reprezintă S, N ori O, iar Y este un rest
mic, alifatic, sau un heteroatom
 Principiul operaţional care stă la baza cromatografiei de adsorbţie tiofilică se
aseamănă cu cel al cromatografiei de interacţie hidrofobă. Astfel, proteinele sunt legate
la tării ionice mari şi eliberate în urma scăderii tăriei ionice. Faţă de matricele tradiţionale
hidrofobe precum fenil-Sepharose sau octil-Sepharose, matricele tiofilice conduc la
randamente înalte de separare cât şi la separări în zone înguste, având drept
caracteristică o afinitate înaltă faţă de imunoglobulinee şi scăzută faţă de
albumine.

Cromatografia de adsorbţie tiofilică este descrisă ca o metodă de purificare a

anticorpilor monoclonali murini din supernatantul unor culturi celulare. În acest caz se
utilizează sulfat de potasiu în concentraţie de 0,5M în tamponul de legare, obţinându-
se imunoglobuline de înaltă puritate. Totuşi datorită concentraţiei tipice scăzute
anticorpilor monoclonali din supernatantul unor culturi celulare, capacitatea matrix-ului
este în consecinţă, de asemenea scăzută. Capacitatea de legare a anticorpilor
monoclonali diluaţi poate fi crescută cu un factor de 10 sau mai mult prin schimbarea
sării liotrope din tamponul de legare, adică prin utilizarea sulfatului de amoniu şi în
acelaşi timp prin creşterea concentraţiei sale până la 1,0-1,2M
Purificarea anticorpilor monoclonali prin cromatografie de adsorbţie tiofilică. Se ilustrarează
legărea, spălarea şi eluţia. Etape: I Legarea la concentraţie mare de (NH4)2SO4, de exemplu,
1,2M (NH4)2SO4 II eluţia la o concentraţie scăzută de (NH4)2SO4, de exemplu 0,8M (eluţia
impurităţilor). III eluţia anticorpului monoclonal purificat realizată cu TRIS/HCI 0,05M, pH 9,0.
 CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic (ion-exchange chromatography, IEC), denumită uneori şi

cromatografie ionică (IC), se referă la metodele moderne şi eficiente de separare şi determinare
a speciilor ionice, pe răşini schimbătoare de ioni. Cromatografia de schimb ionic a fost iniţial
dezvoltată la miljocul anilor „70 când s-a arătat că un amestec de anion ori de cationi poate fi rapid
rezolvat pe coloane de cromatografie ori de înaltă performaţă, împachetate cu un suport alcătuit
dintr-o răşină schimbătoare de ioni, anioni ori cationi. În acel moment, detecţia se realiza în general
prin măsurători conductometrice. Astăzi, sunt disponibile diverse detectoare utilizate în
cromatografia de schimb ionic.
Schimbul ionic este probabil cea mai frecvent utilizată tehnică cromatografică pentru
separarea şi purificarea proteinelor, polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor, a altor
biomolecule încărcate electric. Raţiuniunea pentru succesul cromatografiei de schimb ionic este
reprezentată de generala sa aplicabilitate, puterea sa matre de rezoluţie şi marii sale capacităţi, a
simplicităţii, reproductibilităţii şi controlabilităţii ei.

Cromatografia de schimb ionic reprezintă o variantă a cromatografiei de adsorbţie în

care adsorbentul solid posedă grupări chimice încărcate electric legate covalent la un
suport solid, inert. Ionii sunt legaţi electrostatic la grupările încărcate electric; aceşti ioni
pot fi schimbaţi cu ionii aflaţi într-o soluţie apoasă. Schimbătorii de ioni sunt cel mai
frecvent utilizaţi în coloane, pentru a separa moleculele funcţie de sarcină; deoarece
moleculele încărcate electric se leagă la schimbătorul de ioni reversibil şi astfel ele pot fi
legate ori eluate prin schimbarea tăriei ionice sau a pH-ului solventului de eluţie.
 Două tipuri de schimbători de ioni sunt disponibile: unii care posedă grupări funcţionale legate
chimic, cu sarcini electrice negative denumiţi schimbători cationici şi alţii care posedă grupări
funcţionale cu sarcini electrice pozitive denumiţi schimbători anionici. Sarcinile de pe schimbători
sunt balansate de către contraioni de tipul ionilor clorură în cazul schimbătorilor anionici şi de ioni
metalici în cazul schimbătorilor cationici. Moleculele din soluţie, care vor fi adsorbite pe schimbători
au de asemenea sarcini nete care sunt şi ele balansate de către contraioni. De exemplu, dacă se
analizează un proces de schimb ionic şi se consideră că moleculele din soluţie au sarcini negative
(X-), acestea sunt contrabalansate de ionii de sodiu (Na+). Astfel de molecule încărcate electric
negativ pot fi cromatografiate pe un schimbător anionic (A+), care posedă ioni de clorură drept
contraioni pentru a se neutraliza şi a produce A+Cl-. Când moleculele (Na+X-) din soluţie
interacţionează cu un schimbător de ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe schimbător şi se
leagă electrostatic, formându-se A+X-, simultan cu eliberarea ionilor de sodiu. Acest proces de
schimb ionic este ilustrat în figura de mai jos. Un proces similar, dar opus, se va produce pentru
molecule încărcate pozitiv (Y+CI-), care se vor cromatografia pe un suport cu sarcini electrice
negative. Acesta este cazul schimbătorilor cationici (C-Na+), unde schimbătorii cationici vor lega
moleculele încărcate pozitiv din soluţie.

Schema unui proces de schimb ionic:

moleculele (Na+X-) din soluţie
interacţionează cu un schimbător de
ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe
schimbător şi se leagă electrostatic,
formându-se A+X-, simultan cu
eliberarea ionilor de sodiu.
 ECHILIBRUL DE SCHIMB IONIC
Procesele de schimb ionic se bazează pe un echilibru de schimb dintre ionii din soluţie
şi ionii de acelaşi semn de pe suprafaţa unui suport insolubil, cu masă moleculară mare.
Schimbătorii naturali de ioni precum cleiurile şi zeoliţii au fost recunoscuţi şi utilizaţi de
multă vreme. Răşinile schimbătoare de ioni sintetice au fost produse pentru prima dată
la mijlocul anilor 1930 pentru dedurizarea şi deionizarea apei ori pentru purificarea unor
soluţii. Cele mai comune situsuri active ale unor rășini schimbătoare de cationiţi sunt
grupările sulfonil acide - SO3H+, puternic acidă şi carboxil acid, -COO-H+, slab acidă.
Schimbătorii anioniţi conţin grupări amino terţiare -N(CH3)3OH-, puternic bazică, ori
grupări amino primare -NH3OH-, slab bazică.
În cazul în care un schimbător de ioni de tipul acid sulfonic este adus în contact cu un solvent
apos care conţine un cation, Mx+, se produce un echilibru de schimb ce poate fi descris prin reacţia:

- x+ - x+ + unde RSO-3H+ reprezintă una din multitudinea

x RSO 3 H+ + M (RSO 3) x M + xH de grupări sulfonice ataşate pe o
solid solutie solid solutie macromoleculă polimerică.

În mod similar, un schimbător bazic puternic interacţionează cu un anion Ax- după reacţia:

+ x-
xRN(CH3)OH + Ax- [RH(CH3) 3]x A + xOH
solid solutie solid solutie
 Ca un exemplu de aplicare a legii masei la un echilibru de schimb ionic, se consideră pe
coloană are loc o reacţie între un ion monovalent, B+ cu o grupare acid-sulfonică prezentă pe
suportul cromatografic. Din considerente de neutralizare, retenţia iniţială a ionilor B+ se realizează
la capătul superior al coloanei după reacţia:

unde (s) şi (aq) delimitează faptul că sistemul conţine o fază solidă, respectiv apoasă. Eluţia
cu o soluţie diluată de acid clorhidric, de exemplu, modifică echilibrul din ecuaţia 1 în partea
stângă, ceea ce conduce la transferul parţial a ionilor B+ din faza staţionară în faza mobilă. Aceşti
ioni coboară apoi de-a lungul coloanei printr-o serie de transferuri între fazele staţionară şi mobilă.
Constanta de echilibru Kex, pentru reacţia de schimb prezentată în ecuaţia 1 ia forma:
unde [RSO3B+]s şi [RSO3H+]s
reprezintă concentraţiile (strict sub
formă de activităţi) ale ionilor B+ şi H+
După rearanjare rezultă: în faza solidă.

În timpul eluţiei, concentraţia ionilor de hidrogen din faza apoasă este mult mai mare decât
concentraţia ionilor de compus B, monovalent din faza mobilă. Pe lângă aceasta, schimbătorul
posedă un număr enorm de situsuri de schimb ionic comparativ cu numărul de ioni B+ ce pot fi
reţinuţi. Astfel, concentraţia totală a ionilor, [H+]aq şi [RSO-3H+]s nu este afectată de schimburile din
ecuaţia 1 ce descrie reacţia globală. Pentru acest motiv, în condiţiile în care [RSO-3H+]s >> [B+]aq
termenii din dreapta ecuaţiei 3 sunt în mod substanţial constanţi şi astfel se poate scrie:
unde K reprezintă constanta ce corespunde
constantei de distribuţie descrisă anterior. Astfel,
toate ecuaţiile descrise în tratarea teoretică din
primul capitol pot fi aplicate cu succes.
 Se poate nota că Kex din ecuaţia 2 reprezintă afinitatea răşinii pentru ionul B+ comparativ cu un
alt ion (în cazul de faţă, H+). În condiţiile în care Kex este mare, se poate spune că există o
puternică tendinţă a fazei solide de a reţine B+; în cazul în care Kex este mică, efectul este diametral
opus. Prin selecţia unui ion comun de referinţă precum H+, se pot compara experimental rapoartele
de distribuţie pentru diverşi ioni pe un tip dat de răşină schimbătoare de ioni. Experimentele relevă
că ionii polivalenţi sunt mai puternic legaţi decât speciile cu o singură sarcină electrică. Pentru un
număr de sarcini date, totuşi, apar diferenţe care sunt legate de mărimea ionului hidratat precum şi
de alte proprietăţi. Astfel, pentru o răşină schimbătoare de ioni sulfonată, clasică, obişnuită, valorile
Kex scad în ordinea: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Pentru cationii divalenţi,
ordinea este: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+.
În cazul anionilor, Kex pentru o răşină bazică scade în ordinea: SO42-> C2O4- > I- > NO3- > Br- >
Cl- > HCO2- > CH3COO- > OH- > F-. Această serie este oarecum dependentă de tipul de răşină şi
de condiţiile de reacţie, putând fi considerată numai aproximativă.

Separarea prin cromatografie de schimb ionic depinde de adsorbţia reversibilă a

moleculelor de solut încărcate electric la grupările de semn contrar imobilizate pe
schimbătorul de ioni. Cele mai multe experimente sunt realizate în cinci etape
importante, ilustrate în figura următoare.
 Principiul comatografiei de schimb
ionic realizată prin eluţie în gradient de
sare (salin)

Prima etapă o reprezintă echilibrarea în care schimbătorul de ioni este adus în starea de start
în termeni de pH şi tărie ionică, stare ce va permite legarea moleculelor de solut. Grupările
schimbătoare de ioni sunt asociate în acest moment cu contraionii de schimb (uzual anioni ori
cationi simplii, precum ionii clorură sau de sodiu).
Cea de a doua etapă o reprezintă aplicarea şi adsorbţia probei, în care moleculele de solut
care posedă sarcini corespunzătoare, ajung şi dislocuie contraionul, legându-se reversibil la suport.
Substanţele nelegate vor fi eluate de pe schimbător utilizând acelaşi tampon de start.
În etapa a treia, substanţele sunt îndepărtate de pe coloană prin schimbarea condiţiilor de
eluţie nefavorabile pentru legarea ionică a moleculelor de solut.
Această eluţie implică în mod normal creşterea tăriei ionice a tamponului de eluţie sau
schimbarea pH-ului acestuia. În figura de mai sus, desorbţia se realizează prin introducerea unui
gradient crescător de sare, ceea ce conduce la eliberarea moleculelor de solut de pe coloană în
ordinea tăriei legării lor, substanţele cele mai slab legate eluând primele.
Etapele a patra şi a cincea sunt cele de îndepărtare de pe coloană a substanţelor care nu au
fost eluate în condiţiile experimentale anterioare şi de reechilibrare a coloanei pentru un nou proces
de purificare.
 Separarea este astfel obţinută datorită diferenţelor
de interacții dintre un schimbător de ion cu molecule cu
densităţi diferite de sarcină şi de distribuţie a acestora pe
suprafaţa lor. Figura alăturată prezintă schematic modul
de legare a unor molecule cu sarcini diferite. Aceste
interacţii pot fi controlate prin variaţia condiţiilor precum
tăria ionică ori a pH-ului. Diferenţele în proprietăţilor
electrice ale compuşilor biologici sunt deseori
considerabile, din această cauză cromatografia de
schimb ionic este capabilă să separe specii cu foarte
mici diferenţe în proprietăţi, de exemplu două proteine
care diferă numai printr-un aminoacid ionizabil, motiv
pentru care această tehnică este deosebit de importantă
în analiza biochimică.

Reprezentarea schematică a diferenţei de legare şi

de eluţie ale unor molecule cu densităţi diferite de
sarcină precum şi de distribuţie a sarcinilor pe
suprafaţa lor.
 FACTORUL DE CAPACITATE A L UNUI SCHIMBĂTOR DE IONI
Factorul de capacitate sau de retenţie, k, este o măsură a retenţiei unui component netrebuind
a fi confundat cu capacitatea de încărcare (mg probă/ml) ori cu capacitatea ionică (mmol/ml).

O cromatogramă posibilă pe baza

căreia se poate calcula factorul de
capacitate k, a unui peak
cromatografic. Legendă: V0 = void
volume, VR1 = volumul de eluţie a
peak-ului 1, VR2 = volumul de eluţie a
peak-ului 2, Vt = volumul total, wR1 =
lăţimea peak-ului 1, wR2 = lăţimea
peak-ului 2.
Factorul de capacitate se calculează pentru fiecare peak individual. De exemplu, factorul
de capacitate k pentru peak-ul 1 din figura alăturată este derivat din ecuaţia:

Tehnica de adsorbţie precum cea de cromatografie de schimb ionic oferă factori mari de
capacitate după cum condiţiile experimentale pot fi alese astfel încât să conducă la volume de
retenţie a peak-ului mari în exces a Vt, opus tehnicii de gel filtrare unde capacitatea este limitată
deoarece toate peak-urile trebuiesc eluate cu un volum egal cu (Vt - V0).
 Capacitatea unui schimbător de ioni este o măsură cantitativă a abilităţii sale de a
îmbunătăţi schimbul de contraioni, din această cauză fiind un parametru deosebit de important.
Capacitatea poate fi exprimată ca şi capacitate ionică totală, capacitate disponibilă sau capacitate
dinamică.
Capacitatea ionică totală reprezintă numărul de grupări încărcate electric substituite per gram
de schimbător uscat ori per gram de schimbător îmbibat. Capacitatea ionică totală poate fi
măsurată prin titrare cu un acid sau o bază puternică.
Cantitatea totală de proteină care poate fi legată la un schimbător de ioni, în condiţii
experimentale definite, determină capacitatea disponibilă pentru gel. Dacă condiţiile definite includ
şi viteza de curgere la care gelul operează, cantitatea legată se referă la capacitatea dinamică
pentru schimbătorul de ioni. Capacitatea disponibilă şi cea dinamică depind de:
proprietăţile proteinei;
proprietăţile schimbătorului de ioni;
condiţiile experimentale alese;

Proprietăţile proteinei care determină disponibilitatea sau capacitatea sa dinamică pe o

matrice schimbătoare de ioni particulară sunt mărimea sa şi raportul dintre sarcina sa/pH.

Proprietăţile matricei schimbătoare de ioni care determină capacitatea lui de disponibilitate

pentru o proteină aleasă sunt limita de excluziune, tipul şi numărul de grupări funcţionale de schimb
ionice substituite. O capactitate înaltă de disponibilitate este obţinută în condiţiile unei matrice care
estre macroporoasă şi înalt substituită cu grupări ionice care îşi menţin sarcina îndr-un domeniu
larg de condiţii experimentale. Matrix-urile neporoase au o capacitate considerabil de mică
comparativ cu matrix-urile poroase, dar şi o mare eficienţă datorită distanţelor mai mici de
difuziune.
Condiţiile experimentale care afectează capacitatea observabilă sunt pH-ul, tăria ionică a
tamponului, natura contraionului, viteza de curgere şi temperatura.
 GRUPĂRI SCHIMBĂTOARE DE IONI
Prezenţa grupărilor schimbătoare de ioni este o proprietate fundamentală a oricărui
schimbător de ioni. Tipul de grupare determină tipul şi tăria schimbătorului de ioni, numărul
total al acestora şi disponibilitatea determinând capacitatea de schimb. Există o varietate de
grupări care au fost selectate pentru a fi utilizate în procesul de schimb ionic, o serie dintre
aceştia fiind prezentaţi în tabelul de mai jos.
Grupările sulfonice şi amino-cuaternare sunt utilizate pentru a forma schimbători de ioni
puternici, celelalte grupe funcţionale formând schimbătorii de ioni slabi. Termenele de
puternic şi slab se referă la măsura variaţiei de ionizare cu pH-ul şi nu la tăria legării.
Schimbătorii de ioni puternici sunt complet ionizaţi pe un domeniu mare de pH, în timp ce la
schimbătorii de ioni slabi gradul de disociere şi astfel capacitatea de schimb variază mai puţin
marcant cu pH-ul.

Schimbători anionici Grupare funcţională

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil cuaternar (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Grupări funcţionale existente
Ammoniu cuaternar (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-
N+(CH3)3 pe schimbătorii de ioni.
Schimbători cationici Grupare funcţională

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metil sulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-

CH2SO3-
 Schimbători de ioni pe bază de dextran
Schimbătorii de ioni pe bază de dextran sunt produşi prin introducerea unor grupări
funcţionale pe scheletul acestuia, o matrice de detran, reticulată. Aceste grupări sunt ataşate
la unităţile de glucoză din structura matricei prin legături eterice, stabile.

Domeniul complet al schimbătorilor de ioni pe bază de Sephadex este prezentat în

tabelul de mai jos. Schimbătorii de ioni anionici şi cationici sunt desemnaţi ca A-25 ori A-50 şi
C-25 ori C-50, respectiv, depinzând de porozitatea matrix-ului.

Schimbători de ioni pe bază de Sephadex

Tipuri Descriere Grupare funcţională Contraion

A-25 Schimbător de ioni slab bazic

DEAE Sephadex Dietilaminoetil- Clorură
A-50

A-25 Schimbător de ioni bazic tare

Dietil-(2-hidroxi-
QAE Sephadex Clorură
A-50 propil)aminoetil-

C-25 Schimbător de ioni slab acid

CM Sephadex Carboximetil- Sodiu
C-50

C-25 Schimbător de ioni acid tare

SP Sephadex Sulfopropil- Sodiu
C-50
 Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt insolubili în orice solvent. Ei sunt stabili în apă, soluţii saline,
solvenţi organici, soluţii slabe acide şi alcaline. În soluţii puternic acide se pot manifesta procese de hidroliză a
legăturilor glicozidice din care cauză valori ale pH-ului mai mici de 2 trebuiesc ocolite, în particular la temperaturi
crescute. Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex pot fi de asemenea utilizaţi în prezenţa solvenţilor denaturanţi
proces ce poate fi important în condiţiile separării unor substanţe numai pe baza proprietăţilor lor electrostatice. În
timpul regenerării schimbătorul de ioni poate fi expus pentru timp scăzut la o soluţie de NaOH, 0,2 M, fără o
hidroliză apreciabilă. Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt susceptibili la atacul unor dextranaze, motiv
pentru care este nevoie ca în condiţiile de stocare să fie prezent şi un agent antimicrobian. Proprietăţile fizice ale
acestor schimbători sunt prezentate în tabelul următor:
Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex pot fi sterilizaţi prin autoclavare, (121°C), până la 30 minute, la
Stabilitatea fizică unpH neutru, ăn formă de sare. În timpul autoclavării totuşi, se eliberează o cantitate de carbohidraţi.
Proprietăţile de umflare ale schimbătorilor de ioni pe bază de Sephadex sunt asemănătoare cu cele ale
Sephadex-urilor de tip G de la care provin. În plus, Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex de tip 50 se
Capacitatea de umflare umflă mai puternic decît cei de tip 25. datorită prezenţei grupărilor ionice de schimb, pe matrice, umflarea
(îmbibarea) variază cu tăria ionică şi cu pH-ul.
La tării ionice scăzute, repulsia dintre grupările ce poartă aceeaşi sarcină pe matrice sunt maxime, din această
cauză umflarea gelului în aceste condiţii, este mare. Gradul de umflare scade cu creşterea tăriei ionice. Se
Dependenţa de tăria ionică poate nota că schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex nu trebuie umflaţi în apă distilată deoarece, datorită
puternicelor interacţii ionice care e manifestă în aceste condiţi, structura perlată se distruge.
Gradul de disociere şi de aici extensia cu care un schimbător de ioni este încărcat electric este dependentă de
pH. Repulsia dintre grupările schimbătoare de ioni este maximă la valori ale pH-ului la care grupările
Dependenţa de pH schimbătoare de ioni sunt total disociate, scăzând la valori de pH apropiate de pK ale grupărilor schimbătoare
de ioni. Se poate nota că schimbători tari precum QAE Sephadex şi SP Sephadex au proprietăţi de umflare
practic independente de pH deoarece sunt încărcaţi electric pe un mare domeniu de pH.
Datorită diferenţelor în caracteristicile de umflare, schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex G-25 au o
capacitate ionică mai mare have per ml gel decât cei pe bază de Sephadex G-50. Astfel, pentru biomolecule
mai mici (masa moleculară < 30 000) schimbătorii de ion de tip A-25 şi C-25 au o capacitate de
disponibilitate mai mare. În domeniul de mase moleculare cuprins între 30 000 şi 100 000 totuşi, schimbătorii
Capacitatea de ion de tip A-50 şi C-50 posedă o capacitate de disponibilitate mai mare datorită existenţei unor pori mai
mari. În condiţiile lucrului cu macromolecule mai mari de 100 000, s-a observat frecvent o mai mare
capacitate de disponibilitate la tipurile A-25 şi C-25 deşi, la aceste mase moleculare, legarea se realizează
numai pe suprafaţa perlei de schimbător de ioni.
Celuloza este utilizată ca matrice, după introducerea unor grupări schimbătoare de ioni,
de tipul dietilaminoetil (DEAE) ori carboximetil (CM), ceea ce conduce la obţinerea unor
schimbători de ioni anionici respectiv cationici.
DEAE celuloza comercializată sub denumirea de DEAE Sephacel este macroporoasă şi are o
limită de excluziune a proteinelor cu masă moleculară de aproximativ 1 x 106. Interacţia ionică a
macromoleculelor cu masă moleculară mult mai mare de 1 x 106 este restiricţionată doar la
sarcinile electrice situate pe suprafaţa perlelor de schimbător.

DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt disponibile sub formă preînmuiată, putând fii
utilizate imdeiat pentru încărcare (împachetare) pe coloană. În privinţa capacitatăţii, se
poate spune că deoarece DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt schimbători de ioni slabi,
numărul de grupări ionice legate care sunt schimbate şi deci capacitatea pentru
macromolecule este dependentă de pH. Această dependenţă se ilustrează cu ajutorul
curbelor de titrare. Domeniul de pH la care se lucrează cu DEAE Sepharose CL-6B este de
2-9 în timp ce pentru CM Sepharose CL-6B este de 6-10.
 SELECŢIA GRUPĂRII SCHIMBĂTOARE DE IONI
În selecţia suportului cromatografic trebuie avut în vedere că nu există un singur schimbător de ioni perfect
pentru oricare separare. Alegerea matrix-ului şi a grupării ionice substituite depinde de:
• necesităţile specifice aplicaţiei;
• mărimea moleculară a componentelor probei;
• punctul izoelectric al componentelor probei.
Substanţele se leagă la schimbătorul de ioni în momentul în care posedă o sarcină opusă celei prezentate
de suportul cromatografic. Această legare este electrostatică şi reversibilă.
În cazul în care substanţele ce doresc a fi separate posedă numai un tip de sarcini electrice, alegerea
schimbătorului este clară. În condiţiile separării unor substanţe cu încărcătură mixtă, ce prezintă sarcini atât
pozitive cât şi negative, substanţe denumite amfotere, sarcina netă va depinde de pH. În consecinţă la o anumită
valoare a pH-ului, o substanţă amfoteră va avea o sarcină netă egală cu zero. Această valoare este denumită
punct izoelectric (pI) şi în acel punct substanţele nu se vor lega nici de schimbătorul anionic nici de cel cationic,
după cum se observă schematizat în figura de mai jos.

Curbă de titrare. Sarcina netă a unei

proteine ca funcţie de pH
 Astfel, pH-ul unui tampon determină sarcina unor molecule amfotere în timpul unui
experiment. Din acest motiv, în principiu, se poate utiliza atât un schimbător anionic ori unul cationic
pentru a lega substanţa amfoteră, prin selectarea unui pH optim. În practică totuşi, alegerea este
bazată pe un tip de schimbător şi un anumit pH, care conduc la cea mai bună separare a
moleculelor de interes, fără constrângeri referitoare la stabilitatea lor la acel pH.
O multitudine de macromolecule biologice se denaturează ori şi pierd din activitate în afara
unei domeniu bine stabilit al pH-ului şi astfel, alegerea schimbătorului de ioni poate fi limitată de
stabilitatea probei. Sub valoarea punctului său izoelectric o proteină are o sarcină netă pozitivă,
schimbul şi astfel adsobţia realizându-se pe un schimbător cationic. Deasupra pI-ului său proteina
are o sarcină netă negativă, putându-se adsorbi pe schimbători de ioni anionici. Totuşi, ea este
stabilă numai în domeniul de pH cuprins între 5 şi 8, astfel se va utiliza un schimbător de ioni
anionic.
Se pot trage următoarele concluzii:
• Dacă componentele probei sunt mult mai stabile mai mici decât valoarea pI, trebuie utilizat un
schimbător cationic.
• Dacă ele sunt mai stabile în jurul valorilor pI, trebuie utilizat un schimbător anionic.
• Dacă stabilitatea componentelor este mare pe tot domeniul de pH, pe ambele laturi ale pI, se
poate utiliza oricare schimbător de ioni.
Metode de testare în tub a condiţiilor de selecţie a schimbătorului de ioni
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE
Conform Uniunii Internaţionale de Chimie Pură şi Aplicată (IUPAC), cromatografia de afinitate
este definită ca o tehnică cromatografică lichidă care se bazează pe “o interacţie biologică” pentru
separarea şi analiza unui analit specific dintr-o probă. Exemple ale acestor interacţii includ legarea
unei enzime la un inhibitor sau al unui anticorp la un antigen. Astfel, cromatografia de afinitate
presupune, în primă fază obţinerea unui agent de legare cunoscut sub termenul de ligand afin, care
interacţionează selectiv cu analitul dorit, acesta fiind apoi plasat pe un suport solid într-o coloană
cromatografică. Odată preparat ligandul imobilizat el poate fi utilizat la izolarea ori la cuantificarea
unui analit.
Ligandul imobilizat este factorul cheie care determină succesul oricărei metodă de
cromatografie afină. După definiţia dată anterior în cromatografia de afinitate cei mai mulţi liganzi
au origine biologică, totuşi termenul de cromatografie afină este de asemenea utilizat de multă
vreme pentru a descrie o serie de coloane care conţin drept liganzi selectivi cu origine nebiologică.
Exemple ale acestor liganzi nebiologici sunt boronaţii, complexe de ioni de ioni metalici imobilizaţi,
coloranţi sintetici. Termeni precum „cromatografie de bioafinitate” şi de „adsorbţie biospecifică” sunt
utilizaţi ocazional pentru a specifica dacă ligand afin estre un compus biologic real. În ceea ce
priveşte originea ligandului, utilizat pentru a divide tehnicile afine de cromatografie se pot menţiona
diverse subcategorii precum cromatografia cu lectine imobilizate, cromatografia de imunoafinitate,
cromatografia cu ligand colorant de sinteză, ori cromatografia de afinitate cu ion metalic imobilizat.
Aceste tehnici afine vor fi examinate în continuare.
Un alt factor utilizat pentru a se face distincţie între o metodă afină de alta este tipul de suport
utilizat în coloană. În „cromatografia de afinitate cu performanţă scăzută (sau pe coloană)”, în mod
uzual, suportul utilizat are un diametru mare iar gelul nu estre rigid. Este cazul suportului de
agaroză, dextran, ori celuloză.
 Ca mecanism de separare cromatografia de afinitate separă proteinele pe baza unor interacţii
reversibile dintre o proteină (ori un grup de proteine) şi un ligand specific cuplat la o matrice
cromatografică.
Tehnica este ideală în capturarea (extracţia) sau ca treaptă intermediară într-un protocol de
purificare şi poate fi utilizată oriunde este disponibil un ligand potrivit pentru proteina (proteinele) de
interes. Cu o selectivitate înaltă şi de aici o rezoluţie mare, o mare capacitate pentru proteina
(proteinele) de interes treptele de purificare realizează mari factori de recuperare, de ordinul a
sutelor şi chiar miilor de ori. Proteina (proteinele) ţintă sunt colectate într-o formă purificată,
concentrată.
Interacţiile biologice dintre ligand şi molecula ţintă pot fi rezultatul unor interacţii electrostatice
sau hidrofobe, a unor forţe van der Waals' şi/sau legături de hidrogen. Pentru a elua molecula ţintă
de pe mediul afin interacţia poate fi reversată atât prin metode specifice, de utilizare a unui ligand
competitiv cât şi nespecific prin schimbarea pH-ului, a tăriei ionice sau a polarităţii. Astfel, într-o
singură etapă, purificarea prin cromatografie de afinitate poate oferi un imens avantaj din punct de
vedere a timpului de realizare comparativ cu procedurile de separare în etape multiple. Efectul de
concentrare conduce la posibilitatea procesării unui volum mare de probă, şi în final, proteina
(proteinele) ţintă putând fi capturată dintr-un amestec biologic complex; formele native de pot fi
separate de formele sale denaturate, putând fi purificate din volume mici de material biologic, cu un
nivel înalt de îndepărtare a substanţelor contaminante.
Succesul purificării prin cromatografie de afinitate presupune existenţa unui ligand biospecific
care poate fi ataşat covalent la matricea cromatografică, ligandul cuplat trebuind să reţină prin
legare specifică afină şi reversibilă molecula ţintă şi astfel, să permită moleculei ţintă să fie eluate în
forma sa activă. Orice component poate fi utilizat ca şi ligand pentru purificarea partenerului său
respectiv de legare.
Interacţii biologice utilizate în selectarea ligandului respectiv a moleculei ţintă,
utilizate în cromatografia de afinitate

 Enzimă Substrat analog, inhibitor, cofactor

 Anticorp Antigen, virus, celulă.
Polizaharide, glicoproteine, receptor celular de suprafaţă,
 Lectină
celulă.


Secvenţa de baze complementară, histone, polimeraza acidului
Acid nucleic
nucleic, proteina de legare a acidului nucleic.
Hormon,
 Receptor, proteină transportoare (carrier)
vitamină
 Glutation Glutation-S-transferază ori proteine de fuziune GST


Proteine de fuziune poli (His), proteine native cu histidină,
Ioni metalici
cisteină şi/sau resturi de triptofan pe suprafaţa lor.
O reprezentare schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate

Reprezentarea schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate. a) mediul

afin este echilibrat cu tamponul de legare; b) proba este aplicată în condiţii care favorizează
legarea specifică a moleculei (moleculelor) ţintă la substanţa complementară de legare (ligandul).
Substanţele ţintă se leagă specific, dar reversibil, la ligand, în timp ce componentele care nu
prezintă afinitate pentru ligand sunt îndepărtate prin eluţie (spălare) de pe coloana afină; c)
proteina ţintă este recuperată prin schimbarea condiţiilor ce au favorizat legarea la ligandul
imobilizat. Eluţia se realizează specific, prin utilizarea unui ligand competitiv ori nespecific prin
schimbarea pH-ului, a tăriei ionice ori a polarităţii. Proteina ţintă este astfel colectată într-o formă
purificată şi concentrată; d) mediul afin este reechilibrat cu tampon de legare
Reprezentarea schematică a procesului de cromatografie afină.
Etapele a), b), c), şi d) sunt prezentate în figura prezentată mai sus.
 Condiţii de eluţie în cromatografia de afinitate

Metode de eluţie: Metoda 1, cel mai simplu caz: o schimbare în compoziţia

tamponului conduce la eluarea substanţei legate, fără a o altera şi fără a
denatura ligandul. Metoda 2. Se utilizează pH-uri extreme ori concentraţii
mari de agenţi chaotropi pentru eluţie, însă acest procedeu poate conduce la
alterarea temporară ori permanentă a moleculei ţintă ori a ligandului.
Metodele 3 şi 4. Se realizează o eluţie specifică prin adăugarea unei
substanţe care competiţionează la legarea de ligand. Aceste metode pot
creşte specificitatea mediilor care utilizează liganzi specifici de grup.
 ALEGEREA MATRICEI CROMATOGRAFICE

Alegerea matricei optime reprezintă o etapă foarte importantă în orice proces

cromatografic. O matrice bună pentru a fi utilizată în cromatografia de afinitate trebuie sa
posede următoarele proprietăţi:
1. Hidrofilicitate: să posede proprietăţi specifica care să-i confere interacţii nespecifice
reduse.
2. Pori mari: să permită tuturor spaţiilor matricei să fie disponibile la cele mai multe
molecule din amestecul de separat. O serie de matrici permit legarea numai la suprafaţa
externă, fiind utilizate mai ales în separarea unor molecule foarte mari, a unor celule sau a
unor viruşi.
3. Rigiditate: matricea trebuie să reziste la presiunile de împachetare şi de curgere a
solventului în timpul eluţiei sau a spălării.
4. Inerţie: matrice nu trebuie să contribuie la procesul de separare cromatografică.
5. Stabilitate chimică: matricea trebuie să fie stabilă la toţi solvenţii utilizaţi în
separarea cromatografică.
O matrice optimă trebuie să posede o structură macroporoasă cu o mare stabilitate
chimică şi fizică, cu o cât mai mică adsorbţie nespecifică, care să faciliteze o capacitate
înaltă de legare şi de recuperare a probei, alături de o rezistenţă mare faţă de eluţiile în
condiţii dure sau condiţiile de spălare.
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU ION DE METAL IMOBILIZAT

La mijlocul anilor „70, echipa de cercetători condusă de Porath a introdus un nou tip de
cromatografie ce a fost atunci denumită iniţial “cromatografie cu metal chelat”, după care s-a
redenumit “cromatografie de afinitate (adsorbţie) cu metal (ion) imobilizat” (immobilized metal
affinity chromatography, IMAC). Tehnica se bazează pe diferenţele de afinitate ale proteinelor
faţă de ioni metalici legaţi de substanţe ce au proprietăţi chelatoare, care sunt imobilizate pe
un suport (răşină) cromatografic.
Cu toate că bazele acestei metode nu au fost noi, Porath şi colaboratorii s-au focusat pe
utilizarea acestei noi tehnici în separarea proteinelor. Această caracteristică de “bio-afinitate”
a captat atenţia biochimiştilor, chimiştilor şi biologilor care au utilizat IMAC şi au descoperit
noi valenţe în aplicații particulare a metodei.
Cea mai cunoscută îmbunătăţire o reprezintă aplicaţiile ce utilizează o “coadă” (tag) de
poli-histidină la separarea polipeptidelor recombinante care consistă din inserţia unei
secvenţe terminale de resturi histidinice atât la capătul N- ori la cel C-terminal al proteinei ori
al peptidei. Utilizarea unor astfel de histidine sau a altor secvenţe ce posedă afinitate pentru
metale în IMAC a dovedit a reprezenta o metodă deosebit de utilă în recuperarea proteinelor,
în special în condiţiile în care se urmăreşte o producţie mare şi a unui randament crescut de
proteine. În consecinţă, IMAC a apărut drept o metodă majoră utilizată în purificarea
proteinelor, pornind din faza de laborator până la cea de pilot ori industrială.
Au fost publicate o multitudine de studii referitoare la IMAC, unele dintre ele prezentând
noi aplicaţii ale metodei ori de introducere a unor noi posibile arii de utilizare, în care această
tehnică poate fi exploatată.
Interacţiile dintre
resturile învecinate ale
secvenţei hexa-
histidinice şi matricea
Ni-NitriloTetraAcetat.
 Utilizarea diferenţelor de afinitate în interacţia proteină – ion metalic

Legarea proteinelor (ori a peptidelor) la ionii metalici se bazează pe interacţiile

dintre grupările donoare de electroni prezente pe suprafaţa proteinelor şi un ion
metalic care prezintă unul sau mai multe situsuri de coordinare, mai mult sau mai
puţin accesibile, expuse. IMAC se realizează între un sorbent, ori un matrix, la care
se ataşează covalent grupări metalice, chelatoare (Figura de mai jos).

Reprezentarea schematică a
mecanismelor implicate în
adsorbția şi desorbția
proteinelor în cromatografia
de afinitate cu metal (ion)
imobilizat (IMAC). Se prezintă
interacţiile specifice ce se
stabilesc între ionul de metal
chelator, suportul chelator şi
secvenţa polihistidinică.
 În condiţiile în care ionii metalici sunt adăugaţi (încărcaţi), chelatorii multidentaţi şi ionii metalici
formează complexe în care ionii metalici sunt fixaţi pentru interacţia următoare cu compuşii ce
trebuie să fie rezolvaţi. La sfârşitul acestei etape, ionii metalici aflaţi în complexe trebuie să posede
situsuri de coordinaţie libere la care se vor lega solventul ori moleculele de solut după interacţia
dintre proteine şi ionii metalici, proteinele legate pot fi eliberate prin utilizarea unui dezlocuitor
(precum imidazolul).

Tăria legăturii metal–proteină variază de la o proteină la alta ceea ce

conduce în majoritatea cazurilor la o diferenţiere între proteine,
proces ce poate fi exploatat efectiv în randamente mari de separare
ori în izolarea unor proteine specifice.
 Ioni metalici utilizaţi în mod comun în IMAC

Diferenţele în afinităţi ale proteinelor pentru un metal pot fi explicate, cel puţin în parte, pe
baza principiului acizilor ori bazelor tari sau slabe, descrise de către Pearson. În această teorie
se statuează că dacă doi atomi formează o legătură, un atom acţionează ca un acid Lewis iar
cel de al doilea atom ca o bază Lewis. Tăria legăturii este guvernată de valorile intrinseci “tari”
ori “slabe” ai atomilor implicaţi. Teoria acizilor tari sau slabi ori a bazelor tari şi slabe dictează că
legăturile dintre atomi cu o poziţie similară, de exemplu un acid tare combinat cu o bază tare
sunt cele mai puternice. Urmând conceptul de mai sus, ionii metalici precum K+, Ca+2, Mg+2 şi
Fe +3 sunt clasificaţi drept acizi Lewis tari, în timp ce ionii monovalenţi ai metalelor precum Ag+ şi
Cu+ sunt categorisiţi drept acizi Lewis slabi. Ionii metalelor tranziţionale de tipul, Co+2, Zn+2, Cu+2
şi Ni+2, sunt consideraţi acizi “de limită”. Aceşti ioni metalici sunt cel mai adesea utilizaţi în
IMAC, în particular Ni(II), care conferă la un număr de coordinaţie egal cu şase, posedă o
stabilitate electrochimică în condiţii cromatografice, o polarizabilitate limită şi o
stabilitate redox. Ionii metalici chelatori manifestă variaţii în afinitate faţă de proteine, care
poate fi precizată prin utilizarea teoriei descrise de Pearson.
Această teorie a acizilor şi bazelor tari şi slabi postulează că există trei tipuri majori de
liganzi. Acei liganzi care conţin oxigen (de exemplu carboxilat), azot alifatic (precum asparagina
şi glutamina) şi fosfor (de exemplu aminoacizi fosforilaţi) sunt clasificaţi drept baze Lewis tari.
Liganzii care conţin sulf (de exemplu cisteina) sunt clasificaţi drept baze slabe, acei care conţin
azot aromatic (de exemplu histidina şi triptofanul) sunt consideraţi baze de limită. Acizii aflaţi la
limită şi care conţin Co+2, Zn+2, Cu+2 şi Ni+2, coordinează în mod favorabil cu atomii de azot
aromatici (baze la limită) şi de asemenea cu atomii de sulf (baze slabe).
 În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi resturile de
aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale imidazolil, tiol şi indolil sunt
principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările funcţionale carboxil şi fosfat sunt
principalele ţinte pentru ionii metalici tari precum Fe(III) şi Mg(II). Un concept acceptat
este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de histidină pe întreaga suprafaţă a unei
proteine în timp ce accesibilitatea acestora va influenţa caracteristicile de retenţie ale
moleculei proteice. Au fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu
mare afinitate pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de
legare a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de
creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare al metalului nu este
întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr de enzime cu
afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin intermediul unui situs care
nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie de secţiuni de legare a metalului la
proteină, chiar dacă sunt expuse, pot contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a
proteinei în IMAC.
 Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare
Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce
furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare. Aceste
substanţe chelatoare sunt ataşate pe o suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare
(braţe, spacere) care pot varia în lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul
metalic este chelatat de către gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor
de coordinaţie în ion metalic pentru adsorbţia ori legarea proteinelor și a moleculelor de solvent.
Diferenţele în numărul de situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de
substanţe chelatoare (acidul iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă
selectivităţi diferite şi activităţi de adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se
va lega la atomul de azot şi de doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri
libere pentru molecula de proteină ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2 ca metal chelator, acesta
putând da o tărie metal-chelatoare superioară, dar pe de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a
proteinei. O altă însuşire a chelatorului ar fi reprezentată de o scădere a riscului de scurgere
(pierdere) a metalului chelat. Figura de mai jos arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi
chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune răşini chelatoare

încărcate cu ioni de Ni(II): Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)–
IDA (a) şi Ni(II)– acid nitrilotriacetic, Ni(II)– NTA (b) precum şi
o comparaţie a interacţiilor dintre matricele chelatoare cu
ionii de nichel (c, d).
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel
mai comun agent ligand chelator de metal pentru
imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi
chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în
ultimele decade, fiecare având propriile lor avantaje şi
limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic
carboximetilat (CM-ASP). Un alt chelator foarte utilizat în
IMAC este NTA, mai recent dezvoltat.
Dezvoltarea unor agenţi chelatori potenţiali noi cu
afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare
funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase
de compuşi cu proprietăţi de ancorare a metalului utilizate
în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură

în condiţiile identificării condiţiilor optime pentru o separarea unei
proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al
specificităţii atinse într-un protocol de purificare prin IMAC.
 Factorii care contribuie la legătura proteină–metal

O multitudine de studii indică histidina drept aminoacidul care posedă cea mai puternică
afinitate pentru ionii metalici. Este general acceptat că histidina, asemeni resturilor de triptofan şi
cisteină ca rezultat al interacţiilor puternice cu ionii metalici sunt compuşii cheie în legarea
proteinelor în IMAC. Aceşti trei aminoacizi au cele mai mari retenţii, comparativ de exemplu, cu
resturile glutamat şi aspartat, care esenţial nu prezintă nici o retenţie. Studiile efectuate au corelat
retenţiile unui mare număr de peptide sintetice ori biologic active pe Ni(II), Zn(II) şi Cu(II) chelaţi pe
IDA, cu profilurile lor în aminoacizi în scopul de a evalua proprietăţile de adsorbţie ale aminoacizilor
implicaţi în retenţia peptidelor. Alte investigaţii au relevat că proprietatea de retenţie a unor proteine
este în mare parte guvernată de resturile de histidină expuse pe suprafaţa proteinei.

