Trifan PDF

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE
ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ,
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE HORTICULTURĂ
Biolog Trifan Daniela Silvia (Briciu)
STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII

DE MASĂ ŞI CARACTERIZAREA GENETICĂ A
MUSTURILOR
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Conducător ştiinţific:
Prof. univ. dr. Doru Pamfil
CLUJ-NAPOCA
2011
Trifan Daniela Silvia- Rezumat teză de doctorat
CUPRINS
INTRODUCERE ............................................................................................................................. 6
CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7
CONSIDERAŢII PRIVIND VIŢA DE VIE ................................................................................... 7
1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANICĂ A VIŢEI DE VIE ................................... 7
1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS ....................................................................................... 7
1.3 IMPORTANŢA VIŢEI DE VIE ........................................................................................... 7
CAPITOLUL II ............................................................................................................................... 8
CONTROLUL ŞI PREVENIREA FRAUDELOR ......................................................................... 8
2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAŢIE DE-A LUNGUL TIMPULUI ......................................... 8
2.2 MIJLOACE ŞI METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI ............................................... 8
2.3 METODELE ŞI MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE AUTENTIFICAREA
VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI ....................................................................................... 8
2.3.1 Analiza senzorială .......................................................................................................... 8
2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticităţii soiurilor ................................... 9
CAPITOLUL III .............................................................................................................................. 9
GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI........................................................... 9
3.1 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI................................................. 9
3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAŢI ÎN PREZENTA TEZĂ DE
DOCTORAT ............................................................................................................................... 9
3.3 UTILIZAREA AMPRENTĂRII GENETICE ÎN DETERMINAREA
POLIMORFISMULUI LA VIŢA DE VIE ............................................................................... 10
CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 11
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA ............................. 11
4.1 SCOPUL CERCETĂRII ..................................................................................................... 11
4.2 OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT
................................................................................................................................................... 12
4.3 MATERIALUL BIOLOGIC ............................................................................................... 12
4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI .................. 13
4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI ................................. 13
4.6 TEHNICI ŞI METODE CERCETARE .............................................................................. 14
4.6.1 Extracţia ADN-ului în vederea realizării analizelor RAPD şi SSR pentru determinarea
polimorfismului la viţa de vie ............................................................................................... 14
4.6.2 Tehnici şi metode de cercetare utilizate în vederea obţinerii ADN-ului din must ....... 14
4.6.2.1 Obţinerea mustului ........................................................................................ 14
4.6.2.2 Păstrarea mustului ........................................................................................ 14
4.6.2.3 Extracţia ADN-ului din must în vederea realizării analizelor SSR .............. 15
4.6.3 Cuantificarea ADN-ului ............................................................................................... 15
4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD ......................... 15
4.7.1 Componentele amestecului de reacţie RAPD .............................................................. 15
4.7.2 Amplificarea PCR ........................................................................................................ 16
4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR ............................. 16
4.8.1 Componentele amestecului de reacţie PCR ................................................................. 16
4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR .......................................................................................... 18
CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 18
REZULTATE ŞI DISCUŢII ......................................................................................................... 18
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII ŞI
CALITĂŢII ACESTUIA .......................................................................................................... 18
I
5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR DE

REACŢIE RAPD ...................................................................................................................... 19
5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA DATELOR
OBŢINUTE CU AMORSELE RAPD ...................................................................................... 19
5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE CU
AMORSELE SSR ..................................................................................................................... 20
5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI DIN MUST ŞI ESTIMAREA
CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA .............................................................................. 24
5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE SSR .. 26
CONCLUZII ................................................................................................................................. 29
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ .................................................................................................... 30
THESIS RESUME………………………………………………….…………………………....33
II
TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION………………………………………………………………………………...6
CHAPTER I…………………………………………………………………………………….....7
CONSIDERATIONS REGARDING THE VINE……………………………………………...…7
1.1 THE SYSTEMATIC BOTANICAL CLASSIFICATION OF VINE………...................7
1.2 VITIS GENDER SYSTEMATICS………………………………………………...........7
1.3 THE IMPORTANCE OF VINE…………………………………………………………7
CHAPTER II………………………………………………………………………………………8
FRAUD PREVENTION AND CONTROL………………………………………………………8
2.1 WINE MAKING FRAUDS OVER TIME……………………………………………….8
2.2 MEANS AND METHODS OF WINE VARIETY FALSIFICATION……………….....8
2.3 METHODS AND MEANS BY WHICH AUTHENTICATION CAN BE DONE FOR A
WINE VARIETY………………………………………………………………………….....8
2.3.1 Sensory analysis……………………………………………………………………..8
2.3.2 Molecular methods applied to determine the authenticity of varieties……………..9
CHAPTER III………………………………………………………………………………...…...9
METHODS OF GENETIC FINGERPRINTING………………………………………………...9
3.1 GENERAL INFORMATION REGARDING MOLECULAR MARKERS…………….9
3.2 DIFFERENT TYPES OF MOLECULAR MARKERS USED IN THIS THESIS……..9
3.3 GENETIC FINGERPRINTING USED IN DETERMINING THE VINE
POLYMORPHISMS………………………………………………………………………..10
CHAPTER IV…………………………………………………………………………………....11
RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD………………...11
4.1 RESEARCH PURPOSE………………………………………………………………...11
4.2 OBJECTIVES PURSUED IN THE PHD THESIS RESEARCH WORK……………...12
4.3 BIOLOGICAL MATERIAL……………………………………………………………12
4.4 RAPD PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION………………………………13
4.5 SSR PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION…...........................................…13
4.6 RESEARCH METHODS AND TECHNIQUES……………………………………….14
4.6.1 Using DNA extraction to achieve RAPD and SSR analysis for determining the vine
polymorphism…………………………………………………………………………....14
4.6.2 Research techniques and methods used to obtain DNA from
must……………………………………………………………………………………....14
4.6.2.1 Obtaining the grape must………………………………………………………...14
4.6.2.2 Must preservation……………………………...………………………………....14
4.6.2.3 Extraction of DNA from must in order to achieve SSR analysis………………...15
4.6.3 DNA quantification………………………………………………………………...15
4.7 DNA AMPLIFICATION WITH RAPD PRIMERS…………………………………...15
4.7.1 RAPD reaction mixture components……………………………………….….…..15
4.7.2 Amplificarea PCR……………………………………………………………….....16
4.8 DNA AMPLIFICATION USING SSR PRIMERS……………………………………..16
4.8.1 PCR reaction mixture components………………………………………………...16
4.9 IMAGE ANALYSIS……………………………………………………………………18
CHAPTER V………………………………………………………………………………….…18
RESULTS AND DISCUSSION…………………………………...………………………….....18
5.1 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION AND ESTIMATION OF THE DNA
QUANTITY AND QUALITY……………………………………………………………...18
5.2 RESULTS REGARDING THE AMPLIFICATION AND ELECTROPHORESIS OF
RAPD REACTION PRODUCTS…………………………………………………………...19
III
5.3 RESULTS REGARDING THE IMAGE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF

DATA OBTAINED WITH RAPD PRIMERS.......................................................................19
5.4 RESULTS REGARDING THE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF DATA
OBTAINED WITH SSR PRIMERS………………………………………………………..20
5.5 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION FROM MUST AND ESTIMATION
OF QUANTITY AND QUALITY……………………………………………………….....24
5.6 VARIETY ANALYSIS USING SSR MICROSATELLITE PRIMERS………………26
CONCLUSIONS………………………………………………………………………………...29
SELECTIVE BIBLIOGRAPHY...................................................................................................30
THESIS RESUME…………………………………………………………………………….....33
IV
INTRODUCERE
Viţa de vie este una dintre cele mai răspândite culturi horticole, de mare importanţă
economică. Soiurile de Vitis vinifera, împreună cu alte specii ale genului Vitis sunt în studiu
permanent, în sectoarele de cercetare din ameliorare, protecţie a plantelor şi, de curând, din
industria farmaceutică.
Problemele care apar continuu în păstrarea purităţii soiurilor, combaterea ecologică a
bolilor şi a dăunătorilor, obţinerea de soiuri rezistente în condiţii grele de climă şi pedologice,
necesită o foarte bună cunoaştere a bazelor genetice ale acestor caractere fenotipice de
importanţă economică.
Identificarea cultivarelor de viţă de vie se face în mod tradiţional pe baza caracterelor
morfologice. În prezent, markerii moleculari s-au dovedit a fi o alternativă în identificarea
soiurilor de viţă de vie şi pot fi folosiţi în investigarea relaţiilor taxonomice dintre speciile de
Vitis.
Markerii moleculari sunt direct legaţi de genotip şi independenţi de fenotip, fapt ce îi
face să fie utilizaţi în identificarea cultivarelor. Ei pot fi folosiţi în programele de ameliorare şi
mapare a genomului, deoarece sunt linkaţi cu unele gene de interes.
Cercetările de genetică moleculară la viţa de vie sunt orientate în general, spre
identificarea polimorfismului existent în cadrul speciilor de Vitis şi spre stabilirea originii
filogenetice a unor specii sau soiuri.
Viţa de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorită
principalelor caracteristici şi anume: durata lungă a generaţiilor, grad înalt de heterozigoţie,
depresia ridicată la consangvinizare.
Tehnologia markerilor moleculari foloseşte secvenţa de ADN, ce este uşor detectată şi a
cărei succesiune poate fi uşor monitorizată. Utilizarea markerilor moleculari se bazează pe
ADN-ul polimorfic. Această tehnică este utilizată pe scară largă în ultimii ani în studii genetice
şi identificarea de soiuri. Identificarea soiurilor de viţă de vie se face cu markeri moleculari,
având la bază reacţia PCR şi folosind ca tehnici moleculare RFLP-ul, RAPD-ul, AFLP-ul şi
SSR-ul.
O altă problemă importantă apărută este autentificarea vinurilor. Vinul, acest “copil
teribil” obţinut din relaţia viţei de vie cu soarele este o adevărată binecuvântare a naturii. Prin
multitudinea componentelor şi a numeroaselor sale principii nutritive, existente într-o
armonioasă cumpănire, vinul, consumat raţional, este o sursă de energie, care poate conferi
omului bună dispoziţie, încântare, înţelepciune şi extaz. Un strop de vin poate constitui un strop
de viaţă adevărată ce poate amplifica bucuria de a trăi. (Cotea, 1995).
Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de importantă atât pentru
producatorii de vin cât şi pentru agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei
consumatorului având în vedere că peste 30 % din vinurile autohtone sunt greşit etichetate. La
ora actuală tehnicile de biologie moleculară (RFLP, RAPD, SSR) sunt folosite pe scară largă
pentru caracterizarea genetică a soiurilor de viţă de vie. Aceste tehnici se pot extrapola şi la
detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de
laboratoare să pună la punct diverse metode de amprentare. Din păcate aceste metode nu au fost
până în prezent publicate sau patentate.
Deşi extracţia ADN-ului din ţesuturile vegetale este o tehnică bine cunoscută, în cazul
musturilor şi a vinurilor tinere există puţine referinţe bibliografice în acest sens. Principalele
constrângeri sunt legate de dificultatea obţinerii unui ADN de înaltă calitate pretabil pentru
amplificare, datorită probabil, interferenţei polizaharidelor, taninilor şi polifenolilor din aceste
mixturi, sau degradării ADN-ului ca urmare a acţiunii enzimatice şi biochimice din procesul
tehnologic de fabricare a vinului.
6
CAPITOLUL I
CONSIDERAŢII PRIVIND VIŢA DE VIE
1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANICĂ A VIŢEI DE VIE

