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ABIERTO
Una mutación de inserción corta altera la
génesis de miR-16 y provoca un aumento de
peso corporal en el pollo domesticado.
Recibido: 27 de abril de 2016

Aceptado: 17 de octubre de 2016 Publicado:

03 de noviembre de 2016
Xinzheng Jia 1,2,3 Huiran Lin 1,2, Qinghua Nie 1,2, Xiquan Zhang 1,2 y Susan J. Lamont 3

El peso corporal es uno de los rasgos cuantitativos más importantes con alta heredabilidad en el pollo. Anteriormente mapeamos un locus de rasgos

cuantitativos (QTL) para el peso corporal mediante un estudio de asociación de genoma completo (GWAS) en una población de recursos de pollo F2. Para

identificar las mutaciones causales vinculadas a este QTL, se determinaron los perfiles de expresión en hígados de líneas de pollo de alto y bajo peso

mediante microarrays. Combinando el patrón de expresión con los efectos de SNP por GWAS, miR-16 fue identificado como el candidato potencial más

probable con una disminución de 3.8 veces en las líneas de alto peso. La secuenciación posterior reveló que una mutación de inserción de 54 pb en la

región aguas arriba de miR-15a-16 presentaba altas frecuencias alélicas en la línea comercial de engorde de alto peso. Esta mutación resultó en una menor

expresión de miR-16 al introducir tres nuevos sitios de empalme en lugar de los 5 que faltan ′ empalme terminal de miR-16 maduro. La elevación de miR-16

inhibió significativamente la proliferación de células embrionarias de pollo DF-1, lo que concuerda con un papel en la supresión del crecimiento celular. La

inserción de 54 pb se asoció significativamente con un mayor peso corporal, tamaño óseo y masa muscular. Además, la mutación de inserción tendió a la

fijación en pollos de engorde comerciales ( Fst > 0.4) Nuestros hallazgos revelaron una nueva mutación causal para la regulación del peso corporal que

ayuda a nuestra comprensión básica de la regulación del crecimiento en las aves.

El peso corporal, un rasgo importante en todos los animales, refleja directamente el equilibrio de la ingesta y el gasto de nutrientes, lo que resulta en una deposición
magra (proteína) o grasa, así como el crecimiento esquelético. El hígado, como el principal órgano metabólico, desempeña papeles críticos en la regulación del peso
corporal a través del mantenimiento del equilibrio energético de todo el cuerpo. Actúa como un centro para controlar la síntesis y el metabolismo de moléculas tales
como carbohidratos, grasas y proteínas, que se utilizan en diversos tejidos para apoyar la homeostasis de todo el cuerpo. 1) Por ejemplo, el hígado mantiene las
concentraciones de glucosa dentro de un rango normal durante el crecimiento y el desarrollo mediante un sistema complejo y bien regulado de enzimas y quinasas. 2)

Estudios recientes revelaron un eje de señalización del músculo esquelético-hígado-grasa que participa en el ciclo de glucosa-alanina en ratones 3)
Cuando el hígado produce grasa a través de de novo lipogénesis, un fosfolípido liberado en el hígado fue enviado a las células del músculo esquelético para quemar
grasa a través de la oxidación de ácidos grasos 4) Por lo tanto, el hígado es un órgano central involucrado en la deposición de grasa y músculo, por lo que es un tejido
ideal para explorar la regulación genética del peso corporal y la composición.
El pollo, uno de los animales productores de alimentos más importantes desde el punto de vista económico, es un excelente ejemplo de control genético del
peso corporal. Después de 60 años de selección genética intensiva para el crecimiento, los pollos de engorde comerciales modernos son tres veces más
pesados ​que los pollos de control aleatorio 5) Recientemente, las tecnologías avanzadas de genotipado permiten caracterizar variaciones genéticas en grandes
poblaciones e identificar loci asociados con rasgos complejos a nivel de todo el genoma. Mediante la resecuenciación del genoma, se identificaron más de
7,000,000 de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en pollos domésticos y salvajes 6) Hasta la fecha, los paneles SNP de alta densidad (60 K y 600 K
SNP-Chip) se han utilizado con éxito para estudiar distintas poblaciones de pollos naturales y experimentales, lo que resulta en la identificación de muchos loci
de rasgos cuantitativos (QTL) y genes candidatos para el peso corporal. 7–9. En nuestro estudio anterior, utilizando un chip SNP de 60 K y un entrecruzamiento de
pollos indígenas y pollos de engorde comerciales, se identificó una región de 3 Mb en el cromosoma 1 con una fuerte asociación con el peso corporal. 10) Asociación
de todo el genoma