Cisteina prezintă de asemenea o afinitate puternică faţă de metal, deşi oarecum mai scăzută decât
histidina. Afinitatea pentru metal a acestor doi aminoacizi poate fi atribuită în general grupărilor lor
funcţionale, în particular a grupărilor imidazol şi tiol, ale histidinei respectiv cisteinei. În cazul
histidinei, alte grupări funcţionale precum grupările carboxil şi  amino, joacă de asemenea un rol în
procesul de legare la metal. Alţi aminoacizi care pot să posede o afinitate substanţială faţă de metal sunt
triptofanul, fenilalanina şi tirozina care acţionează direct prin intermediul catenelor lor aromatice, în timp
ce arginina, lizina, asparagina, glutamina şi metionina, acţionează indirect prin efecte individuale sau
combinate pe accesibilitatea histidinei. Cu toate că retenţia proteinelor ori a peptidelor este în mod primar
(cauzal) dată de afinitatea faţă de metal a aminoacizilor constituenţi, alţi factori pot contribui profund
alături de afinitatea faţă de metal, factori ce includ secvenţa în aminoacizi (poziţia aminoacizilor în
catenă, structura primară), plierea proteinei ori proprietăţile suprafeţei acestora. Se poate spune faptul
că aceste caracteristici de retenţie ale proteinelor în IMAC nu este uşor de precizat.
 În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi
resturile de aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale
imidazolil, tiol şi indolil sunt principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările
funcţionale carboxil şi fosfat sunt principalele ţinte pentru ionii metalici tari
precum Fe(III) şi Mg(II).
Un concept acceptat este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de
histidină pe întreaga suprafaţă a unei proteine în timp ce accesibilitatea
acestora va influenţa caracteristicile de retenţie ale moleculei proteice. Au
fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu mare afinitate
pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de legare
a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de
creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare a metalului nu
este întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr
de enzime cu afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin
intermediul unui situs care nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie
de secţiuni de legare a metalului la proteină, chiar dacă sunt expuse, pot
contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a proteinei în IMAC.
 Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce

furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare.
Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură de condiţiile optime identificate
pentru separarea unei proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al specificităţii
atinse într-un protocol de purificare prin IMAC. Aceste substanţe chelatoare sunt ataşate pe o
suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare (braţe, spacere) care pot varia în
lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul metalic este chelatat de către
gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor de coordinaţie în ion metalic
pentru adsorbţia ori legarea proteinelor ori a moleculelor de solvent. Diferenţele în numărul de
situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de substanţe chelatoare (acidul
iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă selectivităţi diferite şi activităţi de
adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se va lega la atomul de azot şi de
doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri libere pentru molecula de proteină
ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2). În acelaşi mod, tetradentatul NTA este considerat a lega ionul
meztalic cu un oxigen extra carboxilat, acesta putând da o tărie metal chelatoare superioară, dar pe
de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a proteinei. O altă însuşire a chelatorului tetradentat ar fi
reprezentată de o scădere a riscului de scurgere (pierdere) a metalului chelat.
Figura arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii
de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune

răşini chelatoare încărcate cu ioni de
Ni(II): Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)–
IDA (a) şi Ni(II)– acid nitrilotriacetic,
Ni(II)– NTA (b) precum şi o comparaţie a
interacţiilor dintre matricele chelatoare
cu ionii de nichel (c, d) .
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel mai comun agent ligand
chelator de metal pentru imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi
chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în ultimele decade, fiecare
având propriile lor avantaje şi limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic carboximetilat (CM-ASP). Un
alt chelator foarte utilizat în IMAC ar fi NTA, mai recent dezvoltat. Dezvoltarea unor
agenţi chelatori potenţiali noi cu afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare
funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase de compuşi cu proprietăţi
de ancorare a metalului utilizate în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

Structuri ale unor noi grupări

chelatoare utilizate în IMAC

De exemplu dye-resistant yellow 2KT, O-fosfoserina (OPS) şi 8-hidroxiquinolina (8-HQ).

Selectarea unei combinaţii optime de chelator şi de ion de metal este importantă după cum şi
răşina chelatoare poate avea efecte adverse în retenţia proteinei. S-a observat că diferit de
metalul utilizat, răşina chelatoare poate avea un efect important în retenţia proteinei,
sugerându-se că, prin utilizarea unei răşini diferite, retenţia proteinei poate fi alterată ca
rezultat al interacţiilor dintre complexul proteină–metal şi răşina chelatoare utilizată.
 Suportul polimeric utilizat trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici fizico-chimici
în scopul de a fi corespunzător procesului IMAC. Astfel un suport ideal trebuie să fie:
 uşor de derivatizat;
 să nu manifeste adsorbţie nespecifică;
 să prezinte proprietăţi fizice, mecanice bune şi o bună stabilitate chimică;
 să posede o porozitate înaltă care să conducă la o accesibilitate uşoară a ligandului;
 să poată fi utilizat la viteze mari de curgere;
 să fie stabil la eluenţi, inclusiv, în ultimă instanţă la compuşi denaturanţi;
 să permită regenerarea coloanei fără o degenerare a matrix-ului;
 să furnizeze geluri stabile care să nu-şi modifice volumul prin deshidratare ori umflare în
timpul procesului cromatografic.
 Factorii care guvernează adsorbţia şi desorbţia
proteinelor

numărul de legături dintre ionul de metal şi un un chelator de metal imobilizat guvernează

afinitatea totală a complexului chelator–ion de metal pentru proteine ori peptide. Chelatorul trebuie
să aibă o puternică afinitate pentru ionul de metal (pentru a preveni, de exemplu, efectul
transferului de ion de metal), dar trebuie să lase de asemenea o serie de situsuri de coordinare
libere pentru a fi capabile să lege proteina la ionul de metal. Se pare că stabilitatea structurii
chelator–ion de metal depinde de tipul de ion de metal şi de compoziţia tamponului eluent utilizat.
Un număr de caracteristici ale chelatului pot să influenţeze selectivitatea legării metal–proteină:
geometri de coordinare a complexului, sarcina, volumul steric şi chiralitatea.

FAZA MOBILĂ: pH-ul, TĂRIA IONICĂ ŞI CAPACITATEA DE TAMPONARE

Selectivitatea unei IMAC pentru o proteină poate de asemenea să depindă de

compoziţia fazei mobile. Creşterea tăriei ionice a tampoanelor poate să conducă
la o supresie a interacţiilor secundare, electrostatice nedorite cu o creştere a
legării proteinei la complexul chetator după cum o scădere a concentraţiei saline
poate conduce uneori la o mai slabă adsorbţie a acesteia. Clorura de sodiu (la
concentraţii de 0,1–1,0 M) este în mod constant inclusă în tampoanele IMAC
pentru a suprima interacţiile ionice dintre probă şi matrix, ca şi cele dintre proteine.
Utilizarea valorilor crescute de pH (7 ori 8) şi a unei tării ionice mari conduce la particularizarea
IMAC faţă de alte tehnici cromatografice, precum cea de schimb ionic. IMAC se aseamănă cel mai
bine cu cromatografia de interacţie hidrofobă (HIC) deoarece se realizează cu tampoane ce conţin
concentraţii crescute de săruri.
Adsorbţia unei proteine în IMAC se realizează la un pH dat la care grupările
donore de electroni de pe suprafaţa unei proteine sunt parţial neprotonate. Este
deseori întâlnit în practică inducerea adsorbţie proteinei pe un suport IMAC sub
condiţii uşor alcaline, în prezenţa unei tării ionice crescute a tamponului.
Tampoanele fosfat şi acetat sunt cele mai utilizate în IMAC. Rolul pH-ului este
deosebit de complex în eluţia şi adsorbţia proteinelor, deoarece el influenţează un
număr de proprietăţi, inclusiv caracterul nucleofil al componentelor tamponului,
proprietăţile electron-donor acceptor ale soluţilor şi stabilitatea ionului de metal.
Domeniul de pH cuprins între 6 şi 8 favorizează retenţia resturilor histidinice şi
cisteinice; într-un domeniu mai alcalin, coordinaţiile dintre grupările amino
funcţionale sunt favorizate, ceea ce conduce la o scădere a selectivităţii.
Aditivi şi dezlocuitori de proteine

Detergenţii pot fi utilizaţi în IMAC drept amplificatori de selectivitate. Tween-ul-80, la o concentraţie

de 0,01% (v/v) a fost utilizat în purificarea prolactinei recombinate umane ori a prolactinei de la
primate, dovedind a fi deosebit de util în diminuarea interacţiilor nedorite. Uneori, un solvent organic
este adăugat la tampon pentru a ajuta la îndepărtarea endotoxinelor fără efecte dăunătoarea asupra
împachetării corecte a proteinelor, ori în scopul eliminării unor contaminanţi în cazul purificării
albuminei din extracte proteice
 Avantajele şi dezavantajele cromatografie
de afinitate cu metal imobilizat
 IMAC se realizează deseori într-o singură treaptă de purificare;
 Capacitatea de încărcare cu proteină este relativ înaltă, comparativ cu alte tehnici
de cromatografie de afinitate (0,1–10 mM/ml gel);
 Ionii de metal pot fi uşor de îndepărtat de pe răşină cu ajutorul unui agent chelator
mai puternic, EDTA sau EGTA. Ionii de metal diferiţi pot fi astfel testaţi utilizând aceeaşi
răşină chelatoare, pentru a determina ligandul ce dă cele mai mari satisfacţii în
separarea unei proteine de interes;
 Trecerea la scală mare a procesului IMAC este extrem de uşoară şi reproductibilă,
ceea ce face din această tehnică un candidat în aplicaţiile industriale;
 IMAC este utilizată în concentrarea soluţiilor diluate de proteine;
 IMAC este compatibilă un număr mare de tampoane cu forţă ionică crescută şi care
conţin componente chaotrope;
 În general, IMAC nu are efecte adverse asupra structurii proteice, fiind raportate
puţine cazuri în care metaloenzimele care posedă un ion de metal esenţial a fost extras.
Un caz a fost de asemenea raportat în pentru o proteină separată prin IMAC pe o
coloană Cu(II) –IDA, dar alterarea a fost cauzată de către agenţii reducători care au
cauzat proteoliza oxidativă catalizată de ionul de Cu(II);
 Efectuarea unei treceri (pasaj) printr-o coloană neîncărcată de IMAC, conduce la
obţinerea unor soluţii tranzitoriu sterile deoarece toţi ionii de metal esenţiali creşterii
bacteriene sunt îndepărtaţi prin chelatare;
 O răşină IMAC pot fi regenerate de foarte multe ori, fără o pierdere a
caracteristicilor cromatografice. Gelurile utilizate în IMAC sunt extrem de robuste cu
condiţia ca valori de pH sub 4 să nu fie utilizate.
O comparaţie între IMAC şi procedeele standard de cromatografie de
afinitate

Afinitatea pentru Biospecificitate/

Caracteristică
metal bioafinitate
Stabilitatea ligandului Înaltă Scăzută
Încărcarea cu proteină Înaltă Scăzută
Condiţii de eluţie Blânde Deseori extremă
Recuperarea ligandului după Completă În general incompletă
regenerarea coloanei
Selectivitate Scăzută-medie Înaltă
Cost Scăzut Înaltă
 dezavantajele utilizării IMAC

 Fenomenul de transfer al ionului de metal conduce la pierderi de proteină şi la randamente mici în

recuperare. O altă problemă ar fi dacă proteina ţintă reţine ionul de metal capturat în structura sa. În acest caz
ionul capturat poate afecta sau chiar aboli bioactivitatea proteinei. Sechestrarea ionului de metal de către proteină
este de asemenea periculoasă dacă se intenţionează a o utiliza în scop terapeutic, deoarece o serie de metale în
mod curent utilizate în IMAC sunt considerate a fi carcinogene. Ionii metalici de Co(II) ori Ni(II), aproape generaal
utilizaţi în IMAC, sunt cunoscuţi a fi agenţi carcinogeni, deşi ei sunt consideraţi mutageni slabi, comparativ cu
arsenul ori cromul hexavalent. Nichelul a fost legat de o expresie anormală a unui număr mare de gene
considerate a fi implicate în inducţia cancerului. Acest fenomen poate fi remediat prin alegerea unui alt ion metalic
chelator care interacţionează cu proteina ţintă. O altă cale care poate fi urmată este cea în care se utilizează un
agent chelator adsorbent puternic, de tipul TED [tris(carboximetil)-etilen diamină].
 Scurgerea de ion de metal de pe răşină conduce la contaminarea cu acesta a produsului final, problemă
deosebit de importantă în cazul preparatelor terapeutice. O problemă aparte în acest caz este cea datorată chiar
de interacţia dintre ionul metalic şi proteina însăşi,, mai ales în cazul proteinelor cu uz terapeutic, după cum este
cunoscut faptul că ionii de metal nu numai că sunt catalizatori ai reacţiilor oxidative ci şi afectează negativ
stabilizarea preparatelor proteice liofilizate, deşi se ştie că ionii de metal au fost utilizaţi drept aditivi alături de
zaharide în creşterea stabilităţii proteinelor în decursul liofilizării. În acest caz, în care ionul de metal este un factor
destabilizator, creşterea stabilităţii preparatului proteic se poate realiza prin adăugare de agenţi chelatori. Probele
proteice care conţin ion metalici contaminanţi după o treaptă de IMAC pot fi în continuare supuse unor alte etape
de purificare care în final conduc la preparate necontaminate, cu uz terapeutic. În cazul în care se doreşte
eliminarea urmelor de metal într-o singură treaptă se poate recurge la o coloană de tipul de tipul TED în scopul
capturării ionilor de metal contaminanţi din preparatul proteic. O altă cale elegantă de eliminare a scurgerii de ion
de metal o reprezintă utilizarea unor suporturi de imobilizare a metalului cu constante mari de legare a acestuia, şi
astfel se poate preveni pierderea ionului de metal.
 Utilizarea condiţiilor oxidative şi catalitice în timpul procesului de separare în condiţiile în care ionii metalici
sunt imobilizaţi sunt nedorite datorită apariţiei unor procese redox care conduc la alterarea proteinei.
Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal în conjunctie
cu alte tehnici cromatografice

• SECVENŢELE TERMINALE CU AFINITATE PENTRU

METAL: AVANTAJE ŞI APLICAŢII
– Identificarea proteinelor de fuziune
– Creşterea vitezei procesului de purificare
– imobilizarea unei proteine pe o suprafaţă
– Utilizarea secvenţelor tag
– creşterea stabilităţii proteinei şi de creştere a nivelului de
exprimare
 CROMATOGRAFIA CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

 Cromatografia cu ion de argint (denumită uneori şi cromatografie de

argentare) reprezintă o tehnică care se bazează pe o proprietate a ionilor de
argint de a forma complexe polare şi reversibile cu centrii nesaturaţi prezenţi într-
o serie de molecule organice precum cele din lipidic ori flavonoidic. Se face astfel
posibilă separarea pe baza numărului, configuraţiei geometrice şi a poziţiei
legăturilor duble. În practica cromatografică aceasta se realizează în conjuncţie
cu una dintre procedurile cromatografice stabilite: prin TLC, în cele mai multe
experimente realizate în trecut sau mai recent, prin HPLC ori prin cromatografie
de fluid supercritic.
 Sistemul, în mod uzual utilizat, implică încorporarea ionilor de argint într-un
suport solid şi uneori, în cazul cromatografiei cu fază inversă, utilizarea unei faze
mobile în care au fost dizolvaţi ioni de argint. Celelalte componente ale
aranjamentului cromatografic de bază sunt similare cromatografiei convenţională.
 O multitudine de metode de cromatografie cu ion de argint sunt general
aplicabile la o varietate de probe în timp ce altele, sunt mult mai specifice.
PRINCIPIUL ŞI MECANISMUL CROMATOGRAFIEI CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

Cromatografia cu ioni de argint incluşi se bazează pe principiul că moleculele

organice nesaturate reacţionează reversibil cu metale tranziţionale precum argintul,
formând complexe polare cu sarcină transferată. Astfel, se formează o legătură sigma
între electronii 2 p π* ai legăturii duble şi orbitalii 5s şi 5p liberi ai ionului de argint.
Este implicată de asemenea o legătură π între electronii de antilegătură 2 p π* ai
legăturii duble şi orbitalii 4d ocupaţi ai ionului de argint. Tăria complexului este
determinată de accesibilitatea electronilor în orbitali şi de inhibiţiile sterice ale
acestora.
Se cunoaşte mai mult despre stabilitatea acestor complexe realizate în studii de
interacţie a ionilor de argint cu diverse olefine cu catenă scurtă.
În cazul cromatografiei cu ioni de argint incluşi în suportul cromatografic, a
acizilor graşi este cunoscut că, în cazul dienelor cu grupări metilen întrerupte,
stabilitatea complexelor creşte odată cu creşterea numărului de legături duble,
izomerii cu legături duble aflate în poziţie cis sunt mai puternic reţinut decât izomerii
trans, iar stabilitatea scade odată cu creşterea lungimii catenei, şi tinde odată cu
creşterea iniţială a distanţei dintre legăturile duble să devină mai mare. Dienele
conjugate sunt reţinute mai puţin puternic decât dienele cu grupări metilen întrerupte
şi monoenele care sunt mai puternic reţinute comparativ cu monoinele.
Coloanele HPLC de tipul în care ionii de argint sunt legaţi prin
intermediul legăturilor ionice la resturi de acid fenilsulfonic, legate la
rândul lor de matricea de silice posedă proprietăţi chimice relativ bine,
numeroşi factori în special cei legaţi de compoziţie, de temperatură a
coloanei şi de viteza de curgere a fazei mobile pot fi controlaţi cu
acurateţe. Acest sistem a fost utilizat în obţinerea unor informaţii
cantitative asupra mecanismului de interacţie între ionii de argint şi
legăturile duble. S-a constatat că cromatografia cu ion de argint inclus
poate implica un mecanism mixt de retenţie, chiar în acest sistem. De
exemplu, aşa cum ionii de argint participă la complexarea legăturilor
duble, grupările libere de silanol interacţionează cu grupările esterice
ale acizilor graşi.
 CROMATOGRAFIA CU FAZĂ STAŢIONARĂ CHIRALĂ
Enantiomerii, după cum bine se cunoaşte, posedă proprietăţi fizico-chimice identice până în
momentul în care sunt plasaţi într-un mediu care este însuşi chiral. Din acest motiv, ei trebuie să
posede o retenţie egală în interacţia cu orice fază staţionară achirală, neputând fi separaţi cu
ajutorul sistemelor cromatografice achirale. Pentru a crea un mediu chiral, se poate adăuga o
componentă chirală adiţională la sistemul cromatografic, aşa-numitul selector chiral. Selectorul
chiral poate fi prezent în faza mobilă (tehnică denumită fază mobilă chirală) ori în faza staţionară
(fază staţionară chirală). Totuşi, în cazul general, selectorul chiral este prezent în ambele faze iar
recunoaşterea chirală se manifestă simultan, în fazele mobilă şi staţionară.

FAZE STAŢIONARE CHIRALE

Majoritatea acestora sunt realizate pe suport de silicagel ce este

acoperit cu un material polimeric de care este legat un izomer optic
activ. De exemplu, forma L a prolinei se leagă la un copolimer reticulat
polistiren-p-divinilbenzen pentru a se produce o fază staţionară optic
activă necesară separării a unor amestecuri racemice de aminoacizi.
În această aplicaţie, ionii de cupru sunt introduşi în soluţia
enantiomerică de analit ce urmează a fi separată. După cum se
observă în figura următoare are loc formarea unui complex terţiar
între faza staţionară, anionii de aminoacid şi cationii de cupru.
Constanta de formare a acestui complex diferă de formele D şi L ale
aminoacidului analit ceea ce face posibilă separarea acestora.
Reprezentarea schematică a complexului
ternar format între L-prolină legată la faza
staţionară, un aminoacid prezent într-un
analit şi ionul bivalent de cupru.
 Au fost dedicate o serie de studii pentru dezvoltarea unei mai bune
metodologii în cromatografia chirală, enantioselectivă, ceea ce a condus la
identificarea unor noi faze staţionare chirale. O serie de agenţi chirali au fost
derivatizaţi şi imobilizaţi pe suprafaţa suportului cromatografic (deseori
reprezentat de silicagel) servind drept discriminatori chirali în timpul procesului
cromatografic. De multe ori fazele staţionare chirale sunt de preferat în
procesul de separare cromatografică datorită vitezei de analiză, posibilitatea
analizării ori a purificării unor enantiomeri dintr-un amestec complex, a
reproductibilităţii analizei precum şi a flexibilităţii ei. În plus, sistemele
cromatografice analitice pot fi adaptate la separări preparative când se pot
colecta enantiomeri în formă pură.
Această tehnică cromatografia cu fază staţionară chirală are drept
aplicabilitate practică studiile de recunoaştere moleculară, după cum retenţia
diferenţială a enantiomerilor în sistemul cromatografic care utilizează faze
chirale staţionare poate fi datorată discriminării chirale la nivelul situsurilor
chirale, interacţii care se pot explora.
S-a arătat că parametrii cromatografici obţinuţi prin fazele staţionare
chirale pot fi deosebit de sensibili, ceea ce conduce la separări în cazul unor
enantiomeri cu proprietăţi foarte apropiate. În plus, fazele staţionare chirale pot
fi utilizate în studii specifice de recunoaştere chirală între molecule. O altă
aplicaţie a cromatografiei cu fază chirală o constituie studiul unor medicamente
cu structură chirală.
 O clasificare convenţională a tipurilor de
faze staţionare după modul de interacţie
între faza staţionară şi enantiomer este
prezentată în tabelul alăturat

Tip de interacţie Exemple

albumina serică, glicoproteina a1-acidă

Afinitate chirală a proteinelor
(orosomucoid), ovomucoid şi chimotripsina.

Acces stereoselectiv la polimeri

Polizaharide derivatizate ori libere.
chirali helicaţi

Interacţii sterice μ-μ între un donor şi

un acceptor de tip chiral cu grupări Interacţii Pirkle.
amido aromatice

Interacţii gazdă-macromoleculă în
Ciclodextrine, eteri coroană şi polimeri legaţi.
interiorul unei cavităţi chirale

Ioni de cupru complexaţi cu zone moleculare

Schimb de ligand
chirale.
 Deşi α-1 glicoproteina acidă (AGP, orosomucoid) şi ovomucoidul (OVM) au cel mai mare câmp
de aplicaţii, multe rapoarte ştiinţifice au descris separarea cromatografică şi/sau studii de legare
prin utilizarea albuminei serice bovine (BSA), a albuminei serice umane (HSA) şi a celobiohidrolazei
I (CBH I) drept selectori chiral imobilizat. Toate aceste coloane sunt disponibile comercial la fel ca şi
coloanele chirale cu avidină ori pepsină, legate. Se poate evidenţia că proteine precum proteina de
legare a riboflavinei, ovoglicoproteina (fracţia activă a preparatelor proaspete de ovomucoid) şi
amiloglucozidaza reprezintă sunt candidaţi promiţători în separarea chirală a compuşilor activi. Alte
faze chirale staţionare descrise în literatură utilizează tripsina imobilizată α-chimotripsina,
conalbumina (ovotransferina) şi lizozimul însă aplicabilitatea lor este relativ limitată.

Se mai poate nota că numărul de proteine care pot fi utilizate drept selectori chirali
imobilizaţi în electroforeza capilară ori în alte tehnici înrudite este mult mai mic decât cel utilizat
în cromatografia lichidă. Au fost descrise separări chirale prin electrocromatografie în tuburi
deschise capilare (open tubular capillary electrochromatography, OTCEC) cu proteine adsorbite
pe perete (lizozim, avidină, albumina serică bovină - BSA, orosomucoid, albumina serică umană
- HSA) ca faze staţionare. În paralel la aceste studii au fost testate reţele de BSA–dextran şi
geluri reticulate de BSA şi celobiohidrolază I în geluri de electroforeză de afinitate.
În concluzie, aceste faze staţionare se realizează din proteine naturale legate la matricea
de silice. Caracteristica de bază o reprezintă faptul că aceste proteine conţin un mare număr de
centrii chirali recunoscuţi a reacţiona puternic cu analiţii mici manifestând o selectivitate chirală
puternică. S-au evidenţiat situsuri interactive specifice care conduc la selectivitatea chirală, dar,
sunt prezente mult mai multe situsuri ce numai contribuie la retenţia generală. Aceste alte
situsuri pot fi dezactivate de către aditivii prezenţi în faza mobilă (de exemplu octilamina) care
reduc astfel retenţia generală dar cresc selectivitatea chirală.
 Cel de al doilea tip se bazează pe interacţii chirale între solut şi polimeri naturali şi a fost
dezvoltă de către Okamato şi colaboratorii ce au descris în anul 1987 prima preparare de
suport chiral la care polizaharidele au fost legate de gelul de matricea solidă activată cu γ –
amino-propil-silice. Metoda de fixare constă din utilizarea diizocianatului.

Fixarea 3,5-dicloro- şi a 3,5-

dimetilfenil carbamatatului
la celuloză pe gel de γ –
aminopropilsilice.
 Dintre diversele tipuri de polimeri polizaharidici precum celuloza, amiloza, chitosanul, xilanul,
curdlanul, dextranul şi inulina, celuloza şi amiloza au fost utilizate în prepararea şi comercializarea
suporturilor cromatografice de separare chirală. Celuloza şi amiloza ca atare nu pot şi nu sunt
comercializate drept suporturi cromatografice de separare chirală datorită capacităţii lor scăzute în
rezoluţie ca şi din cauza problemelor ce apar în manipularea lor. Din această cauză aceşti polimeri
au fost derivatizaţi sub diverse forme (precum tricarbamaţi ori triesteri). Aceşti derivaţi sunt apoi
legaţi pe suportul de silice.
Catenele polimerice ale unităţilor de D−(+) glucoză conţin legături β-1,4 în cazul celulozei şi
respectiv α 1,4 în cazul amilozei. Aceste catene se află într-o parte şi în alta în formă lineară în
cazul celulozei şi în formă elicoidală în cazul amilozei.
Suporturile cromatografice de separare chirală pe bază de polizaharide sunt disponibile atât în
modul de cromatografiere în fază normală cât şi în cel de fază inversă.

Structurile tridimensionale ale celulozei

şi ale amilozei
 Mecanismul de recunoaştere chirală la nivel molecular a interacţiei chirale în cazul suporturilor
cromatografice chirale pe bază de polizaharide rămâne încă neclar deşi s-a raportat că rezoluţia chirală realizată
pe baza acestora este realizată prin interacţii de hidrogen, interacţii π – π, interacţii dipol – dipol induse, între
suportul chiral şi enantiomeri.
S-a observat că legarea coordinativă contribuie de asemenea la rezoluţia chirală a enantiomerilor ce conţin
atomi de sulf în cadrul moleculei. În plus faţă de aceste legături, efectele sterice guvernează de asemenea
rezoluţia chirală pe aceste suporturi pe bază de polizaharide. Aşadar, structura tridimensională a racemaţilor (care
conţin grupări funcţionale şi inele aromatice) se asamblează stereogenic în diverse moduri în cavităţile chirale ale
fazei staţionare, care se stabilizează prin aceste legături de magnitudini diferite atât pentru enantiomerii (+) cât şi
pentru cei (−) şi astfel are loc ori se manifestă rezoluţia enantiomerilor.

Structurile chimice şi ale celor mai utilizate

suporturi cromatografice de separare chirală pe
bază de polizaharide (celuloză şi amiloză). Esteri de
celuloză: celuloză triacetat (1); celuloză tribenzoat
(2); celuloză tri-4 metilbenzoat (3); celuloză
tricinamat (4); celuloză tri-3-metilbenzoat (5);
Carbamaţi ai celulozei: celuloză trifenil carbamat
(6); celuloză tri-3,5-dimetilfenil carbamat (7);
celuloză 4-clorofenil carbamat (8); celuloză tri-4
metil fenilcarbamat (9); Carbamaţi ai amilozei:
amiloză tris 3,5-dimetilfenil carbamat (10); amiloză
tris (S)-α metilfenil carbamat (11); amiloză tris (R)-α
metilfenil carbamat (12).
 Cel de al treilea tip este reprezentat de substanţele chirale cu o masă moleculară relativă mică
legate la silice. În acest caz fazele chirale staţionare de tip Pirkle sau înrudite cu acest tip de faze
sunt compuse din selectori chirali mici, sintetici ori molecule chirale care sunt ataşate la grupările
silanol ale suportului de silice prin braţe („spacere”) achirale.
Selectorii chirali conţin grupări ori părţi aromatice (fenil, dinitrofenil, naftil, etc.), capabile să
interacţioneze printr-o interacţie “în trei puncte” ce are loc între selectorul chiral şi analit. În plus faţă
de interacţiile prin legături de hidrogen şi cele dipol-dipol, interacţiile π – π dintre părţile aromatice
din structura selectorului chiral şi analit, joacă un rol predominant.
Fiecare dintre grupările legate are un număr limitat de centrii chirali dar, datorită mărimii lor
mici, se pot lega un număr mare de grupări la silice (opus cazului în care complexelor mai mari cu
părţi chirale). Din această cauză apare o probabilitate relativ înaltă de menţinere a interacţiei dintre
solut şi centru chiral. Avantajul fazelor chirale Pirkle este acela că per total, cum molecula care
interacţionează este mică, soluţii nu sunt puternic reţinuţi şi astfel selectivitatea chirală devine
factorul dominant.
 William Pirkle este cel care a descoperit şi dezvoltat acest tip de faze staţionare chirale. În
raţionamentul său, Pirkle s-a bazat pe faptul că dacă o moleculă chirală are afinităţi diferite
pentru enantiomeri, ea trebuie să posede un minimum de trei puncte de interacţie; dintre
acestea, cel puţin unul este stereochimic dependent.
În condiţiile utilizării fazei staţionare chirale de tip Pirkle, recunoaşterea chirală se
manifestă la ambele situsuri de legare. Situsurile majore de legare sunt clasificate astfel: inele
aromatice π - bazice; inele aromatice π – acide; situsuri acide; situsuri bazice; situsuri acide;
situsuri de interacţie sterică.
Inelele aromatice sunt potenţial realizatoare de interacţii π – π. Situsurile acide furnizează
hidrogenii pentru formarea punţilor intermoleculare potenţiale dintre aceştia. Situsurile bazice,
ca şi electronii π, pot de asemenea forma punţi de hidrogen. Interacţiile sterice se pot manifesta
de asemenea între două grupări mari.
Suporturile de cromatografie chirală prin interacţie Pirkle se divid în trei clase: π –
acceptori de electroni; π – donori de electroni; acceptori de electroni π şi donori de electroni π.
Figura de mai jos prezintă schematic mecanismul de legare chirală prin interacţie Pirkle.

Reprezentarea schematică a mecanismului de

legare chirală prin interacţie Pirkle. A= grupare π
acidă; B= Situs acid; C= Situs bazic.
 Un mare avantaj în utilizarea fazelor staţionare chirale de tip Pirkle o
reprezintă capacitatea de a inversa ordinea de eluţie prin utilizarea aceluiaşi
tip de fază staţionară chirală, dar cu configuraţie absolută inversată. Este
astfel posibil a elua în urme enantiomerul, înaintea celui major, o trăsătură
dorită în cazul determinării purităţii enantiomerilor. Pentru separări preparative
este benefic a elua compusul dorit, primul.

Fazele staţionare chirale de tip Pirkle pot separa o multitudine de

enantiomeri din numeroase grupe de compuşi, precum: medicamente din
clasa acidului aril propionic, compuşi antiinflamatori nesteroidici, compuşi cu
importanţă în agricultură, produse naturale, β- blocante, o multitudine de
compuşi farmacologici activi, etc.
 Al patrulea tip de faze staţionare chirale este reprezentat de suporturi ce conţin în
structura lor glicopeptide macrociclice şi a fost introdus în cromatografie de către
Armstrong, în anul 1994.
Acestea sunt compuşi chimici care conţin de asemenea un număr mare de centrii
chirali, împreună cu o serie de cavităţi moleculare în care moleculele de solut pot intra şi
astfel interacţiona cu grupări aflate în aceste zone. Caracterul spaţial al solutului va
determina gradul de pătrundere şi în consecinţă proximitatea interacţiei care, în schimb,
va determina energia de interacţie şi magnitudinea retenţiei.

Antibioticele macrociclice posedă o serie de caracteristici care le permit să interacţioneze cu

analiţii şi astfel să servească drept selectori chirali. Ele posedă un număr de centrii stereogenici şi
grupări funcţionale, care participă la multiplele interacţii cu moleculele chirale.
Antibioticele macrociclice posedă o masă moleculară cuprinsă între 600 - 2200 şi au deseori
numeroase grupări funcţionale inserate pe structura lor. Ele pot fi acide, bazice ori neutre, neavând
ori având o absorbanţă redusă în domeniul UV–VIS. Un serie dintre aceste proprietăţi fizico-
chimice sunt prezentate în tabelul 3.30.
Antibioticele macrociclice pot interacţiona prin interacţii hidrofobe, dipol–dipol, interacţii π–π,
legături de hidrogen precum şi prin repulsii sterice. Una dintre cele mai importante interacţii sunt
cele ionice ori cele de schimb de electroni. În plus faţă de părţile hidrofobe, aceste molecule
posedă grupări hidrofile precum şi un număr de grupări ionizabile, ceea ce permite o bună
solubilitate în soluţii apoase. Cele mai de succes şi mai utilizate antibiotice macrociclice ca şi
selectori chirali sunt glicopeptidele. Ansamicinele, polipeptida tiostreptonă şi aminoglicozidele,
fradiomicină, kanamicină şi streptomicină, au fost de asemenea utilizate drept selectori chirali.
 UTILIZATAREA UNOR ANTIBIOTICE CA FAZE STAŢIONARE CHIRALE
Ansamicinele, rifamicina B şi rifamicina SV, au o semnificaţie istorică, deoarece
ele au fost utilizate la început drept selectori chirali exclusiv în electroforeza
capilară, înainte de a fi utilizate în cromatografie. Rifamicina B a fost primul
dintre compuşii ansa utilizaţi în electroforeza capilară pentru separarea efectivă
a unei varietăţi de analiţi ce conţin grupări amino. Aceste au o structură
caracteristică ansa ce cuprinde o structură de inel ori un cromofor ce este înţepat
de o catenă. Catena alifatică poate fi înalt substituită din care cauză
ansamicinele diferă prin tipul şi poziţia substituenţilor pe inelul
naftohidroquinonic, după cum se observă în figură

Structurile chimice, numerotare

(A, B) şi reprezentarea schematică
spaţială (C, D) a rifamicinei B şi a
rifamicinei SV.
 Catena alifatică a ambilor compuşi prezintă un etil ester la C21 şi un metil eter la C23.
ansamicinele cele mai des utilizate în separări chirale sunt rifamicina B şi rifamicina SV. S-a arătat
că rifamicina B prezintă enantioselectivitate faţă de compuşi cationici, în timp ce rifamicina SV este
enantioselectivă faţă de soluţi neutrii ori oarecum anionici.
Ansamicinele rifamicina B şi SV, absorb puternic în regiuni spectrale UV şi vizibile din cauza
inelului naftohidroquinonic. Fiecare compus are maximum de absorbţie la 220, 304 şi 425 nm. Din
această cauză rifamicinele sunt utilizate la concentraţii relativ înalte (20–25 mM), separările fiind în
monitorizate (urmărite) cel mai adesea prin detecţie indirectă. Detecţia indirectă se realizează în
general, prin analiza peak-urilor negative, proces datorat reducerii absorbanţei comparativ cu
semnalul de fond (semnal background).
Glicopeptide
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică par a fi cei mai buni selectori chirali
descoperiţi până în prezent. Ele includ avoparcina, ristocetina A, teicoplanina, vancomicina şi doi
analogi derivaţi ai vancomicinei.