Viţa de vie face parte din familia Vitaceae (Lindl) - Ampelidaceae (Kunth), familie cu
mare număr de taxoni şi soiuri, cu mare arie de răspândire şi valenţă ecologică.
Principalele specii ale genului Vitis s-au format în cadrul ecologic a trei arii geografice
diferite, care au imprimat caracteristici morfologice şi productive diferite.
Vitaceaele sunt reprezentate prin 12 genuri, după cei mai mulţi autori, iar după unii, prin
14 sau chiar 18 genuri şi cca 1100 specii, răspândite pe un areal geografic foarte larg. Dintre
acestea genul Vitis este cel mai important, deoarece cuprinde speciile de viţă de vie care se
cultivă pentru producţia de struguri şi cele care se folosesc pentru portaltoi. Se cunosc 108 specii,
răspândite în zonele temperate, subtropicale şi tropicale din Europa, Asia, America de Nord,
America Centrală, America de Sud. Din cele 108 specii, numai 60 sunt bine identificate: 33
specii americane, 27 specii asiatice, în care se include specia Vitis vinifera (Pop, 2003b).
1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS

Genul Vitis cuprinde aproximativ 60 de specii dioice distribuite aproape uniform între
America şi Asia, acestea reprezentând o resursă considerabilă de gene pentru rezistenţa la
patogeni. (Mullins şi colab., 1992).
Genul Vitis a fost subdivizat de către Planchon în 1887 în două subgenuri sau secţii:
- subgenul Muscadinia, cuprinde speciile de viţe răspândite în regiunile tropicale şi
subtropicale ale Americii de Nord. Strugurii sunt mici, cu gust foxat şi cu boabe puţine,
care se maturează succesiv; boabele slab suculente acumulează cantităţi mici în zaharuri;
seminţele aproape rotunde cu chalază ovală şi încreţită. Numărul de cromozomi este
2n=38
- Subgenul Euvitis (Vitis) cuprinde speciile de viţă adevărate, din zonele temperate ale
Europei şi Asiei, Americii de Nord, Centrale şi de Sud. Strugurii sunt mari cu boabe
numeroase, care se menţin pe ciorchine şi după maturarea lor. Bobul este cărnos sau
zemos, în care se acumuează multe zaharuri, seminţe piriforme cu rostru lung. Numărul
de cromozomi de bază este n=19 şi se cunosc soiuri triploide cu 2n=57, tetraploide
2n=76, considerate ca mutaţii, pentaploide 2n=95, hiperploide 2n=40 (Constantinescu,
1971).
1.3 IMPORTANŢA VIŢEI DE VIE

Dintre fructele comestibile, strugurii sunt foarte mult căutaţi şi apreciaţi. Aspectul lor
atrăgător, gustul placut, dar mai ales valoarea alimentară deosebită, le creează un regim
preferenţial de consum, intrând astfel în categoria fructelor de elită de tip delicatese. Au o
stuctură complexă şi cu implicaţie directă în organismul uman, sub aspect energetic,
reconfortant, vitaminizant, mineralizant, reactivant, la care se adaugă însuşirile dietetice şi
terapeutice. Valoare alimentară prezintă nu numai strugurii ca atare, ci şi mustul şi vinul
consumat raţional.
Strugurii au o compoziţie chimică foarte complexă: pe lângă apă care se găseşte în cea
mai mare proporţie în compoziţia bobului, zaharurile ocupă locul al doilea. La maturitatea
deplină, conţinutul strugurilor în zaharuri variază între 14-35% sau 140-350g/l must. Zaharurile
aflate în struguri şi must se găsesc sub formă simplă - monozaharide. Zaharurile simple sunt
asimilate direct în organism, trec în sânge, şi apoi furnizeză organismului energia cheltuită (100g
struguri proaspeţi furnizează între 60-116 calorii sau 1kg struguri, 700-1200 calorii)
Vinurile de struguri conţin cantităţi minime de vitamine, care nu pot satisface pe deplin
cerinţele organismului. Însă diversitatea şi acţiunea complexă a vitaminelor determină
7
importanţa lor. Vitaminele B1, B2, B6, B12, PP şi acidul pantotenic sunt prezente în cantităţi ce
satisfac aproximativ 10% din necesităţile zilnice ale omului. Biotina şi acidul folic se găsesc într-
o măsură mai mică, iar mezoinozitul- în cantităţi ce corespund aproximativ necesarului zilnic al
omului.
CAPITOLUL II
CONTROLUL ŞI PREVENIREA FRAUDELOR
2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAŢIE DE-A LUNGUL TIMPULUI

Trăim într-o vreme când procesul de globalizare, care a inclus numeroase industrii, tinde
să acapareze şi domeniul vitivinicol, când vinuri de pe tot globul se vând pe tot globul, iar
consumatorul modern, mereu în criză de timp, îşi doreşte să se delecteze în sigranţă cu băutura
zeilor, nemuritorul vin. Totodată, profitându-se parcă de beneficiile şi de posibilităţile
prezentului, se găsesc persoane dornice de îmbogăţire prin înşelătorie, eludând legile şi regulile
vitivinicole (Nămăloşanu, I şi colab.2005).
Printre practicile des întâlnite se numără la loc de cinste „botezarea” vinului cu apă,
adăugarea de sulfat de potasiu. Progresele făcute de chimia de sinteză s-au făcut simţite puternic
si în domeniul contrafacerii vinurilor. Astfel, aciditatea vinului este îmbunătăţită cu acid sulfuric,
acidul salicilic poate înetini sau opri total fermentaţia, sulfatul de fier serveşte la ameliorarea
gustului etc. (Ţârdea, 2003).
Alte tipuri de fraude se referă la autenticitatea soiului şi mai ales la arealul de producere.
Consumatorul este dus în eroare asupra anului de recoltă, soiului, categoria de calitate a vinului,
arealului de provenienţă şi chiar modificarea caracteristicilor de compoziţie şi organoleptice.
Aceste falsificări se referă mai mult la vinurile de consum curent, uneori şi la cele de calitate
superioară şi în secial la vinurile aromate.
Viorel Stoian (2001) analizează mecanismul prin care un vin dintr-un soi binecunoscut
„Galbenă de Odobeşti”, a ajuns să se găsească pe piaţă în cantităţi de 3-4 ori mai mari decât se
pot obţine din producţia autohtonă de struguri din acest soi. Adăugarea în reţeta vinului de
struguri din alte soiuri, precum şi apariţia unor sticle clonate cu etichete stranii precum Galbena
Golden sunt consecinţa dorinţei unora de a exploata faima dobândită- mai mult sau mai puţin
meritat- de acest soi în ochii consumatorilor.
2.2 MIJLOACE ŞI METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI

Falsificarea soiului se face cu multă uşurinţă. Distingem două situaţii diferite:
- un vin corect, produs dintr-un anumit soi de struguri, sau un amestec de asemenea vinuri,
este pur şi simplu comercializat sub denumirea altui soi, care este mai cerut pe piaţă, sau
aduce un profit mai mare (se vinde la un preţ mai bun)
- un aşa-zis vin falsificat din alte puncte de vedere este vândut ca vin, ba mai mult este
vândut sub denumirea unui soi cunoscut.
La acestea se adaugă şi cazurile de amestecare a vinurilor în diverse proporţii, după cum
are nevoie comerciantul, fără să respecte cerinţele de a avea minimum 85% dint-un soi atunci
când trecem soiul pe etichetă, minimum 85% vin dintr-un anumit an de producţie, atunci când
trecem anul pe etichetă sau ca vinurile să fie din aceeaşi zonă pentru a putea purta denumire de
origine (Antoce, 2005).
2.3 METODELE ŞI MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE

AUTENTIFICAREA VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI
2.3.1 Analiza senzorială
Deşi analiza senzorială este subiectivă, ea este uneori mai semnificativă decât analizele
chimice obiective. Un degustător bine instruit va putea, în majoritatea cazurilor să diferenţieze
8
un Cabernet Sauvingnion veritabil de un vin de duzină vândut sub acelaşi nume. Dar, există şi
unele inconveninnte, în sensul că un falsificator are la dispoziţie mijloace performante, de la
arome sintetice „identic naturale”, până la aparate de analiză şi control de ultimă generaţie, cu
ajutorul cărora atinge performanţa de a păcăli chiar unii degustători calificaţi. Cu alte cuvinte,
există şi posibilitatea unor erori în sensul declarării drept autentice a unor vinuri falsificate cu
multă grijă.
2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticităţii soiurilor

Pentru a mai echilibra puţin lucrurile, cercetătorii au propus o nouă metodă de lucru,
bazată pe caracterizarea ADN-ului dintr-o probă de vin brută, netratată, provenită dintr-un singur
soi de viţă de vie. Deja această informaţie este disponibilă pentru un număr de peste 600 de
soiuri de viţă de vie. Analiza ADN-ului dintr-un vin oarecare permite, apoi identificarea soiurilor
de viţă din care a fost obţinut acesta. Se întrevăd totuşi unele dificultăţi în acest sens, deoarece
vinul pus în consum este, de obicei purificat şi stabilizat printr-o multitudine de tratamente
fizico-chimice, care afectează ADN-ul conţinut în acesta. Câteva zile de fermentaţie a mustului
sunt suficiente pentru ca ADN-ul din must să fie degradat într-o asemenea măsură încât,
extragerea ADN-ului sa fie dificilă. (Nămăloşanu şi colab, 2005).
CAPITOLUL III
GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI
3.1 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI

Pentru conservarea eficientă a resurselor genetice vegetale este necesară stabilirea cât mai
exactă a variabilităţii genetice a acestora, ce poate fi determinată la două nivele, fenotipică şi
genotipică. Variabilitatea fenotipică se bazează pe analiza morfologiei plantelor, cea genetică pe
markerii moleculari.
Markerii genetici sunt de trei tipuri: markeri morfologici, markeri proteici şi markeri
moleculari. ( Vicente şi colab, 2004)
Markerii morfologici sunt uşor de utilizat, nu necesită echipamente costisitoare, putându-
se efectua o evaluare rapidă a fenotipului cu ajutorul lor. Ca dezavantaje prezintă următoarele: se
găsesc în număr limitat, sunt influenţaţi de condiţiile de mediu şi de stadiul de dezvoltare al
plantei şi necesită evaluarea de către experţi în cunoaşterea speciei respective.
Markerii biochimici (proteici) se bazează pe proprietatea proteinelor de a fi separate în
urma electroforezei. Tipuri de markeri biochimici sunt proteinele rezultate în urma stocării
seminţelor, izoenzimele
Markerii ADN (moleculari) evidenţiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi
citoplasmatic. Markerii moleculari nu sunt influenţaţi de condiţiile de mediu, fiind o măsură
obiectivă a variabilităţii, există în număr nelimitat, acoperind întregul genom, dar necesită
echipamente complexe de analiză.
Markerii ideali ar fi caracterizaţi de următoarele proprietăţi: polimorfism ridicat,
reproductibilitate mare, codominanţă, distribuţie uniformă în genom, distinctivitate (să
evidenţieze diferenţele între indivizi înrudiţi), neinfluenţaţi de condiţiile de mediu, neutri (alela
prezentă la locusul markerului să fie independentă, fără efect asupra presiunii de selecţie aplicată
individului), necostisitori, uşor de utilizat. (Vicente şi colab, 2004)
3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAŢI ÎN PREZENTA TEZĂ DE