1 Departamento de Genética Animal, Cría y Reproducción, Facultad de Ciencia Animal, Universidad de Agricultura del Sur de China, Guangzhou
510642, Guangdong, China. 2 Laboratorio clave provincial de Guangdong de genómica agropecuaria y cría molecular, y laboratorio clave de genética,
cría y reproducción de pollos, Ministerio de Agricultura, Guangzhou 510642, Guangdong, China. 3 Departamento de Ciencia Animal, Universidad Estatal
de Iowa, Ames, IA 50011, EE. UU. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a QN (correo electrónico: nqinghua@scau.edu.cn
)

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Figura 1. Identificación de miR-16-1 como el gen candidato principal. (UNA) Perfil de expresión génica de todos los genes candidatos dentro de la región
QTL mapeados por el estudio de asociación de genoma completo (GWAS) sobre el peso corporal. Se realizó una micromatriz para la expresión de ARNm y
miARN en tejido hepático de pollos de línea de alto y bajo peso. Los ARNm y los miARN expresados ​diferencialmente se identificaron mediante análisis
ANOVA y falsos positivos (cambio de plegado> 1,5; p < 0,01). ( SI) Se identificó una mutación de inserción de 54 pb en el primario de miR-15a-16 en pollos.
Esta mutación se localizó 145 pb aguas arriba del precursor miR-15a-16. ( C) La electroforesis en gel se realizó para la detección de mutaciones en las
distintas líneas de pollo. ( RE) Expresión de miR-16 en el tejido muscular de pollos hembra de crecimiento rápido y crecimiento lento (n = 4 por línea). La
línea de rápido crecimiento es de la raza blanca de roca recesiva con inserción del genotipo homocigoto del miR-15a-16. La línea de crecimiento lento es la
raza indígena Xinghua con un genotipo homocigoto de deleción salvaje de miR-15a-16. Los valores de expresión relativos se calcularon usando el 2 - ∆ Connecticut método.
Los datos se presentan como los medios ± DAKOTA DEL SUR. * * p < 0.05 y ** p < 0.01 fueron estimados por la prueba t de Student.

Los estudios (GWAS) identifican variantes que probablemente estén vinculadas a las mutaciones causales, pero no identifican funcionalmente las mutaciones
causales en sí 11) Para identificar variantes causales se requiere un mapeo de desequilibrio de recombinación o enlace de alta resolución para nominar genes
candidatos putativos, seguido de investigación funcional y análisis de expresión génica. 12) Sigue siendo una tarea difícil buscar las mutaciones causales
vinculadas a los QTL observados responsables de los rasgos biológicos complejos.

La nueva estrategia de analizar la expresión de genes dentro de las regiones QTL ayudaría a reducir el número de genes candidatos o mutaciones
causales responsables del peso corporal u otros rasgos complejos. Usando este método, se identificó una mutación en el sitio de empalme en el cerdo para
causar una mala calidad de la carne al afectar los niveles de expresión del gen PHKG1 13) Anteriormente, mapeamos QTL para el peso corporal en una
población de recursos F2 producida cruzando pollos comerciales e indígenas 10) En el presente estudio analizamos los perfiles de expresión de genes
candidatos dentro de esta región QTL en el cromosoma 1 (167 a 170 Mb) con el objetivo de determinar las mutaciones causales que contribuyen a la
regulación del peso corporal. Los resultados revelaron que una inserción de 54 pb en la región aguas arriba de miR-15a-16 disminuyó la expresión de miR-16,
lo que resultó en un aumento de peso corporal significativamente mayor.