Structurile chimice ale antibioticelor

macrociclice de natură glicopeptidică
utilizate în cromatografia cu fază
chirală: (A) vancomicina, (B)
teicoplanina, (C) avoparcina, (D)
ristocetina A.
 tiostreptona
Polipeptide şi aminoglicozide Kanamicin sulfat
Streptomicina
fradiomicina

O dată cu introducerea fazelor legate ce conţin antibiotic macrociclic acestea au devenit

extrem de populare deoarece s-au dovedit deosebit de utile ca în separările chirale prin
cromatografie lichidă, în special de înaltă performanţă. Antibioticele macrociclice vancomicina,
ristocetina A, teicoplanina, avoparcina, rifamicina B şi tiostreptona au fost utilizate pentru
separări chirale. Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică, vancomicina, ristocetina A,
teicoplanina şi avoparcina par a avea o enantioselectivitate mai largă comparativ cu cea a
ansamicinelor ori a polipeptidului tiostreptonă. Antibioticele macrociclice sunt legate covalent la
gelul de silice prin intermediul unor variate punţi de natură chimică ce le asigură stabilitatea cu
menţinerea proprietăţilor de recunoaştere chirală.
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică şi tiostreptona sunt ataşate la gelul de
silice prin reacţia grupărilor lor carboxilice cu organosilani, în timp ce antibioticul macrociclic
rifamicina B poate fi ataşată prin intermediul reacţiei dintre grupările aminice cu organosilani.
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică pot fi de asemenea ataşate prin reacţie de
epoxilare similar metodei utilizate pentru imobilizarea ciclodextrinelor, ori pot fi imobilizate prin
metoda cu izocianat, în mediu anhidru de dimetilformamidă.
 Fazele cu glicopeptide legate pot fi utilizate în modul de fază normală, fază inversă ori în solvenţi
organici polari pentru a atinge diferite enantioselectivităţi sau pot fi derivatizare pentru a li se altera
enantioselectivitatea.
Fazele cu antibiotice macrociclice legate realizează criteriul general pe care cele mai utilizate faze
legate îl îndeplinesc, adică sunt suficient de efective ca medii de separare, manifestă o bună rezistenţă
mecanică, alături de un preţ accesibil. Fazele legate cu antibiotice macrociclice sunt similare fazelor
staţionare chirale cu proteine legate şi au o capacitate mai mare alături de o mai bună stabilitate.
Enantioseparările se realizează printr-o multitudine de interacţii precum complexări π–π, legături de
hidrogen, incluziuni hidrofobe, interacţii dipol-dipol, repulsii sterice, precum şi combinaţii ale acestor
interacţii. În timp ce cu alte faze staţionare se pot produce o serie din interacţii asemănătoare, ele nu sunt
în mod normal accesibile pentru o singură fază legată cu o proximitate închisă.
În opoziţie la fazele staţionare chirale cu proteine legate, cele pe bază de antibiotice macrociclice pot
fi utilizate în procedeul cu fază normală fără nici o modificare ireversibilă în enantioselectivitate, proces
datorat în primul caz denaturării proteinei legate. Aceste faze pot fi utilizate şi în separări preparative.
Vancomicina, rifamicina B şi tiostreptona au fost primele antibiotice macrociclice introduse sub formă
legată în cromatografia cu fază staţionară chirală. Dintre acestea trei, numai vancomicina a demonstrat un
potenţial larg de aplicare, fiind folosită atât în procedeul cromatografic cu fază inversă cât şi în cel cu fază
normală. Vancomicina a fost de asemenea derivatizată cu 3,5-dimetil - fenilizocianat (DMP) şi evaluată
apoi din punct de vedere al calităţilor de fază chirală. Faza staţionară cu DMP - vancomicină a fost
capabilă să rezolve o serie de compuşi pe care suportul chiral cu vancomicină nu a reuşit, în special în
cazul hidroxizinei şi a altiazidei.
Suportul chiral cu vancomicină legată a fost utilizat într-un mare număr de aplicaţii, pentru separarea
multor compuşi optic activi. Acest suport chiral a fost utilizat la rezolvarea unor amestecuri racemice de
piridone (derivaţi ai piridinei cu una sau mai multe grupări cetonice pe un inel), arildihidropirimidin
carboxilaţi (analogi dihidropiridinici ai modulatorilor canalelor de calciu de tip nifedipinic, un agent clasic
coronaro – vasodilator şi blocant al canalului de calciu, care reduce accesibilitatea ionilor de calciu la
nivelul musculaturii netede şi a inimii, utilizat în tratamentul anginei pectorale); enantiomeri ai
citalopramului (medicament utilizat în tratamentul depresiilor) ori ai metaboliţilor demetilaţi derivaţi ai
acestuia din plasma umană, a α aminoacizilor şi dansil derivaţilor acestora; imide ciclice, barbiturice,
piperdin-2,6-dione şi produşi de semisinteză din alcaloizi izolaţi din ergot.
 Teicoplanina s-a utilizat ca fază chirală legată în separarea a peste de
compuşi 90 optic activi printre care aminoacizi şi peptide, salbutamolului (un
agent simpatomimetic utilizat drept bronhodilator, în special în tratamentul
astmei) şi ai metaboliţilor lui din matrix-uri biologice, în determinarea
enantiomerilor albuterolului (un stimulant β-adrenergic utilizat drept
bronhodilator în tratamentul astei şi a altor boli obstructive de pulmon) din
plasmă, în separarea unor aminoacizi rari aromatici. Aceasta din urmă diferă de
vancomicină printr-o „coadă” hidrofobă, ceea ce-i conferă proprietăţi chirale
diferite. Teicoplanina a fost deseori utilizată împreună cu vancomicina în
separarea unui mare număr de soluţi.
Ristocetina A reprezintă unul din ultimele glicopeptide utilizate în
cromatografia cu fază chirală. Prin utilizarea ei s-au separat peste 230 de
amestecuri racemice, în sistem de fază normală ori fază inversă. Din punct de
vedere al caracteristicilor de retenţie, al stabilităţii coloanei, se pare că acest
suport chiral este complementar primelor două glicopeptide prezentate mai sus,
vancomicina şi teicoplanina.
Avoparcina a fost izolată din pui de găină şi a fost utilizată la drept fază
chirală legată la gelul de silice în analizele HPLC, fiind utilizată în condiţiile în
care alte faze staţionare chirale nu pot rezolva în totalitate o serie de
amestecuri racemice, precum în cazul verapamilului (un vasodilator calciu
blocant utilizat în tratamentul hipertensiunii, anginei pectorale şi a unor aritmii
cardiace), tiroxinei (un hormon ce conţine iod secretat de către glanda tiroidă şi
care amplifică viteza metabolismului celular, reglând creşterea), ori a
mefenitoinei (un medicament toxic anticonvulsiv cu denumire comercială
mesantoin utilizat în tratamentul epilepsiei în condiţiile în care alte medicamente
anticonvulsive devin ineficace).
 Al cincilea tip de cromatografie cu fază chirală legată se referă la cea de schimb
enantioselectiv de ligand, tehnică sugerată de Davankov şi colaboratorii spre sfârşitul
anilor ‟70, fiind utilizată la rezolvarea unor amestecuri de racemici în enantiomerii
constituenţi, fiind astfel prima tehnică de cromatografie lichidă care conduce la o
separare completă şi certă a stereoizomerilor din cele mai importante clase de compuşi
naturali ori de sinteză, precum α aminoacizii, hidroxiacizi, aminoalcooli şi a multor altora.
Introducerea cromatografiei cu schimb de ligand a condus la o dezvoltare în cercetarea
chimică (studii stereochimice, sinteze asimetrice, cataliză enantioselectivă) şi în cea
farmacologică.
Principiul de bază al separării enantioselective prin cromatografie cu schimb de
ligand a fost demonstrat de către un selector chiral chimic legat la o matrice polimerică
precum un complex al Cu (II) cu o serie de aminoacizi naturali care formează în anumite
condiţii complexe ternare compuse din ligandul chiral din faza staţionară, ionul de Cu (II)
şi analit. Enantioselectivitatea formării de complexe ternare, de exemplu diferenţa în
stabilităţi termodinamice a două structuri diastereoizomerice ce cuprind enantiomeri (R)
sau (S) ai analitului este extrem de mare.
Implicarea a doi enantiomeri într-un proces de complexare este aproape identic iar
în ceea ce priveşte mărimea şi sarcina celor două complexe diastereomerice ternare
formate acestea sunt exact identice. Două specii diastereomerice pot diferi numai prin
forma spaţială a lor, singura diferenţă care poate afecta în mod dramatic reprezentând-o
adsorbţia lor pe suprafeţe solide ori pseudo-solide. Acest fenomen reprezintă baza fizică
a procesului de discriminare chirală
 Metode de separare

de atingere a s tarii de echilibru

Cromatografia Elec tro foreza (steady state, displacement electrophoresis)
frontalã, liberã, de migrare î n s olutii (tampon)
moving boundary electrophoresis is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
î n medii s tabilizate, zonalãisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeazã zonele de migrare
si permite o mai bunã separare
suporturi chimic active
medii suport cu structurã capilarã
medii suport cu structurã reticularã imunoelectroforeza
pe strat subtire electroforeza de afinitate
pe hârtie
pe folii de acetat de celulozã pe poliacrilamidã
pe agar, agarozã
pe amidon
 Istoric
• 600 i. C. - Thales din Milet
• 1908- Reiss
• 1909 – Michaelis
• 1937 – Tiselius
• 1947 – Martin & Synge - definesc
ionoforeza
 Concepte de baza in electroforeza
• Fenomenele electrocinetice de transport se tine cont de
faptul de:
– Particula care migreaza (coloidul de dispersie)
– Mediul de dispersie
Coloizii de dispersie sunt putatori de sarcina electrica
Cohen-la contactul dintre două faze, faza cu constanta
dielectrică mare se încarcă pozitiv
Graham- chemosorbtie
qs reprezintă densitatea electrică superficială
d2 este grosimea stratului dublu
ε este constanta dielectrică a mediului
ϛ (zeta)=potențial electrocinetic care apare la
suprafața particulei din mediu și care
generează separarea electroforetică

k-1 = grosimea stratului dublu electric (sau

lungimea Debye)
kB = constanta Boltzmann
T= temperatura
e = sarcina electrică
F = constanta Faraday
I = tăria ionică zi ; ci = valența respectiv concentrația molară
a ionilor din soluție
O particulă încărcată electric, într-un mediu lichid tamponat, sub acțiunea unui câmp electric uniform, se va
deplasa cu o viteză constantă, determinată de acțiunea a patru forțe:
•Forța de atracție electroforetică (F1) egală cu produsul dintre sarcina electrică Q a particulei ( a entității
electrocinetice) și intensitatea câmpului electric aplicat (E)

•Forța de frecare Stokes (F2), egală cu produsul dintre coeficientul de vâscozitate a mediului (η), raza
particulei (r) și viteza electroforetică, v după relația:

F2= 6πηrv

•Forța de frânare electroforetică (F3) rezultată ca urmare a atracției exercitate de câmpul electric asupra
ionilor electrolitului (soluția tampon în care se deplasează particula) conform relației:

F3= (Q - ε• ξ•r)•E
reprezintă sarcina electrică a particulei;
unde Q
ε este constanta dielectrică a mediului;
ξ reprezintă potențialul zeta;
r este raza particulei;
E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.
Forța datorată efectului de frânare (F4), forță care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului în
apropierea particulei, sub acțiunea unui câmp electric uniform.
 Imediat după aplicarea unui câmp electric , suma vectorială a celor patru forțe devine
egală cu zero, iar viteza electroforetică devine constantă:

Pentru electroforeza în medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamidă, etc.) F3 și F4 sunt practic
neglijabile, astfel încât forței de atracție electroforetice (F1) se opune forța de frecare Stokes (F2):

ceea ce înseamnă că:

Din ultima relație se calculează viteza electroforetică:

Ecuația de mai sus conduce la relația Huckel:

unde ξ reprezintă potențialul zeta;

ε este constanta dielectrică a mediului;
H este gradientul de potențial, egal cu raportul dintre tensiunea
aplicată, E și distanța dintre electrozi, l.
r este raza particulei;
E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.
La baza fenomenelor electrocinetice importanță practică are relația Helmholtz-
Smoluchovski:

Henry, plecând de la relațiile Huckel și Helmholtz-Smoluchovski,

le generalizează conform teoriei stratului difuz:

unde re reprezintă raza efectivă a particulei hidratate, r+δ, iar χ este

inversul grosimii stratului dublu electric, fiind cuantificat de relația:
 în care: z reprezintă valența;
e este sarcina elementară;
n este numărul ionilor

La temperatura camerei,
pentru n=c (în moli/litru)

Se poate deci evalua potențialul zeta (ξ):

unde v reprezintă viteza electroforetică.

 MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea electroforetică este în relație de proporționalitate

directă cu viteza electroforetică, fiind raportul dintre viteza
electroforetică și intensitatea câmpului electric. Ea se determină
prin măsurarea intervalului de timp, t, necesar unei particule sau
unei interfețe solid-lichid să parcurgă o anumită distanță, d, sub
acțiunea unei diferențe de potențial exterior.

Dacă l, reprezintă distanța dintre electrozi măsurată în interiorul

soluției, atunci mobilitatea electroforetică se poate scrie:

Cum H (gradientul de potențial), este egal cu

raportul dintre intensitatea câmpului electric
aplicat (tensiunea aplicată), E și distanța dintre
electrozi, l, se poate scrie:

de unde se deduce mobilitatea efectivă (măsurată în sistemul

internațional în m2•V-1•s-1), µ:
În practică se folosește mobilitatea relativă, µo care
este proporțională cu distanța de migrare:

Mobilitatea relativă se calculează prin compararea mobilităților

diferitelor particule, considerându-se că timpul de migrare și
intensitatea câmpului electric sunt constante (adică particulele care
se compară au condiții identice de migrare electroforetică.

Pentru electroforeza în medii stabilizate, când

adică,

Se calculează viteza de migrare drept:

Coeficientul 6π•η•r este denumit coeficient de fricțiune (frecare)

în medii stabilizate. El depinde și de alți factori.
 Substituind viteza electroforetică din relația de mai
sus în ecuația mobilității relative:

atunci,

Se observă astfel faptul că mobilitatea relativă este în funcție de

sarcina particulei, Q și de raza sa, r:
unde Q reprezintă sarcina particulelor, iar r este raza particulei. Se poate
spune că particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate
identică
Cum Q este produsul dintre suprafață și densitatea
de sarcină superficială, qs, pentru o particulă sferică Q = 4 π•r2•qs
cu raza r, sarcina particulei este:
iar mobilitatea relativă este funcție
de raportul Q/r = 4 π•r•qs
atunci,
ceea ce arată că dacă variațiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de
variațiile de sarcină electrică superficială, particulele vor migra cu mobilități
egale.
 REZOLUȚIA DE SEPARARE

În electroforeza într-un mediu stabilizat, particulele cu

mobilități (µ) diferite se vor deplasa în zone discrete.
Teoretic separarea diferitelor particule sub formă de zone
discrete este realizată, dacă mobilitățile relative sunt suficient
de diferite și dacă distanța migrării este suficient de mare.
Eficiența unei separări electroforetice este exprimată printr-o
mărime denumită rezoluție de separare, Rs.

Considerând două zone separate electroforetic, cu lățimea benzii egală

cu l1 și l2, iar distanța dintre ele fiind egală cu Δd, rezoluția de separare
este egală cu:

unde Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2, iar l1 și l2 sunt lățimile celor
două zone formate de două tipuri de particule.
 Drumul parcurs (distanța) în procesul
d = µ•E•t separării electroforetice este
egală cu: d = v•t
unde v reprezintă viteza electroforetică iar t
este timpul de migrare

Din relația mobilității, µ=V/E se deduce viteza electroforetică, v=µ•E, iar drumul
parcurs de o particulă în funcție de mobilitatea sa este dat de relația:

Se poate spune că drumul parcurs de o particulă este egal cu produsul dintre

mobilitatea sa, timpul de migrare și câmpul electric aplicat.
Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = µ1•E•t iar
drumul parcurs de particula 2 este egal cu d2 = µ2•E•t.

Cum Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2 fiind egală cu diferența de

migrare între cele două particule (d1-d2) se deduce rezoluția de separare:
Se consideră că: (1) pentru o separare electroforetică eficientă este necesară o
rezoluție de separare cuprinsă între 1 și 1,5; (2) lățimea zonelor de separare (l1 și l2
din figura de mai sus) are un rol hotărâtor. Ea este asociată cu dispersia Gauss
datorată procesului aleatoriu de deplasare.
Dispersia totală este suma a cinci termeni care acționează independent:
•Difuziunea termică;
•Microheterogenitatea;
•Difuziunea turbulentă;
•Electrodifuziunea;
•Electrosorbția.
Primii doi termeni acționează și sunt importanți în cazul electroforezei în mediu liber;
difuziunea termică și difuziunea turbulentă este importantă în cazul electroforezei pe
medii stabilizate.
Pe de altă parte, analiza relației rezoluției de separare în contextul proceselor de
dispersie arată că pentru creșterea rezoluției dee separare este de preferat creșterea
intensității câmpului electric și nu a timpului de migrare.
 FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ REZOLUȚIA DE
SEPARARE ȘI MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea particulelor care se deplasează într-un câmp electric uniform

precum și rezoluția de separare dintre particule cu mobilități diferite sunt
influențate de următorii factori:
•pH-ul soluției tampon. Acesta afectează mobilitatea deoarece sarcina
electrică este funcție de pH. Din această cauză, alegerea soluție cu pH
optim conduce la rezoluții superiore.
•Difuziunea postelectroforetică care depinde de metoda electroforetică
utilizată.
•Factori proprii particulelor: mărime, formă, sarcină electrică,
concentrație, gradul de hidratare și disociere.
•Factori caracteristici mediului de separare: vâscozitate, pH, intensitatea
câmpului electric, timpul de migrare.
•Factori dependenți de metoda electroforetică utilizată: difuziunea
postelectroforetică.
•Alți factori.
 TĂRIA IONICĂ (FORȚA IONICĂ)

Câmpul ionic dezvoltat de un ion în soluție depinde de: (a)

concentrația sa; (b) valența (sarcina) sa; (c) prezența altor
ioni în soluție.
În soluții diluate, tăria ionică este independentă de natura
chimică a ionului. Pentru a ține cont de toți acești
parametrii, s-a introdus o mărime denumită tărie ionică
(forță ionică).
Prin definiție, tăria (forța) ionică (j) reprezintă semisuma
termenilor obținuți prin înmulțirea concentrațiilor molare
(c) a fiecărui ion în soluție cu pătratul valenței sale (z):

unde i = 1,2,....n
 µ

În calculul forței ionice a unei soluții tampon se consideră că acizii slabi sunt
nedisociați, în schimb sărurile lor sunt complet disociate. Astfel, pentru o soluție
tampon conținând 8,8 g/l acid dietilbarbituric și 10,3 g/l dietilbarbiturat de sodiu,
forța ionică este dată numai din disocierea sării de sodiu și ionul de dietilbarbiturat.
Cum dietilbarbituratul are masa moleculară de 206,18g, 10,3 grame reprezintă 0,05
moli/l, de aici se trage concluzia că tăria ionică (j) este egală cu 0,05M.
Teoretic, mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a
forței ionice:

iar mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a forței

ionice:
Din această relație se poate observa că la micșorarea
tăriei ionice are loc o creștere a intensității câmpului
electric uniform aplicat. Astfel, datorită faptului că
rezoluția de separare este direct proporțională cu
intensitatea câmpului electric uniform aplicat,
scăderea tăriei ionice conduce la creșterea rezoluției
de separare.
În general se consideră că: (a) soluții tampon cu forțe
ionice mici permit viteze de migrare mari, deci
mobilități mari; (b) forțe ionice mai mari de 0,15M
conduc la viteze de migrare mici la timpi de migrare
mici dar cu o rezoluție bună. Trebuie totuși avut în
vedere că o forță ionică prea mică poate conduce la
precipitarea probelor.
 EFECTUL TERMIC JOULE
În timpul unei separări electroforetice, la trecerea curentului electric prin soluție are loc
o degajare de căldură denumită căldură Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit
de important în condițiile în care poate afecta negativ separarea electroforetică prin
favorizarea proceselor de difuziune, a apariției curenților de convecție ori de denaturare
a probei (mai ales în cazul enzimelor). Din acest motiv este necesară menținerea între
anumite limite a acestui efect.
Efectul termic Joule poate fi controlat (a) în sisteme tampon continue prin valoarea
puterii electrice intrate (dacă temperatura este constantă); (b) în sisteme tampon
discontinue (multifazice) prin controlul rezistenței electrice a mediului de separare.
Rezistența electrică crește odată cu avansarea frontului mobil datorită scăderii
conductivității mediului. Astfel, la o intensitate a curentului (I) constantă, crește
tensiunea (U) și căldura degajată este în relație directă cu timpul de migrare. Dacă
tensiunea este constantă, scăderea intensității este funcție de timpul de separare iar
căldura degajată dezvoltată prin efect Joule va fi redusă însă rezoluția de separare va fi
slabă.
Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct proporțională cu
tensiunea electrică (voltajul, V) și invers proporțională cu rezistența (R). rezistența
sistemelor electroforetice este dată de tampoanele utilizate, de tipul de configurații ale
gelului și de volumul total al gelurilor care se rulează, iar tensiunea electrică este dată
de produsul dintre intensitate și rezistență după relația:
 ELECTRO(ENDO)OSMOZA
Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic care apare în urma deplasării fazei
lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii poroase la aplicarea
unui câmp electric exterior. Ea se caracterizează prin deplasarea electrolitului în câmpul
electric aplicat. Din aceeași categorie de fenomene fac parte potențialul de curgere
(fenomen opus electroendoosmozei) și potențialul de sedimentare.
În medii suport stabilizate (hârtie de filtru, dar mai ales în gelul de agaroză)
electroendoosmoza se corelează cu proporția de sarcini negative ale acestora, motiv
pentru care se induce un flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separă sunt
încărcate negativ, iar migrarea lor se realizează spre anod, apar fenomene de convecții
interne, deci se produc modificări ale mobilității electroforetice și astfel ale rezoluției de
separare.
În medii poroase saturate cu o soluție ionică se manifestă o serie de sarcini electrice
fixate pe suprafața fazei solide, distribuția spațială a anionilor și cationilor din faza
lichidă are la bază teoria stratului dublu electric. Dacă sarcinile fixe sunt negative, sunt
necesari cationi în exces din faza mobilă pentru a asigura electro-neutralitatea. La
aplicarea unui câmp electric exterior, acești cationi în exces exercită un moment
adițional în fluidul din por care conduce faza lichidă spre catod. Această mișcare netă a
fluidului față de structura solidului într-un gradient electric impus este denumită
electroosmoză. În practică, viteza electroosmotică este descrisă la scală macroscopică
de relația:
În concluzie, pentru ca electroforeza să fie reproductibilă, este
necesar a se preciza riguros condițiile de lucru precum: calitatea
mediului de separare, proprietățile sistemului tampon,
caracteristicile probei, stabilirea câmpului electric aplicat,
temperatura și timpul de lucru.
 APARATURA UTILIZATĂ LA
SEPARĂRILE ELECTROFORETICE

Pentru a realiza un experiment de separare și analiză electroforetică sunt

necesare următoarele sisteme:
•Sursă de putere care generează un curent electric continuu, stabilizat;
•Aparatul propriu-zis alcătuit după metoda electroforetică utilizată, având
o construcție variată dar care trebuie să prezinte compartimente pentru
electrozi (din platină, grafit, etc.) și uneori sisteme de termostatare;
•Dispozitive anexe care cuprind: (a) dispozitiv de turnat plăci (amidon,
poliacrilamidă, etc.); (b) cuve de fixare, colorare, spălare (decolorare);
(c) sistem de uscare (uneori cu aer cald); (d) sisteme de evaluare optică
(spectrofotometru cu sistem de baleiere, densitometru cu lungime de
undă fixa, cu sistem de reflexie sau fluorescență, sisteme video de
preluare a imaginii și de analiză a gelurilor; (e) dispozitive specifice.
 ELECTROFOREZA ÎN MEDIU LIBER

Prin definiție, electroforeza în mediu liber se bazează pe deplasarea liberă a

componentelor cu mobilități diferite dintr-un amestec sub acțiunea unui câmp electric
exterior. În acest context, între diferitele componente se formează suprafețe de
separare (fronturi - de unde și denumirea de electroforeză frontală). Aceste fronturi
pot fi observate prin modificarea bruscă a indicelui de refracție (ca și în cazul
ultracentrifugării). Prin măsurarea acestui indice de refracție de-a lungul celulei
electroforetice se obțin diagrame electroforetice denumite diagrame Schlieren. Din
deplasarea fronturilor se calculează vitezele de migrare.
Tehnica este pretabilă la automatizare și computerizare, fiind de asemenea utilizată la
separarea componentelor în flux continuu (proteine, organite celulare, celule).
Aparatura utilizată în electroforeza în mediu liber are la bază aparatul Tiselius,
care are forma literei U, însă aparatele moderne au modificări la sistemul de
electrozi (reversibili), la modul de alimentare cu soluție tampon, modul de
încărcare a probei, modul de înregistrare a vitezei de deplasare.
Părțile principale ale aparatului sunt reprezentate din (a) compartimentul de
electrozi; (b) celula electroforetică; (c) sistemul de termostatare; sistemul de
înregistrare.
Celula electroforetică este alcătuită din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin
glisare. Modul de încărcare cu probă este prezentat în figura de mai jos. Separarea
se realizează la temperaturi scăzute (2 - 4oC) la o diferență de potențial de 4-10
V/cm timp de 6 ore.
Să presupunem că avem un amestec de două componente PA și PB (pot fi luate în
discuție două proteine) cu mobilități diferite (µA ˃µB) care se deplasează în aceeași
direcție.
Dacă în momentul inițial concentrația celor două proteine este identică pe tot
parcursul tubului electroforetic, după cum semnalul la sistemul optic este constant.
După introducerea în câmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va migra
mai rapid spre anod, îmbogățind frontul de solvent dar sărăcind coada tubului
(figura de mai jos)

Principiul de separare a două

componente prin electroforeză în
mediu liber.
După trecerea unui timp suficient de mare proteina PA se va concentra în fronul
de electroforeză, iar proteina PB va migra după aceasta. Dacă se reprezintă
grafic semnalul primit de sistemul optic se realizează o diagramă Schlieren
(figura 2.3).

Diagrama Schlieren pentru două componente

(PA și PB) separate prin electroforeză în mediu
liber (c=concentrație, n=indice de refracție). .

Prin derivatizarea concentrației sau a indicelui de refracție rezultă o

electroforegramă cu peak-uri electroforetice.
 AVANTAJELE UTILIZĂRII ELECTROFOREZEI
FRONTALE

De la introducerea electroforezei în mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE), în anii 1960,

această metodă de separare și-a găsit o poziţie permanentă printre metodele de analiză şi
preparative în biochimie precum şi în chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,
organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compușilor anorganici și organici. În FFE,
substanţe de analizat sunt separate în mod continuu într-un câmp electric aplicat perpendicular
peste un strat subțire de tampon transportor în flux continuu după cum se observă în figura
urmatoare.
Un amestec de probă este injectat în fluxul continuu de electrolit transportor, iar după un timp de
migrare, componente, diferit încărcate, se împart pe culoarele de migrare diferite care pot fi în
continuare colectate la capătul aparatului.
Sistemele FFE disponibile la scară largă în comerţ au fost iniţial dezvoltat ca sisteme de curățare
a unei probe, de exemplu, ca o treaptă de Prefracționare înainte de a o electroforeză
bidimensională. În continuare au fost dezvoltate mini sisteme cu dimensiuni reduse de FFE care
se pot cupla la spectrometrul de masă sau la cromatograful de lichide și care permit separarea
continuă cu posibilităţi de detectare a on-line. Această combinaţie de FFE, ca metodă pentru
separarea continuă cu detectare on-line, permite monitorizarea în timp real a analitului, în cazul
probelor biologice ale unor pacienţi, produşi de reacţie, etc. Sistemele rămân în continuare
complicate și sunt încă lente în funcţionare, totuși utilizarea lor pare a fi foarte promiţătoare.
Aparatele electroforetice care funcționează după principiul curgerii libere (frontale) în formă
miniaturizată (µ-FFE) și-ar putea găsi aplicații în construcția unor aparate miniaturizate portabile
de monitorizare a unor pacienți.
O ilustrare a principiului electroforezei
libere frontale și principalele
componente ale unui sistem de
separare electroforetică și micro-
electroforetică. Tamponul curge în flux
laminar într-un film continuu de 0,3 mm,
de sus în jos sub acțiunea forței
gravitaționale. Proba se introduce
lateral. Sub acțiunea câmpului electric,
componentele probei se deplasează
spre anod lateral și totodată de sus în
jos, odată cu tamponul.
Spitalul universitar din Basel
Miniaturizarea FFE implică mai multe avantaje mai ales având în vedere
volumul eşantionului şi de viteză de separare. În contrast cu volumele de
ordinul mililitrilor de probă consumate de tehnicile convenţionale de
dispozitivele FFE, microsistemele FFE au nevoie doar de câteva zeci de
nanolitrii până la câteva sute de microlitri de probă. Acest lucru este deosebit
de util în analizele clinice, în cazul în care de multe ori sunt disponibile numai
volume scăzute de probă biologică. Mai mult, timpul de analiză scade de la
câteva ore-zeci de minute, la câteva secunde în cazul timpului de analiză
microdispozitive FFE

DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:

•Aparatura necesară;
•Amestecarea zonelor datorită difuziunii, curenților de convecție, motiv pentru care
este strict necesară existența unui sistem de termostatare;
Existența unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafața peak-ului nu este identică
cu concentrația de proteină. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. În acest
context viteza de migrare ascendentă nu este identică cu viteza de migrare
descendentă. Acest fenomen, în mod obișnuit, se poate neglija, dar pentru o
electroforeză de mare acuratețe, această anomalie nu este de dorit.
APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Date recente arată că toate tipurile de electroforeză standard

pot fi aplicate cu succes electroforezei frontale, dintre care
cele mai obișnuite aplicații sunt:
electroforeza frontală în flux continuu,
focalizarea izoelectrică în flux continuu,
izotacoforeza în flux continuu și
 electroforeza frontală în trepte de câmp electric
 SEPARAREA POPULAȚIILOR DE CELULE PRIN
ELECTROFOREZĂ ÎN FLUX CONTINUU

Există mai multe dificultăţi implicate în separarea electroforetică de celule sau alte bioparticule.
În primul rând, celulele care urmează a fi separate trebuie să fie prezente ca o suspensie
monocelulară. Agregatele de celule sau ansamblurilor lor nu pot fi separate. Astfel, celule
sanguine, limfatice, sau prezente în alte fluide ale corpului pot fi destul de uşor pregătite, în timp
ce celulele din ţesuturi trebuie să fie mai întâi izolate prin dezintegrare mecanică. Multe proceduri
de izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere și de eliberare a nucleilor
sau a ADN-ului, oferind preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetică. Distrugerea
celulelor prin simpla dezintegrare mecanică poate fi redusă prin tratarea țesuturilor cu diferite
enzime combinată apoi cu metode mecanice blânde, cum ar fi amestecare ușoară sau aspiraţie
printr-o pipetă gură largă. Această procedură este singura modalitate de a obţine o suspensie
monocelulară din țesuturi precum cel tumoral. Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate pentru
obţinerea de suspensii monocelulare din ţesuturi diferite sunt tripsina, chimotripsina, colagenaza,
hialuronidaza şi dispaza. Cu toate acestea, astfel de enzime, de multe ori au dezavantajul de a
cliva o serie de grupări specifice de suprafaţă, modificând sarcina superficială a acestora, care
reprezintă o condiţie prealabilă pentru separarea electroforetică. Acesta este unul dintre
principalele motive pentru care un număr relativ mic de exemple de succes de separare
electroforetică a celulelor ţesutului pot fi găsite în literatura de specialitate.
O abordare diferită, utilizată la pregătirea prealabilă a celulelor, cum ar fi a nefronilor, care
sunt conectați între ei prin intermediul unor complexe juncționale Ca2+-dependente, este de a
trata țesutul cu complexanți slabi ai Ca2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, în combinaţie cu
o agitarea blândă. În general, orice nuclei eliberați în timpul procedurii de izolare pot fi
eliminați prin filtrarea suspensiei pe vată de sticlă introdusă într-o pipetă Pasteur. ADN-ul
liber, care poate apărea în cazul în care nucleii sunt dezintegrați, trebuie să fie de asemenea,
eliminați, deoarece, în câmp electric, conduc la agregarea celulară. Un tratament scurt cu DN-
ază ultrapură (20-30µg/ml) la temperatura camerei timp de 5-10 minute este în general
suficientă.
O altă problemă este alegerea mediului de pregătire şi de separare. Cele mai multe dintre
instrumente de electroforeză în flux continuu prezintă sisteme eficiente de răcire care permit a
se crește tăria ionică a mediului de separare până la 8-10 x 102 µohm/cm. Aceasta este încă o
tărie apropiată condiţiilor fiziologice în care se separă celule în stare viabilă. În scopul de a
atenua pierderea viabilității celulelor acestea trebuie să fie colectate în mai multe soluţii
fiziologice, cum ar fi medii de cultură, după ce acestea au fost separate prin camera
electroforetică. Compoziţia cele mai potrivită a tamponului de separare trebuie să fie
identificată pentru fiecare tip de celule.
 ELECTROFOREZA FRONTALĂ
PE COLOANA

O altă aplicație a electroforezei în flux continuu o reprezintă tehnica

denumită electroforeză în flux liber pe coloană, în timp ce metoda cea mai
cunoscută fiind electroforeza preparativă ascendentă.

Aparatul este alcătuit dintr-o coloană cilindrică parțial umplută cu

tampon cu densitate specifică mai mare decât cea a celulelor.
Suprafața astfel realizată va reprezenta stratul de start pe care
celulele sunt depuse (starting cushion).). În continuare coloana se
umple cu o soluție izotonă de tampon.
Densitatea specifică crescută a stratului de start se realizează cu
”Ficoll-Hypaque, sucroză ori apă grea. Electrozii se găsesc în
compartimente separate.
În condițiile aplicării unui câmp electric, celulele vor migra
ascendent spre anod, viteza de migrare a acestora fiind în relație
directă cu sarcina superficială de pe suprafața lor. Separarea durează
circa o oră, formându-se zone distincte care se pot colecta în
fracțiuni. Coloana este termostatată și prezintă o capacitate de circa
2•x106-2•x108 celule/ciclu de separare.
 Studying Materials and Processes in Microgravity:
Materials Science

• The Continuous Flow

Electrophoresis
System is used to
separate and purify
biological cells and
proteins.
O importanță deosebită o reprezintă utilizarea electroforezei în mediu liber la
studiul analitic al macromoleculelor biologice. Tiselius, folosind un tampon cu
pH=7,6 a reușit să separeu proteinele serice în patru fracțiuni: albumina, cu
mobilitatea cea mai mare și trei fracțiuni globulinice (α, β și γ, cu mobilități
descrescătoare de la α, la β și γ).). Ulterior s-a observat că la pH=8,6 (la care
toate proteinele serice sunt negative, ele migrând spre anod), globulinele α se
rezolvă ca două subfracții α1 ți α2, iar la introducerea unor ioni de calciu (Ca2+
interacționează cu componentele serice modificând astfel mobilitatea lor) într-un
tampon veronal, fracția β se separă în două componente:β1 și β2.
În mod curent, electroforeza în mediu liber se utilizează la separarea: (a)
celulelor intacte (de exemplu a celulelor sanguine); (b) a organitelor celulare
(lizozomi, mitocondrii, aparat Golgi); sistemelor de membrane celulare.
Procedeul este utilizat la studiul adezivității bacteriilor, la purificarea
plasminogenului tisular exprimat în drojdii, la separarea celulelor transformate și
clonate, fiind utilizată în tehnologia anticorpilor monoclonali.
Prin utilizarea unei celule electroforetice în flux liber orizontale
(figura alăturată) procedeul se utilizează la studiul eritrocitelor
umane din sânge periferic în cazuri normale și patologice (malarie),
în studiul celulelor imunocompetente T și B și a celulelor dendritice,
la diagnosticarea și clasificarea unor leucemii și monitorizarea
tratamentului aplicat precum și la urmărirea efectelor antitumorale
ale unor medicamente. S-a obținut astfel un medicament cu structură
de polizaharid extras din Coriolus versicolor (familia
Basidomicetae) denumit krestin cu efect antitumoral și reversor
(care reinstaurează comportamentul normal al limfocitelor,
readucându-le în limite normale funcțiile leucocitelor și
macrofagelor).).
Prezentarea schematică a reducerii selective și
masive a sarcinii electrice superficiale la unele
populații celulare cu ajutorul unor anticorpi
specifici în cazul separării celulelor cu mobilități
electroforetice apropiate sau identice.
 •ELECTROFOREZA ZONALĂ
În momentul în care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa clasică
referitoare la electroforeza în mediu liber. în 1937, Konig (1937)
a indicat posibilitatea de a utiliza hârtia de filtru pentru separarea
electroforetică a amestecurilor de proteine. În deceniul al cincilea
din secolul trecut o serie de cercetători au descris variate tehnici
care au utilizat hârtia ca agent anticonvectiv pentru separarea
amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine și alte substanțe.

Utilizarea hârtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de asemenea o serie de
factori care implică mobilitatea electroforetică a moleculelor încărcate electric,
electroosmoza, curgerea hidrodinamică a lichidului, adsorbția, efecte cromatografice și
de stivuire. Din acest punct de vedere, electroforeza zonală nu poate fi utilizată pentru
determinarea precisă a mobilității electroforetice, a punctului izoelectric sau a altor
proprietăți de migrare a substanțelor fără o procedură de standardizare adecvată pentru
tehnicile particulare. Suportul ideal ar trebui să fie acela care nu prezintă impurități, este
chimic inactiv în ceea ce privește substanțele separate, nu prezintă activitate adsorbtivă
și prezintă cel mai scăzut efect electroosmotic. Nici o hârtie de filtru nu îndeplinește în
totalitate toate aceste condiții. Totuși, noi medii suport au fost introdusă care posedă
proprietăți mult mai favorabile, precum acetatul de celuloză, gelurile de agaroză și de
poliacrilamidă
În prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot împărți în:
•Medii suport cu structură capilară, care
(a) prezintă proprietăți anticonvective - dacă secțiunea capilară este suficient de mică (într-un canal cu
secțiune circulară curgerea descrește cu puterea a 4-a a razei);
(b) sunt stabile fizico-chimic;
(c) prezintă proprietăți mecanice bune;
(d) sunt netoxice;
(e) sunt ieftine și astfel accesibile;
(f) sunt relativ inerte – este cazul hârtiei de filtru, a acetatului de celuloză, a mediilor specifice
cromatografiei pe strat subțire (celuloza microcristalină, silicagelul, alumina, silicagelul);
(g) au proprietăți electroforetice specifice bune – nu interacționează decât foarte slab cu compușii pe care
îi separă (excepție face hârtia de filtru la care se observă o adsorbție nespecifică).
În cazul acestor medii suport, proteinele serice se separă în albumină și patru sau mai multe
componente globulinice dar cu o rezoluție inegală, cu o poziție relativă a fracțiunilor (zonelor)
asemănătoare.
•Medii suport care, datorită structurii poroase caracteristice, participă activ în separare. În acest caz
separarea electroforetică are loc atât densității sarcinilor electrice cât și a efectului de cernere
moleculară. Astfel, două particule cu aceeași sarcină electrică dar cu dimensiuni diferite, vor fi separate
ca zone distincte, particulele mai mici migrând mai ușor. De exemplu, dacă prin electroforeză pe hârtie
proteinele serice se separă în fracțiile albumină, α1-, α2-, β- și γ-globuline, după electroforeza pe gel de
amidon se identifică circa 15 zone proteice. Din categoria acestor medii fac parte gelul de amidon, gelul
de agaroză (unde efectul de sită moleculară apare la concentrații mari de gel) și gelul de poliacrilamidă
(care prezintă avantajul de a putea alege dimensiunea porilor).
•Medii afine, pe care le vom examina într-un capitol special.
 ELECTROFOREZA PE HÂRTIE
În acest caz, hârtia de filtru reprezintă mediul stabilizant care posedă următoarele caracteristici:
(a) conține minimum 96% celuloză, insolubilă în NaOH concentrat;
(b) prezintă o capacitate mare de imbibiție (absorbție) - mărimea acestei proprietăți este dată de
firma producătoare și trebuie să fie de două ori mai mare decât greutatea sa;
(c) este lipsită de metale grele (de exemplu Pb), care modifică conductibilitatea sa electrică; (are
o structură uniformă a fibrelor de celuloză, unidirecționate;
(d) prezintă o densitate caracteristică a fibrelor - o hârtie de filtru fină sau medie prezintă o
textură deasă care va conduce la separări în zone bine delimitate, dar într-un timp mai mare, în
timp ce o hârtie de filtru grosieră se îmbibă rapid cu cantități mari de tampon iar separările vor
conduce la zone neclare, într-un timp mai scurt;
(e) la un pH acid și la tării ionice scăzute apar fenomene de adsorbție a proteinelor pe suportul de
hârtie de filtru ceea ce va conduce la formarea benzilor cu coadă.
Tamponul, reprezintă de asemenea o componentă importantă în sistemul electroforetic. În cazul
electroforezei pe hârtie, tamponul se află în compartimentul electrozilor, la un nivel egal și
constantă, evitându-se fenomenul de sifonare. Menținerea evaporării tamponului în limite
rezonabile se realizează prin:
(a) scăderea forței ionice, legată de efectul Joule și de efectul de flux capilar;
(b) saturarea compartimentului de separare cu vapori;
(c) adăugarea de propilenglicol sau glicerină (5-15%) în soluția tampon sau
(d) în cazul electroforezei de înaltă tensiune, prin plasarea hârtiei de filtru în solvenți hidrofobi.
Valoarea pI este specifică unei proteine și ea depinde
de natura solventului și de concentrația electrolitului
(a nu se confunda pI cu punctul izotonic, definit ca
valoarea pH-ului unei soluții apoase de proteină după
îndepărtarea tuturor ionilor necoloidali din soluție).
În separarea electroforetică este necesară o conduce
cu mare atenție pH-ul și tăria ionică a soluției tampon.
De obicei tăria ionică a soluției tampon este cuprinsă
între 0,06-0,1. Soluțiile tampon cu o tărie ionică mai
mică de 0,06 nu tamponează suficient în timp ce
soluțiile cu o tărie ionică mai mare de 0,1 conduc la Dependența dintre pH-ul soluției și
sarcina electrică a două polipeptide,
un efect Joule, marcant, ceea ce conduce la o degajare insulina umană și fragmentul
semnificativă de căldură. polipeptidice des-B23-B30-
Echipamentul utilizat în electroforeza pe hârtie octapeptid insulină (DOI).).
consistă din două componente principale: o cameră
(tanc) electroforetic și o sursă de putere electrică.
Tancurile electroforetice sunt variate în construcție și
depind de aranjamentul pe orizontală sau verticală a
benzii de hârtie electroforetică precum și de
necesitățile caracteristice ale unor experimente
particulare.
Tancul electroforetic comun utilizat
la electroforeza pe hârtie de voltaj
scăzut este de două tipuri, după cum
hârtia de filtru este așezată. În tipul
orizontal, hârtia de filtru este fixată
orizontal la capetele incintei. La tipul
vertical, hârtia de filtru este așezată
vertical pe o baghetă. La extremități,
banda de hârtie este imersată în vasele
de tampon la aceeași adâncime în timp
ce nivelul tamponului în cele două
compartimente trebuie să fie egal.
Unele aparate prezintă un sistem
labirint prin care comunică, în condiții
speciale, cele două rezervoare,
prevenindu-se astfel fenomenul de
sifonare prin banda de hârtie în timpul
separării electroforetice. Aparatul este
de asemenea prevăzut cu un capac,
realizat de obicei din plexiglas.