DOCTORAT
Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN
amplificate aleator) sunt rezultaţi prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN
genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams şi colab., 1990). Produşii de
9
amplificare sunt migraţi într-un gel de agaroză şi vizualizaţi prin colorare cu bromură de etidiu
(fluorescentă în lumină ultravioletă) sau azotat de argint. Diversitatea genetică şi relaţiile de
înrudire dintre indivizi se evaluează pe baza prezenţei sau absenţei benzilor, rezultând o
amprentă genetică specifică.
În urma amplificării cu amorsa decameră aleatoare rezultă un număr mare de fragmente
de dimensiuni variabile (300-2000 pb), însă acestea pot prezenta problema co-migrării
(fragmentele cu aceeaşi greutate moleculară pot avea structuri diferite, astfel presupunerea lipsei
polimorfismului pentru banda respectivă fiind eronată). Fiind o metodă simplă, necostisitoare şi
care nu necesită cunoaşterea secvenţei de ADN ţintă, RAPD se utilizează şi astăzi în analizele
genetice, deşi markerii sunt dominanţi iar reproductibilitatea între laboratoare e scăzută. (Karp,
A. şi colab, 1997).
Microsateliţii (ADN înalt repetitiv) cunoscuţi ca şi SSRs (Simple Sequence Repeats) sau
STRs (Short Tandem Repeats) au fost descrişi pentru prima dată de Hamada şi colab. (1984) ca
şi secvenţe scurte de ADN constituite din 1 până la 6 nucleotide repetitive în tandem. Această
clasă de secvenţe simple de ADN se regăseşte sub formă abundentă şi uniformă în genomurile
organismelor eucariote. Aceste secvenţe nu se transcriu în ARN şi, între ampla varietate de
funcţionare care se atribuie se include şi reglarea genetică (Hamada şi colab. 1984) şi de a
acţiona ca semnale pentru conversia genetică şi recombinare (Jeffers şi colab. 1985). Reprezintă
secvenţe scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repetă în tandem, găsindu-se în
proporţie mai mare la nivelul centromerului şi telomerelor (ADN non-informaţional) (Gupta PK
şi colab, 1996). Pentru a putea fi utilizaţi ca markeri trebuie cunoscută localizarea lor în genom.
Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR
cu amorse complementare secvenţelor ce flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate
în cadrul speciei, uneori şi a genului). Produşii de amplificare (benzi de 200-300 pb, ce diferă
între ele ca mărime prin cel puţin 10-20 pb) sunt migraţi în gel de agaroză şi vizualizaţi prin
colorare cu BrEt. Produşii în general sunt migraţi în gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin
colorare cu azotat de argint sau cu ajutorul izotopilor radioactivi. Produşii se pot secvenţializa
pentru o analiză foarte clară a rezultatelor.
Numărul de repetiţii este variabil şi, în general, gradul de polimorfism creşte cu
longitudinea totală a microsatelitului (Weber,1990) care nu poate fi mai mare de 0.1Kb.
3.3 UTILIZAREA AMPRENTĂRII GENETICE ÎN DETERMINAREA

POLIMORFISMULUI LA VIŢA DE VIE
Viţa de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorită
principalelor caracteristici şi anume: durata lungă a generaţiilor, grad înalt de heterozigoţie,
depresia ridicată la consangvinizare.
Perfecţionarea metodelor de analiză a ADN-ului, cum ar fi RAPD, AFLP şi SSR au
deschis noi posibilităţi de caracterizare şi comparare a genotipurilor, independent de fenotip şi,
respectiv, de exprimarea genelor în funcţie de condiţiile de mediu. Utilizarea tehnicilor de
analiză bazate pe PCR au permis detectarea polimorfismului ADN în loci dispuşi randomizat
(RAPD, AFLP) sau specific (SSR) în genom. Utilizarea markerilor ADN a crescut enorm
potenţialul pentru caracterizarea soiurilor cultivate şi a descendenţilor acestora.
Markerii moleculari ca AFLP, RAPD, şi SSR au fost utilizaţi în studii genetice la viţa de
vie. Aceste studii au dus la înţelegerea relaţiei dintre soiuri din aceeaşi regiune sau din regiuni
diferite. Nivelul înalt de heterozigoţie prezent la viţa de vie multiplicată vegetativ permite
diferenţierea între cele mai importante soiuri aproape prin orice tehnică moleculară.
Ca urmare a perfecţionării tehnologiei PCR, a fost dezvoltată tehnica RAPD. Aceasta
este ieftină, rapidă şi uşoară şi a fost aplicată pentru detectarea diferenţelor genetice între diferite
varietăţi, specii de viţă de vie şi portaltoi. Marele dezavantaj al acestei metode este dependenţa
rezultatelor de condiţiile stricte de lucru. Diferite aparate PCR, Taq polimeraze, concentraţii
10
diferite ale amorselor şi ale ADN-ului, precum şi persoana care realizează experimentul
influenţează rezultatele. Stabilitatea rezultatelor poate fi obţinută numai prin respectarea strictă a
condiţiilor standard de realizare a experimentului.
Markerii microsatelitici sunt utilizaţi, începând cu mijlocul anilor 90, pentru
caracterizarea genetică a diferitelor soiuri de viţă de vie cultivate în diverse ţări cu tradiţie
viticolă. Aceasta, deoarece locii microsatelitici oferă un profil genetic unic pentru fiecare soi,
permiţând caracterizarea fără echivoc a oricărei varietăţi (Di Gaspero şi colab, 2000). Thomas şi
colab., 1993 au aplicat pentru prima dată tehnica SSR pentru identificarea varietăţilor de viţă de
vie. Aceştia au demonstrat că secvenţele microsatelitice sunt abundente în genomul viţei de vie şi
sunt înalt informative pentru identificarea varietăţilor de Vitis vinifera. Prin analiza pedigree s-a
demonstrat că acest tip de markeri moleculari este transmis la descendenţi după legile
mendeliene ale eredităţii codominant, confirmând faptul că sunt adecvaţi pentru cartarea genetică
şi investigarea gradului de înrudire genetică.
Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de importantă atât pentru
producatorii de vin cât şi pentru agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei
consumatorului având în vedere că peste 30 % din vinurile autohtone sunt greşit etichetate. La
ora actuală tehnicile de biologie moleculară (RFLP, RAPD, Microsateliţi) sunt folosite pe scară
largă pentru caracterizarea genetică a soiurilor de viţă de vie. Aceste tehnici se pot extrapola şi la
detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de
laboratoare să pună la punct diverse metode de amprentare. Din păcate aceste metode nu au fost
până în prezent publicate sau patentate.
Deşi extracţia ADN-ului din ţesuturile vegetale este o tehnică bine cunoscută, în cazul
musturilor şi a vinurilor tinere există puţine referinţe bibliografice în acest sens. Până în prezent
nici un autor nu a raportat reuşita extracţiei ADN-ului din vinuri vechi. Principalele constrângeri
sunt legate de dificultatea obţinerii unui ADN de înaltă calitate pretabil pentru amplificare,
datorită probabil, interferenţei polizaharidelor, taninilor şi polifenolilor din aceste mixturi, sau
degradării ADN-ului ca urmare a acţiunii enzimatice şi biochimice din procesul tehnologic de
fabricare a vinului.
Baleiras-Couto şi Eiras-Dias (2006) au perfecţionat o metoda eficientă de extracţie pentru
ADN rezidual din must şi vinuri, de calitate adecvată pentru amplificarea cu microsateliţi.
Markerii microsatelitici din genomul cloroplastelor au fost utilizaţi pentru caracterizarea ADN-
ului din must şi vinuri în vederea certificării acestuia din viţă de vie. Un studiu recent a
demonstrat că ADN-ul rezidual de la viţa de vie şi de la Saccharomyces cerevisae sunt prezente
în musturi şi vinuri vechi de până la 2 ani, iar acest ADN poate fi utilizat pentru amplificare cu
microsateliţi şi cuantificare la RT-PCR (Savazzini şi colab., 2006).
În cazul musturilor multivarietale, markerii microsatelitici sunt cei care permit
autentificarea vinului prin relaţia dintre proporţia fiecărei varietăţi şi intensitatea semnalului
alelelor specifice fiecărui soi. În plus, se poate cuantifica proporţia fiecărui soi introdus în
procesul de vinificaţie.
CAPITOLUL IV
SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA
4.1 SCOPUL CERCETĂRII

În cadrul prezentului studiu scopul propus a fost analizarea la nivel molecular a
polimorfismul genetic la 10 soiuri de viţă de vie pentru strugurii de masă, prin metoda RAPD şi
cea a markerilor microsatelitici (SSR- Simple Sequence Repeats). Pentru fiecare soi de viţă de
vie luat în studiu, vor fi identificaţi loci microsatelitici care pot fi utilizaţi pentru caracterizarea
genetică a acestor soiuri. Majoritatea markerilor SSR sunt constituiţi din repetiţii dinucleotidice
[(AC)n, (AG)n şi (AT)n]. Repetiţiile dinucleotidice (AT)n sunt relativ abundente la plante şi
11
prezintă un grad ridicat de polimorfism. Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a

repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR cu amorse complementare secvenţelor ce
flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate în cadrul speciei, uneori şi a genului).
Un alt scop propus în cadrul acestei teze a fost stabilirea unei metode eficiente de
extracţie a ADN-ului din musturi şi vinuri tinere. S-a urmărit de asemenea şi compararea
profilelor genetice a soiurilor de viţă de vie din musturi monovarietale cu profilele genetice din
frunzele aceluiaşi soi.
Elaborarea de vinuri monovarietale ce prezintă caracteristici conferite de struguri are o
mare relevanţă la nivel mondial. Aceste soiuri sunt reprezentative pentru zonele vitivinicole,
prezentând Denumire de Origine. Acest lucru face să existe un control strict pentru a garanta
autenticitatea lor. De aceea, căutarea metodelor de identificare a soiurilor în vinuri au o mare
importanţă în obţinerea unui produs final de înaltă calitate.
4.2 OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE

DOCTORAT
Cercetările din experimentele realizate în prezenta teză de doctorat au vizat atingerea
următoarelor obiective:
1. Identificarea amorselor RAPD capabile să genereze polimorfisme la nivel molecular între
soiurile studiate
2. Alegerea amorselor SSR capabile să discrimineze soiurile analizate
3. Stabilirea distanţelor genetice apărute între soiurile luate în studiu
4. Extracţia ADN-ului din frunze de viţă de vie şi evidenţierea profilului alelic al soiurilor
analizate. Profilul alelic obţinut va permite identificarea precisă şi discriminarea între
soiurile testate. Pe baza acestui profil va fi analizat ADN-ul extras din must şi vinuri.
5. Stabilirea unui protocol pentru extracţia ADN-ului din must şi vinuri tinere.
6. Realizarea unui studiu privind degradarea ADN-ului pe parcursul procesului de
fermentaţie a mustului şi după terminarea acestuia.
7. Amprentarea genetică a soiurilor luate în studiu cu ajutorul amorselor SSR.
Caracterizarea musturilor şi vinurilor tinere se va realiza prin amplificarea cu markeri
microsatelitici pentru a se evidenţia profilul alelic. Rezultatele obţinute vor permite verificarea
autenticităţii acestora prin compararea ADN-ului extras din must şi vinuri cu ADN-ul obţinut din
frunze al soiurilor de vin utilizate. Acest lucru este de importanţă majoră pentru controlul calităţii
şi protecţia consumatorului, oferind o garanţie ce contribuie la menţinerea valorii soiurilor
folosite şi evitarea utilizării abuzive a numelor prestigioase pe produse false.
4.3 MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic utilizat pentru stabilirea polimorfismului la strugurii de masă a fost
constituit din zece soiuri de viţă de vie provenite din două locaţii viticole din România respectiv,
de la Staţiunea Didactică Experimentală USAMV Cluj - Napoca şi Staţiunea Didactică
Experimentală USAMV Iaşi. Recoltarea frunzelor s-a făcut în primăvară, în fenofaza de creştere
a lăstarilor. Au fost recoltate frunze tinere care au fost păstrate în congelator la o temperatură de
-800C. Ulterior din aceste frunze a fost extras ADN-ul, care a fost folosit în reacţiile PCR.
Cercetările experimentale au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Biotehnologii
Vegetale al Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj.
În ceea ce privesc analizele efectuate pentru extracţia ADN-ului din must, materialul
biologic utilizat în experienţă a fost format din zece soiuri de struguri pentru vin provenite de la
Staţiunea Didactică Experimentală USAMV Cluj-Napoca. În primăvara anului 2008 am recoltat
frunze tinere de la cele 10 soiuri (minim 5g de frunze/soi). Fiecare butaş de pe care au fost
recoltate frunzele a fost marcat, urmând ca în toamnă de pe acelaşi butaş să se recolteze strugurii.
12
Frunzele au fost păstrate la congelator la –800C până în momentul în care s-a efectuat extracţia
de ADN.
Strugurii recoltaţi în toamnă (sfârşitul lunii septembrie) au fost supuşi procesului de
microvinificaţie, urmând ca mustul şi apoi vinul obţinut să fie utilizat în analizele moleculare.
4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI

Diversitatea genetică şi relaţiile de înrudire între indivizi se evaluează pe baza prezenţei
sau absenţei benzilor, rezultând o amprentă genetică specifică. În acest scop, au fost testate un
număr de 30 de amorse RAPD, dintre acestea doar 12 fiind polimorfice. După stabilirea
amorselor care au generat polimorfism, acestea au fost utilizate pentru analiza tuturor soiurilor
din ambele regiuni luate în studiu. Pentru că metoda RAPD este influenţătă de factorii externi,
amplificarea probelor din cele două regiuni s-a realizat în acelaşi thermocycler. În tabelul 4 sunt
redate secvenţele celor 12 amorse care au generat polimorfism.
Au fost realizate câte 2 repetiţii pentru fiecare amorsă, luându-se în calcul doar benzile
vizibile prezente în cele două repetiţii. Fragmentele rezultate prin amplificare cu amorsele
polimorfice au avut lungimea cuprinsă între 150 şi 2000 pb. Notarea benzilor s-a realizat prin
raportare la markerul ADN (100 pb DNA Step Ladder Promega), notându-se cu 1 prezenţa
benzilor şi cu 0 absenţa acestora. Pe baza acestor date s-a recurs la întocmirea dendogramei.
Tabel 1
Secvenţele amorselor RAPD care au generat polimorfism
Nr. Amorsă Secvenţa (5`-3`)
Crt. Primer Sequence (5`-3`)
No.
1. OPB 09 TGGGGGACTC
2 OPB 17 AGGGAACGAG
3 OPB 18 CCACAGCAGT
4 OPH 12 ACGCGCATGT
5 OPAB 11 GTGCGCAATG
6 OPC 14 TGCGTGCTTG
7 OPD 16 AGGGCGTAAG
8 OPD 19 CTGGGGACTT
9 OPD 20 ACCCGGTCAC
10 OPE 14 TGCGGCTGAG
11 OPF 16 GGAGTACTGG
12 Mic 07 TGTCTGGGTG
4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI

Pentru amplificarea probelor de ADN în vederea evidenţierii polimorfismului genetic la
celor 10 soiuri luate în studiu au fost utilizate un număr de 6 amorse microsatelitice, amorse care
au fost selectate din literatură. Amorsele au fost selectate pe baza a trei criterii: uşor de
amplificat, heterozigoţia prezentă în fiecare locus şi intervalul de mărime al alelelor (pb). Aceste
amorse sunt: VVS 2, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG
47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).
Pentru amplificarea ADN-ului extras din must şi vin au fost utilizate un număr de 8
amorse, amorse care au fost alese pe baza literaturii de specialitate. Aceste amorse sunt: VVS2,
VVS5, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD5, VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG 47,
ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).
13
Tabel 2
Secvenţele amorselor SSR utilizate în analiza PCR
Amorsă Secvenţa TM Intervalul de Referinţă
Primer Sequence (0C) mărime (pb) Reference
Size range (bp)
VVS2 f: CAGCCCGTAAATGTATCCATC 52.2 126-151 Thomas şi
r: AAATTCAAAATTCTAATTCAACTGC 47.7 colab. 1993
VVS5 f: ATTGATTTATCAAACACCTTCTACAT 19.9 90 – 148 Thomas şi
r: TAGAAAGATGGAAGGAATGGTGAT 52.1 colab. 1993
VVS29 f: CCCCAAGGCTCTGAAAACAAT 52.2 168-189 Thomas şi
r: TGCAAAGCAAATAAAGCTTCCA 49.1 colab. 1994
VVMD5 f: CTAGAGCTACGCCAATCCA 51.6 226 – 246 Bowers şi
r: TATACCAAAAATCATATTCCTAAA 45.3 colab. 1996
VVMD7 f: AGAGTTGCGGAGAACAGGAT 51.6 233 – 263 Bowers şi
r: CGAACCTTCACACGCTTGAT 51.6 colab. 1996
ssVrZAG f: GGTCTGAATACATCCGTAAGTATAT 52.6 149-172 Sefc şi colab.
47 r: ACGGTGTGCTCTCATTGTCATTGAC 57.5 1999
ssVrZAG f: GGTGAAATGGGVCACCGAACACACGC 62.4 185-203 Sefc şi colab.
62 r: CCATGTCTCTCCTCAGTTCTCAGT 60.8 1999
ssVrZAG f: AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCG 59.2 236 – 260 Sefc şi colab.
79 r: TGCCCATTTTCAAACTCCCTTCC 29.2 1999
4.6 TEHNICI ŞI METODE CERCETARE

4.6.1 Extracţia ADN-ului în vederea realizării analizelor RAPD şi SSR pentru
determinarea polimorfismului la viţa de vie
Atât în cercetările de genetică moleculară, cât şi în cele de inginerie genetică, extracţia
ADN-ului reprezintă un prim pas extrem de important. Izolarea acizilor nucleici din diferite
ţesuturi vegetale, este obligatorie în majoritatea metodelor moleculare utilizate în biologia
moleculară.
Metodele de izolare a ADN-ului au ca şi criterii de bază puritatea, integritatea şi
cantitatea de ADN obţinută. S-a demonstrat că puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai
importanţi factori în reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriţei de ADN cu o
puritatea mare asigură reproductibilitate prin metoda RAPD. Amprente RAPD vor fi identice în
repetiţii numai dacă ADN-ul are o calitate adecvată.
Pentru extracţia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi şi colab.
(1994), modificat de Pop şi colab (2003b).
4.6.2 Tehnici şi metode de cercetare utilizate în vederea obţinerii ADN-ului din must
4.6.2.1 Obţinerea mustului
Pentru analizele efectuate în prezentul studiu vinul a fost obţinut printr-un proces de
microvinificaţie. După recoltarea strugurilor, aceştia au fost zdrobiţi, iar mustul a fost pus în
sticle pentru fermentaţie. S-a avut în vedere evitarea contaminării soiurilor, schimbându-se la
fiecare soi mănuşile. După obţinerea mustului (aproximativ 2 l pentru fiecare soi), acesta a fost
pus la fermentat la o temperatură de aproximativ 200C.
4.6.2.2 Păstrarea mustului

După obţinerea mustului, aproximativ 20 ml a fost păstrat la -200C, până în momentul în
care a fost analizat. Acesta a fost împărţit în recipiente de 2 ml pentru a facilita decongelarea.
Restul mustului a fost supus procesului de fermentare.
Pentru a urmări influenţa procesului de fermentaţie asupra ADN-ului, pe parcursul
perioadei de fermentaţie s-au efectuat mai multe extracţii de ADN. Astfel, s-au realizat extracţii
în prima zi de fermentaţie şi apoi tot la patru zile de la începerea fermentaţiei. De asemenea, s-au
efectuat extracţii şi la sfârşitul fermentaţiei (aproximativ la o lună şi jumătate de la începerea
14
fermentaţiei), precum şi din vin, vin care a fost supus procesului de limpezire timp de trei
săptămâni.
4.6.2.3 Extracţia ADN-ului din must în vederea realizării analizelor SSR

Metodele de izolare a ADN-ului au ca şi criterii de bază puritatea, integritatea şi
cantitatea de ADN obţinută. S-a urmărit de asemenea, eliminarea polifenolilor şi a
polizaharidelor care împiedică obţinerea unui ADN de bună calitate, ce poate fi folosit în reacţia
PCR. Deoarece se ştie faptul că extracţia ADN-ului din must şi vinuri ridică probleme din cauza
degradării acestuia pe parcursul perioadei de fermentaţie, au fost testate mai multe metode.
Astfel, pentru extracţia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi şi colab.
1994, modificat de Pop şi colab. 2003b, iar pentru extracţia ADN-ului din must s-au utilizat 3
metode de izolare, cu fiecare metodă fiind realizate câte trei extracţii pentru fiecare soi în parte.
Protocoalele utilizate sunt:
a) protocolul descris de Faria şi colab. (2000),
b) protocolul descris de Lodhi şi colab.(1994) modificat de Pop şi colab. (2003),
c ) protocolul descris de Sambrook şi colab. (1989) modificat de Baileras-Couto şi Eiras Dias
(2006).
4.6.3 Cuantificarea ADN-ului

ADN-ul este considerat suficient de pur, dacă puritatea este cuprinsă între 1,7 şi 2,0.
Valorile mai mici de 1,7 indică impurificări cu proteine, iar cele mai mari de 2,0 indică
impurificări cu alţi contaminanţi. Banda de absorţie a moleculelor biologice în UV este între 200
şi 400 nm, de exemplu proteinele, care constituie contaminantul major al soluţiilor de ADN, au
un maxim de absorţie la 280 nm. Densitatea optică a fost măsurată la rata de absorţie A260nm şi
A280nm, făcându-se raportul dintre cele două rate de absorţie.
După extracţie, cantitatea şi calitatea ADN-ului a fost măsurată cu ajutorul aparatului
Spectofotometru ND-1000 utilizând programul NanoDrop. Acest aparat efectuează măsurători
de absorbţie la lungimile de undă de λ=260 nm, λ=280 nm şi λ=230 nm, fiind capabil să afişeze
nu doar extensiile absorbţiilor, ci şi concentraţia ADN-ului din proba analizată.
De asemenea, s-a realizat o cuantificare a ADN-ului şi în gel de agaroză 0.8%. Calitatea,
cât şi gradul de degradare a ADN-ului au fost evaluate în funcţie de prezenţa unei benzi de
dimensiuni normale, intense. În cazul în care banda nu era intensă, iar degradarea se putea
observa prin prezenţa unor urme, s-a recurs la repetarea extracţiei.
4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD

Unul dintre cei mai importanţi factori în reproductibilitatea metodei RAPD este puritatea
ADN-ului. Utilizarea matriţei de ADN cu o puritate mare asigură reproductibilitate prin metoda
RAPD. Amprentele RAPD vor fi identice în repetiţii numai dacă ADN-ul are o puritate adecvată.
4.7.1 Componentele amestecului de reacţie RAPD

Pentru a realiza o tehnică PCR, au fost necesare următoarele elemente, care formează
amestecul de reacţie:
 ADN-ul care conţine secvenţa ce urmează a fi amplificată
 Amorsele
 Cele patru feluri de nucleozide trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 ADN polimeraza
 Soluţia tampon în care toate aceste componente sunt amestecate.
Pentru amestecul de reacţie s-a utilizat Go Taq Green Master Mix PCR (Promega) care
are următoarea compoziţie:
- 0,05 unităţi/µl Taq DNA polymerase
15
- 4 mM MgCl2
- 0,4 mM dATP, 04 mM dCTP, 0,4 mM dGTP, 0,4 mM dTTP
Amestecul de reacţie a avut un volum final de 25µl/tub: 12,5 µl PCR Mastermix, 2,5 µl
amorsă, 2µl ADN şi 8 µl Nuclease free water (furnizată împreună cu mastermixul PCR).
4.7.2 Amplificarea PCR

Amplificarea s-a realizat în aparatul thermocycler (Corbett Research) după următorul
program:
 3 minute la 950C- predenaturare
 1 minut la 930C- denaturare
 1 minut la 340C- fixarea primerilor 45 de cicluri
 1 minut la 720C- extensie
 10 minute la 720C- extensia finală
4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR

4.8.1 Componentele amestecului de reacţie PCR
Amestecul de reacţie SSR a avut un volum de 25 μl/tub eppendorf, cu următoarea
compoziţie:
- 50 ng ADN
- 200 μM amestec dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Promega)
- 0,5 µl amorsă forward
- 0,5 µl amorsă reverse
- 2,5 mM MgCl2
- 2,5 mM 10 x buffer
- 1 U Taq DNA Polymerase (Promega)
- 2% PVP (Sigma)
- apă bidistilată sterilă
În cazul markerilor microsatelitici temperatura de fixare a primerilor poate fi diferită în
funcţie de amorsă. Pentru stabilirea acesteia s-a trecut la amplificarea unei probe de ADN în
gradient de temperatură cu fiecare din primerii SSR. S-au testat temperaturi cuprinse intre 55-
590C. În urma testării au fost stabilite următoarele programe de amplificare:
- pentru amorsele VVS2, VVMD7:

Predenaturare -950C timp de 2 minute
Denaturare -940C timp de 30 de secunde
Fixarea primerilor -560C timp de 45 secunde 30 de cicluri
Extensia -720C timp de un minut
Extensia finală -720C timp de 7 minute.
- pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79:

Predenaturare -950C timp de 2 minute
Denaturare -940C 30 de secunde
Fixarea primerilor -570C timp de 45 secunde 30 de cicluri
Extensia -720C timp de un minut
Extensia finală -720C timp de 7 minute.
În ceea ce priveşte ADN-ul obţinut din must, acesta a fost amplificat cu opt amorse
microsatelitice. De asemenea, amplificarea PCR s-a realizat cu ajutorul aparatului 96 Well
Gradient Palm-Cycler CG1-96 (Corbett Reserch).
Pentru amplificarea probelor cu cele 8 amorse s-au utilizat trei programe de amplifcare,
diferenţa între cele trei programe fiind temperatura de a fixare a amorselor.
16
Pentru amorsele VVS 2, VVMD 7 s-a folosit următorul program de amplificare:

Predenaturare 950C timp de 2 minute
Denaturare la 950C - 30 de secunde 30 de cicluri

Fixarea amorselor la 560C - 45 de secunde
Extensia la 720C – 1 minut
Extensia finală 720C – 7 minute
Pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 s-a folosit următorul program
de amlpificare:
Denaturare la 950C - 30 de secunde

Fixarea amorselor la 570C - 45 de secunde 30 de cicluri
În cazul amorselor VVS 5 şi VVMD 5, VVS 29 programul de amplificare a fost

următorul:
Denaturare la 950C - 30 de secunde

Fixarea amorselor la 580C - 45 de secunde 30 de cicluri
Migrarea electroforetică
După stabilirea programelor de amplificare s-a trecut la amplificarea tuturor probelor cu
cele 8 amorse microsatelitice.
Produşii de amplificare obţinuţi cu amorsele RAPD au fost migraţi în gel de agaroză
1,4%. Sursa de putere a fost programată la tensiunea de 80V, respectiv 200 mA iar durata de
migrare a fost de 1 oră şi 30 de minute. Metoda electroforetică se bazează pe separarea diferitelor
specii de particule încărcate electric, prin migrarea diferenţiată sub influenţa unui câmp electric.
Produşii PCR obţinuţi în urma amplificării cu amorsele SSR, au fost migraţi în gel de
agaroză 4%. Soluţia tampon, utilizată în electroforeză, a fost Tris-acetatul (TAE 1x). În gel au
fost încărcaţi 12 μl produs PCR. Deoarece bufferul a fost colorat, nu a mai fost necesar
adăugarea unui alt tip de colorant. Sursa de putere a fost programată la tensiunea de 100V,
respectiv 200 mA iar durata de migrare a fost de 2 ore.
Deoarece gelul de agaroză nu are o putere de rezoluţie aşa de ridicată, el nefiind capabil
să separe fragmente de ADN care diferă printr-o singură pereche de baze, ulterior produşii de
amplificare au fost migraţi în gel de poliacrilamidă, gel cu o putere de rezoluţie mult mai
ridicată.
17
4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR

În analizarea statistică a imaginilor au fost luate în considerare doar benzile cu o
intensitate luminoasă mare. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.
Cu ajutorul acestui program se stabileşe mărimea fragmentelor de ADN prin compararea
acestora cu un ADN standard (Lader ADN 100pb).
În urma comparării cu ADN-ul standard s-a stabilit mărimea fiecărui fragment amplificat.
Matricea binară a fost utilizată ulterior pentru calcularea distanţelor genetice, pe baza cărora s-a
realizat întocmirea dendogramei. Calcularea distanţelor genetice şi întocmirea dendogramei s-a
realizat cu ajutorul programului FreeTree 0.9.1.50, utilizând coeficientul Nei Li/Dice pentru
distanţele genetice, respectiv metoda UPGMA pentru dendogramă. Programul FreeTree 0.9.1.50
permite optimizarea structurii arborelui şi totodată testarea robusteţii acestuia prin calcularea
valorilor de coeficienţă Bootstrap şi/sau Jackknifing. Prezentarea grafică a dendrogramei s-a
realizat cu programul TreeView.
CAPITOLUL V
REZULTATE ŞI DISCUŢII
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII

ŞI CALITĂŢII ACESTUIA
În urma extracţiei de ADN de la cele 10 soiuri de viţă de vie recoltate de la Staţiunea de
Cercetări Experimentale Cluj-Napoca, utilizând metoda descisă de Lodhi şi colab. (1994) şi
modificată de Pop şi colab. (2003b) s-au obţinut cantităţi cuprinse între 145 ng/µl şi 1121,79
ng/µl, cu o puritate care a variat între 1,82 şi 2. Au fost realizate câte două citiri pentru fiecare
probă în parte. Cea mai mică cantitate s-a obţinut la soiul Muscat Perla de Csaba (145,33), iar
cea mai mare s-a obţinut la soiul Coarnă neagră (1121,79). Cantitatea a fost corespunzătoare
având în vedere că pentru amplifacare s-au utilizat 50 ng. Astfel, ADN-ul extras a fost diluat cu
apă ultrapură până la concentraţia finală de 50ng/µl (tab 7).
În ceea ce priveşte cantităţile obţinute în urma extracţiei ADN-ului din probele recoltate
de la SDE Iaşi, cea mai mică cantitate s-a obţinut la soiul Napoca şi anume 484,67 ng/μl iar cea
mai mare cantitate a fost de 743,85 ng/μl la soiul Coarnă albă. De asemena purităţile obţinute în
urma efectuării extracţiilor la cele 10 soiuri au variat între 1,82 şi 2.
De asemenea calitatea ADN-ului a fost verificată şi în gel de agaroză 0,8%. Astfel, dacă
banda a avut o intensitate luminoasă ridicată s-a considerat că extracţia ADN-ului din proba
respectivă a fost reuşită. În figura 1 sunt prezentate imaginile obţinute în urma cuantificării
ADN-ului în fel de agaroză. După cum se poate observa, toate probele au prezentat bandă de
intensitate luminoasă ridicată. Prin urmare, cantitatea şi calitatea ADN-ului sunt suficiente pentru
efectuarea următoarelor analize.
L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD
Banda de
ADN
Fig 1. Verificarea concentraţiei de ADN a probelor analizate de la SDE Iaşi şi SDE Cluj
18
5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR

DE REACŢIE RAPD
Amplificarea probelor s-a făcut în două repetiţii pentru fiecare amorsă. De asemenea,
aceeaşi amorsă a fost folosită pentru amplificarea tuturor probelor din fiecare staţiune în parte,
obţinându-se de fiecare dată acelaşi profil electroforetic. Repetarea amplificărilor, în cazul
metodei RAPD, cel puţin de două ori, este de o importanţă fundamentală datorită sensibilităţii
evidente a metodei. Din totalul celor 30 de amorse utilizate iniţial, s-au obţinut polimorfisme cu
un număr de 12 amorse.
Fragmentele rezultate prin amplificarea cu amorsele polimorfice au avut lungimea
cuprinsă între 150 şi 2000 pb, majoritatea având între 300 şi 1500 pb.
Pentru a evidenţia posibilele diferenţe între aceleaşi soiuri, dar provenite de la staţiuni
diferite, fiecare amorsă a fost amplificată cu probele provenite de la aceleaşi soiuri dar din
staţiuni diferite. Din analiza gelurilor se observă că nu există diferenţe între provenienţele
aceluiaşi soi. Acest lucru se poate explica prin faptul că viţa de vie se înmulţeşte cel mai adesea
vegetativ, prin altoire, soiurile fiind înmulţite în staţiuni sau centre de cercetare unde este
controlată riguros provenienţa acestora.
1000 pb 1000 pb
500 pb 500 pb
a b
Fig. 2 Produşii de amplificare obţinuţi cu primerul Mic 07 la cele 10 soiuri de viţă de vie de la
SDE Cluj (a) şi Iaşi (b)
5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA

DATELOR OBŢINUTE CU AMORSELE RAPD
Un număr total de 114 fragmente de ADN de mărimi diferite au fost vizualizate. Au fost
marcate şi luate în studiu doar benzile clare de ADN amplificate. Din punct de vedere analitic au
fost selectate ca şi prezente doar benzile reproductibile din fiecare gel analizat.
Din totalul de 114 benzi cu mărime cuprinsă între 150 pb – 2000 pb, 97 de benzi au fost
polimorfice şi 17 monomorfice cu un indice al polimorfismului de 85,08%. Numărul de
fragmente polimorfice detectate de o amorsă variază de la 2 (amorsa OPA 09) la 14 (OPD 19). În
ceea ce priveşte procentul de polimorfism, acesta a variat între 100% în cazul amorselor OPAB
11, OPC 14, OPD 16 şi 50 % în cazul amorsei OPA 09.
Polimorfismul obţinut cu amorsele RAPD este mare, reflectând diversitatea accesiunilor.
Distanţele genetice calculate sunt prezentate în tabelul 3. Cu cât valorile distanţelor
genetice sunt mai mici cu atât speciile sunt mai înrudite între ele.
Tabel 3
Distanţele genetice calculate pentru cele zece soiuri luate în studiu
Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD
Ca 0.000
CN 0,236 0.000
V 0,159 0,319 0.000
TC 0,183 0,271 0,284 0.000
PC 0,250 0,385 0,244 0,263 0.000
19
Tabel 3- continuare
CA 0,301 0,279 0,341 0,244 0,341 0.000
Ce 0,205 0,297 0,111 0,263 0,244 0,341 0.000
N 0,341 0,386 0,218 0,413 0,356 0,463 0,195 0.000
MH 0,405 0,377 0,474 0,407 0,447 0,352 0,500 0,425 0.000
CD 0,470 0,395 0,365 0,444 0,341 0,375 0,341 0,317 0,465 0.000
Datele din interiorul tabelului 3 arată că cea mai mică valoare a distanţei genetice
(0,4421) s-a înregistrat între soiurile Victoria şi Cetăţuia, ceea ce denotă o strânsă înrudire între
ele, fapt confirmat şi în dendrograma din figura 36. Din puntul de vedere al distanţei genetice
considerăm că cele mai îndepărtate soiuri analizate sunt Cetăţuia şi Muscat de Hamburg,
valoarea distanţei genetice fiind de 0,500.
Apropierea genetică între cele zece soiuri de viţă de vie analizate, stabilită pe baza
matricei distanţelor genetice şi a algoritmului Neighbor Joining Tree sunt prezentate în figura 3
sub forma unei dendrograme.
În cadrul dendogramei s-au evidenţiat două grupuri principale:
Primul grup (A) cuprinde soiurile Coarnă albă şi Coarnă neagră, aceste soiuri situându-se
în acelaşi grup şi din punct de vedere ampelografic, având caractere fenotipice asemănătoare. De
asemenea, ambele soiuri au origine comună (Turcia).
Grupul B cuprinde soiurile Victoria, Cardinal, Cetăţuia, Timpuriu de Cluj, Musat Perla
de Csaba, Napoca. Soiul Victoria provine din încrucişarea soiurilor Cardinal şi Afuz Ali, soiurile
Timpuriu de Cluj şi Cetăţuia au un părinte comun, deci situarea lor în acelaşi grup confirmă acest
lucru. La o distanţă mai mare se află soiurile Chasselas dore şi Muscat de Hamburg. Grupul A
cuprinde la rândul lui alte subgrupuri cum ar fi cel care cuprinde soiurile Victoria şi Cetăţuia.
MH
CD
100
N
18
PC
58
18
TC
12
Ca
28 35
Ce
81
CA
25
CN
Fig. 3 Dendrograma obţinută la cele zece soiuri de viţă de vie analizate
5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE

CU AMORSELE SSR
Variabilitatea genetică a celor zece soiuri de viţă de vie a fost analizată la nivelul a
6 loci microsatelitici. Toate amorsele utilizate au generat produşi de amplificare şi s-au
dovedit a fi multialelice. Electroforeza produşilor de amplificare s-a realizat în gel de
agaroză de concentraţie 4%.
20
L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD
300 pb
300 pb
100 pb
100 pb
Fig. 4 Profilul electroforetic obţinut cu amorsele VVMD7 şi ZAG 47
După migrarea produşilor PCR obţinuţi cu cele şase amorse în gel de agaroză, aceştia au
fost migraţi şi în gel de poliacrilamidă. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total
Lab TL 100. Cu ajutorul acestui program se stabileşe mărimea fragmentelor de ADN prin
compararea acestora cu un ADN standard.
Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic la soiurile analizate sunt
prezentate în tabelul 4.
Tabel 4
Profilele genetice ale celor 10 soiuri de viţă de vie analizate cu cei 6 loci microsatelitici
(dimensiunea alelelor este exprimată în pb)
Amorsă VVS 2 ZAG 79 ZAG 62 ZAG 47 VVMD 7 VVS 29

Soi
Cardinal 162 249 196 166 245 265
162 249 186 166 238 265
Coarnă Neagră 167 245 202 174 245 268
156 245 192 166 235 268
Victoria 160 238 197 166 245 270
160 238 187 166 234 270
Timpuiu de Cluj 160 238 196 172 243 280
160 238 186 164 233 281
Muscat Perla de 168 251 186 162 233 280
Csaba 158 251 186 162 233 280
Caoarnă Albă 181 273 200 168 239 279
158 251 182 162 239 276
Cetăţuia 181 278 190 169 240 278
157 254 182 162 231 278
Napoca 159 239 186 164 241 278
159 239 186 164 231 276
Chasselas dore 156 266 201 164 247 278
156 245 192 159 240 278
Muscat de Hamburg 155 269 192 163 259 280
155 249 182 159 239 282
Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un număr de 10 variante alelice.
Dimensiunea alelelor este cuprinsă între 155-181 pb. Se remarcă predominanţa soiurilor
homozigote (60%) şi faptul că dimensiunile alelelor detectate depăşesc intervalul de mărime citat
de literatură. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între 0,0714 şi 0,1428.
Pentru locusul microsatelitic ZAG 79 au fost detectate tot un număr de 10 variante
alelice. Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 238-278 pb. Dintre soiurile analizate 40%
dintre acestea au fost heterozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate
depăşesc intervalul de mărime citat de literatură.
21
Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate 10 variante alelice cu dimensiuni

cuprinse între 182 pb şi 202 pb. Se remarcă în cazul acestui locus un grad mare de heterozigoţie,
80% dintre indivizi fiind heterozigoţi. Dimensiunile alelelor detectate se încadrează în intervalul
citat de literatură şi anume: 185-203 pb. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între 0,0555 şi 0,1666.
În cazul locusului microsatelitic ZAG 47 au fost detectate 9 variante alelice cu
dimensiunile cuprinse între 159 pb şi 174 pb. Se observă predominanţa indivizilor heterozigoţi,
aceştia fiind prezenţi în procent de 60%. Toate valorile alelice obţinute se încadrează în
intervalul citat de literatură şi anume 149 pb-172 pb. Frecvenţa alelelor este cuprinsă între
0,0625 şi 0,1875.
În cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 12 variante alelice cu
intervalul citat de literatură şi anume 233 pb-263 pb. În cazul acestui locus frecvenţa aleleor este
cuprinsă între 0,0588 şi 0,1176.
Pentru locusul microsatelitic VVS 29 au fost detectate 9 variante alelice diferite, cu
dimensiuni cuprinse între 265 pb şi 282 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic predominanţi
sunt indivizii homozigoţi, aceştia apărând în procent de 60%.
După cum reiese din datele prezentate mai sus, s-a obţinut un număr total de 60 de alele,
între 9 şi 12 alele/locus, numărul mediu de alele obţinute/locus fiind de 10.
Tabel 5
Parametrii genetici obţinuţi cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de viţă de vie studiate
Locus Nr. de Nr. de alele Heterozigoţia Heterozigoţia

Locus soiuri detectate aşteptată observată
No. of No. of alleles Expected Observed
varieties detected heterozygosity heterozygosity
VVS 2 10 10 0,926 0,400
ZAG 79 10 10 0,947 0,400
ZAG 62 10 10 0,884 0,800
ZAG 47 10 9 0,879 0,600
VVMD 7 10 12 0,942 0,800
VVS 29 10 9 0,895 0,400
Valoare medie 10 0,912 0,566
Datele obţinute cu amorsele SSR au fost prelucrate într-o matrice binară, pe baza căreia
au fost calculate distanţele genetice între accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetică
Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab., 2001).
Tabel 6
Distanţele genetice obţinute în urma amplificării celor 10 probe cu amorsele SSR
Ca CN V TC PC CA Ce N CD MH
Ca 0.000
CN 0.625 0.000
V 0.625 0.625 0.000
TC 0.666 0.666 0.583 0.000
PC 0.791 0.791 0.875 0.541 0.000
CA 0.708 0.625 0.708 0.625 0.541 0.000
Ce 0.708 0.625 0.708 0.625 0.666 0.458 0.000
N 0.75 0.75 0.833 0.583 0.708 0.666 0.583 0.000
CD 0.75 0.458 0.75 0.625 0.791 0.625 0.416 0.583 0.000
MH 0.708 0.583 0.708 0.583 0.666 0.458 0.541 0.708 0.541 0.000
22
Datele tabelare arată că cea mai mică valoare a distanţei genetice este 0,416 şi se observă
între soiurile Chaseelas dore şi Cetăţuia. Această apropiere este confirmată şi prin dendograma
din fig 5. Aceste două soiuri sunt considerate ca fiind cele mai apropiate din punct de vedere
genetic, deoarece cu cât valoarea dintre două soiuri este mai mucă, cu atât soiurile sunt mai
apropiate din punct de vedere genetic. Cea mai mare distanţă se află între soiurile Muscat Perla
de Csaba şi Victoria (0,875).
Apropierea genetică între cele 10 soiuri din genul Vitis analizate, stabilită pe baza
matricei distanţelor genetice şi a algoritmului UPGMA este prezentată în figura 5 sub forma unei
dendrograme.
Din fig 5 se poate observa că soiurile au fost grupate în două grupuri principale: A şi B.
Grupul A este format la rândul său din alte subgrupuri: subgrupul A1 care cuprinde soiurile
Cardinal şi Victoria. Aceste soiuri sunt foarte apropiate şi din punct de vedere ampelografic,
deoarece, soiul Victoria provine din încrucişarea soiurilor Cardinal şi Afuz Ali, deci situarea lor
pe aceeaşi ramură confirmă acest lucru. Subgrupul A2 cuprinde soiurile Carnă albă şi Coarnă
neagră. Situarea lor în acelaşi subgrup se poate explica prin faptul că aceste soiuri fac parte din
punct de vedere ampelografic din acelaşi sortogrup de soiuri cu caractere fenotipice
asemănătoare alături de Coarnă roşie şi Coarnă neagră selecţionată.
Din grupul B fac parte soiurile Muscat Perla de Csaba, Timpuriu de Cluj şi Napoca.
Situarea soiurilor Timpuriu de Cluj şi Napoca în acelaşi grup s-ar putea explica prin originea
geografică comună a celor două soiuri. Soiurile Muscat de Hamburg şi Timpuriu de Cluj se
găsesc pe aceeaşi ramură în dendogramă, ele făcând parte şi din aceeaşi grupă, cea a soiurilor cu
maturare extratimpurie şi timpurie, fiind apreciaţi mai ales pentru timpurietate.
Cardinal
44
Victoria
9
Coarna Neagra
Coarna Alba
4
39
Muscat de Hamburg
5
Cetatuia
43
Chasselas Dore
Napoca
19
Timpuriiu de Cluj
32
Muscat Perla de Csaba
Fig. 5 Dendrograma obţinută la cele zece soiuri de viţă de vie analizate cu amorsele SSR
23
5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI DIN MUST ŞI ESTIMAREA

CANTITĂŢII ŞI CALITĂŢII ACESTUIA
După extracţia ADN-ului, cantitatea şi puritatea acestuia au fost măsurate cu ajutorul
aparatului Spectofotometru ND-1000 utilizând programul NanoDrop. În urma citirii cantităţilor
de ADN obţinute obţinute după extracţia efectuată din must, cea mai mică cantitate de ADN s-a
obţinut la soiul Riesling italian (123,33 ng/µl) utilizând protocolul al treilea de extracţie şi anume
cel descris de Sambrook şi colab.(1989), iar cea mai mare cantitate de ADN s-a obţinut la soiul
Muscat Ottonel (1432.65 ng/µl) atunci când s-a aplicat protocolul descris de Faria şi coalb.
(2000). Cantităţile de ADN obţinute prin cele trei metode de extracţie după prima zi de
fermentaţie sunt prezentate în tabelul 7.
Tabel 7
Cantitatea de ADN obţinută prin cele trei metode de extracţie
SOIUL CANTITATEA DE ADN NG/µL

VARIETY DNA QUANTITY NG/µL
Protocol A Protocol B Protocol C
Burgund mare 512.79 932.84 202.41
536.75 942.25 225.8
543.28 925.23 197.32
Merlot 569.39 697.42 146.34
538.25 604.5 139.5
570.03 682.13 180.21
Cabernet Sauvignon 607.18 856.52 287.7
634.15 849.34 250.41
600.00 832.18 267.13
Riesling de Rhin 423.67 738.86 182.59
450.43 759.52 174.32
413.16 736.5 187.18
Sauvignon blanc 577.82 862.42 168.11
596.88 867.83 161.43
574.18 843.24 139.52
Riesling italian 384.99 540.98 123.33
375.25 532.83 138.45
394.47 580.72 175.75
Aligote 346.71 624.53 157.18
338.25 625.8 185.2
352.18 672.84 132.63
Muscat Ottonel 519.79 1432.65 342.71
532.24 1282.9 234.85
525.42 1025.23 217.2
Saint Emilion 445.85 705.8 252.74
460.32 775.64 225.8
450.54 726.3 202.34
Pinot gris 623.67 877.58 311.5
614.18 820.25 273.63
640.32 868.6 250.15
În urma analizelor efectuate, recomandăm aplicarea protocolului B de extracţie a ADN-