Resultados
El análisis integrado de QTLs con transcriptoma hepático apoyó miR-16-1 como un candidato importante.
En nuestros estudios anteriores, se realizó un GWAS para determinar la arquitectura genética del peso corporal en un entrecruzamiento F2 (de una línea de
crecimiento rápido y una de crecimiento lento), lo que resulta en una región QTL de 3 Mb en el cromosoma 1, que contiene casi todos Los efectos significativos del
SNP sobre el peso corporal 10) También se confirmó que esta región QTL estaba significativamente asociada con el peso corporal en un estudio independiente. 8) Para
diseccionar la mutación causal dentro de esta importante región QTL, se realizó el perfil de expresión de 62 genes codificadores y el mapeo de 2 miRNAs a este
intervalo utilizando hígados de aves de crecimiento rápido y crecimiento lento. Cuarenta y seis genes y miR-15a / 16 se detectaron con éxito (Fig. 1A), de los
cuales tres genes (SUCLA2, CKAP2 y miR-16) exhibieron una expresión significativamente disminuida en las líneas de alto peso. Al integrarse con los resultados
de GWAS, solo miR-16 localiza cerca de dos de los loci más significativamente asociados (rs14916980 y rs13972116; Tabla complementaria S1), que alcanzaron
una significación de todo el genoma en el crecimiento de pollos 8) Además, miR-16, el gen más diferencialmente expresado con una regulación descendente de 3.4
veces, juega un papel crítico en el crecimiento y desarrollo de los órganos. Anteriormente se informó que miR-16 medía en varias vías de señalización esenciales
relacionadas con el crecimiento, incluidas la señalización nodal, la señalización PI3K / AKT, la señalización MAPK y la señalización FGF 14-16. Por lo tanto, es
razonable proponer que miR-16-1 fuera el regulador responsable del control del crecimiento.

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Figura 2. La secuencia primaria completa de miR-15a-16 se ensambló mediante múltiples conjuntos de datos y secuenciación de clonación SMART. El
análisis integrado de un conjunto de datos de RNA-seq largo no codificante (GSM694305) en músculo, otro dataset de RNA-seq largo no codificante (GSE28080) en
datos de músculo y transcriptoma (SRP038897) usando tecnología de secuenciación de lectura larga resultó en 9 contigs mapeados al flanco de miR -15a-16 clúster.
Luego, usando 5 ′ tecnología de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), se identificó una transcripción de 1028 pb para superponerse a 6 contigs de
secuenciación de alto rendimiento, dando como resultado un fragmento de isoforma de transcripción de aproximadamente 5 kb de longitud.

Una inserción de 54 pb se correlacionó con la expresión de miR-16. Para buscar mutaciones potencialmente causales que afecten la expresión de
miR-16, nos centramos en detectar variaciones en las regiones flanqueantes del grupo miR-15a-16 en individuos F0 de líneas de entrecruzamiento de Xinghua y
White Recessive Rock. Se encontraron tres variaciones en la región de miR-15a-16 (Tabla complementaria S2). Es de destacar que una mutación de inserción de 54
pb, ubicada a 145 pb aguas arriba del precursor miR-15a-16, dio como resultado una estructura de ARN cambiada con un asa de horquilla añadida (Fig. 1B). Las
frecuencias de esta mutación de inserción fueron del 10,7% y 63,3% en los grupos de bajo peso (n = 14) y alto peso (n = 14), respectivamente (Fig. 1C, Tabla
complementaria S3). Además, no se detectó ningún tipo de deleción homocigótica en la línea de alto peso, lo que sugiere que esta mutación estaba potencialmente
en proceso de selección para la tasa de crecimiento.

