37.

HIV - diagnostic de laborator

HIV apartine subfamiliei lentivirusuri , care grupează agenti remarcabili prin complexitatea genomului.

Genele HIV se impart in :

- structurale: -gag (Ag de grup) care codifică : - p17 – proteina matrice (MA)
- p24 – capsida (CA)
- p7 – nucleocapsida (NC)

- pol (polimeraza) care codifică : - p11 – proteaza (PR)

- p66 – reverstranscriptaza (RT)
- p32 – integraza (IN)

-env (anvelopa virală) care codifică: - gp160 – glicoproteina precursor

- gp120 – glicoproteina de suprafată
- gp41 – glicoproteina transmembranară

- reglatorii : - rev – activatoare a productiei de virus

- nef – reglatoare negativă a productiei de virus
- tat – transactivatoare, implicată in relatia cu factori de transcriere celulari

- de maturare : - vif – promovează infectivitatea virionilor

- vpu – creste proportia particulelor virale extracelulare
- vpr/vpx – genă accesorie cu activitate neprecizată

Celule tintă pt. infectia in vivo sunt limfocitele CD4+, monocitele si macrofagele (inclusiv microglia) si
celulele foliculare dendritice. Virionii HIV se atasează prin glicoproteina gp120 la celulele care au receptori
CD4 : limfocite T, monocite, macrofage fixe (celulele Kuppfer, cel. endoteliale, cel. gliale). Internalizarea HIV
se face prin fuziunea anvelopei cu membrana celulară, fenomen determinat de gp41.
Infectia HIV se caracterizează printr-o perioadă lungă de incubatie, alterarea sistemului imun cu viremie
persistentă si implicare neurologică.

Clasificare : - există 2 tipuri antigenic distincte : HIV 1 si HIV 2, grupate intre Lentivirinae; HIV 2 izolat mai
tarziu s-a dovedit mai putin patogen. Genomic există o inrudire mai mare intre SIV(vir. imunodeficientei
simiene ) si HIV 2 , decat intre HIV 1 si HIV 2.
Atat virusurile simiene cat si cele umane par a avea un precursor comun. Recent au fost descoperite forme
de trecere care dau la om infectii asimptomatice; mai mult acestea provin de la populatia rurală ceea ce
dovedeste continua contaminare a omului cu tulpini simiene.
→ HIV 1 este cel mai raspandit si virulent retrovirus uman, variatia genetică fiind caracteristica lui majoră
→ 2 izolate HIV 1 nu sunt niciodată identice, chiar dacă provin de la acelasi pacient
→ s-au identificat cel putin 10 subtipuri agregate in 2 grupuri : - grupul M (major) care cuprinde subtipuri
grupate de la A la J si - grupul O ; in Romania cel mai răspandit este tipul F
→ tulpinile patogene HIV 1 sunt mai distantate genomic de precursorul lor simian si mai virulente pt. om
decat pt. maimute

► Diagnostic de laborator

Consecutiv infectiei, replicarea virală poate fi demonstrată prin :

-1] – izolarea virusului

- 2] – evidentierea si dozarea antigenului p24
- 3] – detectarea unor secvente genomice prin amplificare genică cu amorse (“primeri”) specifici gag si env
Aparitia Ac – seroconversia - nu poate fi evidentiată decat după 4-8 săptămani, desi sunt date care
prelungesc această “ fereastră serologic negativă ” si peste 6 – 9 luni. Infectia in timpul “ferestrei” poate fi
probată prin tehnici de hibridare sau amplificare, deci genomconversia precede seroconversia si evită false
negativităti inregistrate timpuriu, in cursul ferestrei serologice.
Primii Ac apăruti sunt IgM si apoi IgG si au următoarea succesiune :
→ Ac anti-gag ( anti p24 si p18)
→ Ac anti-env ( anti gp160, gp120 si gp41)
Inainte si după seroconversie subiectul este infectant !!!
In fazele finale titrul Ac anti p24 scade si Ag p24 poate fi dozat din nou .