ului, protocol prin care pe media soiurilor s-au obţinut cantităţile cele mai mari de ADN şi
nivelul cel mai înalt de puritate al acestuia.
24
Pentru a stabili dacă procesul de fermentaţie are vreo influenţă asupra cantităţii şi calităţii
ADN-ului, s-au efectuat extracţii în diferite perioade ale procesului de fermentaţie. Pentru
extracţii s-au luat probe de must din diferite perioade de fermentaţie care s-au păstrat la frigider
până la efectuarea extracţiei. Deoarece, cele mai bune rezultate s-au obţinut prin metoda descrisă
de Faria şi colab (2000), s-a continuat doar cu această metodă.
În general, extracţia ADN-ului din must, a dat rezultate bune pentru probele de must din
orice perioadă a procesului de fermentaţie. Acest fapt s-a putut observa atât în urma analizei
spectofotometrice cât şi în urma migrării în gel de agaroză.
Cantităţile de ADN au început să scadă drastic la sfârşitul perioadei de fermentaţie şi
după ce vinul s-a limpezit iar depunerile au fost înlăturate. Acest lucru se poate explica prin
faptul că în must se află resturi de tescovină (pieliţă, pulpă, etc). Primul pas în extracţia ADN-
ului este centrifugarea lichidului care se doreşte a fi analizat, pentru a obţine resturile celulare
aflate în suspensie şi eliminarea supernatantului. Peste resturile obţinute în urma centrifugării se
adugă un tampon de extracţie care facilitează ruperea membranelor celulare şi nucleare. În acest
fel se obţine o cantitate de ADN adecvată efectuării viitoarelor analize.
Dacă din contră, în mediu nu se află particule în suspensie cum este în cazul unui must
limpezit sau a unui vin filtrat, cum sunt vinurile comerciale, extracţia de ADN prin această
metodă nu este posibilă.
Sinteza cantităţilor de ADN obişnuite pe parcursul perioadei de fermentaţie, precum şi
din vin este prezentată în tabelul 8. Se observă la fiecare soi cum cantităţile de ADN scad pe
parcursul perioadei de fermentaţie, ajungându-se ca în urma extecţiei din vin să nu se mai obţină
cantităţi de ADN.
Tabel 8
Evoluţia cantităţii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaţie
Ziua 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70
Soiul
Burgund 932,84 853,14 727,84 868,11 612,79 502,41 325,15 223,19 127,72 68,11 -2.85
mare
Merlot 697,42 524,32 642,56 537,73 569,39 546,34 294,24 174,45 92,17 37,73 -4.16
Cabernet 856,52 734,18 663,95 725,18 607,18 637,7 432,43 284,67 123,27 25,18 -6.34
Sauvignion
Riesling de 738,86 575,18 977,78 667,83 623,67 582,59 350,08 227,38 147,47 67,83 -6.84
Rhin
Sauvignion 862,42 703,32 754,95 723,33 576,82 668,11 284,19 197,82 95,63 23,33 -1.77
blanc
Riesling 540,98 423,18 687,81 619,6 484,99 523,33 250,35 185,54 85,81 19,23 2.79
italian
Aligote 624,53 655,52 777, 9 531,84 646,71 657,18 324,15 212,32 77,22 31,84 3.82
Muscat 1432,7 837,2 961,81 932,65 519,79 642,71 309,23 224,18 71,63 32,65 -3.09
Ottonel
Saint 705,8 673,7 548,67 743,23 745,85 552,74 293,88 152,98 84,27 43,23 -7.42
Emilion
Pinot gris 877,58 705,58 882,59 723,78 623,67 511,5 324,23 224,17 82,35 23,78 -6.62
În figura 6 sunt prezentate dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul

perioadei de fermentaţie. Din prezentarea grafică se observă că rezultatele reale urmăresc destul
de fidel dreapta de regresie, având mici abateri la dreapta sau la stânga acesteia.
25
cantitatea de ADN
1000
800
600
400
y = -22,556x + 881,73
200 2
R = 0,9132
0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34
zile
Fig. 6 Dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaţie
5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE

SSR
În efectuarea anlizelor din prezentul studiu s-au utilizat un număr de opt amorse
microsatelitice. Markerii microsatelitici sunt consideraţi cei mai informativi markeri ADN, fiind
utilizaţi, începând cu mijlocul anilor ’90, pentru caracterizarea genetică a diferitelor soiuri de viţă
de vie cultivate în diverse ţări cu tradiţie viticolă, aceştia oferind un profil genetic unic pentru
fiecare soi, ceea ce permite caracterizarea fără echivoc a oricărei varietăţi.
Toate amorsele utilizate au generat produşi de amplificare şi s-au dovedit a fi
multialelice. Electroforeza s-a realizat pentru început în gel de agaroză 4% iar migrarea s-a
realizat la o putere de 100V. Pentru estimarea dimensiunilor fragmentelor, în gel a fost încărcat
un marker ADN de 25 pb (Promega), având fragmente cuprinse între 25 şi 300 pb.
Pentru a urmări dacă ADN-ul extras pe parcursul perioadei de fermentaţie şi din vin este
suficient pentru efectuarea reacţiilor PCR, acesta a fost amplificat cu amorsa ZAG 79, în cazul
soiului Aligote. Se poate observa din imaginea gelului că s-au obţinut benzi în cazul utilizării
ADN-ului extras pe parcursul perioadei de fermentaţie, dar nu s-au mai obţinut benzi cu ADN-ul
extras din vin.
L 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70
300 pb
100 pb
Fig. 7 Produşii de amplificare obţinuţi în urma migrării cu amorsa ZAG 79 la soiul

Aligote
Pentru determinarea cu acurateţe a dimensiunilor produşilor de amplificare, aceştia au

fost migraţi în gel de poliacilamidă, gel care are o putere de rezoluţie foarte mare, putând separa
fragmente de ADN care diferă în mărime şi printr-o singură pereche de baze.
Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic, la cele 10 soiuri luate în studiu
sunt prezentate în talelul 9. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.
26
Tabel 9
Profilele genetice ale celor 10 soiuri de viţă de vie analizate cu cei 8 loci microsatelitici
(dimensiunea alelelor este exprimată în pb)
Pimer VVMD 7 VVS 29 ZAG 47 ZAG 79 ZAG 62 VVS5 VVMD5 VVS2

Soi
Frunze
Merlot 246 178 168 257 187 149 235 132
237 171 159 240 199 149 237 132
Sauvignon 250 172 157 251 185 92 233 140
blanc 241 172 157 240 187 92 237 140
Riesling 242 173 158 245 195 92 - 136
italian 142 173 158 240 199 116 138
Muscat 253 182 165 261 187 106 231 136
Ottonel 243 174 156 242 203 149 235 136
Pinot gris 253 176 160 269 193 92 235 138
245 176 155 248 203 98 237 140
Riesling de 247 184 164 245 185 98 235 134
Rhin 247 176 160 238 185 98 239 134
Aligote 258 184 163 257 199 106 - 136
249 177 153 257 199 116 136
Saint 252 184 158 249 193 90 - 135
Emilion 252 178 158 235 199 92 135
Burgund 262 184 160 257 187 98 226 138
mare 251 175 147 257 193 98 231 138
Cabenet 262 181 163 258 203 98 - 140
Sauvignon 254 178 163 258 203 148 140
Must monovarietal
Merlot 246 178 168 257 187 149 235 132
237 171 159 240 199 149 237 132
Sauvignon 250 172 157 251 185 92 233 140
blanc 241 172 157 240 187 92 237 140
Riesling 242 173 158 245 195 92 - 136
italian 142 173 158 240 199 116 138
Muscat 253 182 165 261 187 106 231 136
Ottonel 243 174 156 242 203 149 235 136
Pinot gris 253 176 160 269 193 92 235 138
245 176 155 248 203 98 237 140
Riesling de 247 184 164 245 185 98 235 134
Rhin 247 176 160 238 185 98 239 134
Aligote 258 184 163 257 199 106 - 136
249 177 153 257 199 116 136
Saint 252 184 158 249 193 90 - 135
Emilion 252 178 158 235 199 92 135
Burgund 262 184 160 257 187 98 226 138
mare 251 175 147 257 193 98 231 138
Cabenet 262 181 163 258 203 98 - 140
Sauvignon 254 178 163 258 203 148 140
În cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 15 variante alelice cu
intervalul citat de literatură şi anume 233 pb-263 pb.
27
În cazul locusului microsatelitic VVS 29 au fost detectate 11 variante alelice cu

aceştia fiind prezenţi în procent de 70%. Dimensiunile alelelor detectate se încadrează în
dimensiunile cuprinse între 147 pb şi 168 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic se observă
predominanţa indivizilor heterozigoţi, aceştia fiind prezenţi în procent de 60%. Toate valorile
alelice obţinute se încadrează în intervalul citat de literatură şi anume 149 pb-172 pb.
aceştia fiind prezenţi în procent de 70%. Se observă că aproape toate valorile alelice obţinute se
încadrează în intervalul citat de literatură şi anume 236 pb-260 pb.
Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate tot un număr de 6 variante alelice.
Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 185-203 pb. Dinte soiurile analizate 70% dintre
acestea au fost heterozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate nu depăşesc
intervalul de mărime citat de literatură.
În cazul locusului microsatelitic VVS 5 au fost detectate 7 variante alelice cu
Pentru locusul microsatelitic VVMD 5 au fost detectate 6 variante alelice diferite, cu
dimensiuni cuprinse între 226 pb şi 239 pb. În cadrul acestui locus microsatelitic toţi indivizii
care au prezentat bandă au fost identificaţi ca fiind heterozigoţi. Şi în cadrul acestui locus
microsatelitic toate valorile alelice obţinute se încadrează în intervalul citat de literatură şi anume
226-246.
Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un număr de 6 variante alelice.
Dimensiunea acestora a fost cuprinsă între 132-140 pb. Dinte soiurile analizate 80% dintre
acestea au fost homozigote. Şi în cazul acestui locus dimensiunile alelelor nu detectate depăşesc
intervalul de mărime citat de literatură şi anume 126-151.
În urma analizelor efectuate, s-au obţinut un număr total de 122 de alele cu o medie de
15,25 alele/locus.
Tabel 10
Parametrii genetici obţinuţi cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de viţă de vie studiate
Locus Nr. de Nr. de Heterozigoţia Heterozigoţia Homozigoţia Homozigoţia

Locus soiuri alele aşteptată observată aşteptată observată
No. of detectate Expected Observed Expected Observed
varieties No. of heterozygosity heterozygosity homozigosity homozigosity
alleles
detected
VVMD7 10 16 0,973 0,700 0,026 0,300
VVS 29 10 16 0,926 0,700 0,073 0,300
ZAG 47 10 16 0,931 0,600 0,068 0,400
ZAG 79 10 17 0,921 0,700 0,078 0,300
ZAG 62 10 17 0,852 0,700 0,147 0,300
VVS 5 10 16 0,842 0,600 0,157 0,400
VVMD5 10 12 0,509 0,600 0,090 0
VVS2 10 12 0,847 0,200 0,152 0,800
Valoarea 15,25 0,850 0,600 0,098 0,35
medie
28
Heterozigoţia aşteptată (HetExp) şi observată (HetObs) şi, respectiv, homozigoţia

