7.

Séquençage des protéines

Protéine inconnue

séquençage des acides aminés

Structure primaire

structure secondaire structure tertiaire structure quaternaire

265

7.1 Stratégie de séquençage d’une protéine

™ Stratégie de base développée par Frederick Sanger en 1953 (Prix
Nobel 1958)

™ Étapes impliquées dans le séquençage d’une protéine:

• Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités)
dans la protéine
• Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires)
• Détermination de la composition des acides aminés de chaque chaîne
polypeptidique
• Les chaînes polypeptiques sont souvent trop longues pour être
directement séquencées; elles doivent avant être coupées en des plus
petits fragments peptidiques par des réactions spécifiques.
• Détermination de la séquence de chacun des fragments peptidiques par
la dégradation d’Edman
• Élucidation de la séquence de chacune des chaînes polypeptidiques
par recouvrement des séquences des différents fragments
• Détermination de la structure de la protéine entière, incluant les liens
disulfures entre les sous-unités
266
 7.2 Analyse des résidus terminaux

O R H H O R H
H N
R N N COO-
NH3+ H O H R H

résidu N-terminal résidu C-terminal

™ Puisque chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N-

terminal et C-terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une
protéine peut être déterminé en identifiant le nombre de chacun des
résidus terminaux.

267

7.2.1 Analyse N-terminal

™ Réaction avec du chlorure dansyl (réagit avec des α-amines):

N(CH3)2 N(CH3)2
O R2 O
+ H2N CH C NH CH C NH CH C ...
R1 O R3
HCl
O S O SO2 O R2 O
Cl HN CH C NH CH C NH CH C ...
chlorure dansyl R1 O R3
polypeptide dansyl

N(CH3)2 N(CH3)2

SO2 SO2 O R2 O
O R2 O H3O+ + +
HN CH C NH CH C NH CH C ... HN CH C OH + NH3 CH C OH + NH3 CH C OH + ...
R1 O R3 R1 O R3

acide aminé dansyl acides aminés libres

(espèce fluorescente) 268
™ Dégradation d’Edman (analyse séquentielle):

phényl isothiocyanate (PITC)

(séquençage de peptides
constitués de 40 à 60 résidus)

269

N O R2 O H3O
+ NH O R2 O
+ H2N CH C NH CH C NH CH C ...
C C NH CH C NH CH C NH CH C ...
S R1 O R3
S R1 O R3
PITC
PITC polypeptide

acide trifluoroacétique

R1 O 1. extraction dans un solvant organique R1 O R2 O

+
+ NH3 CH C NH CH C ...
HN N + N S
Ph 2. traitement avec H3O O R3
S NHPh
dérivé phénylthiohydantoin dérivé thiazolinone
λmax = 296 nm

répétition du cycle

270
 Séquençage automatisé par dégradation d’Edman

271

™ Réaction enzymatique (exopeptidase):

O R2 O aminopeptidase O R2 O
+
H2N CH C NH CH C NH CH C ... H2N CH C O- + NH3 CH C NH CH C ...
R1 O R3 R1 O R3

L’utilité des aminopeptidases pour l’analyse des résidus N-terminal

est limitée puisque ces enzymes agissent spécifiquement sur certains
acides aminés et avec des vitesses de réaction différentes.

272
 7.2.2 Analyse C-terminal

™ Il n’y pas de processus comparable à la dégradation d’Edman pour

l’analyse séquentielle des résidus C-terminal.

™ Réaction enzymatique (exopeptidase):

O R2 O carboxypeptidase R2 O O
+
... HN CH C NH CH C NH CH CO- ... NH CH C NH CH CO- + H3N CH C O-
R3 O R1 O R3 R1

Due à la nature sélective des carboxypeptidases, certains résidus

sont résistants aux coupures ou sont coupés très lentement.

273

™ Réaction chimique (ex. hydrazinolyse):

+
O Rn-1 O
H3N CH C ... NH CH C NH CH CO
-

R1 O Rn
polypeptide

NH2-NH2
90°C, 20-100 h
conditions légèrement acide

+ O +
Rn-1 + O
- ...
H3N CH C O + NH3 CH C NH NH2 + + H3N CH C NH-NH2
Rn O R1
acide aminé libre hydrazines aminoacyles

274
 7.3 Coupure des liens disulfures

COO- COO- COO- COO-

+ + + + +
H3N CH H3N CH H3N CH H3N CH
CH2 SH HS CH2 CH2 S S CH2

Cystéine Cystéine Cystine

Insuline Les liens disulfures

doivent être coupés
avant le séquençage
pour séparer et déplier
les sous-unités.

275

™ Oxydation avec de l’acide performique:

Cystine Acide cystéique

O
H N N H H N N H
H C O OH
-
H C CH2 S S CH2 C H H C CH2 SO3- + O3S CH2 C H
C O O C C O O C

™ Toutes les cystéines dans une protéine sont oxydées (celles qui sont liées
ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol).

™ L’acide performique réagit aussi avec d’autres résidus; ex. le groupement

indole de la Trp est partiellement détruit et les résidus Met sont oxydés.

