Concentrația limonenului în coaja de lămâie (Citrus volkameriana) în funcție de gradul de
maturitate
Sîrb Oana Roxana
Universitatea Aurel Vlaicu Arad, programul de studii master, profil Strategii și politici de management, anul I
Cuvinte cheie:
Gaz cromatografie de înaltă rezoluție
Spectrometrie de masă
Ulei esențial de lămâie
Citrus Volkameriana
Sumar
Dependența conținutului de D-limonen din uleiul
de coajă de lămâie (Citrus volkameriana) de
gradul de maturare al fructelor a fost studiată
prin utilizarea a două metode, distilarea cu abur
și presarea la rece, pentru a extrage uleiurile din
coaja fructelor de lămâie în diferite stadii de
maturare identificate prin culorile verde, galben-
verzui și galben-portocaliu. Probele de uleiuri
esențiale au fost analizate prin GC și GC-MS de
înaltă rezoluție, folosind tetradecanul ca etalon
intern pentru cuantificare. Au fost detectaţi
patruzeci de compuşi; treizeci și opt au fost
identificați pozitiv prin compararea spectrelor lor
de masă (EI, 70 eV) și a indicilor de retenție
Kovats (determinate folosind o scară non-
logaritmică pe coloane capilare acoperite atât cu
polar (DB-Wax) cât și nepolar (DB-1)) cu cele ale
etaloanelor şi cu datele raportate în literatura de
specialitate. Concentrația de D-limonen a atins un
nivel maxim de 79,4% atunci când fructul a fost
în stadiul de maturare intermediar caracterizat
prin colorație galben-verzuie.
1. Introducere
Formarea metaboliților secundari volatili care
constituie aroma multor fructe este un proces
dinamic în care concentrația relativă a diferitelor
componente se schimbă continuu.Gradul de maturare
1
este un factor
important care afectează concentrația și compoziția
compușilor volatili din fructe. Industria columbiană a
sucurilor de citrice produce, ca produs secundar,
cantități mari de coajă de fructe care pot fi prelucrate
în continuare pentru a obține materiale valoroase.
Printre acestea, uleiul esențial de lămâie este
deosebit de atractiv datorită creșterii cererii
industriale pentru D-limonen, componenta
principală.Întrucât coaja de fructe folosită pentru a
extrage uleiul este un produs secundar, cu toate
acestea, materialul disponibil variază mult în gradul
de maturare, indicat prin colorație care trece de la
verde complet la galben-portocaliu.
D-limonenul ca produs cu valoare adăugată şi
optimizarea metodelor care conduc la producerea sa
din cojile de lămâie la prețuri competitive, necesită
explorarea condițiilor precum selectarea metodei
pentru extragerea uleiului esențial și necesitatea de a
pre-clasifica materialul de pornire. În continuare
prezentăm un studiu al compoziției uleiurilor extrase
din coaja de lămâie (Citrus volkameriana), în funcţie
atât de gradul de maturitate al fructelor, cât și de
metoda de extracție (distilare cu abur sau presare la
rece).
2. Materiale și metode
2.1 Materiale
Fructele (Citrus volkameriana) utilizate în acest
studiu au fost colectate în trei ocazii diferite
(februarie, mai-iunie și august) din aceeași plantație,
situată la 30 km nord de Bucaramanga (Santander,
Columbia). Extragerea a fost efectuată în 2 zile de
colectare, folosind coaja tăiată în fragmente de 4
cm². Fructele aparținând fiecărei perioade de
colectare au avut o coloraţie distinctivă; aceasta a
fost folosită ca o indicație a stadiului de maturizare.
Astfel, fructele au fost clasificate ca verzi (I), 45-
75% verzi (maturare intermediară) și galben-
portocaliu (coapte).
2.2 Extracția uleiului esențial
2.2.1 Distilarea cu abur (A)
Coaja de lămâie tocată (1,0-1,5 kg) a fost plasată