Tehnicile de diagnostic serologic se impart in investigatii de :

→ triaj (imunoenzimatice)
→ confirmare (imunoamprente, radioimunoprecipitare si imunofluorescenta )
→ diferentiere (HIV1/2)
→ tehnici rapide de diagnostic

*Există 3 generatii de tehnici de triaj:

- generatia 1-a – cu Ag viral nativ obtinut din culturi de limfocite infectate
- generatia a 2-a – cu Ag preparate prin tehnologia ADN recombinat
- generatia a 3-a – cu oligopeptide chimic sintetizate mimand epitopi imunodominanti

Indiferent de Ag , există 4 tipuri de reactii serologice imunoenzimatice folosite :

→ reactii de tip indirect sau cu conjugat anti IgG uman
→ reactii de tip competitiv sau cu conjugat anti HIV-IgG
→ reactii de tip captură care decelează clasa IgM de Ac
→ reactii de tip sandwich antigenic sau imunometric care determ. titrul unor categorii specifice de Ac

Metodele indirectă si de competitie sunt cele mai folosite si se completează reciproc. Orice probă initial
reactivă trebuie retestată in duplicat cu un kit bazat pe acelasi sau (mai bine) si pe alt principiu serologic.

Tehnicile rapide de triaj se bazează pe latexaglutinare sau pe aglutinarea unor particule de Au coloidal
care au fost cuplate cu Ag virale. Reactiile se citesc in 5-10 min., iar cele pozitive trebuie confirmate cu
tehnicile amintite mai sus. In ultimii ani sunt promovate metode de triaj care nu se adresează probelor de ser,
ci altor produse biologice (salivă, urină) care pot fi recoltate prin procedee noninvazive. Rezultatele acestor
proceduri noninvazive de diagnostic care evidentiază prezenta Ac in salivă sau in transudatul gingival
crevicular (“orasure”), pot atinge specificitatea de 98% , dar sensibilitatea este intre 85-90%.

Tehnica Western – Blot sau imunoamprentele - este metoda cea mai utilizată pt. confirmare. Criteriile
de pozitivitate variază după indicatiile firmei producătoare,stipuland prezenta benzilor env (două) + gag (una)
Probele reactive care nu intrunesc criteriile de confirmare Western-Blot sunt etichetate ca indeterminate si
reclamă urmărirea longitudinală la intervale de 3-6 luni a subiectului. Majoritatea testelor rapide contin
suspensii microscopice de particule (latex, gelatină, hematii tanate) cuplate cu Ag viral. Ac din serul de testat
aglutinează aceste particule care formează un depozit ce poate fi citit cu ochiul liber sau la microscop după
numai 5 minute. Există si tehnici rapide de imunoamprente – spoturi mici de Ag HIV pe hartie de
nitroceluloză , care servesc la cuplarea Ac din probă, ulterior developati prin procedee imunoenzimatice sau
cu aur coloidal.
 Tehnici de detectie a virusului si a produselor virale

Metodele care identifică si cuantifică direct produsele virale sunt :

- izolarea virusului prin cocultivarea limfocitelor pacientului cu culturi celulare
- dozarea antigenemiei p24 prin tehnici imunoenzimatice cu sisteme de amplificare
- detectarea ADN proviral in limfocite sau ARN viral plasmatic prin PCR

