MVP Lp 7

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN INFECTIILE CU ENTEROBACTERII

Familia ENTEROBACTERIACEAE
Cuprinde germeni patogeni intestinali care produc un sindrom diareic de tip infectios
-exista 28 de genuri de enterobacterii
-CELE MAI IMPORTANTE SUNT :
1. Salmonella
2. Shigella
3. Klebsiella
4. Proteus
5. Yersinia
6. Enterobacter
7. Hafnia
8. Serratia
9. Escherichia
10. Citrobacter
11. Morganella
12. Providencia

Dintre acestea 1,2,5 si 9 sunt patogeni intestinali (exclusiv la nivelul intestinului)

4,6 ,8sunt si patogeni extra intestinali

CARACTERE GENERALE :
1. Morfologice:
-dimensiuni- variaza intre 2 si 3 microni
-forma : bacili
-majoritatea mobile, cu exceptia genului Shigella , Klebsiella si Yersinia
- nesporulati
-incapsulati (Klebsiella)/ necapsulati
- Gram negativi
2. Caracterele de cultura :
-bacterii nepretentioase ( se dezvolta pe mediile uzuale /simple)
1
-cultivarea pe mediile lichide- formele de tip S tulbura uniform mediul pe cand formele de tip R cresc si
formeaza un mic depozit ( pelicula)
- exceptii: genul Proteus care formeaza un val la suprafata mediului lichid ,respectiv genul Klebssiella
care creste sub forma unui inel
-dezvoltarea pe medii solide: a.pe geloza sange (formeaza colonii mari de 2-4 mm, bombate, rotunde
de culoare gri cu sau fara hemoliza.
-pe geloza simpla pot sa apara colonii de tip S/ colonii R
-doua exceptii : genul Proteus- are mai multe fenomene particulare ( fenomenul de migrare ) si genul
Klebsiella care formeaza colonii mucoide /mari si lucioase ( colonii de tip M)
3.Caractere biochimice:
-enterobact sunt bact aerobe , facultative anaerobe
-sunt germeni mobili (prezinta cili , peritrichi )/imobili(Shigella;Klebsiella)
-fermenteaza zaharurile de tipul glucoza (G) cu sau fara producere de gaz/ lactoza ( L)
-enterobact lactozo pozitive sunt nepatogene ,cele lactozo negative sunt in general patogene
-catalazo-pozitivi , oxidazo -negativi ,reduc nitratii cu formare de nitriti
STRUCTURA ANTIGENICA:
1.Ag somatice : in peretele bacterian (reprezinta endotoxina)
-formele de tip S prezinta antigenul O care confera specificitate de specie
-formele de tip R prezinta antigenul R
2.Ag capsulare: struct polizaharidice
-antigenul K la Klebsiella si antigenul AgVi (factor de virulenta)
3.-antigenele flagelare care confera specificitate de tip-Ag H , format din structuri proteice (flagelina din
flagel sau din cili pentru formele mobile)-cili monotrichi,amfitrichi,lofotrichi,peritrichi
-enterobact produc endotoxine care sunt responsabile de fenomene de tip hipotensiune soc , coagulare
intravasculara diseminata
-produc si enterotoxine cu actiune intestinala.

Diagnosticul de Laborator :
-se bazeaza pe diag bacteriologic
-in unele boli infectioase sistemice cu evolutie prelungita (febra tifoida si paratifoida) se foloseste si
diagnosticul serologic
-pentru dg bact se examineaza produsele patologice recoltate de la bolnavi, convalescenti , purtatorii
sanatosi, contacti, de la personalul din sectorul alimentar,din spitale sau probe din mediul extern.
1.RECOLTAREA –in functie de boala –mat fecale
2.TRANSPORTUL : mediul de transport -pt materii fecale Carry-Blair
3.Examenul microscopic -pe frotiul colorat Gram din produsul patologic-morfologie
2
4.IZOLAREA/Cultivarea se face prin insamantare pe medii nutritive care inhiba flora de asociatie,
favorizeaza cultivarea preferentiala a germenilor patogeni enterici si izolarea lor in culturi pure (mediile
selective) si identificarea biochimica (mediile diferentiale).
MEDIILE FOLOSITE PT INSAMANTARE:
-mediile selective :
1.Mediile slab selective a.EMB denumit si LEVINE ( care contine eozina care este indicatorul de pH si
Metilen Blue, care este agentul selectiv) + si un zahar ( lactoza)
-enterobacteriile lactozo- pozitive pe acest mediu,formeaza colonii de culoare rosu aprins cu luciu
metalic.
-cele lactozo- negative -colonii necolorate care raman in culoarea initiala a mediului
-b mediul MACCONKEY ( mediu lactozat = contine lactoza)
-agentul selectiv al mediului este reprezentat de sarurile biliare si mai contine rosu neutru ca indicator
de pH (pe acest mediu enterobact lactozo -pozitive formeaza colonii rosii si mari iar cele negative
formeaza colonii incolore)
2.Mediile moderat selective :a. mediul ADCL denumit si LEIFSON ( are in compozitie Agar , dezoxicolat
– care este agentul selectiv al mediului, citrat de sodiu si lactoza)
-pe acest mediu enterobact lactozo pozitive cresc greu si formeaza colonii rosii dar mai mici
-initial este un mediu de cul roz
-b. mediul ISTRATI-MEIERT : contine saruri biliare , indicator de pH -albastru de bromtimol , lactoza.
-entero bact lactozo -pozitive , formeaza colonii de culoare galbena insotite de ingalbenirea mediului ,iar
cele lactozo negative formeaza colonii de cul albastru verzui
3.Mediile inalt selective: mediul WILSON-BLAIR pentru bact din genul Salmonella
-nu contine nici un zahar dar contine citrat de bismut care confera coloniilor culoarea neagra si un halou
negru in jur,cu suprafata rugoasa