într-un balon cu fund rotund de 5 L și supusă unui
flux de abur (1 kg/h, 96-100 °C) la o presiune de 1,1
atm timp de 3 ore. Volatilele condensate au fost
decantat și uscate pe sulfat de sodiu anhidru. Cojile
de lămâi în diferite stadii de maturitate au dat astfel
trei tipuri de probe: IA, IIA și IIIA.
2.2.2 Presarea la rece (B)
Probele de coajă de lămâie (2,0-2,5 kg) în cele trei
stadii de maturare au fost supuse extracţiei prin
presare la rece pentru a furniza trei tipuri de probe:
IB, IIB, IIIB. Conținutul uleiului raportat reprezintă
media a trei extracţii.
3.2. Analiza uleiului esenţial
Analiza HRGC (gaz cromatografie de înaltă
rezoluţie) a probelor a fost realizată cu un gaz
cromatograf Hewlett Packard (HP) 5890-11 echipat
cu un detector de ionizare a flăcării și un sistem de
date HP ChemStation 3365-11. Coloanele utilizate
au fost 60 m x 0,25 mm i.d. coloane capilare din
silică topită acoperite cu o peliculă de 0,25 pm, fie de
Carbowax 20Mor (DB-Wax) sau dimetilpoliziloxan
reticulat (DB-1).
Pentru analiza cu DB-Wax temperatura cuptorului a
fost menținută la 50°C timp de 10 minute după
injecție și apoi programată la 2°min−1 la 150°C care
a fost menţinută timp de 20 minute.
Pentru analiză pe coloana DB-1 temperatura
cuptorului a fost menținută la 70° C timp de 5 minute
2
după intrare și apoi programată la 2,5°min−1 la
250°C, care a fost menținută timp de 15 minute.
Heliul a fost utilizat ca gaz purtător la presiuni de
intrare de 152 și 78 kPa; vitezele liniare au fost de 19
cm s−1 iar debitul scindat 30 ml min−1 pentru ambele
coloane. În toate rulările, temperaturile detectorului
și injecției au fost de 250°C. Volumul de injecție a
fost de 0,3 µL al unei soluții 25% v/v de ulei esenţial
de lămâie în diclorometan. Tetradecanul a fost
utilizat ca etalon intern; suprafeţele picurilor de la
diferite cromatograme au fost comparate după
normalizare folosind acest etalon.
Spectrele de masă au fost obținute pe un sistem
Finnigan MAT 1020 GC-MS. Temperaturile camerei
de ionizare și a separatoarelor au fost de 200°C,
energia electronilor a fost de 70 eV. Spectrele de
masă și cromatogramele ionice reconstruite au fost
obținute prin scanarea automată între m/z 30 și 350
la intervale de 2 s. Vârfurile cromatografice au fost
verificate pentru omogenitate cu ajutorul
cromatogramelor de masă ale ionilor fragmentaţi
caracteristici. Gaz cromatograful Perkin Elmer din
sistemul GC-MS a fost prevăzut cu o coloană
capilară de silică topită de 30m x 0,25 mm, acoperită
cu o peliculă de 0,25 km de dimetilpolisiloxan (DB-
1). Heliul a fost folosit ca gaz purtător (0,7mL min−1
).
Temperatura cuptorului a fost menținută la 50°C
timp de 5 min după injecție și apoi programat la
200°C la 3°min−1. Debitul portului de injecție a fost
de 30 ml min−1. Compușii au fost identificați prin
compararea spectrelor de masă și a indexurilor
Kovats cu cei ai etalonului și cu datele raportate în
literatura de specialitate.
3.3 Rezultate şi discuţii
Figurile 1 și 2 prezintă cromatogramele tipice
obținute din uleiul esențial de coajă de lămâie (proba
IIIB) pe coloanele DB-1 și, respectiv, DB-Wax.
Indicii de retenţie Kovats și spectrele de masă au fost
utilizate pentru identificarea diferiţilor compuşi ai
uleiului esențial. Tabelul 1 prezintă rezultatele
analizelor triplicate ale probelor de ulei esențial din
trei etape diferite de maturare, verde (I), maturare
intermediară (II) și galben-portocaliu (III), după
extracţia fie prin distilarea cu abur (A), fie prin
presarea la rece (B)

