RESISTENCIA GENÉTICA DEL CULTIVO DE BANANO PARA Fusarium

oxysporum MEDIANTE EL GEN I-2 DE Solanum pimpinellifolium

GENETIC RESISTANCE OF CULTIVATION OF BANANA FOR Fusarium oxysporum

THROUGH GENE I-2 OF Solanum pimpinellifolium
Cynthia Ramírez-Yumbay

Resumen
La enfermedad de banano causada por Fusarium oxysporum preocupan a nivel mundial por las
pérdidas económicas debido al daño en los cultivos o al costo de las medidas de control. El
desarrollo de variedades resistentes reduce el uso de plaguicidas, siendo fundamental disponer de un
protocolo de alta eficiencia de transformación de resistencia mediada por Agrobacterium. En la
presente investigación se planteo obtener plantas transformadas de Musa spp con el gen I-2 de S.
pimpinellifolium el cual confiere la resistencia contra F. oxysporum, favoreciendo a la resistencia
horizontal, siendo así más difícil de romper por el patógeno y por ende más duradera.

Palabras claves: Fusarium oxysporum, síntomas, Agrobacterium

1. Introducción

El cultivo de banano forma parte de El fitopatógeno fúngico, produce

los frutos tropicales más importantes a
nivel mundial ya que son una fuente
importante de crecimiento económico
(Arias, Dankers, Lui, & Pilkuaskas, 2004)
(Arias et al., 2004; César, 2014). Sin
embargo, los cultivos se han visto
afectados por la enfermedad llamada Mal
de Panamá, causada por el hongo
Fusarium oxysporum la misma que es
considerada una de las más destructivas
en la mayoría de regiones bananeras del
mundo (De Beer, Hernández, & Sabadel,
2001).
toxinas que son responsables de la
marchitez vascular, pudrición en semillas,
tallos, raíces, cormos y tubérculos. El
hongo habita en el suelo, sobrevive en
restos de plantas infectadas en forma de
micelio y esporas, presenta estructuras
resistentes como clamidosporas que
pueden sobrevivir en el suelo por más de
treinta años (Portal, Solano, & Santos,
2017). Entre los factores que permiten el
desarrollo de la enfermedad se encuentran
la presencia de suelos ácidos, deficiencia
de potasio, humedad en el suelo, mal
drenaje y alto nivel de inoculo en el sueño
(Alarcón & Jimenez, 2012).
El ciclo de la enfermedad en el
banano es sistémico, empieza cuando el
hongo entra a la planta mediante las
raíces terciarias, seguido para al sistema
vascular del rizoma y pseudotallo e
invade los vasos de la xilema; el hongo
produce conidios que son llevados a lo
largo de los haces, lo que ocasiona la
obstrucción del movimiento del agua y
por ende, el ingreso de nutrientes se
reduce (Swarupa, Ravishankar, & Rekha,
2014).
En estados más avanzados la
enfermedad el microrganismo crece fuera
del sistema vascular, es decir, en el
parénquima adyacente y produce grandes
cantidades de conidios y clamidiosporas,
estas retornan al sueño cuando la planta
muere y permanece en dormancia por
varios años; el ciclo se repite cuando las
clamidiosporas germinan e infectan
nuevamente la planta de banano (FAO,
2015).
El Mal de Panamá se puede
disipar a través de semillas provenientes
de cepas afectadas, también mediante el
movimiento del suelo que es generado
por la maquinaria agrícola, herramientas,
vientos, suelo contaminado y la población
como tal son agentes que esparcen el
patógeno (Ploetz, 2015).
Los síntomas producidos por
Fusarium oxysporum se caracterizan por
un amarillamiento de las hojas más
adultas al largo del margen foliar que
continua hacia la nervadura central hasta
que toda la hoja se encuentre
completamente marchita y de color café
(FAO, 2015).
Los síntomas internos residen en
un desgaste en el color vascular en el
interior de pseudotallo, líneas de color
marrón, rojo o amarillo las cuales son
visibles en las vainas. Mientras que en el
cormo los síntomas son similares a los del
pseudotallo presentando estrías
necróticas, oscuras o azuladas (Huamán,
2017).
En cuanto a las inflorescencias los
síntomas son variados, en algunos casos
se observa manchas de tonos marrones o
rojizos en el borde de la bráctea,
distribuidos en diferentes partes de la
inflorescencia. Las raíces de las plantas
afectas son necróticas, los rizomas no son
siempre afectados (Alarcón & Jimenez,
2012)
 Lo anteriormente mencionado fue mapeada al brazo corto del
demuestra que deben existir moléculas cromosoma 11 (Pérez-Almeida et al.,
específicas para la patogenicidad y la 2016).
virulencia de los aislados
En la presente investigación se
correspondientes; el entender la
plantea obtener plantas transformadas de
interacción planta-patógeno permite
Musa spp con el gen I-2 de S.
identificar las fases críticas para
pimpinellifolium el cual confiere la
desarrollar cultivos resistentes empleando
resistencia contra F. oxysporum,
enfoques genéticos (Williams et al.,
favoreciendo a la resistencia horizontal,
2016).
siendo así más difícil de romper por el
Hoy en día no existen reportes o estudios patógeno y por ende más duradera.
sobre productos de genes de avirulencia
2. Metodología
de F. oxysporum que permita el
2.1. Cepa
desarrollo de estrategias para incrementar
la resistencia a la enfermedad y como Se utilizará la cepa LBA4404, de

