Separarea doxiciclinei şi a

produşilor săi de degradare prin

metoda de analiză HPLC

Masterand: Simona Ştefanovici

Specializarea: Chimia produselor cosmetice şi farmaceutice

1. Introducere

În ultimii ani s-a remarcat o creştere a utilizării doxiciclinei în practica medicală, fapt
care nu se datorează în principal proprietăţilor sale antibacteriene, ci efectului său inhibitor
asupra unui grup de enzime;astfel, ea e mentionată ca matrice a metaloproteinazelor. Aceste
metaloproteinaze sunt enzime care intervin în cazurile inflamatorii, precum: gingivite şi
ulceraţii aftoase. Doxiciclina, ca medicament din clasa tetraciclinelor, se distribuie uşor în
marea majoritate a ţesuturilor, cum ar fi: dentina, smalţul dinţilor neerupţi şi gingii, motiv
pentru care s-a dovedit a fi eficient în tratamentul afecţiunilor inflamatorii ale gurii.

Determinarea prin HPLC a doxiciclinei şi a produşilor săi de degradare s-a dovedit a fi

relativ dificilă. Mulţi dintre aceşti produşi de degradare sunt epimeri , deci se aseamănă
structural foarte mult cu doxiciclina, dar şi între ei (fig.1a şi b), apărând constant probleme în
ceea ce priveşte separarea lor. O altă problemă de separare prin HPLC apare atunci când sunt
folosite coloane ODS, deoarece timpul de retenţie e mare din cauza hidrofobicităţii crescute.
Totuşi această problemă poate fi ocolită dacă faza mobilă e suficient de acidă astfel încât să
permită ionizarea tetraciclinei, lucru posibil prin creşterea hidrofilicităţii şi reducerea timpului
de retenţie.

Pentru determinarea tetraciclinelor în formulele farmaceutice, s-au utilizat multe

metode HPLC, folosind silica gel, grafit poros, faze staţionare pe bază de silice sau polimeri.
Majoritatea acestor metode sunt complexe, necesită un timp de analiză îndelungat , unele sunt
foarte scumpe, iar altele nu pot reda separarea tetraciclinelor de produşii lor de degradare.

În acest articol a fost descrisă o metodă HPLC simplă şi selectivă pentru separarea
doxiciclinei şi a unor produşi ai săi de degradare: 6-epidoxiciclina şi metaciclina. Această
metodă îndeplineşte cerinţele Farmacopeei Europene în privinţa selectivităţii pentru aceste
substanţe. Încercări anterioare de separare a celor doi produşi de degradare au întâmpinat mari
dificultăţi. Astfel, metoda propusă este adecvată pentru evaluarea calitativă a acestor compuşi
în produsele farmaceutice.
Figura 1. a – doxiciclina şi epimerii săi

b – produşi de degradare ai doxiciclinei

2. Experimente

2.1. Reactivi

Ca reactivi s-au utilizat doxiciclina, metaciclina şi 6-epidoxiciclina. De asemenea, s-au

mai folosit acetonitril, metanol şi acid percloric. Toţi reactivii utilizaţi sunt de puritate
analitică.

2.2. Cromatografie. Aparatură

S-au folosit: un sistem HPLC cu separare termică a produşilor, detector UV, un

Integrator Chromjet şi un autosampler Merck. Coloanele folosite în vederea separării sunt:
Hypersil ODS C18, C8 de diferite diametre. Lungimea de undă a detectorului a fost setată la
350 nm, iar debitul stabilit pentru separarea doxiciclinei şi a produşilor de degradare este de
1.0 ml/min. Compoziţia fazei mobile este: acetonitril : apă : acid percloric = 26:74:0.25,
echilibrată la pH 2.5 cu NaOH 5M. Probele şi standardele au fost dizolvate în faza mobilă, iar
20 µl de probă au fost injectaţi la temperatura camerei în sistemul HPLC.