El análisis de expresión reveló que la expresión de miR-16 en el tejido muscular de las aves con el tipo de deleción homocigótica (línea de bajo peso, n = 4) fue
mucho mayor que la del tipo de inserción homocigótica (línea de alto peso, n = 4 ) (Fig. 1D), mientras que miR-15a no mostró cambios significativos (no se muestran),
lo que es consistente con nuestros datos transcriptomáticos hepáticos. El resultado es interesante porque esta mutación de inserción corta se correlaciona
significativamente con la disminución de la expresión de miR-16 en el hígado de pollo y los tejidos musculares.

Caracterización de la transcripción primaria del grupo miR-15a-16-1. Para determinar el impacto de la mutación en la biogénesis de miR-16, es
necesario caracterizar el proceso de transcripción del grupo miR-15a-16. La secuenciación de alto rendimiento y las tecnologías de clonación SMART
proporcionaron un enfoque eficaz para identificar posibles transcripciones primarias. Análisis integrado de nuestros datos anteriores de RNA-seq no
codificantes largos (GSM694305) en músculo, otros datos de RNA-seq largos no codificantes (GSE28080) en músculo 17 y datos de transcriptoma (SRP038897)
utilizando tecnología de secuenciación de lectura larga 18 años resultó en 9 contigs mapeados a la región flanqueante del grupo miR-15a-16 (Fig. 2). Luego, usando
5 ′ La tecnología de amplificación rápida de cDNA termina (RACE), se identificó una transcripción de 1028 pb para superponer 6 contigs de secuenciación de
alto rendimiento, lo que resulta en un fragmento de isoforma de transcripción de aproximadamente 5 kb (Fig. 2). Estos datos revelaron que miR-16-1 tiene una
unidad transcripcional independiente con más de 5 kb de transcripción primaria de ARN.

La inserción de 54 pb induce un empalme alternativo que da como resultado una disminución de la expresión de miR-16.
Aunque miR-15a y miR-16-1 se producen a partir del mismo grupo primario, los niveles de expresión varían. Para confirmar si la mutación de inserción altera
el patrón de empalme alternativo durante la génesis de miRNA, 3 ′ RACE PCR se realizó a partir de ARN del músculo esquelético de las aves con la inserción
o eliminación de 54 pb (tipo salvaje). Para cada biblioteca de ADNc, se seleccionaron al azar 100 clones para la secuenciación. Se detectaron cinco tipos de
sitios de empalme alternativos en los individuos de inserción sin 5 ′ empalme terminal de miR-16 maduro, mientras que se detectaron 3 tipos de sitios de
empalme alternativos normales en los 5 ′ terminal de miR-15 maduro y miR-16 para los individuos con deleción (Fig. 3A; Tabla complementaria S4).
Curiosamente, 2 sitios de empalme se ubicaron dentro de la región de inserción de 54 pb. Analizando aún más la estructura de las secuencias de inserción,
hubo un típico vástago flanqueado por dos repeticiones directas de 19 pb (Fig. 3A). Por lo tanto, los sitios de empalme cercanos en ambos tallos de la
estructura de la horquilla podrían ser sensibles al reconocimiento por parte de RNase III, un fenómeno que merece más estudio.

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Figura 3. La inserción de 54 pb cambió los patrones de empalme alternativo de ARN. (UNA) Estructura de ARN de inserción y sitios de empalme alternativos
variados en comparación entre los tipos de inserción y eliminación. ( SI) Los niveles de expresión de ARN de fragmentos cerca de la región de inserción se probaron en
las aves con el genotipo de inserción. ( C) Los niveles de expresión de ARN de fragmentos cerca de la región de inserción se probaron en las aves con el genotipo de
deleción. ( RE) El empalme alternativo en la región de inserción se realizó usando un sistema de gen indicador. Un fragmento de 106 pb que incluye la inserción del
tallo-asa, o fragmentos normales de 52 pb, se clonó en el 3 ′ UTR del gen informador (luciferasa) seguido con señales de poliA. Los vectores recombinados se
cotransfectaron con el vector de control pRL-TK en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1 durante 36 h para detectar la actividad de luciferasa de luciérnaga.
( MI) El efecto de la mutación de inserción en la expresión de miARN maduro in vitro Un fragmento de 1300 pb de la transcripción primaria de miR-15a-16 se clonó en el
vector pcDNA3.1 (pcDNA-II y pcDNA-DD) para sobreexpresar miRNA en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1. Los miARN maduros se probaron por
q-PCR. En todos los paneles, los datos se presentan como media ± DAKOTA DEL SUR. ** ** p < 0.01 fue estimado por la prueba t de Student (n = 3).