consecuente de una mejor comprensión Agrobacterium tumefaciens (Rustagi

de su papel en la respuesta inmune de las et al., 2014), la cual será transformada

plantas. con el método de congelamiento-

descongelamiento con el plasmido
La ingeniería genética se considera
pCAMBIA (Silva, 2012).
como alternativa viable y eficaz como
estrategia de control de patógenos más
duradera y amigable con el medio
ambiente, promoviendo la mejora de
cultivos de banano, teniendo como 2.2. Plásmido

beneficio menos pérdida de cultivos y El segmento de DNA transferido es

subiendo su rendimiento, como tal no
habrá perdidas económicas significativas.
Según estudios realizados la resistencia a
Fusarium oxysporum se introgresó de S.
pimpinellifolium y el gen I-2 de tomate
conocido como la región T-DNA (DNA
de transferencia) (Díaz & Chaparro,
2014), lugar donde se insertara el gen I-2
de S. pimpinellifolium. Para ello, ellos se
insertara un gen de selección nptll, para
que se dé una transferencia efectiva de fosfotransferasa bajo el control del
esta región es necesaria la expresión de promotor 35S y el gen I-2 que codifica
los genes Vir contenidos en la región Vir para determinada enzima que produce la
(González-Mula et al., 2018). resistencia a la enfermedad (Pérez
Hernández, Remy, Swennen, & Sági,
Se utilizará el plásmido Pcambia, que
2006).
contiene el gen de la neomicina

Figura1. Plásmido TI con los genes I-2 y nptll

Borde Borde
Gen nptll Gen I-2
izquierdo derecho

Elaboración: Autor, (2020)

