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DEPARTAMENTO ACADÉMICO
DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
TESIS
LICENCIADO EN
BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA-PARASITOLOGÍA
Presentado por:
Br. José Samuel Flores López
Br. Julio César Benites Santisteban
LAMBAYEQUE-PERÚ
2015
Efecto del estiércol de cuy, porcino y vacuno en la
biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel en terrarios
TESIS
BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA-PARASITOLOGÍA
APROBADO POR:
PRESIDENTE
SECRETARIO
VOCAL
PATROCINADORA
LAMBAYEQUE, PERÚ
2015
Agradecimiento
I. INTRODUCCIÓN….....................................................................................1
II. MARCO TEÓRICO......................................................................................4
2.1 Antecedentes de la investigación......................................................4
2.2 Base teórica….......................................................................................8
2.2.1 Petróleo...............................................................................................9
2.2.2 Biodegradación del petróleo..........................................................14
2.2.3 Tecnologías de remediación.........................................................19
III. MATERIAL Y MÉTODOS........................................................................26
3.1 Material biológico...............................................................................26
3.2 Población y muestra de estudio…...................................................26
3.3 Métodos................................................................................................26
3.3.1 Variables en estudio…...................................................................26
3.3.2 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis….......26
3.3.3 Primera fase: Determinación de las características químicas,
microbiológicas y toxicidad del suelo experimental..................27
3.3.4 Segunda fase: Efecto del estiércol en la biorremediación
del suelo...........................................................................................37
3.3.5 Análisis estadísticos de datos…...................................................49
IV. RESULTADOS..........................................................................................50
4.1 Características químicas, microbiológicas y toxicidad de suelo
contaminado con diésel….................................................................50
4.2 Características químicas, microbiológicas y toxicidad del
estiércol….............................................................................................50
4.3 Efecto del estiércol en la biorremediación de suelo contaminado
con hidrocarburos de diésel…..........................................................50
V. DISCUSIÓN…............................................................................................67
VI. CONCLUSIONES....................................................................................75
VII. RECOMENDACIONES...........................................................................76
VIII. RESUMEN…............................................................................................77
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................78
Índice de tablas
1
bioaumentación. La
2
bioestimulación se define como la adición de nutrientes, principalmente fuentes
de nitrógeno y fósforo, agua y oxígeno para favorecer el crecimiento y
desarrollo microbiano. La bioaumentación es la adición de microorganismos
endógenos o exógenos previamente caracterizados e incrementados1,2.
2.2.1 Petróleo
El término petróleo deriva del latín petroleum, formado por petra que
significa piedra y óleum aceite. El crudo de petróleo se caracteriza por ser un
líquido negro viscoso, constituido por miles de compuestos, básicamente de la
familia de los hidrocarburos (50-98%), cuya fórmula general es C nH2n+2. La
composición elemental de un crudo es C (84-87%), H(11-14%), S(0-8%), O(0-
4%), N(0-0,5%) y elementos traza como el níquel y el vanadio(<1% v/v) 6. Los
principales componentes (Figura 1) se subdividen y purifican en cuatro
fracciones: saturada (57%), aromática (29%), resinas y asfaltenos (14%), es
decir: componentes saturados (alcanos acíclicos y cicloalcanos), insaturados
(aromáticos) y polares que incluyen las resinas y asfaltenos 6,10,16.
La mayor parte del nitrógeno, oxígeno y azufre están asociados con
las resinas y asfaltenos, por lo que se les denomina compuestos NSO polares 15.
3.3 Métodos
3.3.1 Variables en estudio
Variable independiente: Estiércoles de cuy, porcino y vacuno.
Variable dependiente: Biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel.
Figura 11. Caldo nutritivo para la cuantificación del número más probable de
microorganismos totales.
Figura 12. Caldo Bushnell Haas para la cuantificación del número más probable
de microorganismos hidrocarbonoclásticos.
Se utilizaron semillas de rabanito a las que previamente se les determinó
el porcentaje de germinación. En cinco placas de Petri, con papel esterilizado y
humedecido con agua esterilizada se depositaron 20 semillas por placa, se
taparon y se mantuvieron a temperatura ambiente (28 °C), humedeciéndolas
interdiariamente, hasta obtener el máximo de germinación, que fue 99
% después de 120 horas (Figura 13).