2.3. Prepararea soluţiilor

Soluţiile test de doxiciclină (40µg-ml), metaciclină (7ug/ml) şi 6-epidoxiciclină

(7ug/ml) au fost preparate prin dizolvarea lor in faza mobilă. Standardele de calibrare (3-40
µg/ml pentru doxiciclină şi oxitetraciclină şi 0.5-7 µg/ml pentru metaciclină şi 6-
epidoxiciclină) au fost preparate din soluţiile stoc, după cum urmează: s-au cântărit cu
precizie 0.020 g doxiciclină HCl şi 0.003 g 6-epidoxiciclină şi metaciclină, fiecare într-un
pahar de 200 ml. Se dizolvă în aproximativ 100 ml faza mobilă, după care se completează cu
faza mobilă până la un volum prestabilit. Aceasta este solutia S, care e apoi diluată
corespunzător. Soluţia SI: 10 ml de soluţie S diluată la 25 ml, soluţia SII: 15 ml de SI diluată
la 25 ml, SIII: 15 ml de soluţie SII diluată la 25 ml, SIV: 10 ml SIII diluată la 25 ml, SV: 5 ml
SIV diluată la 10 ml. Probele au fost filtrate printr-o seringă cu filtru de nylon cu diamentru
foarte mic, înainte de a fi injectate în sistemul HPLC.
3. Rezultate şi discuţii

3.1. Cromatografie

A fost posibilă o separare eficientă a metaciclinei şi 6-epidoxiciclinei, atât una faţă de

alta,cât şi faţă de doxiciclină, utilizând doar o coloană Luna de 5 µm C8 250x4.6 mm. Prin
această metodă, pentru compuşii investigaţi s-au obţinut valori ai timpilor de retenţie , care
sunt aproximativ la fel cu cei obţinuţi prin metoda oficială a Farmacopeei Europene ( 30
minute). De asemenea şi cerinţele de rezoluţie şi simetria picurilor sunt îndeplinite de această
metodă (fig.2 si tab.1).

Figura 2. Exemplu de cromatogramă: pic1 – metaciclina, pic2 – epoxiciclina, pic3 –

doxiciclina.
 Tabel 1. Timpi de retenţie si rezoluţie

Substanţă Timp de retenţie (min) Rezoluţie

Metaciclină 22.22
6-epidoxiciclină 23.30 1.2a
Doxiciclină 25.16 1.9b

a – între metaciclină şi 6-epidoxiciclină

b – între 6-epidoxiciclină şi doxiciclină

Principalele avantaje ale acestei metode faţă de cea oficială sunt timpul considerabil
redus necesar efectuării analizei şi faptul că probele sunt mai uşor de preparat.

Studii preliminare asupra capacităţii de separare prin această metodă descrisă, dar
pentru alte tetracicline, arată o separare bună pentru toţi compuşii investigaţi (fig.3), ceea ce
indică faptul că metoda poate fi aplicată în analiza diferitelor tetracicline.

Figura 3. Exemplu de cromatogramă: pic 1 – tetraciclina, pic 2 – demeclociclina, pic 3 –

clortetraciclina, pic 4 – minociclina, pic 5 – metaciclina, pic 6 – 6-epidoxiciclina, pic 7 –
doxiciclina
3.2. Faza mobilă

3.2.1. Compoziţia fazei mobile

Au fost testate compoziţiile pentru faza mobilă ce conţine o soluţie tampon de acid
percloric, apă si acetonitril in rapoarte diferite (30-50%), ajungându-se la concluziile: cu cât
faza mobilă conţine mai multă soluţie tampon, cu atât timpul de retenţie al tetraciclinelor
creşte, se obţine o rezoluţie mai bună, dar se observă şi o lărgire a picurilor. În urma testării
mai multor compoziţii pentru faza mobilă, a fost selectat raportul de 26% pentru acetonitril,
ca fiind ceea ce permite separarea doxiciclinei şi a produşilor săi de degradare.