2.3. Transformación de electroforesis en gel de agarosa al 1%

plásmido (Fernández-Piñán et al., 2019). Las
colonias se cultivarán en medio liquido
La transformación, mediada
por 48 horas siguiendo la metodología
por Agrobacterium requiere de un periodo
reportada por Eady y colaboradores
de co-cultivo, para la debida selección de
(2000).
las clonas transformadas se utilizará los
antibióticos kanamicina (50mg/L), 2.4. Transformación y
rifampicina (100mg/L) y estreptomicina regeneración del material
(100mg/L); para verificar los vegetal
transformantes se realizará 2.4.1. Transformación de cormos
minipreparaciones de ADN plasmídico en
Se emplearán segmentos
el cual con colonias resistentes a
aproximadamente de 4cm² del
kanamicina y los plásmidos que serán
cormo, los explantes serán
aislados se separarán mediante
introducidos en cajas Petri que 2.4.2. Regeneración y
contendrá 10mL de medio PC multiplicación de brotes
líquido, se completará un volumen transformados
de 20mL. Se adicionará el inoculo
Para la regeneración de brotes
bacteriana diluido a 0,1 D.O y se
que será transformados, se
dejará en contacto con los
colocaran en medio MS con
explantes durante 30min. Una vez
reguladores del crecimiento
transcurrido este tiempo, los
bencilaminopurina (BAP) y ácido
explantes pasaran a cajas Petri que
indolacético (IAA). Luego, los
contendrá papel absorbente para
brotes obtenidos se segmentarán y
eliminar el exceso de bacterias.
se colocarán en medio líquido
Posteriormente se colocaron cajas
MS, que contendra 30 g / L de
Petri con medio PC semisólido y
sacarosa y 1 g / L de carbón
se incubaran a 28°C durante 96
activado durante un mes. La idea
horas. Transcurrido el tiempo de
de usar este medio era generar una
co-cultivo, los explantes serán
etapa de enfriamiento y
introducidos a 20mL de medio PC
acondicionamiento, para que los
con cefotaxima a una
brotes aumenten su vigor antes de
concentración de 250mg/L,
pasar a la fase de
seguido se cubrirá con papel
enraizamiento. Los explantes
aluminio para protegerlas de la luz
fueron expuestos a luz blanca
y serán incubadas a 28°C por 96
fluorescente continua (37 μmol /
horas, para eliminar el exceso de
m2 s) y temperatura de 25 ± 2 ° C
bacteria. Finalizado este tiempo,
(CRONAUER & KRIKORIAN,
los explantes se secarán con papel
1984).
absorbente y se sumergirán a
20ML de medio PC semisólido 2.4.3. Enraizamiento
adicionado cefotaxina a 250mg/L y aclimatación ex vitro de
y kanamicina a la concentración vitroplantas
recomendada para cada variedad Para el enraizamiento y la
(Pérez Hernández et al., 2006). aclimatación, se utilizarán plantas
 vegetales de la etapa 1. Alarcón, J., & Jimenez, Y. (2012).
de enfriamiento Manejo fitosanitario del cultivo del
y acondicionamiento in plátano Medidas para la temporada
vitro como material vegetal. Las invernal (ICA, Vol. 1). Bogota :
vitroplantas se colocarán en Ministerio de Agricultura y
bandejas de germinación con Desarrollo Rural .
sustrato de arena (partículas entre 2. Arias, P., Dankers, C., Lui, P., &
0.063 y 2 mm) sin reguladores del Pilkuaskas, P. (2004). La Economía
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cubiertas con un túnel de plástico 3. César, R. (2014). El Banano
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de un minuto cada hora, durante 4. CRONAUER, S. S., &
cuatro semanas (S & S, 2005). KRIKORIAN, A. D. (1984).
Multiplication of Musa from Excised
3. Conclusiones
Stem Tips. Annals of Botany, 53(3),
Mediante el protocolo de transformación 321-328.
que se utilizará en la investigación, será https://doi.org/10.1093/oxfordjournal
eficaz que va a permitir la regeneración s.aob.a086696
de plantas expresando resistencia a las 5. De Beer, Z., Hernández, J. M., &
enfermedades producida por fitopatógeno Sabadel, S. (2001). Enfermedades de
Fusarium oxysporum, por otro lado, el Musa: Hoja divulgativa No. Tenerife.
uso de los reguladores de crecimiento 6. Díaz, C., & Chaparro, A. (2014).
favorecerá al desarrollo de los explantes, MÉTODOS DE
de tal manera que se obtendrá plántulas TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
resistentes, vigorosas, sanas y asépticas DE PLANTAS. Revista U.D.C.A
con 100% de supervivencia, que posterior Actualidad & Divulgación Científica,
a la aclimatación estarán listas para el 17(1), 227-236.
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