Reprezentarea schematică a tipurilor de tancuri utilizate la

electroforeza pe hârtie: (a) tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu
banda de hârtie imersată; (d) tip cu banda de hârtie închisă.
Cele mai bune rezultate sunt obținute cu electrozi obținuți din platină în formă de fir sau folie,
care pot fi utilizați în variați electroliți la diverse pH-uri. Pentru a se preveni contaminarea cu
produși de electroliză care se eliberează la nivelul electrodului, banda de hârtie de filtru nu
trebuie să fie introdusă direct în compartimentul electrozilor, ci într-un compartiment adiacent
acestora, iar contactul electric este realizat prin intermediul unor bucăți din hârtie de filtru sau
bumbac a unor punți din agar sau printr-un sistem special de labirint.
Volumul de electrolit-tampon în vase trebuie să fie suficient de mare pentru a preveni influența
produșilor de electroliză asupra separării electroforetice. Volumul V care transportă ionii de
hidrogen în timpul unui experiment poate fi calculat astfel:

unde UH+ reprezintă mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este timpul
(secunde) iar K este conductivitatea soluției. Astfel, în cazul unor electroliți diluați și la timpi
mari de separare, tamponul trebuie să circule continuu între compartimentele cu electrozi.
Sursa de curent trebuie să fie capabilă să ofere un curent sau un voltaj constant, preferabil
ambele. Pentru cele mai comune separări sursa de curent adecvată trebuie să aibă capacitatea de a
oferi 50 mA și 500V. Intensitatea maximă a curentului care poate fi utilizată pe unitatea de arie a
benzii de hârtie de filtru supuse separării electroforetice poate fi calculată astfel:

unde I (mA) reprezintă intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hârtie
de filtru măsurată între suprafețele de electrolit și compartimentele electrozilor
iar U (V) este potențialul electric.
În general tensiunea maximă de lucru este de 400 V, cu o cădere maximă de
15V/cm (în medie de 2-10V/cm).
Pentru determinări cantitative substanțele separate pe benzile din hârtie de filtru pot fi utilizate
atât metode directe cât și cele indirecte. În cazul metodelor directe, substanța care trebuie să fie
măsurată trebuie să absoarbă radiație UV sau să fie fluorescentă ori radioactivă. În metodele
indirecte zonele separate trebuie să fie mai întâi colorate iar absorbanța măsurată cu ajutorul unui
densitometru racordat. Au fost construite o serie de densitometre semi - sau total automatizate
care trasează grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate de pe o electroforegramă colorată
versus distanța de-a lungul benzii electroforetice în formă de curbe electroforetice. Aria din
interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată, fie cu ajutorul unui
planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor. Sunt descrise de asemenea
scannere computerizate care permit analiza cantitativă completă a unei electroferograme în câteva
secunde. Aria din interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată,
fie cu ajutorul unui planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor.
Aplicarea probei se face pe banda de hârtie de filtru îmbibată
cu soluție tampon, fixată în aparat, după crearea unui mediu
saturat și stabilizat în vapori, cu ajutorul unei pipete capilare,
seringi Hamilton (1-5µl), micropipete, fără a zgâria hârtia. Se
folosesc două tipuri de spotări: în picătură sau în linie.

Profilul electroforetic al proteinelor serice

separate pe hârtie, de filtru, colorate cu
amino black 10B și scannate cu un
densitometru semiautomat.
Pentru urmărirea separării electroforetice
se apelează la un colorant ca substanță de
referință. De obicei se utilizează albastru
de bromofenol, un colorant trifenilmetanic

Albastru de brom fenol

Cei mai folosiți coloranți utilizați în evidențierea componentelor proteice separate
prin electroforeză pe hârtie sunt amino black 10B, Azocarmine B, Light Green SF și
Ponceau Red 2R.

Structura chimică a colorantului diazolic

Amido black 10B, utilizat în practica
biochimică la colorarea totală a proteinelor.

Structura chimică a azo-colorantului Ponceau 2R

(Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R, Acid Red
26, Food Red 5).
Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hârtie prin
colorare cu Sudan Black B ori Oil Red O.

Structura chimică a colorantului diazo Sudan

Black (10)B.

Structura chimică a colorantului diazo Oil Red O

(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,
C26H24N4O).).
Prin utilizarea acestor proceduri se pot separa și detectate patru fracții lipoproteice:
chilomicroni, α-lipoproteine, pre-β-lipoproteine and β-lipoproteine. Totuși, cea mai
bună rezoluție a fracțiilor lipoproteice din serul sanguin se obțin pe gelul de agaroză ori
pe membrane de acetat de celuloză.
Componentele glicoproteice sunt detectate pe hârtie cu ajutorul
 reactivului Schiff-acid periodic, în cazul glicoproteinelor neutre,
difenilamină pentru mucoproteine și glicozaminoglicani,
 albastru de toluidină și Azure A pentru glicoproteine acide,
 alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi.
Pe un ser normal se regăsesc 5-6 fracții glicoproteice, a căror concentrație se
modifică în timpul proceselor patologice ale ficatului, rinichilor, sistemului nervos
central și în timpul maladiilor tumorale.
După colorare, excesul de colorant este îndepărtat de pe banda de hârtie prin spălare cu
un solvent convenabil. Pentru o decolorare mai eficientă se poate adăuga detergent la
soluția de solvent ori spălarea se realizează la o temperatură de aproximativ 80°C.
 ELECTROFOREZA PE HÂRTIE LA TENSIUNE ÎNALTĂ

În acest caz tensiunea aplicată este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent
tensiunea a redresorului este de 10 kV. Se poate afirma că o creștere de la 5V la
100V/cm (adică o creștere de 20 de ori) viteza de migrare crește de asemenea de 20 de
ori dar cantitatea de căldură degajată va crește de 202, adică de 400 de ori, motiv pentru
care este absolut necesară o termostatare uniformă (o termostatare neuniformă conduce
la apariția zonelor de semilună-marginile hârtiei se usucă mai tare. Se mai poate nota că
la concentrații mari de probă rezoluția de separare este scăzută și se vor obține zone cu
coadă.
Electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se utilizează la separarea aminoacizilor (se
produce în tampon acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (separarea se realizează în
tampon piridină-acid acetic (la un pH cuprins între 3,0 și 5,0), glucidelor sau a bazelor
azotate purinice și pirimidinice.
Sub forma bidimensională, electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se poate combina
cu cromatografia pe hârtie.
 ELECTROFOREZA PE STRAT SUBȚIRE
În momentul introducerii cromatografiei în strat subțire și a electroforezei în strat
subțire, cu ceva timp în urmă, comoditatea și sensibilitatea crescută (de la 10 la 50 de
ori) în comparație cu tehnicile pe hârtie au fost considerate metode promițătoare
pentru analizele compoziției proteinelor și a acizilor nucleici. Electroforeza în strat
subțire combinată cu cromatografia în strat subțire a reprezentat o metodă de rutină
pentru separarea a unor mici cantități de aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici și a
altor substanțe cu masă moleculară mică.
Utilizarea mediilor suport de strat subțire oferă următoarele avantaje față de tehnicile
care utilizează hârtia:
(1) necesită un echipament mult mai simplu pentru preparare;
(2) rezoluția este în general superioară;
(3) separările se pot realiza la potențiale înalte în perioade de timp foarte scurte;
(4) sunt necesare mici cantități de probă, putându-se realiza mai ușor separări atât
cantitative cât și micro-preparative;
(5) probele nu trebuie desalinizate, ele se aplică direct pe strat. Astfel, ureea și
glucidele rămân în start, ionii migrând rapid;
(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere și în acest mod se coboară limita de
detecție.
Din punct de vedere al echipamentului
utilizat, se folosesc aparate convenționale
de tip orizontal, similare celora utilizate
electroforeza pe hârtie, acetat de celuloză
ori pe gel de agar. Pentru separări la
potențiale mai înalte și pentru separări Cameră pentru electroforeză în strat subțire. (a)
bidimensionale, s-au descris diverse placă orizontală prevăzută cu system de răcire; (b)
camere prevăzute cu sisteme de răcire. foițe de izolare; (c) strat subțire pe placă de sticlă;
Aparatul pentru electroforeză pe strat (d) bride de hârtie (Whatman 3 MM); (e) placă de
subțire este prezentat schematic în sticlă, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru
tampon și electrozi; (w) sistem de răcire.
alăturată. El posedă un plan orizontal
sub care se află un sistem de răcire cu
apă, pe care se așează placa (cu
dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) cu
strat subțire (circa 250-300 µm) care este
pusă în contact cu tamponul prin
intermediul unor bride din hârtie de filtru.
Aparatul este acoperit cu o placă de
sticlă. Mica distanță dintre placa cu strat
subțire și placa care acoperă aparatul Hunter Thin Layer Peptide Mapping
acționează ca o cameră umedă și previne Electrophoresis System, CE. For high
uscarea stratului subțire. resolution two dimensional tryptic peptide
mapping and phosphoamino acid (PAA)
analysis
În cazul separărilor efectuate pe ser sanguin, volumul de probă este în funcție de cantitatea de
creatinină. În general proba spotată trebuie să conțină maximum 5 µg de creatinină. Timpul de
separare este de aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.
Proteinele sau alte substanțe macromoleculare pot fi separate prin utilizarea gel filtrarea pe strat
subțire-electroforeza pe strat subțire. În funcție de masele moleculare ale probei, se poate utiliza
Sephadex Superfine (de la G-25 la G-200). Sephadex-ul, echilibrat cu tamponul adecvat, este
depus pe o placă de sticlă. Placa cu strat subțire este plasată într-un aparat adecvat ca cel
prezentat în figura de mai jos, fiind echilibrată cu un tampon care curge prin stratul de gel.
Stratul trebuie conectat cu un rezervor prin intermediul unei bride din hârtie de filtru Whatman
No. 1 la capătul superior, iar placa se înclină într-un unghi de 15-20o față de orizontală.

O bucată de hârtie de filtru Whatman 3MM este atașată

la capătul inferior pentru a îndepărta fluidul filtrat. După
finalizarea filtrării, placa este aranjată orizontal iar
electroforeza este realizată pe o direcție perpendiculară
față de prima dimensiune. Pentru a obține o imagine a
spoturilor proteice, placa este acoperită cu grijă cu o
bucată de hârtie de filtru Whatman No. 1 și după 5 minute
de contact, hârtia este îndepărtată de pe stratul subțire,
uscată la 100°C și colorată cu amino black ori un alt
colorant specific proteinelor.
Gel filtrarea pe dextran/electroforeza pe strat subțire a
fost utilizată la separarea proteinelor serice, a diferiți
coloranți tetrazolici, a unor aminoacizi urinari și peptide
și alte substanțe.
Aparat pentru o separare bidimensională
utilizând gel filtrarea și electroforeza pe
strat subțire de Sephadex. (a) sistem
suport; (b) fantă pentru conexiunea prin
hârtie de filtru; (c) sistem de răcire a
platformei cu apă; (d) bazin care conține
tampon ori solvent utilizat la dezvoltarea
electroforegramei; (e) sistem de schimbare
a poziției suportului plăcii; (f) orificii și (g)
șuruburi de prindere.
 Electroforeza pe folie de acetat de celuloza
Dacă inițial membranele de acetat de celuloză au fost produse pentru filtrare, utilizarea membranelor de
acetat de celuloză ca mediu suport a fost sugerată de Kohn în 1957. Foliile de acetat de celuloză se
obțin prin tratamentul celulozei cu anhidridă acetică, iar produsul, triacetat de celuloză este cel mai des
utilizat pentru electroforeză.
Membrana (cu o grosime de cca. 12 µm și cu un diametru al porilor de cca. 0,4 µm) este un material
omogen care conține numai urme de impurități.
Este de culoare alb opacă, cu suprafață netedă și uniformă.
La microscop se observă o structură microporoasă care împiedică difuziunea zonelor sau a spoturilor,
din acest motiv se obține o bună separare a proteinelor plasmatice chiar la o tensiune mică.
Puritatea materialului este mare, lipsesc hemicelulozele, lignina iar metalele grele sunt prezente
numai în urme. Față de hârtia de filtru, adsorbția proteinelor și a altor substanțe pe acest mediu suport
este minimă, deci fenomenul de coadă sau de aspect de cometă fiind practic eliminat.
Timpul de separare este mai scurt iar membranele de acetat de celuloză sunt ideale pentru tehnicile de
imunodifuzie și imunoelectroforeză.
Dintre dezavantajele utilizării membranelor de acetat de celuloză enumerăm prețul mai mare față de
hârtia de filtru, necesitatea de a acorda mai multă atenție pentru obținerea unor rezultate reproductibile.
În prezent s-au adus îmbunătățiri ale produsului inițial prin apariția acetatului de celuloză gelatinizat
(Cellogel).
Foliile (strips-urile) din acetat de celuloză sunt insolubile în apă, alcooli, eteri, acizi și baze diluate și
în majoritatea hidrocarburilor, dar sunt ușor solubile în fenol, acid acetic glacial, diclorometan și
acetonă, și în mod particular în cloroform:etanol 90:10 (v/v) și diclorometan:acetonă 50:50 (v/v).
Strips-urile pot fi transformate în translucide (transparente) prin imersia lor în ulei din semințe de
bumbac, decalină, ulei de parafină ori ulei Whitemore 120, care este important pentru scanarea optică a
benzilor colorate de pe foliile de acetat de celuloză. Ele pot fi impregnate și permanent stocate în
glicerol, care previne destrucția spoturilor colorate.
 Pentru separări electroforetice de proteine și acizi nucleici s-au introdus membranele de
nitroceluloză. Aceste membrane, cu o mărime a porilor cuprinsă între 0,1-12 µm, au fost
utilizate în mod constant în analizele de acizi nucleici în special a hibrizilor RNA-DNA și
DNA-DNA. Aceștia prezintă o adsorbtivitate selectivă față de proteine și acizi nucleici în
condiții adecvate.
Membranele de dimensiuni dorite sunt așezate într-o placă Petri cu tampon și lăsate să
plutească până la dispariția petelor alb-opace după care se scufundă complet. Membranele
de Cellogel nu necesită aceste precauții, ele putându-se scufunda timp de 10 minute.

Strip-urile din nitroceluloză (5 x 1 cm), când sunt utilizate la electroforeza proteinelor,

trebuie mai întâi tratate timp de 5 minute cu o soluție de Tween 60, 2% preparată într-un
tampon compus din veronal, citrat și oxalat, pH=8,6. Astfel, membranele de nitroceluloză
tratate cu detergent nu adsorb proteine și pot fi utilizate pentru separări de proteine în
gradienți înalți de potențial de 15-20 V•cm-1 timp de 10-15 minute.

Membranele îmbibate se plasează imediat în sistemul reglabil și se aplică probele cu ajutorul unei
micropipete sau unui dispozitiv de aplicare simultană a probelor (10-16 probe).) Volumul aplicat de probă
este în funcție de grosimea membranei și de concentrația proteică. Nigrozina (denumită și Indian ink) este
cel mai bun colorant al proteinelor pe folii de nitroceluloză. Un alt colorant utilizat în colorarea proteinelor
este Ponceau S.
La pH neutru și alcalin, RNA migrează rapid în folie spre anod, în timp ce DNA nativ rămâne pe linia de
start. DNA monocatenar denaturat migrează spre anod. Membranele de nitroceluloză cu dimensiuni variate
a mărimii porilor, impregnate cu detergenți ori soluții de albumină serică, pot fi utilizate la separări de
proteine, polinucleotide și nucleoproteine.
Modelul de bază a tancurilor electroforetice utilizate pentru
membranele de celuloză seamănă cu cele utilizate la tehnica
electroforetică pe hârtie. O serie dintre acestea prezintă
sisteme de răcire și pot fi utilizate concomitent pentru
electroforeză pe membrane și pe strat subțire. Ambele
separări se pot realiza atât la voltaje scăzute cât și la cele
înalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, se poate
adăuga glicerol la soluția tampon. Controlul evaporării se
poate realiza și prin folosirea de soluții tampon cu tării ionice
mici (o concentrație mică a soluției tampon favorizează
creșterea vitezei de migrare în paralel cu scăderea efectului
Joule.

Astfel, dacă tăria ionică este dată de relația:

După electroforeză strip-ul de acetat de celuloză este uscat la 100°C
timp de aproximativ 10 minute.
 Metodele de colorare și detecție utilizate sunt asemănătoare cu cele
utilizate la hârtia de filtru.
 Sunt de preferat ca soluțiile apoase de colorant față de soluțiile
alcoolice, concentrația acestora fiind deobicei mai scăzută față de cea
aplicată pentru hârtia de filtru.
 Membranele din acetatul de celuloză și nitroceluloză sunt ideale
pentru examinările absorbțiometrice și fluoro-densitometrice, precum și
de detecție a substanțelor radioactive prin autoradiografie ori prin
metode de scanare directă.
 MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZĂ
Benzile (strips-urile) de membrane (acetat de celuloză sau nitroceluloză) de mici
dimensiuni (50 x 10mm) disponibile dau posibilitatea efectuării a analizei proteice
complete pe 0,25 µl de ser sanguin (electroforeza microzonală, microelectroforeza pe acetat
de celuloză) în 50 minute.
Procedeul de miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor și a
timpului se bazează pe faptul că mobilitatea electroforetică este relație directă cu distanța de
migrare și invers proporțională cu timpul și intensitatea câmpului electric aplicat după
relația:
 Aplicații ale electroforezei pe membrane de acetat de celuloză

Membranele de celuloză sunt utilizate în mod comun pentru separarea proteinelor

plasmatice, glico- și lipoproteinelor, hemoglobinelor, enzimelor și a altor proteine.
Ele putând fi folosite în metodele analitice și în scopuri preparative.
Metoda electroforetică pe membrane de acetat de celuloză este încă cea mai des
utilizată în diagnosticarea unor maladii. Tabelul următor prezintă profilul
electroforetic obținut în urma separării pe Cellogel al unei proteinograme din ser
sanguin normal.
Procente Deviație
Fracția electroforetică analizată
% standard
Albumine 61% ± 1,5
Alfa 1-globuline 2,5% ± 1,5

Alfa 2-globuline ± 2,0

8%
Beta globuline 10% ± 2,0
Gama globuline 16% ± 3,5
Analiza proteinogramei este deosebit de importantă în identificarea unor maladii prin analiza
concentrației unor proteine serice. Astfel prin interpretarea unei proteinograme se pot depista:
-hipergamaglobulinemiile (creșterea tuturor claselor de imunoglobuline);
-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);
-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenström (apariția unei benzi foarte omogene care
semnifică prezența unei proteine monoclonale);
-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor α2 și β, cu diminuarea albuminei și a γ
globulinelor);
-ateroscleroza (creșterea β globulinelor);
-poliatrita reumatoidă (creșteri policlonale ale γ globulinelor și creșterea fracției α2 globulinei.
Figura următoare prezintă profilul unei
electroforegrame obținute după procesarea
electroforetică a unei probe de ser sanguin normal.

Tehnica electroforetică care implică membranele de acetat de celuloză

este de asemenea utilă în monitorizarea unui tratament aplicat. Ea este
superioară tehnicilor imunologice în determinarea izoenzimelor
enolazei (procedeul durează circa 10 minute iar necesarul de ser este
de circa 10µl), activitatea enzimatică fiind determinată în aproximativ
5 minute prin bioluminiscență.
Electroforeza pe membrane de acetat de celuloză a fost și este utilizată la studiul comparativ
al unor proteine serice la om și la alte animale.
A fost folosită la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul
hemoglobinelor normale și patologice când s-au evidențiat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F, Hb
S, Hb S și Hb C de Hb E și Hb O.
Membranele de acetat de celuloză se utilizează și în tehnicile de imunoelectroforeză,
colorarea efectuându-se în acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecția realizându-se direct,
pe membrană, fără transfer pe o altă membrană de nitroceluloză.
Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) s-au folosit în scop preparativ, în
acest caz utilizându-se la separare 0,25-1 ml de ser sanguin.
Protéinogramme sérique normal
INTERPRETATION du protéinogramme (2)
Valeurs normales
Causes d‟erreur
sérum hémolysé
présence de fibrinogenen
Inflammation AIGUE (2)
 Insuffisance hépatique
(cirrhoses, hépatites fulminantes)
Syndrome NEPHROTIQUE
Hypogammaglobulinémie des
déficits immunitaires
Hypergammaglobulinémie
POLYCLONALE
Hypergammaglobulinémie
MONOCLONALE
Electroforeza pe gel de amidon

Loading samples onto a starch gel for electrophoresis

Electroforeza pe gel din amidon, prima metodă de electroforeză zonală care a pus în
valoare efectul de sită moleculară a mediului suport a fost introdusă de Smithies. Ea a
fost recunoscută drept o tehnică care furnizează mijloace elegante de rezolvare a ionilor
similari și cu mobilități libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu și în cazul mediilor
poroase de tipul hârtiei sau a granulelor de amidon - prezintă o structură reticulată care
poate impune o rezistență fricțională apreciabilă la trecerea ionilor, accesul acestora în
structura de rețea fiind dat de mărimea porilor și dimensiunea ionilor care migrează.
Dacă în cazul gelurilor de amidon, domeniul dimensiunii medii a porilor se apropie de
domeniul dimensiunilor proteinelor, fracții proteice variate vor fi întârziate diferențial
într-un grad proporțional cu dimensiunea lor. Ca atare, datorită reticulării fine și având
un efect de sită moleculară, separarea amestecurilor este realizată în astfel de geluri
matrice atât prin dimensiunile, forma, cât și prin diferențele de sarcină electrică.
Amidonul este un polizaharid insolubil în apă. În stare nativă, în prezența apei el se umflă.
Matricea electroforetică se obține printr-o hidroliză parțială când amidonul se convertește într-o
formă care se solubilizează la o temperatură de circa 70oC și care apoi se solidifică într-un gel
ferm la temperatura camerei. Mărimea porilor din gelul de amidon este dată de concentrația
acestuia și de gradul de hidroliză, ea variind într-un domeniu redus prin faptul că nici
concentrații, nici gradul de hidroliză nu pot fi schimbate decât în anumite limite, bine definite,
fără a afecta caracteristicile mecanice ale gelului.
Dacă la început s-a utilizat amidonul din cartof, s-a constatat că rezultate mai bune se obțin cu cel
din orez.
Față de alte medii stabilizante de separare a proteinelor, peptidelor ori a acizilor
ribonucleici, amidonul prezintă o serie de avantaje comparativ cu hârtia, gelatina,
agarul, silicagelul:
(i) Adsorbția celor mai multe proteine pe amidon este neglijabilă;
(ii) Eluția segmentelor de amidon după separarea electroforetică se realizează mai ușor
decât în cazul gelului de gelatină ori agar ceea ce reprezintă un factor important în
scopurile preparative;
(iii) Amidonul formează mai ușor o pastă omogenă cu diverse tampoane față de pudra
de celuloză;
(iv) Electrosmoza este mai mică decât în cazul multor altor medii suport deși acest
fenomen poate cauza o separare slabă, mai ales în cazul când tehnica este cea “de bloc
de amidon” și se realizează în modele de aranjament orizontal.

Electroforeza pe gel de amidon este considerată după unii autori a fi o metodă blândă de
purificare a proteinelor fără șanse de denaturare, putându-se pune alături de metoda salting-out
ori precipitarea cu acizi, alcool sau acetonă. Pe de altă parte, alți autori consideră că din contră, în
timpul electroforezei au loc procese ireversibile de denaturare care conduc la o pierdere
considerabilă de proteină. Chestiunea în cauză se ridică dacă acest proces se manifestă din cauza
dezvoltării de căldură cauzată la intensități de 17-20 mA a curentului electric cu soluții tampon cu
tărie mare. Astfel, procesul de denaturare nu se observă la tării ionice scăzute, rezultatele fiind
satisfăcătoare.
Amidonul este utilizat ca mediu suport
în trei tehnici electroforetice zonale:
Electroforeza clasică pe gel de
amidon, descrisă pentru prima dată de
Smithies;
Electroforeza pe coloană, dezvoltată
de către Carlson și independent de
Flodin și Porath;
Electroforeza pe bloc de amidon,
introdusă de Kunkel și Slater.
Aparatura utilizată în electroforeza pe
gel de amidon este de două tipuri: I)
pentru geluri orizontale; II) aparate cu
gel vertical. Ambele aparate sunt
alcătuite de 2 rezervoare cu soluție
tampon, compartimentate pentru a
împiedica produșii de electroliză să
intre în contact direct cu gelul.
Contactul dintre suport și gel se
realizează prin intermediul unor bride
din hârtie de filtru sau tifon (bumbac)
iar legăturile dintre compartimente se
formează în același mod.
Godeurile se efectuează cu ajutorul unui pieptene din plexiglace care se plasează peste
stratul de amidon înainte de gelificare și se îndepărtează după aceasta. Dimensiunile
godeelor sunt de 15-30 mm lungime, 1 mm lățime și 50 mm adâncime.
În general separări bune sau foarte bune se pot obține la temperatura camerei la o
tensiune de 6V/cm timp de 6 ore sau la o temperatură de 5oC și la o tensiune de
10V/cm, în sistem de tampon continue sau discontinue.
După separarea electroforetică sunt recomandate diverse proceduri de colorare a
gelurilor. Astfel, gelul este extras cu grijă din cuva de electroforeză și tăiate paralel cu
suprafața în două părți egale. Colorarea se realizează prin turnarea colorantului peste
suprafața secționată. O serie de lucrări prezintă colorația cu soluție de Amido black 10B
în metanol:apă:acid acetic glacial (50:50:10) timp de l0-30 min.

Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore într-o o soluție alcătuită din: 1,2 g
Sudan black 10B, 40 ml de apă distilată, 600 ml etanol și 2 ml NaOH,. Decolorarea completă se
realizează după 6-8 zile după imersare într-o soluție de etanol 60%. De asemenea, pentru a
vizualiza lipoproteinele se poate utiliza o soluție saturată de Oil Red O pregătită într-un amestec
metanol:apă:acid acetic glacial (60:10:30).).
Proteinele care conțin cupru precum hemocianina, sunt detectate prin plasarea gelului secționat
pentru 3-4 ore într-o soluție care conține 50 ml acetat de sodiu l0% și 3 ml de soluție ditio-
oximidă, 0,1% preparată în alcool. Apariția unei colorații verde-închis este un rezultat pozitiv.
Hemoglobinele sunt detectate cu reactiv benzidină sau cea descrisă pentru electroforeza pe gel de
agar. Hem-proteinele pot fi de asemenea colorate cu o-tolidină.
Pentru complexul acestor proteine cu hemoglobina care prezintă o activitate peroxidază-like, o-
dianisidina pare a fi cel mai bun reactiv ea formând o colorație brună.
o serie de aplicații ale electroforezei pe gel de amidon
Tărie ionică
Material biologic Tampon pH V mA Timp (ore)
(Molaritate)
Barbital 0,1 25-60
Lipoproteine serice normale și patologice 8,6 100-500
Fosfat 0,5 24
Proteine lenticulare bovine Barbital 0,1 8,6 400 - 24
Tuberculo-proteine Barbital 0,1 8,6 360 17-20 30
Fosfataza alcalină intestinală Barbital 0,02 8,6 200 7-9 12
Acetat 0,017 4,00 175 30 24
Hormonul de creștere (somatotropină)
Carbonat 0,1 11,2 175 30 72
β-Galactozidză Pirofosfat 0,025 8,5 370 1 16
Chimotripsinogen Cacodilat 0,1 6,6 3,2V/cm - 65
Tirozinază de mamifere Barbital 0,1 8,5 300 11 19
Tripsină Acetat 0.1 4,00 /300 - 10
0,02M borat +
Hemocianină Borat 8,0/3 92V/cm - 12
NaOH 0,008M
Hemoglobină Borat 0,05 M 8,5 6V/cm - 5
Plasmă umană Borat 0,025 - 450 - 18
 ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZĂ
Agaroza este singurul hidrocoloid neadeziv care și-a găsit o multitudine de utilizări în științele
separatologice după prepararea sa de către Araki (1937) ca un component aparent fără grupări sulfat,
din agaropectina, bogată în astfel de grupări, la rândul ei obținută din agar.
Cele două componente se separă prin acetilare și dizolvare în cloroform când agaroza acetilată este
solubilă. Încă din secolul al XVII-lea în Japonia, agarul și o mulți alți hidrocoloizi derivați dintr-o serie
de alge roșii de mare din clasa Rhodophyceae (speciile Gelidium și Gracilaria) au fost utilizați la
prepararea hranei.
Agarul a fost introdus ca mediu pentru imunoelectroforeză de către Grabar și Williams în anul 1953,
tehnica originală descrisă de aceștia fiind ocazional utilizată și astăzi. Electroforeza pe agar tratat este
de altfel principala metodă curentă de identificare a variantelor de hemoglobină.
 Agarul a fost aplicat de către Polson în anul 1961 pentru separări cromatografice bazate pe
proprietatea sa de sitare moleculară, după care acesta a fost înlocuit gradat cu agaroza, începutul fiind
făcut de către Hjerten (1961).
Conținutul în sulfat a agarozelor de diferite grade furnizate pentru utilizare în laborator este în
general sub 0,12% comparativ cu 4% conținutul în agaropectină. Din această cauză agaroza poate fi
utilizată în prepararea gelurilor fără nevoia utilizării unor aditivi sau a unor agenți de reticulare iar
inerția sa față de interacția cu proteinele și acizii nucleici reprezintă principalele rațiuni ale ei în larga
utilizare ca mediu de separare. Tot ce este necesar în prepararea gelurilor este de a dizolva agaroza
pulbere prin încălzire controlată la fierbere sau aproape de temperatura de fierbere, după care să se lase
să se răcească. Procesul de gelificare se manifestă spontan și este complet în gelurile reci. În plus față
de simplicitatea pregătirii gelului de agaroză, alături de inerția față de interacții cu proteinele și acizii
nucleici îi oferă acesteia o multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea simplă a
probei, netoxicitatea și simplicitatea pregătirii gelului.
Agaroza este de asemenea unică ca aplicativitate în numeroase proceduri imunoelectroforetice.
În comparație cu gelul de poliacrilamidă, gelul de agaroză este un material foarte poros, ceea ce îi
limitează oportunitatea folosirii sale în formă nemodificată în separări de proteine bazate pe
efectul de sită moleculară la cele cu masă moleculară mai mică de 60 kDa. Pe de altă parte, marea
sa permeabilitate face din ea un mediu superior poliacrilamidei pentru studii imunochimice.

Proprietățile gelurilor de agaroză. Din punct de

vedere chimic, agaroza este un polizaharid liniar
compus din unități alternative de D- și L-
galactozobioză (agarobioză) legate prin legături β
1-4 (figura alăturată) cu catene de o lungime dată
de cele 400 de unități de agarobioză, legate prin
legături α 1-3 și cu o masă moleculară de circa 120
kDa (figura de mai jos), cu resturi substituite
carboxilat, piruvat și/sau sulfat.
Gelificarea se manifestă ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Astfel, în timpul acestui
proces, lanțurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legăturile 3,6 din structura 3,6
anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lanțului inițial în
lanțuri dublu elicoidale mai scurte a căror capete se vor uni încrucișat, proces de numit
schimbarea partenerului. În continuare are loc asocierea în suprafibrile cu raza de 10-20 nm
(figura de mai jos), supraînfășurare care explică rezistența mai mare și porii mai mari a gelului
de agaroză comparativ cu alte geluri care nu formează suprafibrile (ca de exemplu gelul de
amidon, gelul de poliacrilamidă cu un grad de reticulare, C% cuprins între 1 și 5).

Gelurile sunt translucide

deoarece fibrele înfășurate
împrăștie lumina dar devin
transparente prin uscare.
Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei să formeze geluri chiar
la concentrații sub 0,2%. Încorporarea agarozei în suprafibre groase fac aceste geluri
înalt poroase până la o concentrație mai mare de 6%, limita la care agaroza poate fi
dizolvată fără a apela la temperaturi de autoclavare. Concentrații până la 16% se pot
realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentrație egală cu 2% efectul de
sită moleculară nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, în timp ce la gelurile
cu o concentrație cuprinsă între 3 și 10%, distanțele între și din interiorul
suprafibrilelor devin egale și ia astfel naștere un gel cu o singură dimensiune a
fibrelor. Porozitatea mare a agarozei o face superioară poliacrilamidei pentru
separarea proteinelor mari, polipeptidelor, complexelor cu un domeniu de masă
(Mr) cuprins între 100 kDa și mai mulți megadaltoni. Prin utilizarea agarozei se
pot separa fragmente de ADN din domeniul 1000 la 23000 perechi de baze (bp).
În cazul agarozei hidroxietilate numărul de lanțuri din constituția suprafibrilelor este
mai mic decât în cazul agarozei nesubstituite și din această cauză porii gelului sunt
mai mici fiind similari cu cei ai gelului de poliacrilamidă, având o mare capacitate de
sitare moleculară similară gelului de poliacrilamidă însă rezistența mecanică este mai
mică decât a agarozei nemodificate. Recent, au fost obținute noi formule de derivați de
agaroză care au proprietăți mecanice îmbunătățite.
În funcție de gradul de substituție cu sarcini negative și de modificările chimice survenite, se
disting trei categorii de agaroză caracterizate prin:
a)conținutul în resturi sulfat (exprimat în %);
b)electroosmoză;
c)temperatura de gelificare;
d)temperatura de topire.
Electroendoosmoza preparatelor de agaroză este dată de parțial de conținutul în resturi sulfat și
piruvat. Ea poate fi măsurată convențional fie
 cu ajutorul ciancobalaminei (vitamina B12), colorată în roșu,
 fie cu Dextran-500, care poate fi detectat în urma precipitării cu etanol,
 fie urmărind migrarea albuminei serice bovine (BSA).
 De obicei se utilizează deplasarea BSA la pH=8,6 iar în urma acestei analize se determină
factorul –mr, după care se clasifică agarozele în agaroze cu electroosmoză mare, medie
(standard) și mică. Grupările sulfat prezente în cele mai multe preparate induc o mică
electroendosmoză (EEO) în timpul electroforezei. Electroendosmoza se manifestă ca o curgere
de tampon prin gel. Efectul este datorat faptului că sarcinile negative ale grupărilor sulfat din
matricea de gel nu se pot mișca spre anod motiv pentru care apare ca rezultat o pompare
compensatoare de tampon spre catod. Efectul asupra mobilității proteinelor este în general mic,
totuși devine pronunțat în sisteme de tampon discontinue utilizate pentru îngustarea benzilor din
proba aplicată. EEO poate astfel induce colapsarea gelurilor în sisteme tampon discontinue
datorită electroendosmozei inegale prin frontul de tampon. Astfel, o serie de sisteme de
tamponare descrise pentru gelurile de poliacrilamidă nu funcționează la fel de bine pentru
gelurile de agaroză.
Agarozele cu electroosmoză diferită se utilizează în tehnici specifice precum:
Agarozele cu electroosmoză mare (-mr=0,25) se utilizează în tehnicile de
contraimunoelectroforeză;
Agarozele cu electroosmoză standard și mică (-mr =0,13-0,07) se utilizează pentru
electroforeză și imunoelectroforeză. Ele sunt folosite la separarea acizilor nucleici
(agarozele standard), dedetectând DN-azele, RNA-azele, proteazele, inhibitorii
endonucleazelor, enzimele de restricție și modificare, ligazele, polimerazele.
Agarozele cu electroosmoză egală cu zero sunt utilizate pentru focusare (focalizare)
izoelectrică. Ele se obțin prin adăugarea unor aditivi sau printr-un procedeu chimic
(reacție de substituție) în scopul blocării (contrabalansării) sarcinilor electrice negative
cu grupări electropozitive. Aditivii dintr-o serie de zero-EEO agaroze contribuie la
formarea unui background în timpul colorării.
Agarozele hidroxietilate (numărul de grupări hidroxietil fiind de circa 15%) formează
geluri cu concentrație de 2-10% cu dimensiunile porilor aproximativ egale cu cea a
proteinelor. Ele au o temperatură de gelificare în jurul a 25oC iar temperatura de
solidificare de aproximativ 45oC (25/45). Astfel, o agaroză hidroxietilată 15/45
formează geluri de concentrație 2-10%, asemănătoare gelurilor de poliacrilamidă.
Agarozele cu un procent de 5% hidroxietil formează geluri cu o temperatură de topire
de 60-65oC
 Echipamente și sisteme tampon.

Gelurile de agaroză sunt în mod curent utilizate pentru electroforeză plană, orizontală pe care
gelurile sunt plasate între electrodul anodic și catodic aflați în camere umplute cu tampon și
conectate prin punți umede. Cu excepția unor cerințe uzuale la platforma pe care se așează
gelul se poate adapta ușor un sistem de răcire prin recircularea apei. Gelurile sunt turnate în
casete deschise ori prevăzute cu două spațiatoare. Se are în vedere că utilizarea punților din
hârtie sau bumbac conduce la o pierdere de voltaj prin ele ceea ce conduce la o creșterea a
efectului de încălzire și apariția fenomenului de condensare în camera de separare
electroforetică. Pierderea de voltaj de-a lungul gelului trebuie să fie controlată direct de la
nivelul gelului și nu din sursa de curent. În plus hârtia de filtru nu este totdeauna
recomandată deoarece prin utilizarea sa drept bridă de contact, datorită procesului de
electroosmoză, puntea dinspre anod se poate usca împreună cu extremitatea respectivă a
gelului în timp ce la extremitatea catodică se adună lichid în exces, deoarece hârtia de filtru
nu poate prelua și transfera cantități mari de lichid. Condensarea vaporilor pe gel este ușor
de prevenit printr-o simplă barieră de vapori care se așează pe gel. Pentru electroforeza
acizilor nucleici utilizarea punților (bridelor) de legătură a fost eliminată prin aplicarea tehnici
cunoscute drept „submersă” în care gelul este așezat pe o platformă încărcată cu tampon
conectată la camerele electrozilor. Modul de electroforeză submarin nu este în mod curent
aplicabil în electroforeza proteinelor deoarece acestea au tendința de a difuza în tamponul
înconjurător, în timp ce acizii nucleici posedă constante de difuziune foarte mici, motiv pentru
care migrează aproape în întregime prin gel la aplicare unui câmp electric, cu o doar mică
difuziune. Gelurile de migrare din agaroză în format vertical cu camere de electrozi sunt
rareori utilizați deoarece agaroza are tendința de a se dilata și astfel de a părăsi caseta.
Inițial, aplicarea probei în gelul de agaroză s-a realizat
prin tăierea unei fante în gel. Această tehnică este în
continuare utilizată la electroforeza acizilor nucleici,
care formează benzi înguste când migrează nerestinctiv
din soluția de probă în gelul de migrare restrictiv,
comparativ cu proteinele la care se manifestă foarte
mică îngustare a benzii care permează gelul ușor. În
plus, godeurile induc distorsiuni ale benzilor proteice
datorită: (i) procesului de permeație parțială în
marginile godeului înainte de începerea „de facto” a
separării electroforetice; și (ii) datorită tensiunii
electrice inegale care se manifestă le-a lungul godeului
în momentul aplicării unui câmp electric. Datorită
ușurinței cu care soluțiile pot fi îmbibate în agaroză
urmată de compresia temporară cu hârtie de transfer,
probele pot fi depuse pe gel în benzi demarcate prin
intermediul așa-numitei tehnici „folie de aplicare a
probei”, un plastic subțire întins peste gel care are
prevăzute niște fante prin care probele sunt depuse pe
gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de
Cawley simplificând procedura comparativ cu cea de
formare de godeuri.
Din punct de vedere electric, în cele mai multe aparate se utilizează un gradient de
potențial de 15-20 V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a câmpului electric de
250-300 V și o intensitate de curent de 100-140 mA, depinzând de mărimea electrozilor.
În cazul gelurilor subțiri de 3 mm grosime, tensiunea aplicată este de 6 V/cm.

Fixarea fracțiilor proteice se realizează: a) fie prin imersarea gelului în soluție de acid
acetic 20% timp de o oră, după care gelul se usucă timp de 16 ore la 37oC; b) fie prin
imersarea sa într-un amestec de acid picric (soluție saturată):acid acetic (20%) într-un
raport 3/1 timp de 15 minute, după care gelul se usucă.