3
 Tabelul 1 Compoziţia chimică a uleiului esenţial din coaja de lămâie

Indice
Nr pic   Suprafaţa picurilor %
Kovats

DB DB
DB1 Compus DB1 IA IIA IIIA IB IIB IIIB
Wax wax

1 2 α-tuiona 924 1025 0,318±8E-02 0,311±3E-02 0,344±3E-02 0,466±3E-02 0,326±2E-01 0,360±2E-01

2 1 α-pinena 932 1021 0,998±2E-01 0,802±8E-02 0,901±6E-02 1,529±3E-02 1,499±3E-03 1,415±3E-02

3   2,6-dimetil-2-octan 967  - 3,545±3E-01 1 391±3E-01 1,149±6E-01 4,867±9E-01 3 402±1E-01 2 251±4E-01

4 3 sabinen 973 1107 0,804±4E-02 0,648±7E-02 0,727±3E-02 0,989±3E-02 0,944±5E-04 0,899±4E-02

5 4 β-pinen 979 1120 0,204±1E-01 0,221±2E-02 0,249±1E-01 0,124±6E-04 0,168±6E-03 0,142±3E-02

6 5 mircen 982 1162 1,744±1E-01 1 684±5E-02 1,648±4E-02 2,005±1E-02 1,960±2E-02 1 548±5E-01

7 6 α-felandren 1000 1177 0,080±3E-02 0,068±5E-03 0,068±4E-03 0,063±7E-04 0,061±2E-03 0,060±3E-04

8 6 1,4-cineola 1011 1177 0,335±7E-02 0,362±5E-02 0,339±2E-02 0,191±8E-03 0,129±9E-02 0,203±5E-03

9 13 p-cimen 1013 1271 1,278±3E-01 0,653±1E-01 0,923±3E-01 0,590±2E-02 0,505±7E-02 0,551±1E-01

10 7 D-limonen 1026 1201 77,267±8E-01 79,359±7E-01 78,776±8E-01 77 104±9E-01 78.899±1E-01 78.213±6E-01

11 12 trans-p-ocimen 1037 1252 0,324±6E-02 0,242±5E-02 0,214±4E-02 0,322±1E-02 0,208±4E-02 0,178±1E-02

12 11 y-terpinen 1051 1248 7,811±9E-02 8,846±2E-01 8,755±3E-01 7 319±1E-01 7 866±3E-01 7.918±2E-01

13 20 trans-sabinen-hidrat 1054 1463 0,060±5E-02 0,011±8E-03 0,036±2E-02 0,156±2E-02 0,082±5E-02 0,083±4E-02

14 15 terpinolen 1074 1290 0,117±4E-02 0,080±2E-02 0,101±2E-02 0,055±1E-03 0,049±6E-03 0,057±5E-03

15   fencona 1080  - 0,531±1E-02 0,547±4E-02 0,538±2E-02 0,423±7E-03 0,429±4E-03 0,420±6E-03

16 19 furanoid 1082 1451 0,079±4E-02 0,118±2E-02 0,123±5E-02 0,089±8E-03 0,131±1E-03 0,108±3E-02

17 17 6,10-dihidro-mircenol 1083 1439 0,434±3E-01 0,162±1E-01 0,238±1E-01 0,283±3E-02 0,233±2E-02 0,181±6E-02

4
18 22 linalol 1088 1507 0,050±3E-02 0,150±3E-02 0,181±7E-02 0,066±9E-02 0,098±5E-02 0,212±6E-02

19   cis-epoxy-limonen 1118  - 0,068±6E-02 0,248±5E-02 0,310±1E-01 0,124±2E-01 0,171±8E-02 0,377±9E-02

20 15 trans-alo-ocimen 1121 1396 0,038±1E-02 0,083±1E-02 0,101±3E-02 0,027±4E-02 0,046±2E-02 0,095±1E-02

21   trans-p-menth-2-en-1-ol 1127 -  0,059±9E-03 0,051±1E-02 0,051±4E-03 0,045±2E-03 0,040±3E-03 0,039±2E-03

22 26 cis-alo-ocimen 1131 1590 0,402±2E-01 0,304±1E-02 0,328±1E-01 0,360±5E-03 0,408±8E-03 0,395±3E-02

23 21 citronelal 1146 1472 0,403±2E-01 0,271±2E 02 0,285±2E-02 0,032±5E-03 0,029±1E-03 0,026±5E-03

24 28 terpinen-4-ol 1173 1602 0,462±2E-01 0,306±5E-02 0,351±9E-02 0,289±3E 02 0,229±2E 02 0,181±7E-02

25 34 neidentificat 1179 1735 0,046±3E-02 0,023±3E 03 0,027±8E-03 0,035±3E-03 0,027±5E-03 0,026±3E-03

26 33 α-terpinol 1183 1729 0,345±2E-01 0,187±9E-03 0,213±8E-02 0,300±1E-03 0,280±2E-02 0,258±3E-02

27 33 verbenona 1196 1730 0,045±2E-02 0,047±9E-03 0,053±1E 02 0,005±8E-03 0,006±4E 03 0,004±6E-03

28 24 format de linalil 1206 1553 0,041±0E+00 0,078±3E-02 0,078±2E-02 0,022±2E-02 0,028±2E-02 0,056±3E-03