Metode de izolare - sunt rezervate laboratoarelor care dispun de nise de biosecuritate clasa III si
laboratoarelor de interdictie.
→ Izolarea virală – se face pe culturi de limfocite imortalizate prin tratament cu interleukina-2 si
tratate cu Ac antiinterferon; in prezent există protocoale standardizate pt. izolarea HIV prin cocultivarea in
vitro a limfocitelor de la bolnav, cu limfocite periferice de la subiecti sănătosi, stimulate 24 de ore inainte cu
fitohemaglutinină si IL-2.
→ Detectarea antigenemiei p24 – se face prin metoda ELISA, care utilizează amplificarea
sensibilitatii prin sistemul Ac biotinilati; disocierea complexelor Ag p24 – Ac anti p24, prin tratamentul acid al
serurilor, creste de 5 ori sensibilitatea metodei si este utilă mai ales la sugari. Dozarea Ag p24 serveste si pt.
monitorizarea infectiei in vitro, permitand afirmarea precoce a unei izolări pozitive. In vivo există un raport
invers intre nivelul antigenemiei si nr. de limfocite CD4.
→ Metode de detectare virală prin amplificare genică – PCR – sunt tehnici accesibile
laboratoarelor de cercetare , dar rezultatele sunt foarte valoroase in aprecierea variabilitătii antigenice a
virusului, pt. elucidarea originii unor surse infectante, pt. prognosticul bolii si pt. dg. infectiei neonatale.
Tehnicile de amplificare genică PCR sunt frecvent folosite, existand seturi de primeri specifici ce fac posibilă
evitarea falselor pozitivităti.
→ Detectarea ADN proviral sau ARN viral plasmatic – se face după amplificarea cu primeri
specifici prin PCR, cu tehnici de hibridizare; tehnica PCR poate detecta pană la nivelul 10-30 copii de ADN
HIV proviral. Pt. detectarea produsului amplificat si cuantificarea ADN proviral au fost propuse mai multe
metode : - sonde marcate cu markeri reci
- metode de detectare colorimetrică sau prin chemiluminiscentă
- microtitrarea in plăci cu 96 godeuri
Interpretarea reactiilor PCR – pozitive este validată in functie de anumite criterii stricte: dacă se utilizează un
singur set de primeri, fiecare probă trebuie testată in duplicat; numai probele reactive repetat sunt
considerate pozitive, cele cu un singur rezultat pozitiv sunt indeterminate si retestate. Utilizarea a 2 perechi
de primeri, selectia riguroasă a primerilor si evitarea contaminării probelor sunt elemente care cresc
specificitatea rezultatelor.
→ Amplificarea genică după reverstranscriere (Rt-PCR) - este metoda pt. detectarea ARN-HIV in
plasmă si ilustrează direct infectivitatea probelor pozitive; sensibilitatea extremă a PCR face această metodă
de dg. indispensabilă in detectia infectiei inainte de seroconversie, in detectia transmisiei materno-fetale a
virusului si in evaluarea răspunsului la terapia antiretrovirală si monitorizarea incărcării virale.
→ Incărcarea virală – evaluarea cantitativă a incărcării virale se face prin PCR; există cel putin 4
strategii pt. determinarea cantitativă a nivelului ARN-HIV:
► PCR competitiv cantitativă (PCR-QC) – cea mai folosită, implică desfăsurarea simultană a mai multor
reactii PCR, pornind de la amestecuri ce contin cantităti necunoscute a tintei – ARN-HIV care urmează a fi
determinat si cantităti definite din ceea ce se numeste standard intern;
► NASBA (nucleic acid sequence based amplification) - implică izolarea acidului nucleic prin liza celulelor,
legarea lui de particule de silicon si amplificarea izotermică cu următoarele enzime : reverstranscriptaza, RN-
aza si ARN polimeraza fagului T7
► tehnica de amplificare a semnalului cu AND ramificat (b-DNA) – este o tehnică de hibridizare in care
detectia se face nonizotopic datorită prezentei unor markeri de amplificare a semnalului pe ADN tintă
► tehnici de microplăci de titrare (Amplicor) - se bazează pe stabilirea unei curbe standard pt. dilutiile
controlului intern si pe utilizarea primerilor biotinilati; proba amplificată –amplicor- prin PCR este adăugată in
godeurile unei microplăci in care ampliconii biotinilati se leagă de sonde complementare produse fie de
standardul intern fie de ARN tintă. Un conjugat peroxidază/avidină dă un semnal colorat pt. rezultate pozitive.