Toate metodele comune de colorare utilizate

(bazate pe Coomassie Brillant Blue,
fluorescență, chimiluminescență, și de tip
coloidal) funcționează bine cu agaroza,
metoda cu Coomassie coloidal fiind una
dintre cele mai rapide. Amido Black 10B
(soluție 1% preparată într-o soluție de acid
acetic 7% sau preparată într-un amestec
metanol:acid acetic:apă, în raport de 5:1:5)
este utilizat deoarece produce zone distincte Structura chimică a Coomassie
și facilitează vizualizarea α- și β- Brillant Blue G-250 (sinonime: Serva
lipoproteinelor. blue G sau C.I. acid blue 90), un
colorant trifenilmetanic.
O adaptare a electroforezei pe agaroză o reprezintă electroforeza de înaltă
rezoluție. Ea este utilizată în clinică în laboratorul de analize medicale. Prin
utilizarea ei, se evidențiază schimbări calitative și cantitative ale proteinelor
serice, semnificative din punct de vedere clinic care nu pot fi decelate prin
electroforeză convențională sau pe acetat de celuloză. Practic se lucrează
pe gel de agaroză de 1 mm grosime, turnate pe folii de film flexibil de
poliester, Gelbond™ care sunt păstrate în soluție tampon și în ambalaje
ermetice, care facilitează mânuirea și stocarea gelului prelucrat. Volumul de
probă este de 2-4 µL, putându-se aplica simultan 6 ori 12 probe. Timpul de
separare este de aproximativ 45 de minute la o tensiune de 20V/cm
 INTERPRETAREA ELECTROFOREGRAMELOR ÎN TERMEN DE
VARIAȚIE A PROTEINELOR INDIVIDUALE
Abilitatea gelului de agaroză de a
revela proteine diferite variază în
funcție de concentrația de proteină,
capacitatea de legare a colorantului și
de gradul de omogenitate
electroforetică. În general, capacitatea
de legare a colorantului scade odată cu
creșterea conținutului în oligozaharide
și lipide. Figura de mai jos dă o
prezentare schematică a concentrației
relative și eterogenitatea
electroforetică a proteinelor
plasmatice majore, într-un subiect
sănătos, având cel mai frecvent
fenotip Distribuția electroforetică și concentrațiile relative ale proteinelor majore plasmatice
comparativ cu fracțiile obținute prin electroforeză clasică. Abreviații: Alb, Albumină;
Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; α1-At, α1-antitripsină; α2-M, α2-
macroglobulină; GC, componente specifice de grup; Hp, haptoglobine; CIG,
globulină insolubilă la rece; Hz, hemopexină, Tf, transferină; C3, complement C3;
Fg, fibrinogen; Ig, imunoglobuină; și CRP, proteină C-reactivă
Tabelul de mai jos prezintă proteinele individuale care pot fi prezente în concentrații
care pot influența profilul electroforetic. Datele din paranteze sunt prezente la așa
concentrații încât nu pot influența semnificativ profilul electroforetic.
Proteina țintă Domeniul normal (g/L)

Prealbumina 0,15-0,36
Albumina 39-51
α-Lipoproteine (3-7)
(α-Fetoproteina)a <1-1 -5
(Orosomucoid) 0,40-1,05
α1-Antitripsina 0,8-1,9
Globuline specifice de grup 0,2-0,55
(Inhibitorii inter-α1-tripsină) 0,2-0,7
(Ceruloplasmina) 0,22-0,46
α2-Macroglobulinele 1,2-2,4
Haptoglobinele (1-1, 2-2, 2-1) 0,40-2,9
Globulinele insolubile la rece 0,1-0,3
Transferina 1,7-2,7
β-Lipoproteinele 2,2-7,4
Al treilea component al sistemului complement, C3 0,6-2,2
IgA 1,0-3,0
Fibrinogenul 2,2-4,4
(IgM) 0,6-2,2
IgG 6,5-15,5
(Catenele de imunoglobulină ușoară) <0,001
(Proteina C-reactivă) <0,02
 Analiza profilului electroforetic

Zone electroforetice Observație Cauze posibile

Masă celulară hepatică scăzută,
Zona prealbuminei Scăzută Răspuns inflamator
Malnutriție
Răspuns inflamator,
Malnutriție,
Scăzută Pierderi în greutate,
Zona albuminei Maladii maligne,
Un volum extracelular crescut.
Medicamente (penicilină)
Front anodal rapid
Icter
Intensitate scăzută Leziuni ale celulei hepatice
Interzona albumină-
Malnutriție
α1
Intensitate crescută Abuz de alcool
α1- Lipoproteine
Nivel estrogenic crescut postmenstrual
Polimorfism Variante genetice.
Răspuns inflamator,
Zona α1 Crescută
Alterarea celulei hepatice
α1-Antitripsina
Deficiență genetică,
Relativ scăzută
Scăderi în greutate.
Dependentă de vârstă la copii,
Zona α2
Crescută Persoane în vârstă (>70),
α2-Macroglobulina
Proteinurie selectivă
Crescută Răspuns inflamator,
Haptoglobina
Relativ scăzută Hemoliză in vivo
Benzi înguste Componenta M
Imunoglobuline Difuzie crescută Creștere policlonală
Apariție în benzi Creștere oligoclonală, infecție virală, malignitate
Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice
pe gel de agaroză (anodul fiind în stânga). Banda γ prevăzută cu
asterisc este lărgită și se întinde pe toată aria de mobilitate gama
(Panelul B). Trasarea densitometrică a acestei observații vizuale
relevă un peak difuz de mobilitate gama. Acest profil este cel mai
adesea dat de prezența unui proces inflamator ori reactiv, precum și
în bolile cronice ale ficatului, în bolile țesutului conectiv, în infecții
cronice, ori într-o maladie limfoproliferativă (Panel A).
 Variante genetice (proteina Bence
Polimorfism
Jones, componenta M, hemoglobină)
Zona β1
Crește Deficiență de fier, estrogeni
Transferina
Malnutriție, scăderi în greutate răspuns
Scade
inflamator
Hipercolesterolemie
β- O mobilitate scăzută cu creșterea
Poziție crescută
Lipoproteine intensității sugerează o obstrucție
biliară
Zona β2 Malignitate, infecții ale mucoasei,
Creștere selectivă
IgA artrită, abuz de alcool
Polimorfism Variante genetice,
Poziție Conversia in vivo/invitro a C3 la C3c
C3 Răspuns cronic inflamator,
Crește
Obstrucție biliară
Scade Activarea complementului
Zona γ Crește Răspuns inflamator
Fibrinogen
PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR DIN PLASMĂ COMPARATIV
CU CELE DIN FLUIDUL CEREBROSPINAL
În mod normal, aproximativ 80% din proteinele fluidului cerebrospinal fluid (CSF) au
originea în plasmă iar restul sunt sintetizate local. Timpul de înjumătățire pentru
proteinele plasmatice care intră în spațiul subarahnoid este de aproximativ o
săptămână, și din acest motiv compoziția în proteine a CSF o urmează pe cea din
plasmă, cu o oarecare întârziere. Rezistența de transfer a proteinelor plasmatice crește
rapid odată cu masa moleculară și din acest motiv raportul dintre proteinele mari
(IgM, β-lipoproteine și α2-macroglobuline) și albumină, este în mod normal mai
scăzut în CSF decât în plasmă. Această discriminare pe baza masei moleculare se
micșorează când concentrația proteică a CSF este crescută.

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR

DIN URINĂ COMPARATIV CU CELE DIN PLASMĂ
Un determinat primar pentru profilul proteinelor urinare este compoziția și cantitatea de
proteine care permează filtrarea glomerulară în relație cu capacitatea resorbtivă tubulară.
În mod normal, aceasta este limitată la aproximativ 200 mg/zi. Asupra pierderii urinare
intense de cantități de proteină, analizele comparative electroforetice disting trei
posibilități majore:
(a) proteinuria glomerulară neselectivă,
(b) proteinuria glomerulară selectivă, și
(c) proteinuria Bence Jones.
 PROTEINURIA BENCE JONES

Excreția urinară a catenelor ușoare de imunoglobuline κ ori λ, cu origine monoclonală

(proteinuria Bence Jones) conduce la apariția unei singure (ori uzual dublă) bande, mai mult ori
mai puțin închisă la culoare, undeva în zona α1 spre zona cu mobilitate mică γ. Natura ei poate fi
demonstrată prin imunoelectroforeză, dar este de preferată o evidențiere prin imunofixare după o
electroforeză pe gel de agaroză în prezența antiserurilor anti κ și anti λ. Rezultatul unor analize
imunoelectroforetice convenționale este mai dificil de interpretat decât rezultatul obținut prin
imunofixare dacă concentrația de catenă ușoară monoclonală este scăzută, deoarece catenele
policlonale ușoare apar în urină.
Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroză în
prezență de dodecil sulfat de sodiu

S-a introdus pentru analiza calitativă a proteinelor urinare electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezența
dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). SDS-PAGE separă proteinele în funcţie de mărimea lor moleculară, iar
monomerii catenelor ușoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o bandă cu masă
moleculară (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uşurinţă de imunoglobulinele intacte (cu masă
moleculară de 150.000 Da). SDS-PAGE diferenţiază, de asemenea, proteinuriea cu origine glomerulară
(proteine, cu masă moleculară de 66.000 Da), de cea cu origine tubulară (proteine cu masă moleculară de
66.000 Da), sau cu origine mixtă. Această metodă este, aşadar, un potenţial instrument clinic pentru evaluarea
funcţiei renale, un important factor de prognostic în MM. Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizată pe
scară largă în laboratoarele clinice, pentru că este exigentă din punct de vedere tehnic, un timp mai
mare, şi este mai costisitoare.
Le Bricon și colaboratorii (1998; 2000) propun pentru prima dată o tehnică de
analiză a proteinelor urinare prin electroforeză pe gel de agaroză în prezență de
dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) la pacienți suferinzi de Mielom multiplu. Astfel,
urina, fără o concentrare prealabilă, se analizează prin SDS-AGE pe suport
Hydragel®, mediu electroforetic utilizat în mod comun la analiza proteinuriei.

Profilul electroforetic a cinci probe diferite obținut

după SDS-AGE. De la stânga spre dreapta: 1,
proteinurie glomerulară selectivă: transferină și
albumină; 2, BJP prerenală pură: dimeri ai
catenelor ușoare și monomer, înainte de
tratamentul cu β mercaptoetanol; 3, proteinurie
mixtă: immunoglobuline, transferină, albumină,
α1- microglobulină (Alfa-1 µ), monomeri ai
catenelor ușoare (policlonali), proteina de legare
a retinolului (RBP) și β2-microglobulină (Beta-2
µ); 4, BJP prerenală pură: monomeri ai
catenelor ușoare; 5, proteinurie tubulară: mici
cantități de albumină, monomeri ai catenelor
ușoare (policlonale) și RBP. Caracterul
monoclonal al catenelor ușoare detectate sunt
confirmate prin imunofixare.
 Trebuie însă accentuate o serie de limitări ale tehnicii SDS-AGE. Cea mai
importantă este faptul că SDS-AGE nu poate să realizeze o distincție
definitivă între proteinele monoclonale şi cele policlonale. În absenţa unor
leziuni tubulare (în cazul BJP pură sau în proteinuria glomerulară), se
evidențiază întotdeauna banda electroforetică corespunzătoare
Mr=25.000 Da caracteristică BJP.
În concluzie, SDS-AGE
pare a fi un instrument de laborator clinic pentru urmărire a pacienţilor diagnosticați cu
MM.
SDS-AGE are o înaltă rezoluţie, sensibilitate, şi reproductibilitate.
Într-un laborator specializat, metoda este utilă în monitorizarea progresiei maladiei la
pacienți prin intermediul determinării semicantitative a BJP.
Comparativ cu electroforeză pe gel de agaroză de rutină, SDS-AGE combină simplitatea
(nu este nevoie de o concentrare prealabilă a urinei) cu o sensibilitate crescută pentru
detectarea BJP.
Profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identifică ușor pe gelul de
agaroză. Interpretarea profilurilor benzilor proteice după SDS-AGE cere, totuşi,
conştientizarea unor capcane, în special în ceea ce priveşte polimerizarea catenelor ușoare şi
prezenţa unor catene ușoare mono-şi/sau policlonale în specimenele de urină a pacienţilor
diagnosticați cu mielom multiplu.
În unele cazuri, SDS-AGE poate fi ușor mai sensibilă decât imunofixarea în detecția
proteinelor Bence Jones la concentrații scăzute.
 ELECTROFOREZA FRAGMENTELOR DE ADN PE GEL DE AGAROZĂ

Acizii nucleici sunt polimeri compuși din unităţi nucleotidice individuale, unităţile fiind conectate prin
intermediul legăturilor diester fosfat la scheletul zaharidic. Efectul net al acestor legături este cel de a oferi
polimerilor o sarcină netă negativă.
Încă de la începutul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul că moleculele care transportă o sarcină
electrică vor migra într-un câmp electric într-un mod previzibil. Atunci când este supusă unui câmp electric, o
moleculă care transportă o sarcină netă negativă va migra spre polul pozitiv, în timp ce o moleculă încărcată
cu o sarcină netă negativă va migra spre polul negativ.

Atunci când macromolecule de acizi nucleici încărcate electric sunt plasate în matricea
semi-solidă a unui gel, ele vor migra spre polul pozitiv într-un mod previzibil şi
reproductibil, procesul putând fi descris ca o funcţie exponenţială negativă a lungimii
acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede în timp ce moleculele
mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. Într-adevăr, în cazul unui acid nucleic, aflat
într-un câmp electric uniform, orice alt element al expresiei migrării sale este o
constantă, iar mobilitatea sa este complet determinată de mărimea moleculei (masa
moleculară a unui acid nucleic se exprimă în daltoni sau în perechi de baze, base pair,
bp, de fapt nucleotide; o pereche de baze este aproximativ egală cu 660 daltoni).
Metoda este deosebit de simplă, rapidă și sensibilă pentru separarea, identificarea și
purificarea fragmentelor de ADN.
Din punct de vedere practic, intr-un gel de
agaroză, este dificil să se rezolve cu
precizie acizi nucleici dubli catenari mai
mici de aproximativ 100 de baze, deoarece
proprietăţile de cernere moleculară a
agarozei nu sunt suficient de pregnante. Pe
de altă parte, macromoleculele mai mari
de aproximativ 25.000 bp dar mai mici de
aproximativ 2.000.000 bp vor migra în gel
cu viteze diferite, datorită limitării de
mobilitate. Macromoleculele de acizi
nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor
putea penetra un gel convențional de Mobilitatea electroforetică a fragmentelor de
agaroză. Astfel, domeniul efectiv de restricție a ADN într-un gel de agaroză. DNA provine
mărime pentru electroforeza acizilor din bacteriofagul lambda în urma digestiei cu enzima
nucleici dublu catenari pe un gel de restricție Hind III. Graficul arată că distanța de
migrare în centimetri în funcție de mărimea în
convențional de agaroză este între 100 bp
perechi de baze a fragmentului separat
și 25.000 de bp. În acest interval
comportamentul macromoleculei este
precis şi previzibil. Acest comportament
este prezentat în figura alăturată.
În anii „80, a fost prezentată o teorie prin care se consideră că
acizi nucleici migrează prin gel asemănător mișcării
ondulatorii a unui şarpe. Astfel macromolecula se mișcă din
față și trage restul de macromoleculă după ea. În acest model,
cu cât molecula este mai mare, cu atât ea interacționează mai
puternic cu matricea de gel și astfel întâmpină o rezistenţă mai
mare din partea acesteia . în așa fel încât timpul său de
staționare într-o zonă este mai mare. Aşa cum a fost arătat mai
sus, creşterea rezistenţei gelului este neliniară. Acest model,
numit „biased reptation”, este suficient pentru a explica tot
comportamentul unui acid nucleic într-o matrice de semi-
solidă.
În anul 1989 un grup de cercetători de la Universitatea din
Washington, au testat această teorie, filmând macromoleculele
de ADN care se deplasează printr-un gel de agaroză. Filmul a
arătat atât mișcarea ondulatorie, sigmoidală, cât și
interacțiunile dintre acid nucleic și matricea gelului de
agaroză.
Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni
diferite prin electroforeză pe gel vertical. Gelul este
preparat prin turnarea agarozei topite sau a
acrilamidei nepolimerizate între două geamuri de
sticlă aflate la o distanță de câțiva milimetrii. După
solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei se
formează o matrice de gel, a cărei pori depinde de
concentrația de gel sau de acrilamidă utilizată.
Deoarece porii sunt mai mari în gelurile de agaroză
decât în cele de poliacrilamidă, cel din înainte este
utilizat la separarea fragmentelor mari de ADN (între
500 și 20 kb) în timp ce al doilea se utilizează la
separarea fragmentelor mici (de la o nucleotidă, până
la 2 kb). Amestecul de fragmente de ADN care
urmează a fi separat este depus într-un godeu din
partea superioară după care se aplică un câmp
electric prin gel. Fragmentele de ADN se mișcă spre
polul pozitiv cu o viteză invers proporțională cu
logaritmul lungimii lor formând benzi care pot fi
vizualizate prin autoradiografie (dacă fragmentele
sunt radiomarcate) ori prin adăugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu; în acest ultim
caz, agaroza lichefiată este lăsată să se solidifice pe
un suport de sticlă sau plastic orizontal
Cum matricea de gel restricționează difuzia întâmplătoare a moleculelor,
moleculele cu lungimi diferite se separă în zone discrete („benzi”) a
căror lățime este egală cu lățimea godeului unde s-a plasat amestecul
original de ADN

Analiza unor fragmente de ADN după

separare electroforetică pe gel de agaroză.
Prima linie conține fragmente cu masă
moleculară cunoscută de ADN obținute în
urma digestiei cu o enzimă de restricție a
unui ADN cunoscut. Celelalte patru linii
arată diverse fragmente cu mărimi diferite
prezente în probe.
Se poate spune astfel că mobilitatea ADN este funcție de masa moleculară,
câmpul electric aplicat, compoziția nucleotidică, temperatura de lucru și
soluția de tampon utilizată la separare. Deplasarea moleculelor liniare de
ADN se realizează cu o viteză invers proporțională cu logaritmul masei lor
moleculare.
După cum se cunoaște, conformația ADN explică mobilitățile diferite la
mase moleculare egale. Astfel, ADN o serie de conformații: circular închisă
(covalentry closed circle) supraînfășurată (supercoiled), circular deschisă
(open circular), liniară. Moblitatea electroforetică a celor trei forme de
ADN este în funcție de condițiile de lucru.
Pentru vizualizate postelectroforetică a
fragmentelor de ADN se utilizează tehnici
autoradiografice (dacă fragmentele sunt
radiomarcate) ori prin adăugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu
(figura alăturată).

Bromura de etidiu, o moleculă planară, se

intercalează în structura ADN între bazele
azotate iar buclele supraînfășurate încărcate
cu sarcină negativă ale conformației
circular închise se desfac și în aceste
condiții mobilitatea electroforetică se
reduce.
 Legarea bromurii de etidiu la ADN crește de asemenea
fluorescența intrinsecă. Ca rezultat, în condițiile iluminării unui
gel cu lumină ultravioletă, regiunile de gel care conțin ADN,
vor fi mai strălucitoare față de regiunile gelului fără ADN.

La concentrații de 0,1-0,5 µg/ml de bromură de etidiu, toate buclele

înfășurate sau supraînfășurate sunt desfăcute. De asemenea, bromura de
etidiu reduce și mobilitatea conformațiilor circular închise și liniare. ADN
marcat radioactiv poate fi vizualizat și prin autoradiografia gelului. În acest
caz, gelul este depus în contact cu un film fotografic, la întuneric; filmul
astfel expus va indica pozițiile ADN prezent marcat. Dacă filmul se
developează, se obține imaginea fotografică a ADN. Benzile de ADN
radiomarcat pot fi detectate prin analiza particulelor β eliberate de
moleculele marcate din gel. Datele rezultate se pot stoca în computer și pot
fi convertite într-o imagine asemănătoare unei autoradiograme
Compoziția nucleotidică nu influențează în mod semnificativ mobilitatea electroforetică, în
schimb, concentrația de agaroză este esențială: cu cât concentrația de gel este mai mare, cu
atât mobilitatea fragmentelor de ADN este mai mică. Prin folosirea gelurilor în gradient de
concentrație este posibilă separarea ADN de diferite mărimi.
Pentru a obține o rezoluție bună, căderea de tensiune între bornele aparatului de electroforeză
trebuie să fie de 5V/cm. În general, la diferențe mici de potențial, mobilitatea fragmentelor
lineare de ADN este proporțională cu intensitatea câmpului electric.
În general se lucrează la temperatura camerei. Pentru geluri care conțin mai puțin de 0,5%
agaroză, se recomandă migrarea la o temperatură de 4oC. Majoritatea protocoalelor de lucru
recomandă tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim în ceea ce privește tăria ionică și
capacitatea de tamponare.
Aparatura utilizată este de obicei orizontală, asemănătoare celei utilizate la electroforeza
proteinelor. Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o intensitate maximă de 100 mA
și o tensiune maximă de 100V, iar pentru evidențiere postelectroforetică a fragmentelor de ADN
după colorare cu bromură de etidiu, de o lampă UV prevăzută cu un filtru de 300 nm.
Tehnica de lucru pentru electroforeza submersă a fragmentelor de ADN. De obicei se utilizează
o agaroză cu o electroosmoză standard (-mr = 0,13) sau mai mică (-mr = 0,07). Gelurile se prepară
asemănător celor de amidon, iar după solidificare se plasează pe platforma cuvei unde se acoperă
cu tampon, stratul de deasupra fiind de circa 1 mm. La trecerea unui curent electric, rezistența
electrică a stratului de soluție tampon este aproape egală cu cea a gelului și astfel, cea mai
importantă parte a curentului aplicat va trece prin gel. Această tehnică este numită electroforeză
cu gel scufundat (submers) și este cea mai utilizată tehnică de analiză electroforetică a
fragmentelor de ADN.
 Electroforeza fragmentelor de ADN în câmp electric
pulsator

Dacă prin metoda clasică, convențională se pot separa fragmente de ADN de până la 20 kbp cu
rezoluție bună, cele până la 40 kbp cu rezoluție satisfăcătoare, pentru separarea fragmentelor
până la 500 kbp se rezolvă cu rezoluție slabă, într-un gel de agaroză foarte fragil cu o
concentrație de 0,1%. La mijlocul anilor `80 s-au dezvoltat o serie de metode de analiză
electroforetică a moleculelor de acizi nucleici în domeniul de mărime care limitează mobilitatea.
Soluția a implicat introducerea mobilității dependente de mărime a moleculelor de acizi nucleici
prin alterarea câmpului electric. Primul tip de alterare implică simpla schimbare de polaritate a
câmpului electric într-o manieră regulată. S-a arătat că o schimbare periodică a polarității va
induce moleculelor o mișcare de întoarcere în forma literei U, în matricea de gel. Chiar pentru
cele mai mari molecule, această întoarcere permite separarea moleculelor. Dacă lungimea
timpului de reversare a moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de mișcare spre
înainte, ele se vor putea separa în câteva ore pe agaroză standard. Prima demonstrație practică a
acestei metode, denumită ”electroforeză în câmp inversat” (Field Inversion Gel Electrophoresis-
FIGE), a rezolvat complet printr-o migrare de o secundă înainte urmată de o secundă înapoi
molecule mari de 2.000.000 bp precum cromozomii intacți din drojdie. De atunci s-au dezvoltat o
varietate de metode, în mod comun denumite ”electroforeză în câmp pulsator”. Prin aceste
tehnici cele mai mari molecule de ADN cu o lungime cuprinsă între 2•104 la 107 bp (20 kb la 10
megabp, Mb), se pot separa în funcție de masa lor moleculară. Separarea prin electroforeză în
câmp pulsator depinde de comportamentul singular al moleculelor mari de DNA într-un câmp
electric care este pornit și oprit (pulsat) la intervale mici de timp.
În condițiile în care se aplică un câmp electric unor
molecule mari de ADN aflate într-un gel, molecule
migrează în direcția câmpului electric și de asemenea se
întind pe toată lungimea lor. Dacă curentul este stopat,
moleculele încep să se “relaxeze” prin înfășurări
întâmplătoare. Timpul necesar pentru relaxare este
direct proporțional cu lungimea moleculei. Câmpul
electric este apoi reaplicat într-un unghi de 90° ori 180°
față de prima direcție. Moleculele mai mari se
relaxează mai puțin decât moleculele mai scurte în
momentul în care curentul este oprit. Cum moleculele
trebuie să se relaxeze prin înfășurări întâmplătoare
înaintea miscării lor într-o nouă direcție, moleculele
mai mari încep ă se miște în direcția nouă impusă mai
lent decât cele mai scurte. Alternarea repetată a
direcției câmpului electric forțează moleculele mari de
ADN de diferite mărimi să se îndepărteze mai mult și
mai multe între ele.
Electroforeza în câmp pulsator este foarte importantă în purificarea moleculelor mari de
ADN, până la ≈107 bp în lungime. Tehnica este necesară pentru analiza cromozomilor
celulari de la 5•105 bp (cel mai mic fiind cromozomul de la drojdie) până la aproximativ 2-
3•108 bp (cromozomii animali și de plante). Cromozomii cei mai mari trebuie în prealabil
să fie digerați în fragmente de 107 bp ori mai mici înainte de analiză. Astfel de fragmente
de restricție pot fi generate cu ajutorul enzimelor de restricție care taie la situsuri de
restricție găsite la situsuri de restricție de 8 bp
Se poate spune că principiul (caracteristica metodei) o reprezintă faptul că
fragmentele de ADN sunt obligate să-și schimbe periodic direcția de deplasare ca
urmare a schimbării direcției câmpului electric. Intervalul de timp pentru migrare
într-o direcție sau alta determină limita superioară a dimensiunii fragmentelor de
ADN care se vor separa distinct. Dependența de timp este aproape liniară: la
frecvențe de timp de 0,1 secunde, se separă fragmente mai mari de 10 Kbp, în timp
ce la intervale de timp de o oră, se vor separa fragmente de circa 1 Mbp. Timpul
necesar separării prin electroforeză în câmp pulsator este cuprins între 20 și 80 de
ore, în condițiile în care gelul de agaroză are o concentrație de 0,5-1%

Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cădere de tensiune de 2,5-10V/cm.

Calculul voltajului se realizează prin asumarea faptului că în sistemele
electroforetice submarine, numai aproximativ 80% din curent trece prin gel,
căderea de tensiune (V/cm) poate fi estimată prin relația:
 Schemele unei serii diverse de tipuri de aparate
utilizate în electroforeza acizilor nucleici în câmp
pulsator.

Mobilitatea moleculelor de ADN este în funcție de tensiunea (diferența de potențial) aplicată,

temperatura de lucru, frecvența schimbării direcției câmpului electric și de soluția de tampon
folosită, din care cauză trebuie identificată combinația optimă tensiune/temperatură (rezoluția
de separare scăzând odată cu creșterea temperaturii și a tensiunii, deși viteza de migrare
electroforetică crește). Din acest motiv se recomandă schimbarea frecvenței ciclurilor de două
sau mai multe ori în timpul separării. Prin această tehnică, este oarecum dificil a se determina
masă moleculară cu toate că se pot utiliza markeri de masă. Asemănător vizualizării
fragmentelor mici de ADN, și în acest caz gelul poate fi colorat cu bromură de etidiu (1 µg/ml),
când fluorescența intens orange a colorantului intercalat în molecula de ADN dublu helicală
conduce la cuantificarea a minimum 50ng de ADN.
Dintre aplicațiile electroforezei în câmp pulsator se pot enumera
obținerea hărților genetice, (a librăriilor metagenomice), a cariotipului
electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida albicans) la
protozoare (Giardia intestinalis). Ea s-a utilizat în studiul genomului
uman, de analiză a unor regiuni implicate în maladii cunoscute precum
complexul major de histocompatibilitate, de analiză a genei distrofiei
musculare Duchenne, unde s-a pus la punct un test molecular de
diagnostic în cazul femeilor ”vector” purtătoare a genei defecte și astfel
de diagnostic prenatal în familii cu risc crescut. Se poate spune că
apariția electroforezei în câmp pulsator a contribuit semnificativ la
dezvoltarea biologiei moleculare.
Dintre dezavantaje se pot enumera timpul mare de izolare și restricție a
ADN care preced electroforeza, acesta fiind dezavantajul major a
analizelor de macrorestricție prin intermediul electroforezei în câmp
pulsator. Astfel, un protocol standard durează cinci-șase zile până la
evaluarea rezultatelor
ELECTROFOREZA PROTEINELOR
PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ
Sursele comerciale furnizează acrilamidă și N,N'-metilen bisacrilamidă
cu o puritate suficientă care permite utilizarea lor fără o acțiune de
pregătire. O serie de reactivi pot fi obținuți în formă pre-mixată
(amestecați) gata pentru reacția de polimerizare. Există disponibile
comercial componente înalt purificate care permit formarea gelurilor
transparente la lungimi de undă cuprinse în domeniul ultraviolet (260
și 280 nm), care permit scanarea directă pentru identificarea acizilor
nucleici ori a proteinelor.
Dintre dezavantaje se pot enumera: neurotoxicitatea, cancerogenitatea
acrilamidei iar la contactul cu pielea, componentele amestecului de
polimerizare pot cauza iritații. În plus, reproductibilitatea depinde de
puritatea reactivilor și a condițiilor de lucru. Ca regulă, componentele
trebuie să fie stocate în vase închise la culoare, la frigider. Odată ce
monomerii au fost dizolvați durata de viață a soluției este de
aproximativ 3 luni. Este recomandat ca pH-ul soluției să fie măsurat
periodic deoarece odată cu îmbătrânirea soluției, pH-ul va crește.
Astfel, această soluție va necesita un timp mai îndelung de
polimerizare, fenomen care servește de asemenea drept indicație că
monomerii se deteriorează.
Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere
albă, ușor solubilă în apă, solubilă în solvenți polari (etanol, acetonă,
cloroform) și insolubilă în solvenți nepolari (tetraclorură de carbon, n-
heptan) Ea își păstrează proprietăție chimice timp îndelungat dacă este
păstrată corespunzător. Dacă este expusă la lumină, polimerizează slab
și formează mici cantități de poliacrilamidă. Amida acidului acrilic se
prepară fie prin sinteză chimică, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin
biosinteză, când utilizând o tulpină de Cornynebacterium se obține cu
un randament de aproximativ 100% acrilamidă.
Acrilamida se purifică prin recristalizare la o temperatură de 60oC din
cloroform sau soluții alcoolice cu un randament de circa 60%.
Acrilamida astfel obținută este aptă pentru focusare izoelecrică și alte
tehnici unde sunt necesare geluri foarte subțiri.
N,N’Cistaminbisacrilamida este utilizată la gelurile de acrilamidă
solubilizabile, înlocuind echimolecular bisacrilamida. Gelurile se
solubilizează utilizând agenți reducători ai legăturii disulfurice (-S-S-), 2
mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritriol.
Diacrilpiperazina (N-Bis-acrililpiperazină, BAP) se sintetizează relative ușor
și este foarte solubilă în apă. Ea formează geluri cu conductibilitate mai
mare decât cele obținute prin copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamidă.
Aceste geluri nu se umflă prea tare cu apă iar în prezența dodecilsulfatului
de sodiu porii gelului scad aparent. Prin utilizarea gelurilor cu
diacrilpiperazină drept agent de reticulare separarea și detecția proteinelor
este îmbunătățită, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloză
este mai eficient.
N,N’ Dialiltartratdiamina formează geluri care își măresc volumul cu
aproximativ 30% în apă. Ele sunt solubile în acid periodic sau periodat de
potasiu. Gelurile formate de N,N’dialiltartratdiamină au o stabilitate
mecanică mai bună, sunt mai aderente pe sticlă și sunt perfect transparente,
comparabilă cu cea a gelurilor de poliacrilamidă-bisacrilamidă.
 Structura chimică a unor monomeri
acrilamido N-substituiți utilizați la
prepararea gelurilor de poliacrilamidă
 Alți agenți de reticulare.

Versatilitatea gelurilor poliacrilamide este, de asemenea demonstrată de numărul mare de agenți de

reticulare, pe langa Bis, care pot fi folosiți pentru a turna geluri cu proprietăţi specifice în scopul
unei fracţionări diferite. Acestea sunt enumerate în tabelul de mai sus. N,N'-(1,2-Dihidroxietilen)
bisacrilamida (DHEBA) poate fi folosită pentru turnarea geluri reversibile, deoarece structura de
1,2-diol face DHEBA un conpus sensibil la clivaj prin oxidare cu acid periodic. Acelaşi principiu se
aplică, de asemenea, pentru gelurile pe bază de N,N'-(1,2-Dihidroxietilen) bisacrilamidă (DATD)
Alternativ, geluri pe bază de etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizate, deoarece acest agenytul de
reticulare conține legături ester care pot clivate prin hidroliză. Agenții de reticulare poli(etilen glicol
diacrilat) fac parte din aceeaşi serie de derivaţi esterici. Așa cum s-a descris anterior, gelurile pe
bază de N,N’-bisacrililcistamină (BAC) conțin punți disulfurice ușor clivabile.
În general sistemele catalitice se pot împărți în:
Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin reacții redox;
Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin fotocataliză.
În afara celor două mari categorii există de asemenea sisteme combinate.
Sisteme catalitice redox constau de obicei din:
Inițiator al reacției de polimerizare vinilică (acesta este o substanță care
introdusă în sistemul chimic în concentrație mică poate declanșa procesul
chimic respectiv. Inițiatorul se descompune cu ușurință în radicali liberi). Cel
mai utilizat inițiator al reacției de polimerizare este persulfatul, S2O82-.
Catalizator (accelerator) al reacției de polimerizare (acesta este o substanță
care modifică viteza de reacție, catalizând formarea de radicali liberi, în acest
caz). O condiție necesară pentru a funcționa drept catalizator este de a
poseda două grupări amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare
amino terțiară.
Schema reacției de descompunere a persulfatului și de generare a radicalilor liberi
Cel mai utilizat accelerator în polimerizarea vinilică a
acrilamidei este tetrametiletilen diamina, TEMED. În
acest sistem, TEMED accelerează descompunerea
moleculelor de persulfat în doi radicali sulfat iar
aceștia inițiază reacția de polimerizare

Trebuie însă avut în vedere necesitatea prezenței TEMED

pentru această reacție. Eficiența polimerizării în acest sistem
scade rapid la valori ale pH-ului mai mici de 6,0

1.4. piperazin dimetil (1. 4 dimetilpiperazina, DMPIP)

reprezintă un alt catalizator utilizat în polimerizarea
vinilică. Acesta este însă un catalizator mai slab decât
TEMED, dar este mai bun pentru colorarea gelurilor cu
argint amoniacal (în acest caz se adaugă la sistemul
catalitic tiosulfat de sodiu alături de persulfat).
 Un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamidă este format din
riboflavină și TEMED. Astfel, riboflavina, sub acțiunea radiație UV generează radicali
liberi care inițiază reacția de polimerizare. Sistemul conține și TEMED pentru a mări
viteza de reacție. Polimerizarea durează circa o oră iar în absența TEMED reacția
decurge în aproximativ 8 ore, după circa o oră, doar 60% din monomeri fiind
polimerizați, obținându-se astfel geluri nereproductibile, monomerii neintrați în reacție
putând interacționa cu resturile de aminoacizi din constituția proteinelor supuse separării
electroforetice, putând chiar interacționa cu diverse componente ale sistemului tampon.
De obicei fotopolimerizarea cu riboflavină drept accelerator, este utilizată pentru gelurile cu
pH scăzut .

Un sistem diferit de fotopolimerizare

cuprinde un colorant cationic (albastru
de metilen) și un cuplu redox alcătuit din
sodiu toluen sulfinat, un reducător și
clorură de difeniliodoniu, un oxidant
mediu
Catalizatori ai reacției de fotopolimerizare: A. clorură de difeniliodoniu
(DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C. albastru de metilen (MB).
Ultimul, poate fi utilizat și în combinație cu riboflavin-5'-fosfatul
 FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACȚIEI DE
POLIMERIZARE
Viteza reacției de polimerizare depinde de:
(1) Concentraţia netă de monomeri şi de radicalilor liberi ( de obicei se utilizează TEMED
în concentrație de 10 mM și persulfat);
(2) Temperatura la care are loc reacția de polimerizare. În acest context se cunoaște că
reacția de polimerizare este exotermă și din această cauză temperatura trebuie să fie
controlată cu atenție. Ea se desfășoară mai ușor la temperatura camerei, cu toate că există
matrice termostatate. În general la gelurile plate, disiparea căldurii este mai eficientă cu cât
grosimea gelului este mai mică;
(3) Puritatea reactivilor;
(4) Concentrația de inhibitori. Prin inhibitor trebui înțeles orice compus care distruge
radicalii liberi. Astfel, orice compus care poate acţiona ca o trapă pentru radicalii liberi va
acţiona ca un inhibitor de polimerizare. Oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor
și din acest motiv este necesară o degazare corespunzătoare a amestecului de polimerizare
pentru a elimina oxigenul dizolvat în soluţiile de acrilamidă. Prezența oxigenului este critică
pentru o reproductibilitate absolută a electroforezei. Cu toate acestea, pot fi acceptabile și
geluri obținute fără o degazare completă. Alți inhibitori ai reacției de polimerizare sunt (a)
aminele alifatice, (b) compușii aromatici precum piridina, (c) protonii (existenți în mediul
acid).
Pentru ca gelurile să fie reproductibile, toți acești parametrii trebuie să fie controlați cu
atenție.
 PROPRIETĂȚILE GELULUI DE POLIACRILAMIDĂ

Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formează o rețea tridimensională în condițiile în care

agentul de reticulare bifuncțional se leagă de lanţurile liniare de poliacrilamidă adiacente formând un mediu
poros în care dimensiunile porilor sunt în funcție de concentrațiile inițiale ale monomerilor (acrilamidă și
bisacrilamidă) și de condițiile de realizare a reacției de polimerizare (sistem catalitic, temperatură, etc.).
Prin convenţie, gelurile de poliacrilamidă sunt caracterizate printr-o pereche de valori, T% şi
C%, în cazul în care T% reprezintă procentul de greutate al cantității totale de monomeri,
inclusiv a agentului de reticulare (în g/100 ml),

adică:

unde a reprezintă cantitatea de acrilamidă iar b este cantitatea de

bisacrilamidă în timp ce V este volumul total de soluție.
C(%) reprezintă procentul (proporția) de agent de reticulare ca procent din totalul de
monomeri, adică din cantitatea totală de monomeri.

C(%) se calculează după relația:

După cum se observă, C(%) este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii în condițiile în care se utilizează doi agenți de
reticulare cu mase moleculară diferită. Aceștia nu vor avea aceeași frecvență.
agentul de reticulare mai mic va avea o frecvență mai mare. Astfel, uneori se
utilizează fracția molară, X care poate fi definită ca:
 Efectul de cernere moleculară
Termenul de por nu definește un element geometric decât în sens orientativ și comparativ.
Mărimea porilor semnifică rezistența opusă de rețeaua tridimensională a gelului la
deplasarea macromoleculelor (în speță a proteinelor). Cu ajutorul gelului de poliacrilamidă
se pot separa molecule de la câteva sute la câteva milioane de daltoni. Mărimea efectivă a
porilor este în funcție de concentrația totală a monomerilor, T (%) și de proprietățile
agentului de reticulare, C (%).

Dependența de concentrația de monomeri, T(%) și C(%)

O macromoleculă cu sarcină electrică dată în funcție de dimensiunile sale și de

dimensiunile porilor va fi mai mult sau mai puțin frânată în deplasarea sa în câmp, fiind
caracterizată printre altele, prin mobilitatea electroforetică. În practică se folosește
mobilitatea relativă electroforetică care este proporțională cu distanța de migrare. Ea se
calculează prin compararea mobilităților diferitelor macromolecule considerând timpul
de separare și intensitatea curentului electric, constante.
 Mobilitatea relativă se notează cu Rf și definește ca raportul
dintre mobilitatea unei macromolecule oarecare și mobilitatea
unei macromolecule standard sau a unui colorant care migrează
cu frontul. Rf poate fi definit și ca raportul între mobilitățile
unei macromolecule în mediu restrictiv µ și mobilitatea sa într-
un mediu liber, nerestriciv, µo după relația:

Rf este o constantă fizică care caracterizează o macromoleculă dată într-un gel cu

o anumită compoziție, în condiții definite
Pentru a obține date despre: (a) dimensiunile și sarcina netă a unei macromolecule, (b) omogenitatea,
(c) concentrația optimă a unui gel care poate rezolva sau diferenția două specii moleculare, se folosesc
reprezentările Ferguson (figura alăturată).
KR (măsura frânării deplasării macromoleculei în gel) și y0 (măsură a mobilității macromoleculei în
mediu liber, nerestrictiv la T (%)=0) sunt parametrii caracteristici ale macromoleculei luate în studiu.
În plus, y0 poate fi corelată cu sarcina electrică netă.
În lumina acestei reprezentări gelurile pot fi:
Zerodimensionale, când fibrele de polimer au o lungime aproximativ egală cu 0, polimerul fiind liniar
și supraînfășurat formând suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.
Unidimensionale, când fibrele de polimer au o lungime ”infinită” iar numărul de capete este
neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convențional reticulate cu C(%)=2-5% care pare a avea
predominant caracter de gel unidimensional cu fibre cu rază de 1-2 nm.