5.VERIFICAREA PURITATII CULTURII

6.IDENTIFICAREA- ,in acest proces se folosesc medii pt identificarea biochimica sau medii diferentiale
- TSI , MIU, mediul SIMMONS (care contine citrate de sodiu )
-mediul cu malonat de sodiu
- mediul cu lizina- folosit pt evidentierea producerii de lizin-decarboxilazei
-mediul cu fenil-alanina folosit pt evidentierea producerii de fenil-alanin-dezaminazei
-testul cu rosu metil in care se foloseste mediul CLARK-LUBS
-testul VOGES-PROSKAUER prin care se evidentiaza formarea acetil-metil-carbinolului , ca produs final
de fermentare a glucozei

3
1.MEDIUL TSI (triple sugar iron)
-contine trei zaharuri si fier ;

-cele trei zaharuri sunt : glucoza(G) ,lactoza(L) si zaharoza(Z);

-fierul din compozitia mediului se gaseste sub forma de sulfat feros; mai contine si tiosulfat de sodiu si
peptona

-initial este un mediu de culoare roz, deoarece contine rosu fenol ca indicator de pH

-este un mediu multitest ( pe el se pot studia mai multe caractere ale enterobact )

-se foloseste pt testarea fermenetarii celor 3 zaharuri si pt evidentierea producerii de hidrogen sulfurat
(H2S)

-mediul are DOUA portiuni : o portiune turnata drept ( o coloana) pe care se studiaza fermentarea
glucozei si o portiune inclinata (in panta)pe care se studiaza fermentarea lactozei ,respectiv a
zaharozei.

-mediul contine de 10 ori mai putina glucoza decat lactoza si zaharoza, ca urmare metabolitii acizi
rezultati din fermentarea glucozei sunt de 10 ori mai putini si vor imprima reactia acida doar coloanei
mediului, in care oxigenul nu are acces.

-la nivelul pantei se continua degradarea oxidativa care neutralizeaza cantitatile mici de acizi prin
metabolitii alcalini rezultati din peptone.

-in cazul fermentarii LsiZ cantitatile mari de acizi rezultate nu mai pot fi neutralizate si panta ramane
acida(galbena).

-fermentarea glucozei este indicata de virajul in galben al portiunii drepte al mediului

-in mod similar fermentarea zaharozei si lactozei este indicata de schimbarea culorii in galben a portiunii
inclinate a mediului ( ingalbenirea pantei)

-producerea de gaz (hidrogen si Co2) din fermentarea glucozei duce la producerea de bule de gaz care
fragmenteaza(disloca) coloana mediului

-producerea de hidrogen sulfurat prin reducerea tiosulfatului de sodiu in mediul acid , care la randul lui
reactioneaza cu fierul din mediu (sulfat feros) duce la producerea de sulfit feros si la innegrirea coloanei
mediului.

2.MEDIUL MIU (M=mobilitate ,I = indol ,U = ureaza)

-mediul contine triptofan ,uree si rosu fenol ca indicator de pH

-initial este un mediu de culoare maronie ( o geloza moale turnata in coloana )

-se insamanteaza prin intepare.