PGR X CRR
IG% = 100
Donde:
T10:Testigo abiótico X X X
0,1 mL 0,9 mL 9 mL 90 mL
c) Proceso de biorremediación
El suelo de cada terrario fue mezclado con el estiércol de cuy, porcino
o vacuno (Figura 27), en la proporción 6:1, correspondiente a 2408 kg de suelo
experimental y 401,33 g de estiércol. Los nutrientes nitrógeno y fósforo se
aplicaron32 hasta alcanzar la relación C: N: P de 100: 10:1 (Anexo 4), para lo
cual se agregaron por terrario (Figura 28) 0,108 g de urea (46% N) y 0,00198 g
de fosfato diamónico (18% N, 46% P). En el testigo consorcio bacteriano se
aplicaron 120 mL (5%) del consorcio bacteriano por terrarios (Figura 29),
correspondiendo 24 mL a cada una de las cinco bacterias seleccionadas.
Inmediatamente después, el contenido de los terrarios se mezcló durante 5
minutos. Para facilitar la aireación, el suelo de todos los terrarios fue removido
dos veces por semana (Figura 30) y en simultáneo se realizaron riegos con
agua declorada hasta alcanzar 60% de la capacidad de campo 6.
d) Condiciones meteorológicas
Durante la biorremediación se registraron las temperaturas máxima,
mínima y media, datos obtenidos por la estación meteorológica de la
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo ubicada en el fundo “El Ciénago” en
Lambayeque. La temperatura media mínima fue 21,0°C en agosto y la máxima
de 23,4°C en noviembre (Tabla 1).
Temperatura
Meses
Máxima Mínima Media
Si − Sf
E= x 100
Si
Donde:
Características Valores
Características Valores
Estiércol
Características Cuy Porcino Vacuno
Figura 31. Porcentaje de bacterias que utilizaron diésel como fuente de carbono
y energía.
Tabla 6. Tiempo requerido para la utilización de diésel como fuente de carbono
y energía por bacterias aisladas de suelo contaminado
Degradación de diésel
Género bacteriano Tiempo
(horas) UAE mL-1
Pseudomonas sp. J1 40 0,615
Características
Acinetobacter sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp.
Células Bacilos rectos Bacilos rectos Bacilos rectos
Tinción de gram - - +
Motilidad - + +
Oxidasa - + -
Catalasa + + +
Descarboxilación de arginina - +
Hidrólisis de la gelatina - -
Hidrólisis de la esculina - -
Reducción de nitrato - +
Descarboxilación de lisina + -
Polimixina B (300UI) ND S
Penicilina R ND
Oxido-fermentación
Glucosa + +
Maltosa + -
Manitol - +
Sacarosa - -
Xilosa + +
Utilización del citrato - + +
Posición de la espora Central
Acidez :
Glucosa +
Manitol +
Xilosa -
Arabinosa -
Hidrólisis de lecitina -
Hidrólisis de almidón -
ND: No determinado, R: Resistente, S: Sensible
NMP g /días
Tratamientos -1
0 30 60 90
NMP g /días
Tratamientos -1
0 30 60 90
62
Tabla 12. Índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito” durante la biorremediación de suelo contaminado con
diésel
* Significancia (α=0,05)
63
Tabla 13. Niveles de toxicidad de contaminantes durante la biorremediación de suelo contaminado con diésel
Nivel de toxicidad
Tratamientos 0 30 60 90
65
Tabla 14. Características del suelo contaminado con hidrocarburos de diésel y biorremediado durante 90 días con estiércol de
cuy + NP
Días
Características 0 30 60 90
66
V. DISCUSIÓN
El diésel se utilizó como contaminante del suelo porque este derivado del
petróleo tiene grandes probabilidades de derrames durante su traslado y
comercialización en las estaciones de servicio 1,15,22. Los hidrocarburos de los
derivados del petróleo son los contaminantes más comunes en la naturaleza.
Su presencia ha sido detectada en componentes vivos e inertes de los
ecosistemas1. El diésel, derivado del petróleo es el combustible más utilizado
en la actualidad. Está constituido por 64,1% de parafinas; 31% de aromáticos y
4,9% de oleofinas, siendo más difícil de tratar que la gasolina o el gasoil26,34.