Reprezentarea Ferguson. Din panta

dreptei (α) se calculează coeficientul KR iar
din intersecția cu axa oy se obține yo
valoare dată pentru T(%)=0.
Configurațiile geometrice probabile ale diferitelor tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă

Tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă. A. Poliacrilamidă

nereticulară cu C(%)=0%. Este un gel unidimensional iar consistența
polimerului este lichid-vâscoasă. B. Un gel de poliacrilamidă cu C(%)
de valoare medie. C. Un gel de poliacrilamidă cu C(%) de valoare mare.
D. Un gel de poliacrilamidă reticulat pur, zerodimensional
(C(%)=T(%)).
La valori ale C% situate în domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamidă sunt
zerodimensionale, supraînfășurate, diametrul porilor crește, iar practic moleculele
nu mai sunt frânate în migrarea lor în câmp electric. Figura de mai jos prezintă
dependența factorului de frânare în funcție de concentrația totală de polimeri, T%.

Dependența mărimii porilor de gradul de reticulare, C(%).

 În ceea ce privește dependența mărimii porilor de parametrul
T(%), se poate spune că la o valoare constantă a gradului de
reticulare (C%=2-5%), mărimea porilor scade pe măsură ce
valoarea parametrului T% crește după relația:

Astfel, mărimea efectivă a porilor a unui gel de

poliacrilamidă este o funcţie inversă a concentrației totale
de monomeri (T%). Pentru orice concentrație totală de
monomer dat, dimensiunea porilor efectivă, variază de
asemenea, în funcţie de proporţia de agent de reticulare din
amestecul de reacţie (C%). Odată cu creșterea T(%), la o
concentrație scăzută de agent de reticulare, numărul de
catene liniare crește, iar mărimea porilor scade. Când T%
este crescut la o concentrația fixă, dar scăzută de agent de
reticulare, numărul de catene crește iar dimensiunea
porilor se reduce. Pe de altă parte, dimensiunea porilor este
o funcţie bifazică dependentă de C (%). În condițiile în care
se variază C (%), la un T% constant, scade dimensiunea
porilor, nivelul minim fiind atins la aproximativ C=5%
Pe lângă aplicațiile evidente de analiză a purității unor probe proteice, disc-electroforeza
este utilizată la determinări fizico-chimice. Dacă proteina supusă analizei într-o serie de
geluri cu concentrații (T%) și se măsoară mobilitatea ei electroforetică relativă, Rm (Rm, Rf
este definit ca raportul dintre distanța migrată de proteina dată și distanța migrată de
colorantul trasor, de obicei albastrul de bromfenol) în fiecare gel se poate construi o
diagramă liniară, log Rm versus T% (diagrama Ferguson). Această reprezentare poate da o
importantă informație: panta acestei drepte este o măsură a mărimii moleculare și este
denumită coeficient de retardare (retardation coefficient, KR). Prelungirea acestei drepte care
intersectează axa 0y (Y=Rm când T=0) este o măsură a mobilității electroforetice în condiții
libere (când gelul nu este prezent) și așadar este o măsură a sarcinii electrice nete.
 Reprezentarea grafică a
logaritmului mobilității
electroforetice a BSA
versus concentrația
(densitatea) gelului (T%) la
un grad de reticulare (C%)
constant de 2%.

În cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizează în cele

mai bune condiții în geluri cilindrice.
Dacă gelurile placă pot fi în egală măsură omogene sau în gradient, gelurile
cilindrice sunt de obicei omogene.
Creşterea ulterioară a C% cauzează formarea de legături mai scurte şi mai
groase de lanţuri de polimer. Utilizarea unor reactivi de înaltă calitate este o
condiţie prealabilă pentru obținerea unor geluri reproductibile și de înaltă
rezoluţie. Acest lucru este valabil mai ales pentru acrilamidă, care constituie
componenta cea mai abundentă în amestecul de monomeri. Reziduurile de
acid acrilic, poliacrilamidă liniară şi a impurităţilor ionice sunt contaminanţi
majori care scad calitatea preparatelor de acrilamidă.
1. Acid acrilic va copolimeriza cu acrilamida şi bisacrilamida, ceea ce pentru
gelul rezultant conferă proprietăţi de schimbător de ioni.
2. Poliacrilamida lineară, prin furnizarea unui nucleu de polimerizare
necontrolat, poate conduce la geluri nereproductibile.
3. Contaminanţii ionici pot să includă atât inhibitori cât și acceleratoriai
reacției de polimerizare. În special, metale precum cuprul poate inhiba
polimerizarea gelului.
Componentele tampon trebuie să fie de grad de reactiv şi numai apa
deionizată trebuie să fie utilizată pentru toate fazele electroforezei pe gel de
poliacrilamidă.
 STRATEGIA DE SEPARARE A
PROTEINELOR PE GELURI DIN
POLIACRILAMIDĂ

În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în

studiu și în funcție de scopul urmărit, trebuie avut în
vedere:
- compoziția chimică, concentrația și structura gelului
de poliacrilamidă (gel omogen, gel în gradient, etc.);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condițiile de separare (denaturante, nedenaturante,
disociative, nedisociative);
- sistemul tampon (continuu sau discontinuu)
- forța ionică și pH-ul sistemului tampon.
 Compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă

Din punct de vedere al compoziției chimice, acrilamida poate fi polimerizată cu bisacrilamida

(cel mai adesea folosită), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina (DATD),
dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc. Ultimii trei agenți de reticulare se utilizează la
prepararea gelurilor solubilizabile, în tehnici la scală micropreparativă, deoarece acești
agenți permit solubilizarea gelului în condițiile cele mai avantajoase pentru conservarea
integrității structurale și funcționale a proteinelor luate în analiză.
Dacă gelul este format din două zone, gelul de concentrare (T%=4%) este plasat deasupra
gelului restrictiv de rezolvare, ultimul având o concentrație de monomeri cuprinsă între 5 și
30%. Gelul de concentrare (de stivuire) conține tampon Tris-HCl 0,125 M, pH=6,8, iar gelul de
separare conține tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două
geluri suprapuse este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă ale ionilor de glicinat
din compartimentul catodic. Concentrațiile de tampon Tris-HCl din cele două geluri derivă
din considerații electrochimice. Porozitatea gelului de concentrare este atât de mare pentru
a nu împiedică mișcarea proteinelor și funcționează în general ca un mediu suport cu
proprietăți anticonvective în timpul formării zonei înguste de start. Separarea proteinelor se
realizează mai jos, în gelul de rezolvare. Porozitatea acestui din urmă gel este determinată
empiric fiind potrivită mobilității proteinelor din probă. Nu există o regulă clară pentru a
predicționa concentrația corectă a concentrației de gel pentru un amestec de proteine
necunoscute neanalizate electroforetic. Alegerea este făcută astfel ca proteinele de interes
să se separe în gel. În mod obișnuit se începe cu un gel cu 7,5%T pentru electroforeza
inițială a probei cu mobilități necunoscute.
Concentrația gelului se referă la concentrația totală a monomerilor (parametrul
T%) și a gradului de reticulare (parametrul C%) Pentru proteine bine caracterizate,
alegerea concentrației gelului nu reprezintă o problemă. În general, pentru
proteine cu masă moleculară cuprinsă între 20.000 și 150.000 daltoni, se
recomandă geluri cu T%=5-12%. În cazul proteinelor cu masă moleculară cuprinsă
între 10.000 și 80.000 daltoni se recomandă geluri cu T%<10-12% iar în cazul
proteinelor masă moleculară mai mică de 15.000 daltoni se utilizează geluri cu
T%>15%.
Structura gelurilor este strâns legată de parametrii T(%) și C(%) Astfel, un gel
omogen se caracterizează printr-o singură valoare a concentrației totale de
monomeri, T(%), în timp ce un gel cu gradient este caracterizat printr-un gradient
de concentrație, deobicei cuprins între 5 și 20%. Gelurile în gradient sunt mai
avantajoase deoarece oferă mai multe date despre proteinele supuse
electroforezei. Gradientul poate fi liniar sau exponențial, putând astfel vorbi
despre gradient de pori. Gelurile omogene au pori de aceeași mărime.
Pentru obținerea unei rezoluții optime de separare a două proteine, se folosește
un gel omogen de concentrație potrivită. Concentrația gelului este în funcție de
mărimea și sarcina electrică a proteinei luate în studiu, putând să fie stabilită
(determinată) prin măsurarea mobilității fiecărei proteine într-o serie de geluri de
concentrații (T%) diferite.
Se disting patru categorii de probleme (situații) de separare:
•Cele două proteine au densități de sarcină electrică identice, deci mobilități identice
într-un mediu nerestrictiv (panelul A).

•Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcină electrică mai mare) este mai mică în
dimensiuni. În acest caz separarea se realizează pe baza mobilității și a masei moleculare.
Se consideră că cele două proteine sunt sinergice iar prin creșterea concentrației de gel
crește și rezoluția de separare (panelul B).
•Una dintre proteine are dimensiuni mai mari și mobilitate electroforetică mai mare. În acest
caz separarea se realizează în funcție de dimensiune și sarcină electrică, cele două proteine
fiind antagoniste. Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (panelul C).
Două proteine au aceleași dimensiuni dar au mobilități electroforetice diferite (este cazul
izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). În acest caz concentrația monomerilor nu are efect
asupra separării relative a celor două proteine. Situația corespunde separărilor prin focusare
izoelectrică sau prin izotacoforeză (panelul D).
Soluțiile de monomeri se prepară uzual ca soluții stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate în
separarea de proteine este preferată o soluție stoc de monomeri cu T%=30% și C%=2,7% care se
prepară prin dizolvarea a 29,2g de acrilamidă și 0,8g de bisacrilamidă în 70 ml de apă complet
deionizată (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specifică de 1,025). Soluția de monomeri
trebuie filtrată și stocată la rece, preferabil într-un vas de sticlă. Pentru gelurile utilizate în
separarea de acizi nucleici se folosește un amestec alcătuit din acrilamidă:bisacrilamidă cu
T%=30% și C%=3,3% preparată din 29g de acrilamidă și 1g de bisacrilamidă.
Concentrațiile de inițiator sunt determinate empiric prin urmărirea polimerizării în timp de 15-
20 minute după adăugare. În aceste condiții, gelificarea se realizează complet în 90 de minute.
Dacă se utilizează geluri de concentrare, este necesar ca acestea să aibă structuri poroase mari.
Pentru o polimerizare rapidă (în circa 8-10 minute) se adaugă persulfat de amoniu, la o
concentrație finală de 0,05% respectiv TEMED, 0,1%.
Soluțiile stoc de monomer și de tampon se combină până la concentrația dorită și apoi se
deaerează sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Inițiatorul și catalizatorul sunt apoi
adăugate iar amestecul se toarnă în aparatul montat. Dacă se utilizează gel de concentrare, se
prepară și se toarnă mai întâi gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o soluție de
izobutanol saturat în apă pentru a exclude aerul din vecinătatea superioară a gelului și pentru a
forma o legătură puternică între cele două geluri. După aproximativ o oră, stratul de alcool este
îndepărtat și gelul format în partea superioară se spală cu apă până la dispariția mirosului
caracteristic de butanol, după care se toarnă amestecul de gel de concentrare peste gelul de
separare și se introduce un ”pieptene” formator de godeuri pentru a forma spații în care se aplică
proba. După finalizarea polimerizării și îndepărtarea pieptenului, gelul este gata de utilizare.
Gelurile de poliacrilamidă sunt inerent instabile în afara domeniului de
pH cuprins între 4 și 6. După un stocaj de aproape 4 luni la o temperatură
de 4oC, în tampoanele uzual utilizate în electroforeză, uneori are loc o
scădere notabilă a profilului benzilor separate electroforetic. Astfel,
pentru a obține o rezoluție maximă, este necesar să se utilizeze numai
geluri proaspăt preparate. Alterarea structurii poliacrilamidei este un
proces lent de hidroliză a grupărilor carbox-amididice (-CO-NH2) ale
monomerilor de acrilamidă și care se manifestă în tampoane bazice.
Hidroliza conduce la formarea unor grupări carboxil (-COO-), ionizabile.
Gelurile vechi umflate au o structură a porilor este schimbată ele luând
caracteristici de schimbători de ioni datorită hidrolizei. Îmbătrânirea
gelurilor de poliacrilamidă are o semnificație comercială deoarece
limitează perioada de utilizare a gelurilor preturnate.
 Forma gelului
Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe
geluri plate, orizontale și apoi pe geluri cilindrice (unde amestecul de polimerizare se toarnă
în tuburi de sticlă sau plexiglace). În prezent însă, în majoritatea cazurilor se apelează la
separarea pe verticală în geluri plate (geluri placă), cu o grosime a gelului cuprinsă între 50
µm și 3 mm.

Gelurile placă orizontală (sau verticală) sunt simplu de preparat , într-un timp scurt. Pe
un astfel de gel se aplică mai multe probe, inclusiv proteine standard cu masă
moleculară cunoscută, separându-se în condiții identice. Numărul de probe aplicate este
în funcție de necesități iar analiza calitativă și estimările cantitative se efectuează cu mai
multă ușurință și precizie în cazul gelurilor cilindrice. Se elimină astfel artefactele optice,
ceea ce face posibilă fotografierea corectă. În plus, în cazul gelurilor placă, căldura
produsă prin efect Joule este mai repede disipată comparativ cu gelurile cilindrice iar
uscarea gelurilor este relativ simplă.
Gelurile cilindrice sunt
de neînlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi când se urmărește
determinarea cantitativă a radioactivității.
 Ele sunt de preferat atunci când trebuie determinată activitatea enzimatică a
fracțiunilor separate deoarece cantitatea aplicată este mult mai mare (fără a afecta
calitatea separării).
 Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru și a concentrației
optime a gelului de poliacrilamidă
 CONDIȚII DE SEPARARE
Condițiile de separare trebuie să asigure o solubilizare completă a probelor
proteice, alegerea acestora realizându-se sistematic în funcție de proprietățile
hidrofile/hidrofobe ale proteinelor.
Pentru testarea solubilității numai prin disocierea legăturilor hidrofile, proba este
incubată în soluții tampon alcaline, neutre și acide, în prezența/absența clorurii de
potasiu (0,1-0,5 M), la o temperatură de 4oC, pentru a nu afecta activitatea
biologică.

Dacă proba nu se solubilizează, se repetă testarea în

prezență de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA
complexează ionii metalici divalenți și astfel se desfac
legăturile în care aceștia sunt implicați.

Urea este deseori utilizată ca agent de disociere în electroforeza pe gel. Urea, care disrupe
legăturile de hidrogen și legăturile hidrofobe poate cauza agregări nedorite ori formarea
unor structuri secundare care afectează mobilitățile proteinelor. Ea este deseori utilizată în
denaturarea acizilor nucleici. Urea este un component esențial al gelurilor la care este
necesară menținerea configurațiilor unicatenare a ADN sau ARN, pentru a se determina cu
acuratețe masele moleculare. Disocierea legăturilor de hidrogen necesită uree în
concentrații mari (7-8 M).

Poliolii (de exempul glicerina, trixidroxipropan, propantriolul) este folosită frecvent pentru
solubilizarea proteinelor în condițiile menținerii activității biologice.
Dacă proba continuă să rămână insolubilă se recurge la detergenți,
compuși care modifică hidrofobicitatea relativă a proteinelor și care astfel
îmbunătățesc separarea electroforetică. Într-o mică măsură același efect
se obține prin folosirea tampoanelor relativ hidrofobe pe bază de N-
etilmorfolină sau hidroxietilmorfolină

O N CH2 CH3 O N CH2 CH2 OH

A B

Structura chimică a N-etilmorfolinei (A) și a hidroxietilmorfolinei (B)

 Electroforeza în condiții denaturante

Cea mai mare parte a studiilor de electroforeză în gel de poliacrilamidă folosește condiții
denaturante, disociative. În aceste condiții, proteinele oligomere disociază în lanțuri
polipeptidice, componente. Astfel, proteinele își pierd activitatea biologică. Detergenții se
utilizează în electroforeză când este necesară disruperea interacțiilor proteină-lipid și
proteină-proteină. În acest scop au fost utilizați o serie de detergenți. Cel mai cunoscut
agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul de sodiu, SDS). SDS este un
detergent ionic care are formula CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+.

Structura chimică a
dodecilsulfatului de sodiu, SDS.
Se observă brațul nepolar și
regiunea polară care posedă o
sarcină negativă
 Cele mai multe proteine sunt ușor solubile în SDS, făcând electroforeza în prezență
de SDS (SDS-PAGE) o metodă general aplicabilă.
 Puritatea (calitatea) detergentului este o condiție importantă în SDS-PAGE.
Efectele impurităților prezente în preparatele de SDS sunt impredictibile.
Dintre contaminanți, cele mai nedorite efecte le au probabil alchil sulfații,
alții decât dodecil sulfatul (C12); în special decil sulfatul (C10), tetradecil
sulfatul (C14) și hexadecil sulfatul (C16) Aceștia se leagă la proteine cu
afinități diferite și în consecință afectează mobilitățile.
Contaminanții lipofilici prezenți în preparatele de SDS, printre care
dodecanolul, pot fi incluși în complexele SDS-proteină și în micelele de
SDS conducând la scăderea rezoluției. Numai SDS purificat (care se
realizează prin recristalizare în n heptan) trebuie utilizată pentru
electroforeză, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine și
nucleoproteine au tendința de a se lega la detergent neregulat, rezultanta
fiind o migrare anormală a complexelor SDS-polipeptide în ceea ce
privește masele lor moleculare. În plus, prezența unor săruri anorganice în
preparatul de SDS conduce la modificarea proprietăților tensioactive ale
acestuia. Dintre proprietățile fizice ale SDS se pot aminti:
 SDS are o solubilitate în apă de 3% (masă/volum);
 SDS precipită la temperaturi cuprinse între 0-10oC.
Dodecil sulfatul de litiu (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost uneori
substituit SDS în analizele efectuate pe geluri de poliacrilamidă după cum
bromura de cetiltrimetilamoniu (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)
a fost de asemenea utilizată în electroforeza proteinelor.
LDS este mai solubil decât SDS și nu precipită la temperaturi scăzute (la
4oC se leagă afin la poliacrilamidă, deși la 25oC nu prezintă o astfel de
proprietate), ceea ce permite migrarea gelurilor la temperaturi scăzute. S-
a constatat că dacă într-un sistem tampon continuu, SDS este înlocuit cu
LDS, separarea moleculelor cu masă moleculară mică este accelerată
datorită deficitului de LDS în regiunea frontală a gelului. Dacă gelul este
saturat în LDS, rezoluția separării la 4oC pe acest gel este mai bună decât
cea obținută după electroforeză un gel de poliacrilamidă în prezență de
SDS efectuată la 25oC.
CTAB este un denaturant mai slab decât SDS, prezervând anumite
activități biologice care sunt distruse de către SDS.
Majoritatea proteinelor leagă SDS într-un raport constant de 1,4g SDS/gram proteină. În
aceste condiții, sarcinile intrinseci (proprii) ale polipeptidelor sunt nesemnificative
comparativ cu sarcinile electrice negative rezultate după legarea SDS. Densitățile de
sarcină electrică superficială ale complexelor SDS-polipeptide sunt în principiu
identice, ceea ce permite separarea (într-un gel cu porozitate controlată) strict în funcție
de dimensiunile polipeptidelor. În acest fel, pe lângă compoziția (conținutul)
polipeptidelor din probă, se determină și masele moleculare ale polipeptidelor, dacă
sunt separate în același timp cu un set de proteine cu masă moleculară cunoscută, prin
raportare la acestea. Tehnica de lucru este simplă iar cantitatea de probă este de
ordinul a micro sau a nanogramelor.
Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizează în SDS, indiferent de sursă, însă
există și excepții: astfel, glicoproteinele și lipoproteinele nu pot fi saturate în SDS,
deoarece, în primul caz, partea neproteică a unităților hidrofile oligozaharidice previn
legarea micelelor de SDS partea proteică numai interacționând cu acesta. Proteinele
puternic bazice (de exemplu, histonele) interacționează prin legare electrostatică a
micelelor de SDS prin intermediul grupărilor sulfat.
În cazul glicoproteinelor, impedimentul poate fi relativ îndepărtat prin
utilizarea tampoanelor Tris-borat în condiții alcaline, astfel crescându-se sarcina netă
negativă a glicoproteinelor ceea ce conduce la viteze de migrare bine corelate cu masa
moleculară.
Migrarea histonelor poate fi îmbunătățită prin utilizarea gelurilor în gradient de
pori care permit catenelor polipeptidice să acceadă la limita lor de pori.
Pe de altă parte, proteinele pure, au tendința ca la temperaturi
ridicate să formeze agregate și să precipite. Este cazul
hemaglutininei bacteriene care disociază complet după 30 de
minute de fierbere la 100oC în prezență de SDS. Competiția
agregare/dezagregare se poate rezolva prin scăderea
concentrației proteinei din probă. Practic, testarea celui mai bun
amestec de disociere se face prin păstrarea constantă a
concentrației proteice, a concentrației de agent reducător (de
obicei β-mercaptoetanol), și a concentrației de detergent cu
varierea timpului de incubare. Dacă rezultatul este
nesatisfăcător, se trece la varierea unui alt parametru dintre cei
arătați mai sus.
 S-a studiat interacțiunea diferiților detergenți anionici cu albumina serică bovină
(BSA). În stare nativă, BSA conține 10-11 situsuri cu constante mari de legare a ionilor
de detergent. Legarea ionilor de detergent de proteina nativă nedenaturată se
realizează secvențial (unul după altul), în timp ce legarea detergentului la proteina
denaturată este puternic cooperativă. Existența complexelor discrete proteină-detergent
sugerează că asocierea ionilor de detergent este, de asemenea importantă, atunci când
afinitatea detergentului pentru proteină este mai mică. Un raport de legare mai mare
decât cel normal pentru un singur situs de legare se explică numai prin formarea de
micele de detergent în acel loc, adică ionii de detergent se leagă atât la proteină cât și la
ionii de detergent deja legați. acest fenomen este numit amplificarea legării, iar acest tip
de legare poartă numele legare micelară și s-a demonstrat că este reversibil. La
atingerea concentrației micelare critice acest mecanism încetează.
Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de asemenea în punctul izoelectric
al acesteia, indirect influențând comportamentul electroforetic. De asemenea, saturarea
cu SDS este posibilă la temperatura camerei și se aplică la electroforeza
bidimensională, gelurilor folosite la separarea proteinelor prin focusare izoelectrică fiind
pregătite pentru a doua dimensiune, electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezență
de SDS (SDS-PAGE). În acest caz, incubarea la fierbere este înlocuită printr-o incubare
la temperatura camerei într-un amestec format din uree, 9M și Triton X-100, 20%.
Un alt agent de disociere foarte aplicat în disocierea probelor pregătite pentru
electroforeză este ureea.
Denaturarea produsă de uree este dependentă de temperatură, pH și tărie
ionică. Pentru o denaturare completă, se utilizează uree cu o concentrație mai
mare sau egală cu 8M, alături de agenții reducători ai punților disulfurice. Totuși
există proteine care nu se pot denatura.
Avantajul utilizării ureei drept agent de denaturare constă în faptul că în
unele separări electroforetice ea nu afectează sarcina electrică intrinsecă a
proteinei permițând astfel o separare atât în funcție de masa moleculară cât și în
funcție de sarcina electrică. Efectul denaturant al ureei datorat ruperii legăturilor
de hidrogen inter și intramoleculare poate fi reversat prin îndepărtarea ei prin
dializă.
Dezavantajele utilizării sale constau în faptul că nu se poate determina cu
precizie masa moleculară, nu este la fel de eficientă ca SDS în disocierea
proteinelor. De exemplu, ureea disociază în proporție de 50% un lizat celular brut
(la electroforeză, 50% din lizat este agregat nefiind apt să penetrteze gelul) în timp
ce SDS disociază același preparat în proporție de 90%.
Unele proteine, pentru a fi disociate complet necesită prezența simultană
a SDS și a ureei.
Clorura de guanidină (guanidina hidroclorică) este, de asemenea, un
agent de disociere utilizat în disocierea probelor pregătite pentru
electroforeză. În concentrații de 4-6M, ea realizează ruperea legăturilor
necovalente provocând desfacerea structurii cuaternare și distrugerea
structurilor secundare și terțiare datorită capacității superioare de a
participa la stabilirea legăturilor de hidrogen. Majoritatea proteinelor în
guanidină hidroclorică au o conformație total dezordonată și din această
cauză este rareori folosită în separările electroforetice.
Disocierea completă a celor mai multe proteine se realizează prin
incubarea probei diluate în tamponul de migrare la 95-100oC (pe baie de
apă) timp de 2-5 minute în prezența atât a SDS în exces cât și a β-
mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului (agenți utilizați la
reducerea punților disulfurice)

Mecanismul reducerii
punților disulfurice de
către tiocompuși.
Coloana din stânga:
reducerea cu monotioli
(de tipul β-
mercaptoetanolului).
Coloana din dreapta:
reducerea cu ditioli
ciclizabili (cum ar fi
ditiotreitolul, DTT).
Sferele întunecate
reprezintă suprafața
proteinei.
 În procedura Laemmli (1970) probele pregătite pentru electroforeză pe gel de
poliacrilamidă în prezență de SDS (SDS-PAGE) se prepară în tampon Tris-HCl, 0,0625
M, pH 6.8, SDS, 2%, β-mercaptoetanol, 5%, glicerol, 10%, și aproximativ 0,025%
(greutate/volum) colorant de monitorizare a migrării, albastru de bromfenol.
 Este de preferat a se prepara un stoc de tampon pentru probă care să conțină toate
componentele cu excepția β-mercaptoetanolului, acesta adăugându-se chiar înainte de
utilizare. Glicerolul oferă probei o densitate care îi permite depunerea sa în godeul
gelului de separare aflat sub tamponul de migrare.
 Colorantul de migrare permite atât aplicarea probei cât și monitorizarea migrării
electroforetice (el migrează odată cu ionul frontal, adică odată cu frontul).
 Cantitatea de detergent prezentă în tamponul probei este suficientă pentru a asigura
saturarea amestecului de proteine. În cazuri rare, când proba are o tărie ionică foarte
crescută (> 0,2 M), ea poate fi dizolvată în tamponul stoc al probei (tamponul de
încărcare) într-un raport de 1:1 (v/v), fiind totuși, mai indicată o diluție într-un raport de
cel puțin 1:4 (v/v).
 Cantitatea de proteină din proba care se încarcă pe un gel depinde de metoda de
detectare utilizată. Proteinele de interes care se încarcă pe gel trebuie să fie într-o
cantitate suficientă pentru a fi ulterior localizate. Detectarea în geluri impune o cantitate
de proteină/bandă de circa 1 µg pentru a avea o vizibilitate uşoară a benzilor proteice
colorate cu coloranţii anionici, de tipul Coomassie Brilliant Blue R-250 sau de 0.1 µg de
proteine/bandă în cazul colorării cu argint.
 Electroforeza în condiții nedenaturante

În acest tip de electroforeză se păstrează conformația nativă a proteinelor,

interacțiile dintre subunități și activitatea biologică, separarea realizându-se pe
baza dimensiunii și sarcinii nete a proteinelor. În acest caz, se utilizează
detergenți neionici, în general nedenaturanți, folosiți la solubilizarea proteinelor
de membrană sau a altor proteine când se urmărește păstrarea activității
biologice.
Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat în electroforeză este Triton X-100,
care din punct de vedere structural este o polioxietilenă, cu structura chimică
prezentată alăturat (unde n=10). În scopul deslușirii mecanismului molecular de
legare, s-a studiat interacția detergent-proteină. Astfel, Triton X-100
interacționează hidrofob cu unele proteine precum albumina serică bovină
(BSA), albumina serică umană, β-lactoglobulina, în timp ce alte proteine nu
leagă acest detergent (mioglobina, imunoglobulina G umană, etc.). S-a constatat
că BSA are 4 situsuri de legare a Triton X-100, nefiind însă o legare cooperativă
(prezentă la legarea cu SDS), probabil, datorită concentrației micelare critice
relativ mici. Avantajul utilizării Triton X-100 derivă din capacitatea de solubilizare
a proteinelor de membrană, iar în general, sunt preferați detergenți cu o
concentrație micelară critică mai mică de 1 mM.
 SISTEME TAMPON

Deşi cunoştinţele cu privire la proprietăţile geluri sunt relativ modeste, se

cunoaşte destul de mult despre comportamentul ionilor din tampoane în
condițiile aplicării unui câmp electric. Astfel, au fost concepute o serie de
sisteme tampon interesante si utile, astfel încât există o mare flexibilitate în
alegerea sistemului de tampon

Tampon de electrolit, evident, are un efect profund asupra migrării electroforetice. Tipul de tampon utilizat
conduce la stabilirea condiţiilor intensității câmpului electric aplicat şi afectează separarea şi de aici
rezoluţia. Proteinele diferă foarte mult în sensibilitatea lor la tării ionice, specii ionice, pH, şi necesitățile
lor în cofactori. Astfel, sistemul de tampon utilizat este în funcție de proba care urmează a fi separată
electroforetic. Tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforeză nativă (nedenaturantă) de
multe ori depinde mai mult de tipul proteinelor luate în studiu decât de cerințele electroforetice.
Sistemele electroforetice în care ionii unei singure soluții tampon sunt
prezenți în probă, gel și compartimentul electrozilor (concentrația lor putând
fi diferită) la un pH constant se numesc sisteme tampon continue. Un sistem
continuu de tampon se poate utiliza pentru separarea acizilor nucleici şi a
proteinelor în concentraţii de aproximativ 1 mg/ml sau mai mare. În acest caz, în
tancul electroforetic se folosește acelaşi tampon, la un pH constant, ca și la
prepararea gelului. De asemenea, proba este încărcată direct pe gelul unde se va
produce separarea electroforetică. După cum moleculele vor migra prin porii de
gel, acestea sunt fracţionate în funcţie de mobilitatea lor. Lățimea benzilor este
determinată în principal de volumul probei aplicate, acest parametru limitând
rezoluția în sistemele continue de electroforeză.
Probe diluate necesită volume mari pentru a furniza cantităţi detectabile de
material, obţinându-se benzi relativ largi. Utilizarea gelurilor de dimensiunea
porilor constantă, limitează sistemele continue la probe cu o concentrație mare de
proteine care conduc astfel la cele mai bune rezultate. De obicei gelul are porii
suficient de mici pentru a permite separarea în funcție de dimensiunile
macromoleculelor proteice.
Unele proteine plasmatice și celulare se pot separa mai bine în geluri de
poliacrilamidă cu gradient de concentrație în sistem continuu, viteza de deplasare
a proteinelor descrescând în timp și ajungând zero, odată cu atingerea limitei lor de
por. În acest fel, crește rezoluția de separare, electroforeza cu limită de pori fiind foarte
valoroasă pentru separări de proteine pe baza masei lor moleculare.
Se poate spune că într-un gel omogen separarea macromoleculelor se
realizează în funcție de sarcină electrică și masă moleculară, în timp ce într-un gel cu
gradient de concentrație, separarea macromoleculelor se realizează în funcție de
masă moleculară.
De exemplu, într-un gel omogen cu T%=7,5 α1-antitripsina are o mobilitate
mai mică decât albumina, migrând după aceasta, într-un gel în gradient de
concentrație, α1-antitripsina (MM=54.000 Da) va migra în fața albuminei
(MM=68.000Da).
Folosind geluri de poliacrilamidă cu gradient liniar de concentrație (gradient
de pori) %T=3-30, %C=3,8, în sistem de tampon continuu, se constată că distanța de
migrare (D) este proporțională cu logaritmul timpului de migrare după relația:
unde a reprezintă panta dreptei iar b este intersecția cu abcisa

Dreapta de regresie utilizată la calculul

masei moleculare a unei macromolecule
după electroforeză pe geluri cu gradient
de concentrație a porilor.

Există o relație liniară între logaritmul masei moleculare și logaritmul pantei

dreptei de regresie, dată de relația:

Această formulă este utilizată la calculul masei

moleculare a unei proteine studiate.
Îmbunătățirea puterii de rezoluție s-a realizat odată cu introducerea sistemelor de tampon
discontinue. Altfel spus, aceste sisteme sunt concepute pentru a accentua zonele probei pentru
separări de înaltă rezoluție. Sistemele de tampon discontinue (sau multifazice) utilizează ioni
de tamponare diferiți în gel şi în soluţiile de electrozi. În electroforeza zonală multifazică,
discontinuă, probele sunt aplicate pe un gel cu porozitate mare, gelul de concentrare
(stivuire), care serveşte ca și un mediu anticonvectiv. Toate speciile ionice, inclusiv
moleculele din probă, formează fronturi în mişcare.
Ionii din tamponul de gel, formează un front de ioni care se mişcă înaintea moleculelor
de probă.
Ionii din tamponul de electrozi formează un front care se mișcă în spatele probei.
Ionii din probă (macromoleculele cu sarcină electrică) dintre fronturile de tampon se
concentrează (”se stivuiesc”) în zone extrem de îngustă aranjate în ordinea descreșterii mobilităţii
lor. Moleculele din probă se concentrează (se stivuiesc) rapid, în regiuni foarte înguste, nu mai
mari de câteva sute de microni, cu conţinut proteic ridicat, de circa 100 mg/ml proteină.
Probele (macromoleculele) stivuite se vor deplasa prin pori mari ai gelului de stivuire
ca zone individuale foarte înguste, indiferent de volumul de probă iniţial, şi intră în gelul
restrictiv de rezolvare (sau de separare), gel cu o dimensiune mică a porilor, în serii foarte
înguste aflate la distanțe mici, unele de celelalte. Odată ajunse în gelul de rezolvare, cernerea
devine predominantă şi macromoleculele de probă "se destivuiesc" şi se separă, în funcţie de
mărimea şi sarcina lor electrică.
 Sisteme de tampon discontinue
Ornstein (1964) şi Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dată sisteme electroforetice pe gel de
poliacrilamidă (PAGE) de înaltă rezoluţie pentru separarea proteinelor native. Sistemul propus de
ei a fost atât de popular, încât este încă utilizat pe scară largă. Acesta a fost conceput pentru
analiza de proteine serice, dar funcţionează bine pentru o gamă largă de tipuri de proteine.
Sistemul de tampon Ornstein-Davis este prima tehnică de încercat atunci când se lucrează cu o
probă nouă de proteine native. Ornstein a recunoscut că o înaltă rezoluţie este atinsă atunci când
zona de start a proteinelor din probă este cât mai îngustă posibil. Astfel, el a conceput o metodă
electroforetică care comprimă zonele de proteină cu mult dincolo de limitele atinse prin mijloace
mecanice. Formularea lui se bazează pe ecuaţiile care descriu fluxul de curent în soluţii ionice şi
proprietăţile tampoanelor.
Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din probă într-un tip de sandwich intim
mărginit de două fronturi de ioni de electroliţi care se deplasează în câmp electric. Sub influenţa
câmpului electric, proteinele din probă devin comprimate între frontul de ioni conducător şi cel
de extremitate finală și segregă în zone învecinate, în ordinea de mobilităţi lor relative. Acest
proces are loc în regiune gelului cu pori mari, de concentrare. Proteinele din probă ajung la gelul
de rezolvare într-o bandă de start foarte subţire. Odată ce proteine trec în gelul de rezolvare,
predomină efectul de separare prin cernere moleculară. Sistemul Ornstein-Davis, folosește ioni de
clorură drept ioni conducători, după cum ionii glicinat sunt ioni finali, în timp ce ionul Tris este
un ion comun. Dintre componentele posibile disponibile în momentul în care sistemul
electroforetic a fost dezvoltat, proprietăţile acestor tampoane au fost cele mai potrivite pentru
cerinţele procesului de electroforeză. În timp, prin analize electrochimice s-au descris o serie de
sisteme tampon care se pretează separării electroforetice.
Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții discontinue și nedenaturante
după Ornstein-Davis. Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc în
timpul electroforeză discontinue, mai ales având în vedere popularitatea acestuia. Alte
sisteme discontinue funcţionează prin mecanisme similare.
Sistemul Ornstein-Davis, foloseşte la separarea proteinelor, două tampoane diferite care
conţin anioni diferiți şi un cation comun. Ionul clorură, prezent în gel de când acesta este
turnat, devine ion frontal iar ionii glicinat care provin din tamponul de migrare (tamponul
de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris, comun, susţine electroneutralitatea. Cele
mai multe proteine serice transport sarcini negative nete în acest sistem şi migrează
spre anod.
Sistemul Ornstein-Davis constă din patru părţi interdependente: (1) un gel de stivuire
(concentrare), (2) un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare), şi (4)
probă. Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris
de Ornstein-Davis sunt prezentate în figura următoare.
Gelul este format din două secțiuni (panel A), o porțiune cu porozitate mare (gelul de
concentrare) cu T%=4 este turnată peste gelul restricitiv de rezolvare (T%=5-30). Gelul
de concentrare conține tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, în timp ce gelul de separare
conține tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două zone
de gel este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă a ionului glicinat.
ei.
Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis

Etapele separării unui amestec de proteine în sistem discontinuu tampon Ornstein-Davis. (A) gelul este format din două
secţiuni. Un gel de concentrare cu pori mari aflat în parte superioară este turnat peste un gel restrictiv de rezolvare
(separare). Fiecare secțiune de gel conţine tampon Tris-HCl, dar concentraţiile şi pH-urile celor două tampoane
corespunzătoare celor două secţiuni sunt diferite. Gelul de concentrație este indicat printr-o nuanță de gri deschis în timp
ce gelul de separare este de culoare gri-închis. Proba proteică dizolvată în tamponul gelului de concentrare diluat este
plasată în godeurile gelului de concentrare (linii orizontale întunecate). Tamponul Tris- glicină de electrozi (culoarea
fondului figurii) este în contact cu partea de sus a gelului, partea de sus a probei, precum şi partea de jos a gelului. Anodul
este situat în partea inferioară a gelului iar catodul se află în zona superioară, nefiind prezentate. În acest sistem proteinele
serice de exemplu, au sarcini nete negative şi se mișcă în jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuiți în întregul sistem şi
servesc la menţinerea electroneutralității. Intensitatea câmpului electric, E, la scurt timp după aplicarea unei tensiuni
electrice, este reprezentată în graficul din partea dreaptă a imaginii de gel. Câmpul electric din gel, E este relativ scăzut, ca
o consecinţă a conductivitate relativ ridicată datorată ionilor de clorură, mobili. (B). În momentul aplicării unei tensiuni,
constituenții anionici ai sistemului se vor alinia în ordinea de mobilităţi lor electroforetice. Magnitudinea mobilității ioni
clorură (Cl-), în zona tamponului de gel este mai mare decât mobilitatea ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului
de electrozi. Proteinele din probă, cu mobilităţi intermediare, sunt introduse într-un sandwich (în ordinea de mobilitatea lor)
între frontul clorură şi frontul de ioni glicinat. Astfel, proteinele din probă devin "stivuite" în regiunea foarte îngustă dintre
cele cele două fronturi de ioni de tampon în mişcare şi formează, spațial, o zonă foarte îngustă de start. Intensitatea
câmpului electric este influenţată de distribuţie locală a purtătorilor de sarcină, care sunt proteinele din zona de probă.
Intensitatea, E, a câmpului în zone diferite care conțin ioni este ajustată, astfel încât toate fronturile ionice migrează cu
aceeaşi viteză. (C). La scurt timp după ce procesul de concentrare este finalizat, proteinele din probă trec în gelul de
rezolvare care este prevăzut cu pori mai mici pori unde mișcarea este încetinită datorită procesului de cernere moleculară.
În gelul de rezolvare, ionii de glicinat depășesc proteinele din probă şi vor migra chiar în spatele ionilor clorură. În timpul
etapei de rezolvare, proteinele vor răspunde la câmpul electric relativ ridicat determinat de ionii glicinat din gel.
Electroforeza continuă cu proteinele din probă în tampon Tris- glicină, până când aparatul este închis.
Stivuirea. Când este aplicată o tensiune de curent, ionii clorură din secţiunile de gel, proteinele
anionice din probă, precum şi ionii de glicinat din zona tamponului de electrod încep să se
deplaseze spre anod (panel B). Tris-ul (o bază), precum şi orice altă proteină cationică din probă
migrează spre catod. Aşa cum ioni de clorură părăsesc proba, în spatele lor se creează o regiune
localizată, de conductivitate scăzută și câmp înalt. Câmpul crescut din spatele frontului de ion
clorură accelerează proteinele din probă şi ionii de glicinat de la tampon electrodului la aceeaşi
viteză ca şi a ionilor clorură (Eµ=constant). Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de
electrozi (pH=8,3) este de aşa natură că mobilitatea efectivă a ionilor glicinat este mai mică decât
ca a ionului clorură şi a proteinelor din probă. (Mobilitatea efectivă a unei electrolit slab este
mobilitatea medie a formei ionizate; µef=µx, unde x este fracţiunea de molecule ionizate la un pH
specific iar µ este mobilitatea acestuia. Fiecare moleculă poate fi gândită ca fiind ionizată x% din
timp şi neionizată restul timpului. pKa a glicinei este pH=9,8 iar la pH=8,3, moleculele de glicină
sunt disociate în proporție de 1/30 în ioni glicinat). O regiune a frontului mobil se formează rapid
cu ioni de clorură, frontali și ionii de glicinat în spate, iar proteinele din probă sunt comprimate
între ele. Proteinele formează, zone individuale subțiri, așezate precum fișicul de monede, în
ordinea descrescătoare a mobilităţii, între ionul conducător, clorură şi ionul de sfârşit, glicinat. În
acest timp, pH-ul gelului de concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicină se deplasează prin
acest gel. În stiva creată, fiecare zonă proteică se află într-un câmp electric scăzut care se mișcă
în față și un câmp electric ridicat aflat în spatele ei. Orice moleculă de proteină avansează în zona
din fața sa unde întâlnește un câmp electric cu intensitate scăzută, fiind încetinită până când zona
sa îl va prelua. Invers, o moleculă proteică care provine spatele acestei zone este accelerată de
câmpul electric crescut de acolo. În starea de echilibru, fiecare dintre proteine este concentrată
într-o zona îngustă, de înaltă densitate, determinată exclusiv de mobilitatea sa, în condiţii
electroforetice.
Separarea. În cazul în care regiunile mobile se deplasează în ajung la
interfaţa dintre gelul de concentrare (stivuire) şi gelul de rezolvare, proteinele
vor fi încetinite accentuat datorită existenței porilor restrictivi ai gelului de
separare. În acelaşi timp, pH-ul este brusc crescut la o valoare de 8,8 şi
creşte rapid la un pH de 9,5 deoarece tris-Cl se înlocuieşte cu tris-glicinat.
Mobilitatea efectivă a ionilor de glicinat la pH 9,5 este destul de mare și ca
atare depășește proteinele din probă care sunt încetinite în mișcare de către
porii gelului de rezolvare, migrând chiar în spatele frontului de clorură
(x=1/3) În aceste condiții zonele de proteine devin necomprimate şi începe
să se separe în benzi macroscopice prin cernere moleculară (panel C). In
gelul de rezolvare, proteine se mișcă la pH 9,5. pH-ul de operare a gelului
de separare, egal cu 9,5 a fost introdus în sistemul Ornstein-Davis pentru a
asigura o mobilitate eficientă a glicinatului, mai mare decât cea a celei mai
rapide proteine serice (prealbumina) în geluri cu %T=7,5. După cum are loc
progresul migrării, benzile proteice, inițial foarte subțiri se lățesc într-un ordin
de milimetrii, drept consecință a difuziei și diluției.
Principiul electroforezei pe gel de poliacrilamidă în sistem
discontinuu.
Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții discontinue și denaturante
după protocolul descris de Laemmli.

Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-Davis, pentru a permite

determinări ale greutate moleculară. Sistemul Laemmli conține SDS 0,1% în
tampoanele Ornstein-Davis şi utilizează o etapă de denaturare prin tratament termic
a probei. Tratamentul este conceput pentru a denatura complet proteinele de probă
în componentele lor polipeptidice constitutive înainte de electroforeză.
În momentul în care un amestec de proteine se incubează într-un tampon
care conţine SDS (2%) şi un agent tiol reducător, cum ar fi 2-mercaptoetanolul
(5%) la temperatură, proteinele sunt complet denaturate iar polipeptidele rezultate,
datorită SDS-ului, se încarcă cu o sarcină negativă uniform, în raport cu masa lor.
Agentul de reducere rupe legăturile disulfurice între segmentele proteinelor native,
în timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, îmbracă polipeptidele uniform, cu 1,4
g de SDS pe gram de polipeptid. Proprietăţile detergentului ecranează proprietățile
polipeptidelor. Toate filmele SDS-polipeptide iau o formă similară prelungită,
asemănătoare unei vergea, cu dimensiuni proporţionale cu greutatea lor moleculară.
În plus, densitatea de sarcină a complexelor SDS-polipeptidă este independentă de
pH în intervalul 7-10 și astfel fracţionarea în gel este guvernată strict de procesul
de cernere moleculară, astfel încât prin utilizarea acestui sistem se poate la estima
greutățile moleculare ale polipeptidelor separate.
 O serie de tipuri de proteine nu se comportă într-un mod aşteptat în cursul SDS-
PAGE. Proteinele incomplet reduse, cu unele punți intra- sau intermoleculare disulfurice
intacte, nu sunt saturate cu SDS, deoarece o parte din domeniile lor de legare a SDS nu sunt
disponibile la detergent. Glicoproteinele şi lipoproteinele nu sunt, de asemenea, saturate cu
SDS, deoarece componentele lor neproteice nu interacţionează cu detergent. Proteine care
conțin secvențe neuzuale de aminoacizi, în special cele cu un conținut crescut în resturi de
lizină sau cele cu un conţinut crescut în resturi de prolină, proteinele foarte bazice şi cele foarte
acide se comportă anomal în SDS-PAGE, probabil pentru că raportul sarcină electrică/masă a
complexelor SDS-polipeptidă sunt diferite de cele care ar fi de aşteptat, dată pentru
dimensiunea lor. În mod similar, complexele foarte mari SDS-proteină, cu mase moleculare de
sute de kilodaltoni, ar putea avea conformații anormale.
Polipeptidele mai mici de aproximativ 12.000 Da nu sunt rezolvate bine în cele mai
multe sisteme SDS-PAGE. Complexe SDS-polipeptidă mici, fie au aceleaşi conformație
aproximativ sferică, fie nu pot fi separate de zona de micele de SDS pur care se formează în
spatele frontului de ioni conducători.
Sistemele electroforetice descrise de Laemmli și Ornstein-Davis pot fi utilizate la
separarea atât a proteinelor cât și a acizilor nucleici. În cazul separării acizilor nucleic, este
totuși preferat sistemul Laemmli deoarece în cazul acestei tehnici, prezența SDS conduce la
denaturarea nucleazelor contaminante.
 ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE

În procedura descrisă de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la

desfacerea proteinelor în subunităţile lor componente şi lasă subunităţile acoperite cu detergent
anionic. Mobilităţile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptidă-SDS rezultate își asumă
aceeaşi relaţie funcţională în referitoare la masa lor moleculară. Într-o primă aproximare, vitezele
de migrare a derivaților SDS sunt invers proporţionale cu logaritmii maselor lor moleculare. SDS-
polipeptidele, astfel, se vor deplasa prin geluri într-un mod previzibil, complexele cu masă
moleculară mică vor migra mai repede decât cele mari. Aceasta înseamnă că masa moleculară a
unei proteine poate fi estimată din mobilităţile relative ale subunităţilor sale în SDS-PAGE, calibrat.
Estimările de masă moleculară sunt printre aplicaţiile cele mai des folosite de electroforeza pe gel
şi reprezintă o parte a popularității SDS-PAGE prin metoda Laemmli.

Masele moleculare sunt determinate în SDS-PAGE prin compararea mobilităţii proteinei de

testare cu mobilităţile unor proteine marker cunoscute. Parametrul relevant este
mobilitatea relativă, Rf, definită ca mobilitatea a unei proteine raportată la mobilitatea
frontului de ioni. Acest parametru permite normalizarea mobilităţilor la o mărime
măsurabilă semnificativă şi caracteristică. Mai degrabă decât a determina mobilităţi, este
suficient să se calculeze Rf ca raportul dintre distanta parcursa de o proteina din partea de
sus a gelului de rezolvare împărţit la distanţă de migrare a frontului de ioni. Deoarece
frontul de ioni este dificil de a localiza, în practică, mobilităţile sunt normalizate la colorant
de urmărire care migrează doar puţin în spatele frontului de ioni:
Graficul log M vs Rf construit
din distanţele de migrare a
standardelor conduc la
calibrarea curbei gelului.
Valorile Rf ale proteinelor de
testat sunt apoi comparate cu
cele ale standardelor.
Interpolarea valorilor Rf ale
proteinei de testat pe curba
standard oferă masa ei
moleculară aproximativă
Curbă de calibrare, logMr vs. Rf plotată cu o serie de markeri
de masă moleculară cuprins în domeniul 10.000-200.000Da,
separați pe un gel omogen (T%=10% și C%=2,75%) de
poliacrilamidă în prezență de SDS. Se poate observa deviația
de la linearitate. Proteinele marker sunt (masa moleculară,
Mr fiind dată în kDa): miozină (194); RNA polimerază
(subunitatea β) (160); β galactozidază (116); fosforilază B
(94); RNA polimerază (subunitea β) (95); albumină serică
bovină (68); ovalbumină (43); RNA polimerază (subunitea
σ) (38,4); anhidrază carbonică (30); tripsinogen (24.5); β-
1actoglobulină (17,5); lizozim (14,5).
Curbele standard sunt de fapt în formă sigmoidală. Liniaritatea aparentă a
curbei standard nu poate acoperi însă, întreaga gamă de mase moleculare
pentru un amestec de proteine separate într-un gel particular. Cu toate
acestea, log M este suficient de aplatizat, într-un sens matematic, pentru a
permite estimări în masă moleculară destul de exacte care urmează să fie
făcute prin interpolare, şi chiar şi prin extrapolare, peste domenii relativ
mari. Intervalele aproximative utile a gelurilor după SDS-PAGE pentru
estimări de masă moleculară sunt după cum urmează: pentru mase
moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru
mase moleculare din domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%;
pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000 Da, geluri cu
T%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da,
geluri cu T%=15%.
Amestecuri de proteine standard cu masă moleculară cunoscută sunt
disponibile în comerţ pentru calibrarea geluri în vederea electroforezei
proteinelor.
 Markeri de masă moleculară utilizați în SDS-PAGE

• Este important a avea la îndemână o gama largă de markeri de

masă moleculară, astfel încât să se exploreze orice dimensiune a
unui polipeptid. Aceștia ar trebui să suficienți pentru cele mai multe
scopuri, deoarece se întind pe un interval de aproximativ 1000 de
ori a masei moleculare (deşi markeri cu masă mai mică de 10 kDa
sunt rar folosiți).
• Kiturile acoperă intervale de masă moleculară limitate sunt, în
general, disponibile din mai multe surse comerciale De exemplu, se
oferă trei seturi de markeri denumiți markeri pe un domeniu scăzut,
pe un domeniu mare şi markeri pe o gamă largă, pentru a fi utilizate
ca standarde pentru separaţii de proteine în intervale cuprinse între
14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000
Da. Dacă aceștia nu sunt de ajuns, se poate pregăti o serie proprie
prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine mici (de
exemplu, lizozim, hemoglobină, albumină serică bovină).
 ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN GRADIENT DE
POROZITATE
Migrarea macromoleculelor într-o matrice de gel cu o concentraţie continuu variabilă
(ceea ce semnifică un gradient de porozitate), are ca efect compactarea zonelor de
proteine de-a lungul direcției de migrare, astfel că banda proteică, traversează
concentrații din ce în ce mai mari de gel, iar viteza sa de migrare scade continuu. Acest
proces conduce la o îngustare progresivă a benzii proteice. Există şi alte motive pentru a
recurge la geluri de porozitate gradată.

Principiul tehnicii este prezentat în figura alăturată, când,

după o separare electroforetică în timp suficient (de cel
puţin 10 kV•h) pentru ca mobilitatea proteinelor să fie
constantă şi în cele din urmă să înceteze pentru că fiecare
element constitutiv al probei să ajungă într-o regiune a
gelului cu o densitate la care dimensiunea medie a porilor
se apropie de diametrul proteinelor (limita de pori). Astfel,
raportul dintre distanţele de migrare a unei proteine cu cea
a oricărui alteia devine o constantă, după ce au intrat toate
într-o regiune a gelului în care acestea sunt supuse unor
condiţii de cernere drastică. Din această cauză profilul
electroforetic devine constant după o migrare prelungită
într-un gel cu gradient de concentrație. Concentraţia de
gel, la care rata de migrare pentru o proteină dată devine
constantă se numeşte limită de pori: dacă acest porozitate
marcată în mod corespunzător cu ajutorul unui set adecvat
de proteine marker, atunci este posibil să se coreleze
distanţa de migrare a oricărui element constitutiv în
amestec cu masa sa moleculară.
Metoda descrisă pentru determinarea masei
moleculare după SDS-PAGE, folosind un gradient
linear de pori. Curba arată o relaţie liniară între
logaritmul masei moleculare și √D (D1/2) pentru o
serie de 34 de proteine standard care acoperă
domeniul de masele moleculare cuprinse între
13.000 și 95.000 Da, separate pe un gel în
gradient T%=3-30% (la un C% constant de 8,4%).
Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de
poliacrilamidă în gradient linear: A, dispozitiv bicameral de
formare a gradientului; B, rezervor; C, cameră de
amestecare; D, supapă; E, bară magnetică de agitare; F,
agitator magnetic; G, robinet; H, pompă peristaltică; I,
tubulatură; J, casetă de turnare a gelului placă vertical.
 Calitatea gradientului generat poate fi verificată prin adăugarea
unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul sau albastru de bromofenol
într-unul dintre rezervoare şi apoi de scanarea gelului cu un
densitometru.

În cazul în care se are în vedere

turnarea simultană a unui număr de
geluri placă verticale

Reprezentarea schematică a unui

aparat pentru prepararea unui număr
de geluri de poliacrilamidă cu gradient
liniar de pori: A, sistem de producere a
gradientului; B, rezervor (concentrație
mare de monomeri, T% mare); C,
cameră de amestecare (concentrație
mică mare de monomeri, T% mică); D,
valvă; E, bară magnetică; F, agitator
magnetic; G, robinet de închidere; H,
pompă peristaltică; I, casetă de
turnare a mai multor copii de geluri
verticale.
 Limitele concentrației aleasă pentru gradient depinde de compoziția probei ce
urmează a fi separată. Gradienți de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerați
în general mai potriviți a se utiliza pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu
proteine serice, proteine urinare, etc.), deși, dacă electroforeza este prelungită este
posibil ca proteinele cu Mr în jur de 30,000 Da să migreze în afara gelului.
. Aplicații ale electroforezei pe geluri de poliacrilamidă în gradient de
porozitate
Electroforeza în gradient de pori în prezența SDS poate rezolva, o gamă largă de proteine
într-un domeniu mare de masă moleculară. Prin urmare, asocierea dintre focalizare
izoelectrică şi electroforeza în gradient de pori în prezență de SDS maximizează numărul de
proteine identificate într-un gel după o singură separare bidimensională. Pentru a obţine pI-ul
și masa proteinelor native, se utilizează în prima dimensiune focalizarea izoelectrică în
absența ureei urmată de electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante

În cazul unei proteine multimerice, parţial purificate, numărul de subunități şi masa
moleculară a subunităţilor sunt analizate simultan prin electroforeză 2-D cu electroforeza în
gradient de pori pentru prima dimensiune și SDS-PAGE pentru a doua dimensiune. După o
primă electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante, poziţia proteinelor
multimerice în gel este determinată prin teste specifice acestei proteine pentru estimarea
masei sale moleculare native, după care proteina multimerică este disociată în subunităţile
sale prin tratament cu SDS. Masa moleculară a fiecărei subunități este determinată prin
electroforeză pe gel de poliacrilamidă în prezență de SDS iar numărul de subunități dintr-o
proteină nativă complexă se calculează din aceste valori.
Au fost descrise alte aplicații ale electroforezei în analiza lipoproteinelor, inclusiv lipoproteinelor cu
densitate mare (HDL) precum și a lipoproteinelor cu densitate mică (LDL). În cele mai multe laboratoare de
analiză specializată, metodele uzuale de separare și analiză a lipoproteinelor din ser sunt cele de
ultracentrifugare în gradient de densitate. Un dezavantaj al acestei metode constă din necesarul unui
echipament scump şi personal cu experienţă, în timp ce separarea și analiza acestora prin electroforeză în
gradient de pori este o metodă relativ simplă, necostisitoare, şi sensibilă pentru detectarea subfracțiilor
lipoproteice dintr-un volum mic de ser. În plus, electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante
separă lipoproteinele, pe baza diferenţelor de dimensiune a particulelor şi astfel poate oferi în mod direct
dimensiunea particulelor, în timp ce separarea ultracentrifugarea în gradient de densitate se bazează pe
diferenţa de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor. Dacă, înainte de
electroforeză, în cazul în care lipoproteinele din probă sunt precolorate printr-o tehnică de colorare a lipidelor
(colorare cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor poate fi monitorizată în timp real. De exemplu,
HDL poate fi fracţionată în 14 subclase prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante.
În plus faţă de interacţiunea funcţională a proteinelor sau a subunităţilor acestora, reacțiile antigen-anticorp
sunt analizate după separarea prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante. Mobilitatea
unui complex de antigen-anticorp este mai lentă decât cea a unei molecule singulare de antigen. Mai mult
decât atât, un complex al unei molecule de antigen şi doi anticorpi monoclonali care recunosc doi epitopi
distincți migrează mai lent decât un complex format dintr-un antigen şi un anticorp monoclonal. Prin urmare,
prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante se poate determina dacă două anticorpi
monoclonali împotriva acelaşi antigen recunosc epitopi diferiți sau identici, și astfel este posibil realizarea
unui studiu de cartografiere a epitopilor prin electroforeză pe gel.
se poate realiza de asemenea, studiul complexelor ADN-proteine. În analiza de modificare a mobilității
electroforetice (electrophoretic mobility shift assay, EMSA), EMSA cu electroforeza în gradient de pori în
condiții nedenaturante are o capacitate de rezoluţie înaltă şi este utilă pentru analiza complexele ADN-
proteine care conțin proteine diferite ori pentru detectarea unor proteine de legare a de ADN mutanți.
 ELECTROFOREZA PE GELURI DE
POLIACRILAMIDĂ ÎN PREZENȚA
BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU

În cazul în care, în loc de încărcarea negativă cu SDS, se utilizează o

încărcare pozitivă a proteinelor cu detergenți de tipul bromurii de
cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina negativă a glucidelor se neutralizează
prin legarea suplimentară a unor molecule de detergent. Acest lucru
conduce la obținerea unor benzi mai clare. CTAB este cunoscut că
solubilizează proteinele foarte eficient şi a fost folosit pentru izolarea unor
proteine "dificile"

În CTAB-PAGE proteinele se deplasează spre polul negativ, mai degrabă

decât spre electrodul pozitiv și ca atare trebuie utilizat un sistem diferit de
tamponare.
Electroforeza nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de Coomasie Brillant Blue
În ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforeză nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de
CBB (Blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o metodă dominantă în identificarea unor tulburări
funcţionale prin analiză din omogenate totale, ţesuturi, celule ori fracţiuni celulare. Metoda a fost utilizată la
determinarea greutății moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins între 10 şi 10.000 kDa. Au fost
analizate cu succes mai ales complexele membranare intrinseci de transfer a electronilor/protonilor din
mitocondrii şi cloroplastele. Metoda a fost combinată cu alte tehnici pentru a determina starea oligomerică,
stochiometria, activitatea enzimatică şi structura moleculară a complexelor multiproteice. Aşa cum multe probe
pot fi separate în paralel, într-o singură migrare electroforetică, printr-o comparaţie directă a complexelor proteice
se permite uşor identificarea unor tulburări, ceea ce permite direcționarea spre analize funcţionale suplimentare. În
proteomică, separarea de înaltă rezoluţie de proteine este, în general realizată prin separări bidimensionale (2-D),
în conformitate cu punctul izoelectric al proteinelor (IEF-PAGE) şi masa lor moleculară (SDS-PAGE). Aceasta
ultimă tehnică de denaturare separă sute de mii de proteine din probe complexe. Cu toate acestea, proteinele
hidrofobe de membrană sunt greu detectabile, după 2-D IEF/SDS-PAGE.
BN-PAGE reprezintă o strategie alternativă de separarea cu rezoluţie înaltă a proteinelor de membrană şi de
menţinere a funcţiei lor enzimatice. Metoda se numește nativă, deoarece cele mai complexe de proteine separate
își păstrează funcţiile enzimatice şi blue native, deoarece separarea electroforetică se bazează pe proprietatea
colorantului Coomassie blue G250 (CBB) de a se lega la proteine. BN-PAGE a fost descrisă pentru prima data în
1991 în cazul separării complexelor de proteine membranare din lanţul respirator al mitocondriei umane. Astăzi,
BN-PAGE reprezintă o alegere în cazul în care este necesară o analiză a interacţiunilor proteinelor native de
membrană, la o rezoluţie înaltă şi cu randament sporit.
Importanţa biologică a interacţiunilor dintre proteine este dată de faptul că proteinele se exprima în funcţie de gene
în toate organismele vii. Proteinele sunt molecule funcţionale care operează pe căi metabolice, de dezvoltare şi de
reglare, dintr-o celulă, ţesut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt complexe integrate, în scopul
organizării lor în mai multe funcţii enzimatice. Complexe de proteine, prin urmare, reflectă organizarea
macromoleculară a stării celulare, care reprezintă fundamentul în înţelegerea funcţiilor celulare. În practica
proteomică, obiectivul central îl reprezintă identificarea tuturor proteinelor prezente într-o stare definită de
dezvoltare a unui organism, ţesut, celuleă sau subfracție celulară şi de a caracteriza modificările lor calitative şi
cantitative, ca răspuns la schimbările de mediu.
Pregătirea probei în vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separă complexe ale proteinelor de
membrană în stare nativă. Pentru a obţine rezultate optime, pregătirea probelor reprezintă pasul
cel mai critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectuează pe gheaţă. Pentru a mări
șansele de solubilizare a complexelor proteice și de creștere a stabilității lor, se are în vedere că
solubilitatea proteinelor depinde atât de natura probei, precum şi pe tipul de detergent şi de
concentrația acestuia, aceste variabile trebuind testate pentru oricare probă de interes.
Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice sunt ansambluri complexe de lipide şi
proteine. Un compus lipidic este de obicei compus din două cozi hidrofobe de hidrocarbură
conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai adesea aranjate într-o structură bistratificată cu
cozile hidrofobe alăturate iar capetele hidrofile ale acestora sunt îndreptate spre exterior.
Proteinele de membrană sunt încorporate în zonele hidrofobe ale bistratului membranar prin
interacţiunea lor cu faza hidrofobă lipidică. Proteine se adună în complexe multisubunitare pentru
a îndeplini funcţiile celulare în cadrul fazei de membrană.
Evoluția unui proces de migrare electroforetică prin BN-PAGE. Imaginile reprezintă trei puncte
caracteristice din perioada de timp de electroforeză prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic constă din
anod (partea de jos) şi tancul rezervor de tampon catodic (sus, umplute cu tampon catodic, care conține
CBB, albastru), gelul se află situat între două plăci de sticlă (ca un sandwich) iar menținerea temperaturii
(la 4oC) se realizează printr-un sistem de răcire prin intermediul tamponului anodal în tot timpul
electroforezei. Tamponul din zona anodală este agitat pentru a menține o temperatură constantă. Înainte
de începerea electroforezei, tamponul catodal care conține CBB este completat în rezervorul cu tampon şi
probele sunt depuse în godeuri (săgeata de culoare albă, godeul probei, panelul 1, înainte de începerea
migrării). În timpul electroforezei, probele încărcate electric intră în gelul de concentrare (stivuire) şi după
un timp, colorantul Coomassie care se deplasează cu frontul ajunge la jumătatea gelului de separare. În
acest moment, complexele proteice încep să devină vizibile în gelul de separare. În acest moment,
tamponul cu Coomassie catodic se schimbă cu un tampon catodal incolor (săgeţile de culoare albă,
panelul 2, în timpul migrării). BN-PAGE poate fi oprită atunci când tampon colorat cu CBB pătată a ajuns
la sfârşitul gelului de separare şi separarea de complexe este finalizată (săgeţile de culoare albă, panelul
3, sfârșitul migrării)
BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide.
Markerul de masă moleculară (MP) conține următoarele
proteine standard separate: tireoglobulină 696, feritină 440,
catalază 232, lactat dehidrogenază 140, şi albumină 67, kDa.
Din 1×108 cloroplastele de orz corespunzând la 400 µg de
proteină, au fost izolate plastide care au fost în continuare
lizate, iar membranele tilacoide au fost colectate prin
centrifugare. Proteinele membranare au fost solubilizate cu
dodecilmaltozid şi separate pe un gel de poliacrilamidă cu
gradient liniar de pori (6-12%), prin blue native PAGE (TM).
Linia a doua de gel a fost colorată cu CBB (CS). Pentru a se
determina activitatea diaforazei
NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea
dreaptă a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat în
50 mM tampon fosfat pH=8,0/EDTA, 1mM. Reacția de culoare
a fost iniţiată prin adăugarea a 0,2 mM NADH şi 0,5 mg/ml
nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat în continuare timp de 12
ore. Se evidențiază (prin săgeţi) două complexe proteice care
conţin clorofilă (AS) la o masă moleculară de 550 kDa
(semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC I) şi un
altul, la o masă moleculară de 120 kDa (semnalul mai mic,
echivalent complexului LHC II).
 Electroforeza nativă pe geluri de
poliacrilamidă incolore

nu este nimic altceva, decât un sistem de gel folosit în BN-PAGE, fără a utiliza
colorantul CBB

Pentru a evita o potenţială agregare a proteinelor de membrană din extractele de

detergent în timpul migrării electroforetice, se adaugă detergenţi blânzi la gelurile
native incolore, de exemplu

Detergentul utilizat Proba biologică

Mitocondrie la mamifere
β-D-dodecilmaltozid Mitocondria la drojdii
Cloroplaste la plante (tilacoide)
β-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere
β-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii
Triton X-100 Mitocondrie la drojdii
Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii
Lubrol Mitocondrie la drojdii
Digitonină Mitocondria la drojdii
 SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ
PRIN FOCALIZARE (FOCUSARE) IZOELECTRICĂ
IEF este o tehnică electroforetică pentru fracționarea compuşilor amfoterici în funcţie de pI-ul lor
de-a lungul unui gradient continuu de pH. Contrar electroforezei zonale, unde mediul de separare
posedă un pH constant (tamponat) care stabilește o sarcină electrică constantă pe suprafața
moleculei și care conduce, în absența procesului de stivuire (cernere moleculară) la o mobilitate
constantă, sarcina electrică de suprafaţă ale unui compus amfoter în IEF este într-o continuă
schimbare, şi scădere, în funcţie de curba sa de titrare, în timp ce trece de-a lungul unui gradient
de pH până când ajunge la o poziţie de echilibru, adică în regiunea în care pH-ul se potriveşte cu
pI-ul său. Acolo, mobilitatea acestei molecule este egală cu zero iar molecula se oprește.
Gradientul este creat şi menţinut, prin trecerea unui curent electric printr-o soluţie de compuşi
amfoterici, care au valori ale pI-urilor apropiate pe o distanță care cuprinde un domeniu dat de pH.
Transportul electroforetic cauzează acestor amfoliți transportori (CA) stivuirea în funcţie de pI-lor,
astfel încât se realizează un gradient de pH care crește de la anod la catod, și care este stabilizat.
La începutul unei migrării, mediul de separare are un pH uniform, este egal cu pl-ul mediu al
amfoliților transportori. Astfel, cei mai mulți amfoliți au o sarcină netă şi o mobilitate netă. Amfolitul
cel mai acid migrează în apropierea anodului și se concentrează într-o zonă la care valoarea pH-
ului său este egală cu pI, în timp ce cel mai bazic amfolit se deplasează adiacent și în apropierea
catodului. Un amfolit mai puţin acid migrează adiacent şi ușor catodal într-o zonă stablită de pH-ul
său și astfel toți componenții sistemului ating o stare de echilibru. După finalizarea acestui proces
de aranjare (stivuire), unii amfoliți transportori tind să se deplaseze în zone cu pH mai mare sau
mai mic prin procese de difuziune în cazul în care sistemul nu se află într-un echilibru izoelectric.
Dar, aşa cum imediat ce aceștia intră în aceste zone, amfoliții transportori devin încărcați electric iar
tensiunea electrică aplicată îi forțează să se întoarcă înapoi în poziţia lor de echilibru.
 Principiul focalizării izoelectrice. Înainte de încărcarea probei, se stabilește un
gradient de pH. (A) Se încarcă proba și se aplică pe gel. Proteinele vor migra în
funcție de pH-ul lor izoelectric, localizare la care sarcina lor netă este nulă; (B)
Proteinele formează benzi electroforetice care pot fi excizate sau utilizate în
experimente ulterioare.
Din punct de vedere chimic, amfoliții transportori sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici,
disponibili comercial sub denumiri diferite. Există trei abordări de bază în sinteza amfoliților
transportori:
•abordarea Vesterberg, care implică o reacţie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-şi hexa-
amine) cu acid acrilic;
•procesul de sinteză chimică propus de Soderberg și colab. care implică co-polimerizarea de
amine, aminoacizii şi dipeptide cu epiclorhidrină;
•abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizează etilenimina şi propilendiamina pentru reacţii
ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu şi clormetil fosfonatul de sodiu.
 Focalizarea izoelectrică cu gradienți de pH imobilizați (CA-IEF).

Se realizează cu tampoane, un set de şase acizi slabi şi baze neamfotere, având o

compoziţie chimică generală, CH2=CH-CO-NH-R, unde R reprezintă fie două grupării
carboxil diferite slab acide, cu pK-uri de 3,6 respectiv 4,6, sau patru grupări terţiare
amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, şi 9,3 (disponibile sub denumirea comercială de
Immobiline, figura alăturată).
 STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMIDĂ
PRIN FOCALIZARE IZOELECTRICĂ

Proteinele, ca molecule amfotere, posedă sarcini nete pozitive, negative, sau neutre în
funcţie de pH-ul de mediului în care se află dizolvate. Sarcina per ansamblu a unei proteine
particulare este determinată de resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe
catenele polipeptidice și de grupările protetice. Grupările carboxilice acide (-COOH), din
proteine sunt neionizate în soluţii acide şi disociază în formă anionică (-COO-), la valorile ale
pH-ului mai mari, de mai sus de pH=3,0. Grupările amino (-NH2) şi alți compuși de bază din
proteine, cum ar fi guanidinele, sunt neîncărcate electric la un pH alcalin, dar devin cationi la
un pH mai în jur de 10,0 (de exemplu,-NH3+). pH-ul la care o catenă polipeptidică disociază
este afectat de compoziția totală a proteinei și de proprietățile mediului în care se află
dizolvată. Ca urmare, fiecare grupare individuală ionizabilă dintr-o proteină are un punct
aproape unic de disociere.
Sarcina netă a unei proteine este suma algebrică a tuturor sarcinilor sale, pozitive şi
negative. După cum s-a mai amintit în acest capitol, există un pH specific pentru fiecare
proteină la care sarcina netă care o posedă este egală cu zero. Această valoare este
denumită pH izoelectric (pI) este o proprietate caracteristică fizico-chimică specifică fiecărei
proteine. În cazul în care numărul de grupări acide dintr-o proteină depăşeşte numărul de
grupări bazice, pI-ul proteinei va avea o valoare scăzută a pH-ului. Pe de altă parte, în cazul
în care numărul grupărilor bazice sunt mai numeroase decât cele acide, pl-ul va fi înalt.
Proteinele arată variaţii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pl-urilor se
încadrează de obicei, în intervalul de pH cuprins între 3 și 10.
În general, IEF se efectuează în condiţii nedenaturante, fiind o tehnică de înaltă
rezoluţie. Deseori, rezoluţia a două proteine diferite se realizează la valori ale
pI-ului lor de doar 0,02 unităţi de pH, sau mai puţin. Din cauza acestei înaltei
rezoluţii, probe de proteine care par a fi omogene atunci când sunt testate prin
alte mijloace poate fi adesea separate în mai multe componente prin IEF. Astfel,
microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferenţe în structura primară,
existența unor izomeri conformaționali, a unor diferenţele de tipuri şi de număr
de grupări prostetice, sau de denaturare a proteinei.
În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în studiu și în funcție de
scopul urmărit, trebuie avut în vedere:
- compoziția chimică, concentrația și structura gelului (de poliacrilamidă ori
agaroză);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condițiile de separare (IEF, CA-IEF).
 REZOLUȚIA DE SEPARARE ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ

Conform teoriei focalizării izoelectrice şi rezultatelor experimentale, diferenţa

de pI (ΔpI) între două benzi de proteine adiacente rezolvate prin această tehnică
este direct proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de pH şi invers
proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de tensiune (intensitatea
câmpului electric aplicat) conform relației:

ΔpI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2

Astfel, în focalizarea izoelectrică, un domeniu îngust de pH şi o tensiune înaltă, aplicată, conduce

la o rezoluţie înaltă (un ΔpI mic). În plus faţă de aceşti doi factori, o rezoluţie bună este favorizată
de substanţe cu coeficienţi de difuzie scăzuți. De asemenea, vitezele ridicate de schimbare a
mobilităţii, cu un pH apropiat de punctele lor izoelectrice conduc la o rezoluție înaltă. Cele mai
multe dintre proteine îndeplinesc ultimele două criterii, dar aceşti factori nu sunt, desigur, sub
controlul experimentatorului. Schimbarea distanței dintre electrozi pentru o tensiune dată şi
alegerea unui domeniu de pH, va schimba în aceeaşi măsură atât pH-ul cât şi gradienţii de
tensiune, astfel încât, cu excepţia cazului în care intervalul amfoliților transportori sau tensiunea
electrică aplicată sunt de asemenea, modificați nu au drept consecinţă o modificare în rezoluţie.
APARATURA UTILIZATĂ ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ
SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALĂ PE GEL DE
POLIACRILAMIDĂ
Prima dimensiune a 2D PAGE implică separarea proteinelor prin focalizare izoelectrică care se realizează pe geluri
cilindrice (T=3-5%), turnate în tuburi de sticlă capilare (cu diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. În mod
uzual, gelurile conţin uree 8 M şi un detergent neionic sau zwitterionic. Detergentul inclus are de obicei o
concentrație de 2% (masă/volum), aceasta putând fi adesea redusă până la 0,5% fără a afecta modul de separare.
Gelurile conțin de asemenea amfoliți sintetici transportori care generează gradientul de pH-ul necesar procesului de
separare într-o concentrație de 2% (masă/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfoliți
sintetici, majoritatea acestora fiind potriviți în 2D PAGE.
Adesea este folosită o gamă amplă de amfoliți (pH 3-10), cu toate că, un amestec de amfoliți dintr-un domeniu de
pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente după cum în gelurile cilindrice utilizate în IEF, gradientul final
de pH rareori se poate extinde peste 7,5.
A doua dimensiune poate fi realizată fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale. Pentru set-up-urile orizontale,
de laborator se pot utiliza geluri gata de utilizare ori geluri de poliacrilamidă cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm
așezate pe un film GelBond PAG) care sunt plasate pe placa de separare cu sistem de răcire a unităţii de electroforeză
orizontală.
Gelurile de poliacrilamidă supuse anterior separării prin focalizare izoelectrică echilibrate, sunt plasate de-a lungul
gelului care va fi utilizat în a doua dimensiune. Scopul echilibrării gelurilor separate în primă dimensiune prin
focusare izoelectrică este cel de a pregăti proteinele focalizate pentru transferul lor în a doua dimensiune a gelului de
SDS-PAGE. Această operațiune implică incubarea timp de aproximativ 30 minute a gelului folosit la focusare într-o
soluție tamponată care conține SDS, uree și glicerol. Această operațiune este necesară deoarece proteinele care au
fost inițial separate pe baza sarcinii lor electrice intrinsece trebuie să fie echilibrate cu un detergent anionic care oferă
sarcina electrică obligatorii separării în cea de a doua dimensiune (proteinele focalizate la valorile lor de pI sunt
neîncărcate electric) și pentru a asigura ca masa polipeptidică reprezintă caracteristica primară a separării în cea de a
doua dimensiune. Surfactantul anionic SDS este ales în acest scop. SDS formează complexe cu proteinele într-un
raport de aproximativ 1,4 g SDS/g proteină, care supra-acoperă sarcina intrinsecă a proteinei, acordând o sarcină
electrică net negativă complexelor SDS-proteină și dând astfel polipeptidelor aproximativ aceeași formă
hidrodinamică .
 Echilibrarea gelurilor supuse focalizării
izoelectrice în detergent (SDS)

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare
izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate
cu SDS în sistem orizontal

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare
izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate
cu SDS în sistem orizontal
 IZOTACOFOREZA

Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, după cum a fost denumită la un moment dat, este o
dezvoltare mai recentă a principiului descris în 1920, fiind o metodă de separare în funcție de
sarcina electrică. Ea se utilizează pentru separarea particulelor care se deosebesc în special prin
încărcătura electric netă și nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale fracțiunilor din
probă, după ce separarea este completă, când s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde și
denumirea acestei metode. În această tehnică electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o singură
soluție uniformă, ci este formată dintr-o secvență discontinuă de soluții diferite (figura de mai
jos), în care ionii acestora migrează cu aceeași viteză (iso = egal, tachos = viteză, phoresis =
migrare).
Izotacoforeza este similară ”stivuirii”, concentrării în faza staționară sau
electroforezei zonale în sisteme multifazice. În practică, totuși se face distincție
între aceste metode. Concentrarea în faza staționară se realizează în două moduri:
•Concentrarea selectivă (selective stacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt incluse în fronul mobil, iar celelalte componente rămân în afara
acestuia (unstacked). Este de altfel cazul izotacoforezei;
•Excluderea selectivă (selective unstacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt
incluse în acesta.
 Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

Deoarece toți ionii sunt forțați să migreze cu aceeași viteză, tăria

câmpului electric este mai mare în aria ionilor cu mobilitate mai mică
și este mai redusă în domeniul ionilor mai mobili. În timpul acestei
migrații se formează zone pure alăturate ale probei alcătuite din
analiți individuali. La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate
migrează în front, ceilalți migrând în spatele lui în ordinea scăderii
mobilității:
mL->mA->mB->mT-

unde m reprezintă mobilitatea, L-, simbolizează ionul frontal, T-, ionul

terminal, A- și B- fiind ioni din cadrul probei. Zona cu cea mai mare
mobilitate posedă cea mai mică tărie a câmpului electric, iar zona cu
cea mai mică mobilitate prezintă cea mai înaltă tărie ionică a
câmpului. Produsul tăriei ionice și a mobilității fiecărei zone este
astfel constant
 ELECTROFOREZA DE AFINITATE
Electroforeza de afinitate, în sens larg, include toate metodele utilizate în biochimie și
biotehnologie în care un anumit tip de interacțiune specifică are loc între un component
din proba supusă electroforezei și un alt component prezent în constituția mediului
suport, denumit ligand specific. Cu ceste metode, unele înrudite cu imunoelectroforeza,
altele, cu cromatografia de afinitate, se detectează componentele dintr-o probă care
prezintă afinitate pentru un ligand, se determină omogenitatea sau heterogenitatea
legării componentului/componentelor de ligand, modificările induse de diverse
tratamente și uneori cantitatea de component/componente care leagă specific ligandul,
sau se elfectuează studii cantitative privind formarea complexelor component-ligand (în
speță, proteină-ligand).
Ligandul poate fi liber sau imobilizat în mediul suport. Dacă masa sa moleculară este
foarte mică în raport cu masa moleculară a proteinelor țintă, modificările electroforetice
vor fi relativ mici sau chiar neglijabile, în special dacă și sarcina ligandului este mică
sau zero (de exemplu substratele cu masă moleculară mică și inhibitorii enzimatici).
Efectele asupra mobilității electroforetice vor fi mai evidente dacă ligandul și proteinele
țintă sunt cu mase moleculare relativ apropiate, sau dacă ligandul are fie o sarcină
electrică mare, fie o structură ramificată, care să permită interacțiunea simultană cu mai
multe molecule țintă de proteine. În aceste cazuri interacțiunea se va concretiza printr-o
scădere sau creștere semnificativă a mobilității electroforetice a proteinelor sau prin
apariția unui precipitat.
Toate aceste posibilități stau la baza diferitelor metode aparținând de
electroforeza de afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :
•Imunoelectroforeza încrucișată;
•Imunoelectroforeza tip rachetă;
•Imunoelectroforeza zonală;
•Electroforeza încrucișată;
•Imunoafinoelectroforeza încrucișată;
•Afinoelectroforeza bidimensională;
•Afinoforeza;
•Electroforeza de afinitate propriu-zisă (care este asemănătoare ca
principiu cromatografiei de afinitate).
 Imunoelectroforeza încrucișată. Tehnica a fost pusă la punct de către Bog-Hansen, în
perioada 1973-1980 și este utilizată la separarea, identificarea și caracterizarea
glicoproteinelor cu ajutorul lectinelor și a anticorpilor specifici.
Metoda are aplicabilitate în cercetare (de exemplu la studiul interacțiilor anticorpilor
monoclonali) ori în clinică (în laboratorul de diagnostic al maladiilor în care sunt implicate
glicoproteine anormale).
Afinoelectroforeza bidimensională. Tehnica are la bază același principiu ca și
imunoelectroforeza încrucișată, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se găsesc
într-o membrană de nitroceluloză. Metoda se caracterizează printr-o rezoluție foarte bună și
este o metodă de perspectivă.
Afinoforeza. A fost pusă la punct de către Shimura și Kasai. Tehnica are la bază
interacțiunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcină electrică mare (afinofor) și o
proteină. Complexul proteină-afinofor se remarcă printr-o mobilitate electroforetică
substanțial mai mare decât al proteinei libere.
Electroforeza de afinitate propriu-zisă. Este analogă cromatografiei de afinitate. În această
tehnică, ligandul este imobilizat într-un gel astfel că proteina țintă, în cursul electroforezei,
este împiedicată și astfel întârziată datorită interacțiunii specifice.
Se poate remarca faptul că nu există o delimitare netă între variantele asemănătoare
imunoelectroforezei și variantele asemănătoare cromatografiei de afinitate, deoarece
imobilizarea ligandului, în cazul variantelor cromatografice nu este necesar să fie completă,
mai ales pentru liganzii mari.
 ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Electroforeza capilară (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnică la

sfârşitul anilor 1980 şi a crescut constant în popularitate de atunci. În forma sa cea
mai simplă şi mai frecvent utilizată, CE reprezintă o întoarcere la metoda originală
descrisă de Tiselius, dar popularitatea sa nu se bazează numai pe această
simplitate inerentă, ci și cu privire la avantajele suplimentare date de viteză,
versatilitate și costuri reduse. Fiind în esenţă o metodă analitică, ea și-a găsit
aplicabilitatea în separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine,
oligonucleotide, ioni de metale și ioni anorganici, precum şi în analiza de
produse farmaceutice ori în monitorizarea calităţii apei. Deşi metodologia de
bază presupune separarea moleculelor pe baza raportului sarcină electrică/masă
moleculară, există simple modificări la procedură, împrumutate de la tehnicile
existente, bine stabilite, care permit separări pe baza dimensiunii sau a punctului
izoelectric, sau care să permită separarea unor molecule fără sarcină electrică, în
timp ce gradul de rezoluţie poate să conducă la separări de izomeri optici.
 Aparatura