Para validar que la mutación de inserción indujo eventos de empalme alternativos, se cuantificó el nivel de expresión transcripcional de segmentos en
distintas regiones que flanquean el sitio insertado. Solo el fragmento que contiene la región de inserción ( - 199 a - 293 pb aguas arriba del precursor de
miARN) fue mucho más bajo en expresión que los fragmentos flanqueantes, lo que sugiere que se produjo un empalme alternativo en la región de
inserción ( - 145 a - 175 pb) (Fig. 3B, C). El fragmento de 106 pb que contiene la mutación de inserción y el fragmento salvaje de 52 pb se clonaron cada
uno en el 3 ′ UTR del gen indicador de luciferasa de luciérnaga seguido con señales de poliA. Después de la co-transfección con el vector de control
pRL-TK en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1, la actividad luciferasa de luciérnaga de tipo mutación de inserción disminuyó en comparación
con el tipo salvaje (Fig. 3D), lo que indicó que la expresión del gen luciferasa fue suprimida por el segmento de inserción en el 3 ′ UTR. Por lo tanto, el
segmento de inserción experimentó un empalme alternativo que condujo a la inestabilidad de ARNm y a una menor actividad de luciferasa.

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Figura 4. miR-16 suprimió la proliferación de fibroblastos embrionarios. (UNA) Sobreexpresión de miR-16 en células de fibroblastos de embrión de pollo
DF-1 usando miRNA mímico. 20 nM imita miR-16 y ARN aleatorio negativo se transfectaron en líneas celulares, por separado. Después de 36 h después de la
transfección, las células se cosecharon para detectar la expresión génica (n = 3). U6 se usó como el gen de referencia. Los valores de cambio de pliegue se
calcularon usando 2 - ∆∆ Connecticut

método. ( SI) El afecto de miR-16 en el crecimiento de células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1. Se transfectaron 20 nM mimetizantes miR-16 y ARN
aleatorio negativo en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1, respectivamente (n = 6). Después de diferentes períodos de cultivo (24 h, 48 hy 72 h), se
analizó la capacidad de proliferación celular con el ensayo MTT. Las curvas de proliferación fueron valores calculados de densidad óptica a 570 nm. Las curvas
muestran que miR-16 inhibió significativamente la proliferación celular de fibroblastos de embriones de pollo DF-1. Los datos se presentan como los medios ± DAKOTA
DEL SUR. * * p < 0.05 y ** p < 0.01 fueron estimados por la prueba t de Student.

Para determinar si el empalme alternativo inducido por la mutación de inserción afectaba la expresión de miRNA maduro, 1300 pb del transcrito
primario de miR-15a-16 se clonó en el vector pcDNA3.1 (pcDNA-II y pcDNA-DD), que se utiliza para sobreexpresión de miARN in vitro 19) Después de la
transfección en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1 y 36 h de cultivo, la expresión de miR-16 madura en los tipos de inserción fue
significativamente menor que en los tipos de deleción ( p < 0,01), mientras que la expresión madura de miR-15a exhibió pequeños cambios (Fig. 3E). Como
era de esperar, estas observaciones fueron generalmente consistentes con nuestros resultados anteriores de que la inserción de 54 pb introdujo dos
nuevos sitios de empalme alternativos en la región de mutación, pero se detectaron pocos sitios de empalme en el miR-16 5 ′ término. Colectivamente, estos
resultados confirmaron que la mutación de inserción en la transcripción primaria indujo un patrón de empalme alternativo especial y disminuyó la expresión
de miR-16 maduro.

miR-16 inhibe la proliferación celular de fibroblastos del embrión de pollo DF-1. La familia miR-16 induce la detención del ciclo celular en la mayoría de
las células cancerosas mediante la regulación de múltiples genes del ciclo celular. 20) Sin embargo, ningún estudio ha abordado aún los impactos de miR-16 en el
crecimiento embrionario. Para verificar esto, se usó el imitador de miR-16 para regular la expresión de miR-16 en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1 (Fig.
4A). El ensayo MTT mostró que miR-16 inhibió significativamente la proliferación de células de fibroblastos de embriones de pollo DF-1 y este efecto fue constante
hasta 72 h (Fig. 4B).