CH3 CH3
S O S O
O
(CH2)2 (CH2)2
H C O OH
NH CH C NH CH C
O O
Méthionine 276
™ Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol:

Cystine

H N N H CH2SH
H C CH2 S S CH2 C H + 2 HSCH2CH2OH ou CH2OH
C O O C CHOH
CH2SH

Cystéines
H N N H HO
SCH2CH2OH S
H C CH2 SH HS CH2 C H + ou
SCH2CH2OH S
C O O C HO

277

Pour empêcher la ré-oxydation de la cystéine formée:

H N H N
-
alkylation
H C CH2 SH + ICH2COO H C CH2 SCH2COO- + HI
C O Iodoacétate C O

Cystéine Cystéine protégée

278
 7.4 Détermination de la composition d’acides
aminés d’une protéine
™ Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique
est un paramètre caractéristique de chaque protéine. Une protéine
inconnue peut souvent être identifiée en mesurant le pourcentage
relatif des différents acides aminés et en comparant avec des bases
de données.

™ Premièrement, les liens peptidiques dans une protéine sont

hydrolysés par traitement acide, basique ou enzymatique. Les
acides aminés libérés sont ensuite séparés et quantifiés.

™ Traitement acide: polypeptides + 6 M HCl, reflux à 100-120°C pour

24 hres sous vide.

279

™ Des temps de réaction plus long sont nécessaires pour une

hydrolyse complète des résidus Leu, Val et Ile.

™ Par contre, certains résidus sont dégradés dans ces conditions

sévères. Trp est considérablement dégradée. La vitesse de
dégradation de certains résidus, tels que Thr, Tyr et Ser peut être
mesurée et un facteur de correction peut être inclut pour tenir compte
de la perte de ces acides aminés en fonction du temps d’hydrolyse.

™ De plus, l’hydrolyse acide convertit Asn à Asp et Gln à Glu,

respectivement (du NH4+ est éliminé). Pour déterminer la quantité de
ces acides aminés, la teneur totale de Asx (Asn + Asp), Glx (Gln +
Glu) et NH4+ (Asn + Gln) doit être mesurée et comparée.

™ Puisque des conditions optimales pour l’hydrolyse acide sont

difficiles à établir, la réaction est effectuée plusieurs fois dans des
conditions différentes et la composition des acides aminés est
déduite à partir des différentes expériences d’hydrolyse.
280
™ Hydrolyse basique: Polypeptides + 6 M NaOH, reflux à 100°C
pendant 4 à 8 hres.
™ L’hydrolyse basique est seulement utilisée dans des cas spéciaux
puisqu’elle est plus problématique que l’hydrolyse acide.
™ Dans ces conditions, Arg, Cys, Ser et Thr sont décomposées et
d’autres résidus sont dé-aminés et racémisés. Ceci limite l’utilisation
de l’hydrolyse basique à la détermination de la teneur en Trp.

™ Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la

détermination de l’Asn, de la Gln et du Trp. Puisque les
exopeptidases et endopeptidases exhibent des spécificités élevées,
il est essentiel d’utiliser un mélange d’enzymes pour assurer
l’hydrolyse de tout les liens peptidiques. Des faibles concentrations
d’enzymes doivent être utilisées (~1%) puisqu’elles sont aussi des
protéines qui peuvent être dégradées et contaminées le mélange
réactionnel.

281

™ Après hydrolyse, les acides aminés libres sont séparés par chromatographie
à échange d’ions ou par HPLC à phase inversée.

™ Exemple: composition des acides aminés dans un peptide

(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)
N(CH3)2

SO2 O
HN CH C OH
R1

SCH2CH2OH

O
N CH C OH
R1

dérivés fluorescents

™ Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention et
quantifiés selon leur volume d’élution.
282
 7.5 Coupure spécifique des liens peptidiques
7.5.1 Fragmentation enzymatique

Endopeptidases:
Coupure spécifique de liens
peptidiques à l’intérieure
d’une chaîne

Exopeptidases:
Coupure d’un acide aminé
N- ou C-terminal d’une chaîne
peptidique

283

trypsine

Protection de la Lys et de l’Arg contre l’hydrolyse par la trypsine 284

La charge positive sur ce dérivé de la cystéine rend cet acide aminé plus
susceptible à l’hydrolyse par la trypsine.

285

7.5.2 Fragmentation chimique

Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal d’un résidu Met.

Br-

H2O

286
 7.6 Détermination de l’ordre des fragments
peptidiques
™ La séquence des fragments peptidiques individuels est déterminé en
établissant l’ordre dans lequel ils étaient connectés.

™ La séquence des acides aminés dans un 1er set de fragments est

comparé avec celui d’un 2è set de fragments pour lequel les points de
coupure sont différents.

™ Un recouvrement de quelques résidus est généralement suffisant pour

identifier un point de connexion.
287

7.7 Détermination des positions des liens

disulfures
™ Fragmentation de la protéine native => mélange de fragments
peptidiques, dont certains sont liés par des ponts disulfures

™ Le mélange peptidique est analysé par électrophorèse sur gel en

2D en utilisant les mêmes conditions de séparation dans les deux
directions.

™ Après séparation dans la 1ère direction, la matrice est exposée à

l’acide performique pour couper tout les liens disulfures existants.

™ Ensuite la séparation est effectuée dans la 2è directions. Les

fragments qui ne contiennent pas de liens disulfures sont
positionnés sur la diagonale puisque leur vitesse de migration
dans le deux directions est identique.

288
™ L’électrophérogramme des fragments contenant des liens disulfures
montrera 2 points pour les fragments produits par oxydation qui sont
positionnés on dehors de la diagonale.

™ Les fragments liés par des ponts disulfures peuvent être isolés du
gel et identifiés par séquençage. La séquence des acides aminés
est ensuite comparer avec celle de la protéine entière, permettant
ainsi l’identification de la position des liens disulfures.

289