68
metabolización. Si la concentración es muy alta, los microorganismos se
intoxican y mueren1,38.
Nombre Ubicación
Peptona 5,0
Peptona 5,0
Triptona 5
Dextrosa 1
Agar 12
pH final 7
NaCl 5,0
Lactosa 10,0
pH 7,0
Caldo Bushnell Hass (gL-1)
KH2PO4 1,0
K2HPO4 1,0
(NH4)2SO4 1,0
MgSO4 0,20
Cl2Ca 0,02
FeCl3 0,005
pH 7,0
KH2PO4 18,0
K2HPO4 6,0
MgSO4 0,2
(NH4)2SO4 4,0
Etanol 20,0 mL
pH 7,0
ANEXO 3
Donde:
Tabla NMP/100mL
ANEXO 4
x 1 U/P
x = 2,174 kg FDA.ha-1
x = 0,217 g FDA.m2
0,217 g FDA 1 m2
x 70%(0,0726) m2
x = 0,011 g FDA
0,000011 kg FDA x
x = 0,00000198 kg N
x = 0,00198 g N FDA
x 10 U/N
x = 21,739 kg úrea.ha-1
x = 2,1739 g úrea.m2
2,174 g úrea 1 m2
x 70%(0,0726) m2
x = 0, 110 g N
x = 0, 108 g úrea
Anexo 5. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) al inicio del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 320 321 332 9,3x105 1,5x106 1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 211 311 322 2x105 7,5x105 2,1x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 211 221 322 2x105 2,8x105 2,1x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 223 310 320 4,2x105 4,3x105 9,3x105
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 221 300 303 2,8x105 2,3x104 9,5x105
95
Anexo 6. Número más probable de microorganismos totales (NMP g -1) a los 30 días del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 311 320 333 7,5x105 9,3x105 >1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 311 322 323 7,5x105 2,1x106 2,9x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 210 310 330 1,5x105 4,3x105 2,4x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 331 331 331 4,6x106 4,6x106 4,6x106
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 321 333 333 1,5x106 >1,1x107 >1,1x107
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 332 333 333 >1,1x107 >1,1x107 >1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 221 332 333 2,8x105 1,1x107 >1,1x107
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 211 333 333 2x105 >1,1x107 >1,1x107
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 322 333 333 2,1x106 >1,1x107 >1,1x107
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 332 333 333 1,1x107 >1,1x107 >1,1x107
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 310 332 333 4,3x105 1,1x107 >1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 110 322 333 7.3x104 2,1x106 >1,1x107
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 201 333 333 1,4x105 >1,1x107 >1,1x107
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 210 333 333 1,5x105 >1,1x107 >1,1x107
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 320 333 333 9,3x105 >1,1x107 >1,1x107
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 111 222 222 1,1x104 3,5x104 3,5x104
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 211 222 222 2x104 3,5x104 3,5x104
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 111 222 222 1,1x104 3,5x104 3,5x104
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 110 111 112 7,3x104 1,1x104 1,5x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 111 112 113 1,1x104 1,5x104 1,9x104
g
T9:Testigo consorcio bacteriano 200 300 310 9,1x103 2,3x104 4,3x104
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 000 320 322 <3x103 9,3x104 2,1x105
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 000 300 310 <3x103 2,3x104 4,3x104
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 000 210 320 <3x103 1,5x104 9,3x104
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 000 110 220 <3x103 7.3x103 2,1x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 000 112 213 <3x103 1,5x104 3,4x104
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 220 321 333 2,1x104 1,5x105 >11x106
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 000 111 322 <3x103 1,1x104 2,1x105
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 000 000 322 <3x103 <3x103 2,1x105
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 000 000 222 <3x103 <3x103 3,5x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 000 000 310 <3x103 <3x103 4,3x104
T4: Estiércol de cuy + nutrientes 100 333 333 3.6x103 >1,1x106 >1,1x106
T5: Estiércol de porcino +nutrientes 100 320 332 3.6x103 >1,1x106 1,1x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes 000 310 332 <3x103 4,3x104 1,1x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes 100 300 332 3.6x103 2,3x104 1,1x106
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes 000 310 332 <3x103 4,3x104 1,1x106