4
1- pe acest mediu un microorganism mobil cultiva si difuzeaza de la traiectul de insamantare invadand
mediul si produce opacifierea sau tulburarea coloanei mediului -mobilitate pozitiva ( M+)

-un microorganism imobil cultiva sau creste numai in lungul traiectului de insamantare - se produce
opacifierea mediului strict la nivelul de insamantare

2-se poate studia si producerea de ureaza ,- hidroliza ureei din compozitia mediului va alcaliniza
mediul.

-se produce amoniac-ph bazic = aparitia culoriii rosii pe coloana mediului (din maro in rosu) => ureaza
pozitiva(U+).

3-productia de indol din triptofan este indicata de inrosirea hartiei indicator care este imbibata cu
reactiv Kovacs sau Ehrlich(I+).

-initial hartia este de culoare galbena -daca isi schimba culoarea in rosu = Indol pozitiv , daca ramane
galbena -indol negativ;

3.MEDIUL SIMMONS (cu citrat de sodiu)

-se foloseste pt evidentierea capacitatii de a folosi citratul ca sursa de carbon in prezenta azotului
anorganic

-este un mediu solid ,turnat inclinat , initial de culoare vernil deoarece contine albstru de bromtimol
care la ph neutru este vernil.

- se insamanteaza pe suprafata pantei- si prin alcalinizarea mediului ,testul pozitiv consta in aparitia
culorii albastre a mediului si a culturii

4.Mediul cu malonat de sodiu-mediu lichid care contine doua surse de carbon : glucoza si malonatul de
sodiu-initial culoarea mediului este vernil.

-toate enterobacteriile fermenteaza glucoza ,astfel incat cele care nu utilizeaza malonatul ca sursa de
carbon vor acidifica mediul (prin fermentarea glucozei)

-cele care folosesc malonatul genereaza metaboliti alcalini, neutralizand cantitatea mica de acid
rezultata din fermentarea G.

-Test +=aparitia culorii albastre a mediului

5.TESTUL CU ROSU METIL

-lichid de culoare galbuie =mediul CLARK

-bacterile care metabolizeaza glucoza din mediu genereaza produsi acizi

-se adauga o picatura de reactiv rosu metil

-test pozitiv=> consta in aparitia unui inel rosu care apare cand pH-ul mediului scade sub 5,5 prin
fermentarea glucozei.

5
-Enterobact care metabolizeaza glucoza din mediu genereaza produci acizi , se adauga apoi in acest test
o picatura de rosu metil si testul pozitiv consta in aparitia unui inel de culoare rosie care apare cand pHul
mediului scade sub 5,5prin fermentarea glucozei

6.Reactia Voges-Proskauer:

-se aseamana cu testul cu rosu de metil

-se foloseste acelasi mediu-CLARK si o solutie cuproamoniacala de culoare albastra

Rezultatul pozitiv: aparitia inelului de cul rosie.

7.EVIDENTIEREA PRODUCERII LIZIN- DECARBOXILAZEI :

-este un test in care se folosesc doua medii lichide de culoare violeta

Eprubeta1: mediu cu lizina

Eprubeta2: martor (nu contine lizina);

In mediul acid si in prezenta unei coenzime (piridoxal fosfatul), bacteriile care produc enzime specifice
,decarboxileaza lizina cu formarea aminelor corespunzatoare

- lizina este descompusa in dioxid de carbon si cadaverina in prezenta lizin decarboxilazei si a piridoxal
fosfatului.

-in ambele medii se adauga o picatura de ulei de parafina pt a impiedica patrunderea O2 si se asigura
degradarea fermentativa a glucozei.

-initial bacteria acidifica mediul prin fermentarea glucozei si creeaza conditii favorabile actiunii
decarboxilazelor specifice ,care in etapa a doua vor alcaliniza mediul prin aminele generate din
aminoacizii corespunzatori

-se va produce accentuarea culorii violete a mediului care contine lizina=R+

-in tubul martor ( care nu contine lizina) –atesta acidifierea mediului-culoarea lui se va schimba din
violet in galben)

REZULTAT pozitiv : tubul 1 cu lizina= violet,

Tubul 2 –martor=galben

REZULTAT negativ : ambele tuburi galbene

8.EVIDENTIEREA FENIL-ALANIN-DEZAMINAZEI:

-se evidentiaza pe un mediu care contine fenil-alanina-in prezenta enzimei

6
=> se transforma in acid fenil-piruvic

-mediu turnat inclinat , transparent

-se insamanteaza , se incubeaza la 37 de grade 24 h

-se adauga o picatura de FeCl3 – reactia pozitiva apare la genul Proteus si consta in aparitia culorii verzi
; reactia negativa este indicata de culoarea portocalie a mediului

7. ANTIBIOGRAMA este obligatorie in cazul enterobacteriilor