29 32 citral 1208 1704 0,239±1E-01 0,231±9E 02 0,274±2E-01 0,054±4E-03 0,063±1E-03 0,066±5E-03

30 27 citronelal 1215 1598 2,115±6E-01 1,828±4E-01 1,850±3E-01 1 189±2E-02 0,978±1E 01 0,992±2E-02

31 35 geraniol 1242 1170 0,114±7E-02 0,084±2E-02 0,073±4E-02 0,057±6E-03 0,039±1E-02 0,029±6E-03

32 31 format de neril 1265 1687 0,182±1E-01 0,106±2E-02 0,133±2E-02 0,075±2E-02 0,058±2E-02 0,051±2E-02

33   p-cimen-7-ol 1270  - 0,041±3E-02 0,033±6E-03 0,044±1E-02 0,030±8E-03 0,027±1E 03 0,028±4E-03

34 30 acetat de terpinen-4-ol 1286 1553 0,017±1E-02 0,023±2E-02 0,025±2E 02 0,033±2E 04 0,048±2E 03 0,042±91-03

35 29 β-cariofilena 1422 1610 0,072±3E-02 0,040±1E-02 0,045±0E-00 0,060±5E 03 0,035±6E 03 0,033±2E-03

36 25 α-bergamoten 1435 1566 0,216±4E-02 0,199±3E-02 0,187±3E-02 0,208±2E-03 0,185±2E-02 0,196±9E-03

37 23 β-bisabolen 1495 1517 0,091±4E-02 0,037±1E-02 0,040±3E-03 0,065±2E-02 0,024±8E 03 0,027±1E-03

38   calamenen 1502  - 0,331±8E-02 0,125±2E-01 0,288±6E-02 0,276±3E-03 0,242±3E-02 0,258±1E-02

39   sescviterpen C15H24 1650  - 0,022±8E-03 0,017±1E-02 0,030±4E-03 0,031±2E-03 0,015±7E-03 0,019±1E-02

40   sescviterpenol C15H26O 1780 -  0,015±5E-03 0,015±1E-02 0,026±7E-03 0,030±6E-03 0,034±2E-03 0,033±6E-03

5
D-limonenul a fost componenta principală a tuturor probelor;
concentrația sa în greutate a variat între 77,2% și 79,4% în funcție de
starea de maturare a fructului. Monoterpenele reprezintă principala
familie de compuşi (86,00-88,79%) din toate probele. După D-limonen,
cel mai abundent monoterpen a fost Y-terpinenul (7,16-8,84%), urmat
de piricen (1,54-1,99%), α-pinenă (0,80-1,50%), sabinen (0,72-0,95%)
și p-cimen (0,50 -1,03%). Cantitățile de D-limonen (79,4%) și
monoterpenele ca grup (88,79%) au fost mai mari în uleiurile esenţiale
extrase din lămâile aflate în stadiul intermediar de maturizare (IIA şi
IIB). Compușii oxigenaţi au constituit 10,64-13.71% din uleiuri, în timp
sescviterpenele au contribuit cu doar 0,53-0,69% din masa totală.
Distilarea cu abur a produs o fracție mai mare de compuși oxigenaţi
(11,46-13,71%) decât presarea la rece (10,64-11,05%).
Figura 3 prezintă compoziția chimică comparativă a uleiurilor de lămâie
grupate în familii combinate; aceste rezultate au fost obținute prin
analiza cromatografică folosind tetradecanul ca etalon intern. Uleiurile
Figura 1 Gaz cromatograma uleiului esențial de citrice pe coloana
esențiale extrase din fructe în stadiul intermediar de maturizare
DB1
conțineau mai multe monoterpene, compuși oxigenaţi și sescviterpene
decât uleiurile din alte stadii de maturare.
Concluzie
38 din cei 40 de compuși diferiți detectați în uleiurile esențiale extrase
din coaja de lămâie (Citrus volkameriana) au fost identificaţi pozitiv de
HRGC și HRGC-MS. Limonenul, componenta principală a acestor
uleiuri, este cea mai abundentă în uleiurile din fructe verzi-galbene
(maturare intermediară). Cel mai mare randament de metaboliți
secundari volatili a fost de asemenea observat tot în acest stadiu de
maturizare.

Figura 2 Gaz cromatograma uleiului esențial de citrice pe coloana DB

Wax

6
Figura 3 Compoziția chimică comparativă pe grade diferite de
maturizare