După cum sugerează şi numele, trăsătura distinctivă a acestei metode o

reprezintă separările efectuate într-un tub capilar (figura de mai jos), a
cărei secțiune transversală (de obicei de 50 µm), are ca scop controlul uşor
a temperaturii. Lungimea capilarei diferă în fincție de aplicaţii diferite, dar
este în mod normal în domeniul de 20-50 cm. Capilarul este umplut cu un
tampon de migrare iar proba este introdusă prin injectare la un capăt al
coloanei, după care se aplică un câmp electric (injecţie electro-cinetică)
ori se aplicare o presiune de gaz (injecţie de presiune). Migrarea prin
capilar este realizată, în mod direct sau indirect, prin aplicarea unui câmp
electric, iar analiţii sunt detectați în momentul în care se deplasează prin
dreptul unei ferestre situate în capătul opus al capilarului.
Schemă de principiu a unui aparat de electroforeză capilară. Sunt
prezentate părțile principale ale instalației. Liniile continue indică
condițiile de separare, în timp ce liniile discontinue indică condițiile de
injecție electrocinetice.
METODE DE DETECȚIE A PROTEINELOR DUPĂ ELECTROFOREZĂ BIDIMENSIONALĂ
PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ
Căutarea unor metode de a vizualiza proteinele rezolvate prin electroforeza pe
oricare suport, de la benzi de acetat de celuloză la geluri de poliacrilamidă
datează de la originile electroforezei în sine. Odată cu introducerea disc-
electroforezei, la începutul anilor 1960, cea mai frecvent utilizată colorație a
proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de metode de colorare cu
sensibilitate înaltă şi colorare uniformă a crescut pentru a satisface cerinţele de
cuantificare proteine în geluri, colorația cu amido negru a devenit improprie.
Colorantul amido black nu are sensibilitate necesară, calitatea variază de la lot
la lot iar de multe ori proteinele se colorează multicromatic

pentru vizualizarea proteinelor separate prin electroforeza pe benzi de acetat de

celuloză, Fazekas St Groth și colaboratorii (1963) au testat sistematic un numar mare de
tehnici standard de colorare utilizate în industria textilă convenabili ca potențiali coloranți
ai proteinelor după electroforeză. În 1963 ei au introdus în practica electroforetică un
colorant acid, Coomassie Brilliant Blue 250, tradițional utilizat pentru colorarea lânei,
colorant convenabil din punct de vedere al gradului crescut de sensibilitate, a marii
intensități a culorii și a absorbanței peakului. În anul 1965, Meyer şi Lambert au aplicat
cu succes metoda de colorare cu Coomassie Blue descrisă de St. Groth la detectarea
unor proteine din salivă, separate prin electroforeza pe benzi de gel din acrilamidă.
Succesul experimentului de colorare i-a condus pe cercetători în a conchide că
"Commasie Brillant Blue și-ar putea găsi o aplicare în cadrul investigațiilor altor fluide
biologice prin electroforeză în gel de poliacrilamidă".
Coomassie Brilliant Blue, un colorant anionic trifenilmetanic este utilizat în două forme:
Coomassie R-250 (de culoare roșie) și Coomassie G-250 (de culoare verde), ultimul
având două grupări metil adiționale

În prezența unui mediu acid, acești coloranți se leagă de grupările amino a

proteinelor prin interacții electrostatice și hidrofobe. În protocoalele originale
gelurile sunt plasate pentru o perioadă de timp într-o soluție de colorare de 0,1%
colorant Coomassie dizolvat într-un amestec de metanol, 45% (v/v), apă, 45%
(v/v) și acid acetic 10%; background-ul se decolorează într-un amestec alcătuit din
metanol, 25% (v/v), apă, 65% (v/v) și acid acetic 10%.
 ALȚI COLORANȚI ORGANICI UTILIZAȚI ÎN EVIDENȚIEREA
POSTELECTROFORETICĂ

Fast Green FCF (food green 3), ușor de

utilizat în densitometria cantitativă.

colorarea proteinelor în geluri de

SDS-PAGE comparabilă ca
sensibilitate cu colorația CBB:
utilizarea acidului 1-(2-hidroxi-4-
sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxi-3-
naftoic (acidul calconcarboxilic,
NN).
 COLORAȚIA CU CUPRU

Colorația reversibilă cu cupru este o metodă realizată într-o singură etapă pentru
detectarea rapidă a proteinelor fracţionate prin SDS-PAGE. În această tehnică nu
este necesară o etapă de decolorare. Colorarea se bazează pe interacţiunea ionilor
de cupru cu poliacrilamida şi cu proteinele separate. Tehnica de colorare implică
precipitarea ionului de cupru în gel care astfel devine verde opac, în timp ce SDS
previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultând astfel o imagine negativă. În
final se evidențiază benzi clare de proteine pe un fundal semiopac albastru-verzui de
poliacrilamidă. Benzile proteice sunt vizualizate în mai putin de 5 minute.
Sensibilitatea colorației reversibile este cuprinsă între 0,5ng și 12ng/bandă proteică.
Colorarea nu interferă cu tehnicile ulterioare de electroeluție a proteinelor și nu
modifică proprietăţile biologice ale acestora. Gelurile colorate reversibil cu ioni de
cupru pot fi decolorate în 20-25 de minute, înainte de transferul sau electroeluția
proteinelor din gel. Un dezavantaj major totuși, este că această colorațioe nu este
compatibilă cu gelurile native

În cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng proteină/bandă, fracțiile proteice fiind
vizibile după o separare pe un gel de poliacrilamidă cu T=12%. În cazul gelurilor cu o concentraţie
mai mică de 12% sensibilitatea scade din cauza creșterii dimensiunilor porilor, cu consecință în
creșterea procesului de difuziune a benzilor de proteine.
 COLORAȚIA NEGATIVĂ IMIDAZOL-SDS-ZINC

Un complex al sării de zinc, al SDS și imidazolului precipită în gelul de

poliacrilamidă și formează un background alb opac, dar care rămâne
solubil în prezența spotului proteic. Zonele proteice devin vizibile ca un
background închis la culoare. Sensibilitatea detecției (care este de ordinul
a câtorva nanograme) este cuprinsă între cea a CBB și colorația cu argint.

Evidențierea fosvitinei după colorare reversibilă

cu imidazol-zinc
 COLORAȚIA CU ARGINT

Detecția proteinelor prin colorație cu argint este larg utilizată deoarece

sensibilitatea ei este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi
sunt relativ scăzute, și-deși presupune o procedură multistadială-rezultatele
sunt disponibile relativ repede. Ideal spoturile sunt brun-închise spre negru pe
un background ușor bej.

Principiul protocolului de colorare cu azotat de argint este următorul: în prima etapă

proteinele sunt fixate; SDS-ul și componentele tamponului sunt îndepărtate prin
spălare cu o soluție de etanol, 40% și acid acetic, 10%. Următoarea treaptă combină
legarea încrucișată a proteinelor din matricea de gel cu ajutorul glutardialdehidei și de
sensibilizare cu tiosulfat de sodiu în prezență de acetat de sodiu. După un număr de
spălări cu apă distilată la intervale exacte de timp, gelul se plasează într-o soluție
care conține azotat de argint 0,25% și o cantitate mică de formaldehidă. Dezvoltarea
se realizează cu formaldehidă la o valoare bazică de pH, care se realizează cu
ajutorul carbonatului de sodiu. Reacția este stopată prin plasarea gelului într-o soluție
de acid acetic, 5% ori într-o soluție de EDTA 1,5%.
Coloratia argentica (silver staining)
• De 100 X mai sensibila decat coloratia cu
coloranti organici
• Metoda simpla, ieftina
– Reducerea fotochimica
– Argint amoniacal
• Metoda ce adimite supracolorarea gelurilor
colorate initial cu CBB
 Fosfoproteinele
• Colorare in rosu a proteinelor sub actiunea bromurii de
1 etil 2,3 –(1 eilnafto-(1,2d) tiazolin-2-iliden)2-metil-
propenil-nafto-(1,2d)-tiazol denumit colorant total
• Fosfoproteinele se coloreaza in albastru

Lipoproteinele
Precolorare cu Sudan Black

Glicoproteinele
Colorare cu sulfit de fucsina (reactiv Shiff) in conditii oxidante realizate cu
acid periodic;
Colorare argentica
Colorare cu Alcian blue (glicoproteinele acide)
Colorare cu izocianat de fluoresceina (FTIC)- lectinebenzi fluorescente
 COLORAȚIA FLUORESCENTĂ

Coloranții fluorescenți prezintă un mare domeniu de linearitate

dinamică, de peste 4 ori magnitudine față de colorațiile clasice, cu
rezultate înalt reproductibile deoarece colorația fluorescentă este o
metodă de tip endpoint. De la introducerea colorării cu Nile Red în
ultimii ani, au fost dezvoltați o varietate de coloranți cu diverse și
marcante sensibilități și proprietăți, precum familia coloranților
Sypro® (Orange, Red, Tangerine și Ruby)

Structura chimică a colorantului hidrofob

Nile red.
PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI
Electrotrensferul proteinelor pe
membrana (western blotting)-
evidentierea specifica
Hârtia diazobenziloximetilată s

ce lulozã
O
+
CH2 N N]
Nitrocellulose
PVDF (polyvinylidene difluoride)
Tipuri de membrane utilizate în
transferul de proteine
Protein transfer systems
• Proteins migrate to the membrane
following a current (I) that is generated by
applying a voltage (V) across the
electrodes, following Ohm‟s law:
• V=IxR
• where R is the resistance generated by
the materials placed between the
electrodes (that is, the transfer buffer, gel,
membrane, and filter papers)
 METODE DE DETECŢIE A PROTEINELOR PE MEMBRANĂ DUPĂ TRANSFER
ELECTROFORETIC

Transferul proteinelor pe membrană (denumit western blotting) reprezintă o tehnică de rutină,

deosebit de utilizată în detectarea şi caracterizarea proteinelor. Metoda prezintă avantajul
specificităţii anticorpilor care conduc la identificarea fără dubii a proteinelor după separarea lor
prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă şi transferate pe o membrană. Western blotting-ul
implică recunoaşterea secvenţială dintre trei componente: proteina ţintă, anticorpul primar
care recunoaște proteina ţintă şi un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar şi
generează un semnal detectabil. După legarea proteinelor la o membrană, situsurile nelegate
sunt inactivate (membrana este blocată), incubată cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp
secundar şi în final, spălată. Anticorpul primar se leagă la proteina de interes în timp ce anticorpul
secundar este pregătit pentru detecţie.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzimă, în marea
majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalină (AP)
O lungă perioadă de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de
anticorpi secundari şi astfel utilizaţi în aplicaţiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au
dezvăluit noi metode mai puţim periculoase şi mai fezabile decât cele radioactive, care conduc la
rezultate comparabile în ceea ce priveşte sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecţie după
transfer pe membrană includ metode bazate pe detecţia emisiei de lumină (chemiluminiscenţă,
bioluminescenţă, chemifluorescenţă şi fluorescenţă), detecţie prin autoradiografie, ori
colorimetrie.
 Detecţia prin chemoluminiscenţă
Chemiluminescenţa reprezintă producerea unei cuante de
lumină detectabilă rezultată în urma unei reacţii chimice. În
detecţia pe membrane de transfer, reacţiile sunt catalizate de
către o enzimă precum fosfataza alcalină ori peroxidaza
conjugată cu un anticorp. Semnalul luminos poate fi
capturat prim impresionarea unui film de tipul celor
utilizate la captura radiaţiilor X sau de către sisteme video
de captare a imaginilor. Beneficiile detectării semnalelor
chemiluminescente de către un sistem de preluare a
imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul de linearitate
dinamică a sistemelor video este de 2 până la 5 ori
magnitudine mai sensibile comparativ cu sistemele de
impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video
digitale de preluare a imaginii oferă pe lângă o sensibilitate
crescută şi o economicitate în sensul eliminării
achiziţionării continue de film ori consumabile de
prelucrare al acestuia. Tehnica chemiluminescentă este uşor
de adaptat la procedurile de western blotting existente
deoarece utilizează anticorpi conjugaţi cu enzimă, pentru a
genera semnalul luminos. Treptele de blocare şi spălare sunt
comune celor utilizate în în tehnicile de western blotting.
Cele mai multe metode chemiluminescente necesită puţine
componente necesare în generarea semnalului luminos. În
cazul chemiluminescenţei luminolului, substratul este
oxidat chimic de către HRP cu producţia unui compus aflat
în stare excitată.
În cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul luminos se produce în
momentul în care produsul excitat se întoarce la starea sa de bază. Semnalul este vizualizat prin
expunerea membranei pe un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziţie a imaginii. Pe
lângă luminol sunt, disponibile comercial şi alte substrate chemiluminescent precum substratele
bazate pe acridan (este cazul Lumigen PS-3 (care utilizează AP sau HRP ca enzimă reporter) ori
substraturi pe bază de 1-2-dioxetan (care utilizează AP ca enzimă reporter) Emisia de lumină
poate fi crescută de până la 1000 de ori prin adăugarea unor amplificatori cu structură fenolică.
Amplificatorul diferă de tipul de kit utilizat. Detecţia chemiluminescentă prezintă ca avantaje,
viteza şi sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde până la 15 minute. Timpul scurt
este principala îmbunătăţire faţă de metoda bazată pe detecţia cu 125I, care necesită până la 48 de
ore de expunere pe film foto. Prin această metodă se pot detecta cantităţi de ordinul picogramelor
de proteină mai sensibile decât majoritatea metodelor colorimetrice şi sunt aproximativ egale cu
cele radioizotopice. Este important a se nota că sensibilitatea detecţiei este oarecun dependentă de
afinitatea antigenului şi a anticorpilor primar şi secundar care poate varia considerabil de la o
probă proteică la alta. Detecţia chemiluminescentă nu prezintă în plus dezavantajul celei
radioizotopice în ceea ce prezintă riscul de expunere la iradiere, costul crescut în ceeea ce
priveşte măsurile de protecţie faţă de reziduurile radioactive în ceea ce priveşte contaminarea
mediului. Nu în ultimul rând, membranele utilizate în cazul metodelor chemiluminescente pot fi
utilizate de mai multe ori prin spălare şi rebandarea proteinelor, proces care nu este posibil în
cazul tehnicilor de detecţie colorimetrice.
 Detecţia prin bioluminescenţă

Bioluminescenţa este un fenomen de emisie de lumină de către multe organisme. Sistemele

bioluminescente diferă în structura şi funcţia enzimelor şi cofactorilor implicaţi în proces
alături de mecanismul reacţiilor de generare a luminii. Bioluminescenţa poate fi exploatată ca
metodă de detecţie pe membrane. Detecţia prin bioluminescenţă implică incubarea membranei
care conţine un antigen legat/complex anticorp-enzimă în prezenţa unui substrat
bioluminogenic, cu măsurarea simultană a luminii emise. Substratul în acest sistem de detecţie
este un derivat al luciferinei. Detecţia luminii este realizată într-o cameră fotoevidenţiere iar
proteinele sunt vizualizate ca spoturi luminoase. Din punct de vedere al sensibilităţii şi a
vitezei de realizare, tehnica este similară celei de chemiluminescenţă dar nu este generalizată
datorită numărului mic de substrate bioluminogenice comercializate. Membrana PVDF este
preferabilă în detecţia bioluminescentă deoarece membrana de nitroceluloză poate conţine
substanţe ce inhibă activitatea luciferazică şi astfel sunt posibile interferenţe în analiză.
 Detecţia chemifluorescentă

Chemifluorescenţa reprezintă a conversie enzimatică a unui substrat

într-un produs fluorescent. Compuşii fluorogenici (substanţe
nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite în produşi
fluorescenţi) sunt utilizaţi cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu
AP ori HRP. Enzima clivează o grupare fosfat a unui substrat
fluorogenic cu producerea unui compus înalt fluorescent. Fluorescenţa
poate fi detectată prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii
astfel, cuantificată de către un program. Chemifluorescenţa poate
conduce la produşi de reacţie fluorescenţi stabili, astfel membranele pot
fi analizate în condiţiiile de timp convenabile. Metoda este compatibilă
pentru recolorări şi spălări.
 Detecţia prin fluorescență

În cazul detecţiei fluorescente, anticorpul secundar este marcat cu un fluorofor

precum fluoresceină (FITC), Texas Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin.
Principalul avantaj în detecţia fluorescenţei este faptul că domeniul dinamic linear
este de circa 10 ori mai mare decât în detecţia prin chemiluminescenţă cu o
reducere a sensibilităţii de numai 2–4 ori. Detecţia fluorescentă a proteinelor
legate de membrane poate conduce uneori la o mai bună linearitate şi la
cuantificări mai bune în limitele de detecţie. Detecţia fluorescentă poate fi
deasemenea multiplex. Legarea mai multor fluorofori coloraţi la diverşi antigeni
conduce la detecţia simultană a mai multor proteine ţintă pe aceeaşi membrană.
 Autoradiografia

Pentru multe aplicaţii radioizotopii pot fi utilizaţi pentru a marca probele

(în cazul membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul
secundar) Radioizotopii cei mai utilizaţi în ştiinţele biologice sunt 35S,
32P, 33P, 14C, şi 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda cea mai

utilizată este autoradiografia pe filme de radiaţii X. Autoradiografia

conduce la o relaţie bună între sensibilitate şi rezoluţie fără o investiţie
mare. Pentru intensificarea semnalului autoradiografic se utilizează
scintilatori. Există sisteme de analiză a fosforului care oferă o alternativă
la metodele de detecţie pe film. Marele avantaj al metodei constă într-o
relaţie lineară între intensitatea semnalului şi cantitatea de proteină.
 Detecţia colorimetrică

O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de către o

serie de enzime precum HRP ori AP, enzime uzual conjugate la
anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizează substraturi
precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu
(BCIP/NBT) pentru AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1-
naftol (4CN) pentru HRP. În momentul acumulării de precipitat pe
bandă, se dezvoltă un semnal colorat pe membrană. Reacţia enzimatică
poate fi monitorizată şi stopată în condiţiile în care semnalul are o
intensitate dorită pentru a preveni zgomotele de fond. Metoda este cea
mai simplă dintre toate tehnicile de evidenţiere, semnalul detectabil fiind
rodul legării anticorpului secundar la un anticorp specific proteinei de
interes
 Metode de detecţie a proteinelor
după transferul pe membrană
Comparaţie între metodele de detecţie a proteinelor după transfer pe membrană
 DETECTAREA ENZIMELOR ÎN GELURI
Detectarea activităţilor enzimatice după electroforeză în gel şi stabilirea exactă a benzilor
individuale proteice produse astfel datorită activităţii catalitice specifice rămâne o ţintă
fascinantă. Acest lucru a fost bine evidenţiat de numărul mare de studii focusate în acest scop. Cu
o vedere spre trecut este interesant de observat legăturile intime dintre metodele de evidenţiere
postelectroforetice de cele histochimice din care, majoritatea metodelor de evidenţiere au
provenit. În acelaşi timp, noi enzime continuă să fie descoperite, de unde noi probleme în
evidenţierea lor postelectroforetică.
Singurele probleme sunt întâmpinate din cauza faptului că activitatea enzimatică trebuie
demonstrată după rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care îşi menţin activitatea
nativă în timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea
poate fi realizată în condiţii denaturante de exemplu în prezenţa dodecilsulfat de sodiu (SDS),
urmată de renaturarea în scopul recuperării activităţii enzimatice maxime. În orice instanţă,
activitatea poate fi determinată direct pe gel ori după transfer pe un suport potrivit. Alegerea
tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietăţile individuale ale enzimelor, de alţi
componenţi ale probei ori de rezoluţia maximă atinsă în condiţii native deoarece proteinele native
nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate.
Astăzi, detecţia activităţilor enzimatice sunt în mod uzual realizate pe geluri plate verticale, mai
mult decât pe geluri cilindrice. Compararea proprietăţilor de migrare este mai uşor realizată şi
este de preferat în condiţii identice, faţă de cele realizate în condiţiile gelurilor cilindrice. Pe de
altă parte, acoperirea cu tampon-substrat care conţine enzime auxiliare, substrat, coenzime, ori
alţi cofactori necesari poate fi produsă maxim numai în cazul gelurilor plate, factori de asemenea
importanţi în detectarea activităţii. Alternativ, transferul pe alte membrane poate reprezenta o altă
alternativă în evidenţierea postelectroforetică a activităţilor enzimatice.
Separarea electroforetică a protein-enzimelor poate fi însoţită de două trăsături diferite.
Este vorba de sarcina intrinsecă a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza în procesul de
migrare electroforetică, sau de sarcina extrinsecă, care poate fi indusă.
Separarea pe baza sarcinii intrinseci, în electroliţi cu o singură valoare a pH-ului ori
prin focusare izoelectrică reprezintă alegeri atractive din cauza faptului că astfel se menţine
proteina în starea ei nativă, cu păstrarea activităţii, ce poate în acest mod determinată direct.
Electrofocusarea este în particular utilizată deoarece prin ea se rezolvă izoforme apropiate.
Separarea bazată pe sarcinile extrinseci are la bază denaturarea şi legarea SDS la
situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta, treapta de maturare este necesară după
electroforeză.
Electroforeza în prezenţă de SDS reprezintă una dintre cele mai comune forme de electroforeză
în gel. Ea se bazează pe separarea în funcţie de mărimea proteinei la care domeniile hidrofobe
ale fiecărei molecule proteice interacţionează cu catena alifatică a SDS, care sunt repartizate ca
sarcini extrinseci pe întreaga suprafaţă a proteinei. Din nefericire, cele mai multe enzime sunt
inactivate de către SDS, numai un număr restrâns reţinând activitatea chiar în prezenţa
detergentului.
 PREPARAREA PROBEI ŞI ELECTROFOREZA EI

Înaintea oricărei separări şi localizări este necesar a cunoaşte proprietăţile enzimei luate în studiu,
precum pH-ul optim, necesităţile în cofactori, inclusiv a cationilor şi a cosubstratelor. Detergenţii,
agenţii de oxidare sau alţi factori detrimentali care pot influenţa activitatea enzimatică precum
pH-ul şi mediul ionic trebuie monitorizaţi cu stricteţe, atât în timpul preparării probei cât şi în
timpul procesului electroforetic. Ieste bine de notat că prezenţa coloranţilor de evidenţiere a
migrării pot ei însuşi să denatureze ireversibil o serie de enzime. Înaintea electroforezei este
esenţial a se determina concentraţia proteică şi a se efectua un test convenabil al activităţii
enzimatice. O cantitate de 1 până la 10 g de proteină pură reprezintă optimul în timp ce
amestecurile de proteine pot conţine până la 100 g. Este important a alege o cantitate optimă de
soluţie proteică care să prezinte o activitate bine-decelată în urma procesului de evidenţiere
postelectroforetică, o cantitate prea mică făcând dificilă identificarea enzimei în timp ce o
încărcare mare va conduce la suprapunerea benzilor şi la o distorsiune a lor. Electrofocusarea este
pe departe mult mai sensibilă la supraîncărcare, după cum proteina va distorsiona în gradientul de
pH.
În condiţiile în care toate informaţiile pertinente sunt obţinute, este necesar un
experiment pilot în determinarea activităţii enzimatice. În acest scop, este preparat un
gel care conţine toate componentele necesare în timpul procesului de separare
electroforetică. Proba este plasată într-un godeu şi lăsată să difuzeze în matricea
gelului, fără migrare electroforetică. Metoda de detecţie este astfel testată fără separare
electroforetică, în scopul stabilirii prezenţei sau absenţei agenţilor denaturanţi ori a
inhibitorilor în gel. Dacă testele preliminarii relevă o inactivare a enzimei, trebuie
aleasă şi testată o altă strategie de evidenţiere în scopul menţinerii activităţii
enzimatice în timpul procesului electroforetic.
Cele mai comune şi nedorite componente inhibitorii ale gelului de poliacrilamidă sunt
iniţiatorii reacţiei de polimerizare, persulfatul şi riboflavina, monomerul de acrilamidă
nepolimerizat şi acidul acrilic, deseori prezent în amestecul de polimerizare. Există o
serie de căi în limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-electroforeza
gelului de separare, singur, înaintea polimerizării gelului de concentrare va elimina
iniţiatorii reacţiei de polimerizare care au capacitatea de a oxida grupările tiol deseori
implicate în actul catalitic. O altă tehnică este aceea de a adăuga acid cisteic la
tamponul de migrare, care va "curăţa" gelul de peroxizi datorită faptului că acest acid
va migra alături de ionul lider, conducător. Alternativ, gelurile subţiri (de 1 mm sau
mai mici) pot fi imersate şi umectate într-un tampon care conţine ditiotreitol în scopul
îndepărtării oxidanţilor. Eliminarea acidului acrilic poate fi realizată prin
recristalizarea monomerului de acrilamidă chiar înaintea polimerizării.
 PRINCIPIILE LOCALIZĂRII “IN SITU”A
ENZIMELOR
– Captura simultană a produsului reacţiei enzimatice. Produsul reacţiei este cuplat cu un
reactiv care conduce la obţinerea unui produs colorat. Această tehnică este utilizată în toate
cazurile în care enzima rămâne activă în prezenţa reactivilor de colorare. Marele ei avantaj este
reprezentat de faptul că procedura este realizată într-o singură treaptă, fără o difuzie
substanţială a enzimei în gel.
– Postincubarea cuplată a substratului. Această tehnică necesită o metodologie în două trepte.
Incubarea enzimei prezente în gel cu substratul este urmată de incubarea cu un reactiv ce
permite formarea unui produs secundar colorat şi insolubil. În cazul acesta, difuziunea se
manifestă în timpul perioadei iniţiale de incubare a gelului cu substratul.
– Metode autocromice. Evoluţia activităţii enzimatice poate fi urmărită în mod direct prin
observarea modificărilor proprietăţilor optice precum absorbţia luminii sau fluorescenţa, produsă
de substrat sau de către produsul de reacţie. O serie de substrate sau coenzime îşi modifică
proprietăţile optice în lumină vizibilă sau ultra violetă în timpul reacţiei enzimatice. Schimbarea
fluorescenţei serveşte de asemenea ca indicator în cazul metodelor autocrome.
– Analiza indicator-matrice. Enzimele de cuplare auxiliare şi substratele cu masă moleculară
mare necesită o incubare a gelului cu un strat care conţine o matrice indicatoare, un gel
suplimentar, indicator. Incubarea de tip sandwich a gelului de separare şi indicator conduce la
localizarea activităţii enzimatice. O variantă a acestei tehnici o reprezintă incubarea după
separare cu o matriţă pe care proteina a fost transferată şi imobilizată. Astfel, după separare,
proteina este transferată din gel pe membrană prin tehnicile descrise ca Western blotting.
– Copolimerizarea substratului în gelul de separare. Substraturile cu masă moleculară mare
precum polimerii carbohidraţi, proteinele sau acizii nucleici pot fi copolimerizaţi în gelul de
separare. Acest procedeu poate totuşi influenţa separarea enzimei. În timpul electroforezei,
activitatea enzimatică poate fi stopată prevenindu-se astfel acţiunea ei asupra substratului, de
exemplu prin utilizarea unor inhibitori reversibili precum SDS. După separare, gelul este spălat în
tampon fără detergent, ceea ce conduce la renaturarea sa. O altă cale de prevenire a activării
enzimei în timpul procesului de electroforeză este reprezentată de incubarea cu diverşi agenţi
chelatori care leagă ionii metalici esenţiali. După finalizarea procesului de separare gelul este
incubat în tampon care conţine cationul esenţial într-o concentraţie mai mare decât cea a
agentului chelator, şi prin aceasta se restabileşte activitatea.
 Oxidoreductaze- Detecţia directă a enzimelor
NAD- şi NADP-dependente prin conversia
coloranţilor tetrazolici la formazani
Aplicarea cu succes a acestei metode necesită ca sensul reacţiei enzimatice să
conducă la oxidarea substratului cu reducerea concomitentă a coenzimei
(formarea de NADH ori NADPH) Echivalenţii de reducere sunt apoi transferaţi
spre colorantul tetrazolic, reacţie de cele mai multe ori mediată de fenazin
metosulfat; astfel prin reducerea sării de tetrazoliu rezultă formazan, colorat şi
insolubil. Stoichiometria transferului necesită un echivalent de reducere la o
pereche de electroni transferaţi pentru formarea unui formazan din sărurile
monotetrazolice şi doi echivalenţi pentru sărurile ditetrazolice. Astfel, sărurile
monotetrazolice precum MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliu, tiazolil blue) sunt mult mai sensibile decât sărurile de sărurile
de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-3,3'-
(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, în condiţiile reducerii incomplete,
conduce la un formazan de culoare roşie, în timp ce forma total redusă este
albastră.
 N

N+
CH3OSO3
CH3

Structura fenazin metosulfatului (N-Metilfenazin metilsulfat).

Compusul are rolul de a cupla transferul de electroni dinspre
NAD(P)H spre sărurile de tetrazoliu, făcînd astfel posibilă
urmărirea reducerii NAD(P)+.

Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza

Amestecul de reacţie, 50 ml, este astfel preparat să conţină 25 mg de NAD+, 15 mg de

clorură de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de -
glicerofosfat sare de sodiu, 1 M, pH 7,0 şi 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul,
care conţine enzima, se incubează la 37°C până când apar benzile albastre. Gelul se clăteşte
cu apă, apoi se fixează într-un amestec etanol/acid acetic/glicerol/apă (5:2:1:4).
Este necesar a se utiliza un control pentru a arăta dependenţa culorii de substrat şi nu ca
efect al reducerii datorate luminii ori a oxidării produse de oxigen.
Formulele generale ale sărurilor de mono- (A) şi di-tetrazoliu (B)
 Evidenţierea alcool
dehidrogenazei, EC 1.1.1.1
• un alcool + NAD+ <=>
o aldehidă sau o
cetonă + NADH+H+

• NAD+, 1 mg/ml,
• PMS, 0,02 mg/ml,
• Nitro blue tetrazoliu,
0.2 mg/ml,
• Etanol, 0.1 M
 Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin iluminare UV

Piridin nucleotidele sub formă redusă sunt vizibile direct în lumină UV ca şi

fluorescenţă galbenă în timp ce formele lor oxidate apar ca benzi negre. Faţă de
metodologia descrisă mai sus, această tehnică poate fi aplicată la identificarea
atât a formelor reduse cât şi a formelor oxidate de substrat. O altă însuşire
utilizabilă a metodei constă în capacitatea ca de a detecta benzile “fără
dehidrogenaze”, adică a formării de NADH în absenţa substratului, astfel
eliminându-se coloraţiile fals-pozitive. Un dezavantaj al acestei tehnici este
reprezentat de difuzia continuă a substratului în timpul perioadei de incubare şi
de necesitatea fotografierii în timpul evoluţiei reacţiei.
 Oxidoreductazele piridin nucleotid-independente

Tirozinaza prezentă în celulele mamiferelor , o enzimă care

reţine activitatea chiar şi în prezenţă de SDS, poate fi dată ca
exemplu. Chiar dacă procedeul prezentat include ca treaptă în
de evidenţiere îndepărtarea SDS după separarea
electroforetică, ea nu este neapărat necesară în cazul unei
probe care conţine o activitate foarte activă. Enzima
catalizează oxidarea L-tirozinei la L-Dopa (3,4-dihiroxi
fenilalanină) şi în continuare la dopaquinonă. Dopaquinona se
converteşte spontan în dopacrom, un produs maro-închis. Cum
prima treaptă de oxidare este foarte lentă, metoda descrisă
utilizează Dopa ca substrat
 Transferazele
Reacţiile de transfer ale grupărilor metil, glicozil, ori fosfat de la un donor spre un acceptor sunt
catalizate de către transferaze. Denumirea generică a acestor enzime este de "donor:acceptor grup
transferaze." Sunt unele cazuri unde donorii sunt ATP ori CoA, care conţin grupări (fosfat
respectiv acil) ce pot fi transferate. În mod curent, detecţia transferazelor implică participarea
unor enzime auxiliare. De exemplu, pentru identificarea hexokinazei (ATP:glucozo
fosfotransferaza) enzima este incubată la început cu glucoză, ATP, şi Mg2+ pentru a produce
glucoză-6-fosfat. Formarea glucozo-6-fosfatului este cuplată cu glucozo-6-fosfat dehidrogenaza,
o enzimă NADP-dependentă. Astfel, formarea de NADPH este detectată printr-o metodă descrisă
în cazul oxidoreductazelor precum transferul de echivalenţi dinspre NADPH spre PMS şi în final
spre sarea de tetrazoliu cu producerea unui formazan. Utilizarea enzimelor auxiliare se realizează
în mod curent şi prin tehnica de acoperire a gelului cu o hârtie sau agar, într-o incubare de tip
sandwich. Alternativ, transferul produşilor de electroforeză pe un alt suport precum membranele
de nitroceluloză este urmată de detectarea activităţii enzimatice pe membrane. Trebuie avut însă
în vedere că enzimele auxiliare necesită condiţii specifice care trebuiesc asigurate pentru a avea
activitate catalitică.
L-Alanina + -cetoglutarat piruvat + L-glutamat
L-glutamat + APAD+ -cetoglutarat + APADH + NH3
PMS
APADH + MTT APAD+ + MTT-formazan
APAD-Un analog al NAD, 3-acetilpiridin
adenin dinucleotid

Tehnicile cu gel indicator şi de transfer pe membrane

 Hidrolazele

În general, hidrolazele sunt cele mai stabile enzime dintre toate clasele sus
menţionate. Substraturile cromogene pentru multe dintre ele sunt
disponibile comercial, evoluţia reacţieie putând fi monitorizată direct, în
lumină vizibilă, ori în UV. Substraturile sau produşii care-şi schimbă
proprietăţile fluorescente sunt deasemenea larg utilizaţi datorită tehnicilor
de mare sensibilitate. Hidrolazele pot fi deasemenea localizate prim
metode de cuplare cu derivaţi azoici, în care substratul hidrolizat
reacţionează cu săruri de diazoniu, precum Fast Red TR ori Fast Blue
RR.
 CENTRIFUGAREA

Separarea amestecurilor eterogene sub influenţa forţei centrifuge care apare

când în amestec se realizează viteze de rotaţie mari, poartă denumirea de
separare centrifugală sau centrifugare.
Centrifugarea este o metodă foarte răspândită în aproape toate
subramurile industriei alimentare. Utilajele utilizate pentru separarea sub efectul
forţei centrifuge poartă denumirea de centrifuge, acestea fiind caracterizate prin
elemente în mişcare la turaţie mare.
Materialele din care se construiesc centrifugele trebuie să satisfacă
cerinţele impuse de evitarea coroziunii, de păstrare a calităţilor lichidului şi de
rezistenţă admisibilă. Sub aspectul separării eterogene, efectele forţei centrifuge
şi a celei gravitaţionale sunt aceleaşi, deosebirea constă în faptul că, intensitatea
câmpului centrifugal poate fi modificată prin modificarea turaţiei şi a distanţei faţă
de axul de rotaţie.
 Separarea amestecurilor eterogene
sub influenţa forţei centrifuge

Separarea amestecurilor eterogene sub influenţa forţei centrifuge, se realizează pe

două principii:
1) Sedimentare, când separarea sub influenţa forţei centrifuge se realizează pe bază
de diferenţă de sedimentare, prin stratificarea componenţilor. Se aplică amestecurilor
eterogene lichid-lichid, solid-lichid, solid-solid, solid-gaz. Separarea centrifugală pe
principiul sedimentării, poartă uneori denumiri speciale: limpezire) eliminarea
impurităţilor solide dintr-un lichid), concentrare (concentrarea particulelor solide dintr-
un amestec solid-lichid ), etc.
Sedimentarea sub influenţa forţei centrifuge se realizează în două faze:
• depunerea fazei cu viteza de sedimentare sau cu densitatea mai mare, care se
supune legilor hidrodinamicii în cazul sedimentelor solide;
• tasarea sedimentului, care se supune legilor mecanicii solului. Sedimentarea
sub influenţa forţei centrifuge se deosebeşte de sedimentarea sub influenţa forţei
gravitaţionale prin faptul că se realizează sub influenţa acceleraţiei centrifugale.
Centrifugarea se foloseşte pentru accelerarea sedimentării, pentru amplificarea vitezei
de filtrare şi eliminarea fazei lichide dintr-un solid în stare de granule. Se pot realiza
umidităţi minime de 3-10%.
 Viteza de sedimentare în câmpul gravitaţional este dată de legea lui Stokes:

1 2 1   2 g d   1   2  2
wg   d   
18 2  18  2

unde:
wg- viteza de sedimentare în câmp gravitaţional;
d – diametrul particulelor care sedimentează;
1- densitatea particulelor;
2- densitatea lichidului;
g – acceleraţia gravitaţională
- vâscozitatea cinematică a lichidului
 Viteza de sedimentare în câmpul gravitaţional depinde de mărimea
particulelor care sedimentează şi de constantele fizice (1,2, ) ale sistemului
dispers. Rezultă că viteza de sedimentare nu poate fi schimbată decât prin
schimbarea proprietăţilor sistemului, de exemplu prin mărirea particulelor
(coagulare) sau prin micşorarea vâscozităţii (încălzire). O altă posibilitate de
mărire a vitezei de sedimentare este de a lucra într-un câmp de forţe
caracterizat printr-o acceleraţie mai mare decât cea gravitaţională, ceea ce se
poate realiza prin centrifugare.
Într-o centrifugă viteza de sedimentare nu este constantă din cauza câmpului
neomogen a cărui intensitate creşte cu distanţa de la centru.
Durata de sedimentare, adică timpul necesar ca particula cu diametrul d să
parcurgă un strat de lichid egal cu ( R2-R1) se deduce cu ajutorul vitezei medii:
 
1 2 1   2 w  R 2
w R 2 
w0,c  d    w0, g   w0, g  z
18 2  g
 Efectele sedimentării într-un câmp de forţe centrifuge sunt:
• viteze mari de sedimentare;
• sedimentarea particulelor mai fine, adică o separare mai
înaintată a celor două faze din care este format sistemul dispers;
• separarea sistemelor disperse cu diferenţă mică între densităţile
1 şi 2 ale celor două faze.
 Ultracentrifugarea zonala
• Svedberg- separarea particulelor in câmp
centrifugal
• Intensit cp. Centrifugal
a = x•ω2 x=pozitia radiala
ω=viteza unghiulara
ω = 2π•η
a = x• (2π•η)2
a = x•ω2 / g
• F = me•xω2 me= m-ms
• Fef = m•xω2 - ms•xω2
• Vp=volum particula de masa m
• ρp= densitatea particulei
• ρl = densitatea lichidului

• ms=Vp• ρp
• Fef = m•xω2 - m•(ρl / ρp) xω2
• s = v / a = dx/dt/x•ω2
• Unitate svedberd 1s = 10-13sec
• s = so / (1 + kc) so = val. Coef. la conc. = 0
 sRT
M= l
D(1-  )
p
 Factorii care influenteaza
sedimentarea particulelor

• Raza particulei
• Vâscozitatea
• Densitatea mediului