aşteptată (HomExp) şi observată (HomObs) au fost calculate cu coeficientul de corecţie al lui
Levene, cu ajutorul programului Genepop (Raymond şi Rousset, 1995).
Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,509 (VVMD 5) şi 0,973 (VVMD 7), cu
o medie de 0,850, după cum reiese din tabelul nr. 40. Valorile heterozigoţiei observate au
prezentat o valoare minimă de 0,200 (VVS 2) şi maximă de 0,700 (ZAG 62, VVMD 7, VVS 29,
ZAG 79), cu o medie de 0,6. Cea mai mare diferenţă între valoarea heterozigoţiei aşteptate şi cea
observată (0,273) s-a înregistrat în cazul locusului VVMD 7.
În cazul a şapte loci heterozigoţia aşteptată a dat valori mai mari decât heterozigoţia
observată, iar în cazul locusului VVMD 5 heterozigoţia aşteptată a dat valori mai mici decât cea
observată.
CONCLUZII
 Metoda utilizată în acest studiu, şi anume cea descrisă de Lodhi şi colab. 1994,
modificată de Pop şi colab 2003b, a permis obţinerea unui ADN de înaltă calitate.
 În urma aprecierii cantităţii şi calităţii ADN-ului la cele 10 soiuri de viţă de vie de masă,
s-a observat faptul că aceşti doi parametri sunt influenţaţi de genotip.
 Din totalul celor 30 de amorse RAPD testate, doar 12 au generat polimorfisme cu
fragmente ce au variat între 150 şi 2000 pb.
 Faptul că nu s-au observat diferenţe între staţiunile didactice de unde s-au recoltat probele
se datorează înmulţirii vegetative ce a fost şi este riguros controlată atât de centre de
cercetare cât şi de staţiuni.
 În urma analizării probelor cu cele 12 amorse polimorfice s-a obţinut o medie a
procentului de polimorfism de 80%. În urma calculării distanţelor genetice s-a obţinut cea
mai mică valoare (0,4421) între soiurile Victoria şi Cetăţuia, iar cea mai mare valoare
(0,500) s-a obţinut între soiurile Cetăţia şi Muscat de Hamburg.
 În urma analizelor SSR, dimensiunile alelelor la soiurile analizate s-au încadrat în
intervalul citat de literatura de specialitate, excepţie făcând markeii VVS 2 şi ZAG 79.
 În cadrul cercetărilor aferente tezei de doctorat, markerii SSR au fost utilizaţi cu succes în
studierea polimorfismului genetic la viţa de vie, profilele genetice ale soiurilor sugerând
o diversitate genetică la nivel molecular.
 Utilizând amorsele SSR am obţinut un număr total de 60 de alele, între 9 şi 12
alele/locus, numărul mediu de alele obţinute/locus fiind de 10.
 Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,884 (ZAG 62) şi 0,947 (ZAG 79), cu o
medie de 0,912. Valorile heterozigoţiei observate au prezentat o valoare minimă de
0,400 (VVS 2, ZAG 79, VVS 29) şi maximă de 0,800 (ZAG 62, VVMD 7), cu o medie
de 0,566.
 În urma prelucrării datelor obţinute cu amorsele SSR, cea mai mică valoare a distanţei
genetice de 0,416 s-a observat între soiurile Chaseelas dore şi Cetăţuia, fapt confirmat şi
prin dendogramă, iar cea mai mare distanţă se află între soiurile Muscat Perla de Csaba şi
Victoria (0,875).
 În urma testării celor trei metode, metoda descrisă de Faria şi colab (2000) a dat cele mai
bune rezultate, prin această metodă obţinându-se cele mai mari cantităţi de ADN.
 Din analiza varianţei, aplicată rezultatelor de extracţie a ADN, a reieşit că cei doi factori
experimentali (soiul şi metoda de extracţie), au influenţat distinct semnificativ cantitatea
şi puritatea de ADN obţinute.
 Între soiuri există diferenţe asigurate statistic în ceea ce priveşte cantitatea de ADN
obţinută, indiferent de metoda de extracţie aplicată, ceea ce sugerează că genotipul, la
29
viţa de vie, influenţează în mod hotărâtor cantitatea de ADN ce poate fi extrasă prin
metode curent folosite în acest scop.
 Metoda de extracţie a avut, de asemenea, o influenţă semnificativă asupra cantităţii şi
purităţii ADN-ului ce se poate obţine, indiferent de localitatea de experimentare.
 Procesul de fermentaţie a influenţat în mod negativ cantitatea şi puritatea ADN-ului;
ADN-ul extras din vinul obţinut prin microvinificaţie nu a putut fi utilizat în analizele
moleculare.
 În urma comparării profilelor genetice obţinute din must, s-a constatat că acestea au fost
identice cu cele obţinute din frunze.
 Cei 8 markeri microsatelitici aleşi pentru acest studiu s-au dovedit a fi informativi şi
eficienţi în identificarea corectă şi analizarea structurii genetice.
 În urma prelucrării datelor, s-au obţinut un număr total de 122 de alele cu o medie de
15,25 alele/locus, alele care s-au încadrat în intervalul citat de literatură.
RECOMANDĂRI
 Datele obţinute în studiul de faţă se recomandă a fi integrate cu datele morfologice,

fenologice şi biometrice pentru a identifica cu acurateţe cultivarele existente în plantaţiile
viticole. De asemenea se recomandă utilizarea lor pentru protecţia legală a cultivarelor.
 Se recomandă continuarea cercetărilor în ceea ce priveşte studierea polimorfismului la
soiurilor de masă, pentru a creşte valoarea informaţiilor.
 Se recomandă perfecţionarea metodelor de extracţie din vin pentru ca ADN-ul extras din
acesta să poată fi utilizat în tehnicile moleculare ce urmăresc genotipizarea vinurilor
comerciale.
 Metoda SSR poate fi folosită cu succes în laboratoarele acreditate ce urmăresc
amprentarea vinurilor comerciale. Acest lucru fiind foarte important pentru producătorii
de vin, agenţiile de control guvernamental sau ale protecţiei consumatorului.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. ANTOCE A.O, 2005, Condiţionarea, ambalarea şi etichetarea vinurilor. Editura Ceres,

Bucureşti
2. BALEIRAS-COUTO M.M., J.E. EIRAS-DIAS, 2006, Detection and identification of
grape varieties in must and wine using nuclear and chloroplast microsatellite markers.
Analytica Chimica Acta 563, pag. 283-291
3. BOWERS J.E, G.E. DANGL, R. VIGNANI, C.P. MEREDITH, 1996, Isolation and
characterization of new polimorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera
L.) Genome 39, 628-633.
4. CONSTANTINESCU, G., 1971, Viticultură generală, EDP, Bucureşti.
5. COTEA V., 1995, Vinul în existenţa umană- discurs de recepţie. Editura Academiei
Române.
6. DI GASPERO G., E. PETERLUNGER, R. TESTOLIN, K.J. EDWARDS, G.
CIPRIANI 2000, Conservation of microsatellite loci within the genus vitis.
theoretical& applied genetics 101, pag. 301-308
7. FARIA M. A, R. MAGALHAES, M.A. FERREIRA, C.P. MEREDITH, F. FERRIRA
MONTEIRO, 2000, Vitis vinifera must varietal authentification using microsatellite DNA
Analysis (SSR), Journal of Agriculture Food Chem, 48 (4), 1096-1100
30
8. GUPTA M., Y.S. CHYI, J. ROMERO-SEVERSON, J.L. OWEN, 1996, Amplification of

DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-
sequence repeats. Theor.Appl.Genet.89,998-1006
9. HAMADA H., H. LEIDMAN, B.H. HOWARD, C.M. GORMAN, 1984, Enhanced gene
expression by the poly (dT-dG)-poly(dC-dA) sequence. Mol. Cell. Biol., 4: 2622-2630
10. HAMPL V., A. PAVLÍCEK, J. FLEGR, 2001, Construction and bootstrap analysis of
DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree:
Application to trichomonad parasites, International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 51: 731-735.
11. JEFFERS A.J., V. WILSON, S.L. THEIN, 1985, Hypervariable “minisatellite” regions in
human DNA. Nature 314: 67-73
12. KARP A., S. KRESOVICH, K.V. BHAT, W.G. AYAD, T. HODGKIN, 1997, Molecular
tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI
Technical Bulletin No. 2. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy
13. LODHI M.A., Z.GUANG-NING, F.N.F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1994, A simple and
efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and
Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter 12(1), pag. 6-13.
14. MULLINS M.G., A. BOUQUET, L.E. WILLIAMS, 1992, Biology of the grapevine.
Cambridge University Press, Cambridge
15. NĂMLOŞANU I., ARIANA OANA ANTOCE, 2005, Oenologie-controlul şi prevenirea
fraudelor, Editura Ceres, Bucureşti
16. POP NASTASIA, 2003a, Viticultură generală, Editura Academic Press
17. POP RODICA, M., ARDELEAN, D. PAMFIL, IOANA GABOREANU, 2003b, The
efficiency of different DNA isolation and purification protocols in ten cultivars of Vitis
vinifera. Bul. USAMV Cluj, 59, 259-261
18. RAYMOND M., F. ROUSSET, 1995, GENEPOP (version 1.2): A population genetics
software for exact tests and ecumenicism, J. Heredity, 86:248-249.
19. SAMBROOK J., E.F. FRITISH, T. MANIATIS, 1989, Molecular cloning: A Laboratory
manual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York USA
20. SAVAZZINI F., L. MARTINELLI, 2006, DNA Analysis in Wines: Development of
Methods for Enhanced Extraction and Real-time Polymerase Chain Reaction
Quantification, Analytica Chimica Acta
21. SEFC K.M, F. REGNER, E. TURETSCHEK, J. GLOSSL, H. STEINKELLNER, 1999,
Identification of microsatellite sequence in Vitis riparia and their applicability for
genotyping of different Vitis species. Genome 42, 367-373.
22. STOIAN V., 2001, Marea carte a degustării vinurilor: degustarea pe înţelesul tuturor. Ed.
Artprint, Bucureşti
23. THOMAS M.R., N.S. SCOTT, 1993, Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA
polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (sts). Theor. Appl. genet. 86,
pag. 985-990
24. ŢÂRDEA C., LILIANA ROTARU, 2003, Ampelografie, vol I şi II, Editura Ion Ionescu
De la Brad, Iaşi
25. VICENTE M.C., C. LÓPEZ, T. FULTON, 2004, Genetic Diversity Analysis with
Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources
Institute (IPGRI), Rome, Italy.
26. WEBER J.L., 1990, Informativeness of human (dC-dA)n-(dG-dT)n polymorphisms.
Genomics, 7:524-530
27. WILLIAMS J.G.K., A. R. KUBELIK, K. J. LIVAK, J. A. RAFALSKI, S.V. TINGEY,
1990, DNA polymorphoisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nuc. Acids Res. 18(22):6531-6535.
31

Trifan PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Trifan PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

Biolog Trifan Daniela Silvia (Briciu)

STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII

5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR DE

5.3 RESULTS REGARDING THE IMAGE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF

1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANICĂ A VIŢEI DE VIE

1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS

1.3 IMPORTANŢA VIŢEI DE VIE

2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAŢIE DE-A LUNGUL TIMPULUI

2.2 MIJLOACE ŞI METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI

2.3 METODELE ŞI MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE

2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticităţii soiurilor

3.1 GENERALITĂŢI PRIVIND MARKERII MOLECULARI

3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAŢI ÎN PREZENTA TEZĂ DE

3.3 UTILIZAREA AMPRENTĂRII GENETICE ÎN DETERMINAREA

4.1 SCOPUL CERCETĂRII

prezintă un grad ridicat de polimorfism. Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a

4.2 OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE

4.3 MATERIALUL BIOLOGIC

4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI

4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE ÎN AMPLIFICAREA ADN-ULUI

4.6 TEHNICI ŞI METODE CERCETARE

4.6.2.2 Păstrarea mustului

4.6.2.3 Extracţia ADN-ului din must în vederea realizării analizelor SSR

4.6.3 Cuantificarea ADN-ului

4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD

4.7.1 Componentele amestecului de reacţie RAPD

4.7.2 Amplificarea PCR

4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR

- pentru amorsele VVS2, VVMD7:

- pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79:

Pentru amorsele VVS 2, VVMD 7 s-a folosit următorul program de amplificare:

Denaturare la 950C - 30 de secunde 30 de cicluri

Extensia finală 720C – 7 minute

Predenaturare 950C timp de 2 minute

Denaturare la 950C - 30 de secunde

Extensia finală 720C – 7 minute

În cazul amorselor VVS 5 şi VVMD 5, VVS 29 programul de amplificare a fost

Predenaturare 950C timp de 2 minute

Denaturare la 950C - 30 de secunde

Extensia finală 720C – 7 minute

4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR

5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI ŞI ESTIMAREA CANTITĂŢII

5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR

5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA

5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE

Fig. 4 Profilul electroforetic obţinut cu amorsele VVMD7 şi ZAG 47

Amorsă VVS 2 ZAG 79 ZAG 62 ZAG 47 VVMD 7 VVS 29

Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate 10 variante alelice cu dimensiuni

Locus Nr. de Nr. de alele Heterozigoţia Heterozigoţia

Muscat Perla de Csaba

5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA ADN-ULUI DIN MUST ŞI ESTIMAREA

SOIUL CANTITATEA DE ADN NG/µL

În urma analizelor efectuate, recomandăm aplicarea protocolului B de extracţie a ADN-

În figura 6 sunt prezentate dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul

Fig. 6 Dreapta şi ecuaţia de regresie a cantităţii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaţie

5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE

Fig. 7 Produşii de amplificare obţinuţi în urma migrării cu amorsa ZAG 79 la soiul

Pentru determinarea cu acurateţe a dimensiunilor produşilor de amplificare, aceştia au

Pimer VVMD 7 VVS 29 ZAG 47 ZAG 79 ZAG 62 VVS5 VVMD5 VVS2

În cazul locusului microsatelitic VVS 29 au fost detectate 11 variante alelice cu

Locus Nr. de Nr. de Heterozigoţia Heterozigoţia Homozigoţia Homozigoţia

Heterozigoţia aşteptată (HetExp) şi observată (HetObs) şi, respectiv, homozigoţia