3.2.2. Faza mobilă. pH

În alegerea valorii pH-ului fazei mobile, un rol important au avut trei factori: în primul
rând, doxiciclina trebuie să se prezinte sub forma sa ionizată pentru a putea creşte timpii de
retenţie, prin urmare, pH-ul fazei mobile trebuie să fie mai mic decât pKa-ul doxiciclinei, care
este 3.4. În al doilea rând, la un pH foarte mic, timpul de viaţă al fazei staţionare din coloană e
redus cu mult, mai ales la pH mai mic de 2; iar în al treilea rând, cu cât valorile pH-ului scad,
creşte numărul de izomeri analogi obţinuţi. În urma acestor considerente, s-a ales o valoare a
pH-ului de 2.5.

3.3 Validarea metodei analitice

Pentru a valida metoda HPLC s-au realizat o serie de teste . Parametrii incluşi in
metodologia de validare a metodei cromatografice sunt:

3.3.1. Liniaritatea

Scopul procedurii:se doreşte să se demonstreze că există o relaţie liniară între

concentraţiile soluţiilor analitului de interes care se injectează în coloana cromatografică

şi ariile picurilor generate în cromatogramele corespunzătoare.

Pentru cei trei compuşi s-a făcut câte o curbă de calibrare. Concentraţiile investigate au fost
între 3 si 60 µg/ml pentru doxiciclină şi 0.5-7 µg/ml pentru 6-epidoxiciclină şi metaciclină.

Coeficientul de corelaţie nu indică liniaritatea dacă nu are o valoare ce depăşeşte r = 0,999.

Coeficienţii de corelare (R2) au fost: 0.9990 pentru doxiciclină, 1.0000 pentru 6-
epidoxiciclină şi 0.9994 pentru metaciclină.

3.3.2. Selectivitatea

Scopul procedurii:se doreste să se demonstreze că metoda cromatografică propusă are

capacitatea de a separa substanţa activă în raport cu impurităţile înrudite chimic rezultate prin
degradarea acesteia.

Selectivitatea metodei pentru separarea doxiciclinei de compuşii săi de degradare a

fost studiată trecând cantităţi exacte de tetraciclină prin faza mobilă. Aşa cum s-a arătat în
fig.2 şi tab.1, compuşii au fost separaţi cu o rezoluţie corespunzatoare. Aşadar, o analiză bună
înseamnă că toate perechile de picuri care eluează succesiv sunt separate cu o rezoluţie de cel
puţin 1,5.

3.3.3 Precizia şi acurateţea

Scopul procedurii: se doreşte să se demonstreze că aplicarea metodei, în mod repetat,

asupra aceleiaşi probe, generează rezultate similare.

Prin repetarea analizelor (n=7) au fost determinate deviaţia standard relativă (R.S.D.)
pentru aria de sub curbă (AUC) şi timpii de retenţie pentru cele trei substanţe. Media valorilor
R.S.D. obţinute pentru timpii de retenţie a fost de 1.16%, iar pentru ariile de sub curbă: 1.44%
(tab.2). Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii standard relative (RSD) în studiul preciziei
metodei este RSD ≤ 2% (n ≥ 6).

Tabel 2. Precizia

Compus R.S.D. (%) AUC R.S.D. (%)

Doxiciclină 1.16 1.12
6 - epidoxiciclină 1.15 1.63
Metaciclină 1.16 1.58
4. Concluzii

S-a dezvoltat o nouă metodă pentru separarea doxiciclinei şi a produşilor săi de

separare, 6-epidoxiciclină şi metaciclină, metodă care s-a dovedit că este fiabilă, relativ ieftină
şi simplă în ceea ce priveşte procedurile ce trebuiesc aplicate, comparativ cu metoda
Farmacopeei Europene.

Rezultatele arată că metoda descrisă poate fi folosită în analizele calitative ale celor
trei compuşi, iar cercetări suplimentare vor putea determina aceste limite calitative ale
metodei. Simplitatea metodei prezentate o face să fie o alternativă potrivită la metodele
oficiale folosite în controlul calitativ al doxiciclinei.

Acest studiu indică, de asemenea, faptul că metoda poate fi folosită atât pentru
analiza calitativă cât şi în analiza cantitativă a multor tetracicline, însă pentru confirmarea
acestui fapt sunt necesare cercetări suplimentare.