La mutación indel estuvo fuertemente asociada con rasgos de crecimiento. La selección artificial ha producido grandes cambios fenotípicos entre
razas durante la domesticación. Aquí, se construyó una población de recursos F2 entrecruzando una raza indígena (XH, 10% de alelo de inserción) y pollos de
engorde comerciales (WRR, 63% de alelo de inserción) para llevar a cabo un análisis de asociación de marcador-rasgo de la inserción de 54 pb en el rendimiento
de crecimiento (Fig. 5A). Los resultados revelaron una asociación altamente significativa entre la mutación de inserción de 54 pb y el peso corporal, el diámetro
del vástago y la longitud del vástago. De 28 a 84 días, el peso corporal de las aves homocigóticas de inserción (genotipos II) fue significativamente ( p < 0,01) más
pesado que las aves homocigotas de tipo deleción (genotipos DD), y a la edad de 84 días, la diferencia de ganancia de peso fue de 224 g (Fig. 5B). El diámetro y
la longitud del vástago también fueron mayores en las aves que contenían la inserción de 54 pb. De 49 a 84 días, los diámetros de vástago de las aves de tipo
inserción fueron significativamente mayores que los de las aves de tipo deleción (Fig. 5C). Del mismo modo, las longitudes de la caña fueron más largas en las
aves de inserción (Fig. 5D). Estos datos indican que la mutación de inserción se asoció con el rendimiento del crecimiento, contribuyendo al aumento de peso y al
crecimiento óseo.

En el pollo, el crecimiento está altamente correlacionado con los rasgos de la canal. 21, que impacta el valor económico. Aquí, mostramos que los rasgos de
composición corporal del peso de la canal, el peso semieviscerado, el peso eviscerado, el peso muscular de las mamas, el peso muscular de las piernas y el peso de
las plumas se asociaron significativamente con la mutación de inserción ( p < 0,001)
(Tabla 1).

Frecuencia alélica de mutación de inserción entre distintas poblaciones de pollos. La frecuencia alélica es un reflejo de la diversidad genética
entre las poblaciones, lo que puede indicar una deriva genética o una nueva introducción de mutaciones. Para ayudar a aclarar cuándo ocurrió esta mutación de
inserción durante la domesticación del pollo, se utilizaron 12 razas distintas para estimar su frecuencia de alelos. Se encontraron grandes diferencias en la
frecuencia alélica entre las razas indígenas, las aves silvestres y las razas comerciales. Las aves de la jungla roja, el supuesto antepasado del pollo doméstico,
tenían el genoma de referencia sin el alelo de inserción. Una raza salvaje de la isla de Kauai, que representa una raza sin selección artificial reciente, también
exhibió una baja frecuencia de inserción de alelos en 6.3%. Para las razas indígenas, que se han sometido a una selección no sistemática y tienen un crecimiento
lento, la frecuencia del alelo de inserción fue de aproximadamente 5% a 21%. Sin embargo, la frecuencia de inserción de alelos de dos razas comerciales de
pollos de engorde con rápido crecimiento fue de hasta el 70% (Tabla 2). Según el análisis de alineación de genomas de referencia de otras especies de aves
(pato, ganso y pavo), no

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Figura 5. Efecto genético de la mutación indel. (UNA) La población de recursos F2 se construyó mediante entrecruces recíprocos entre los
pollos indígenas Xinghua y los pollos White Rock. Se midió un total de 450 aves para el rendimiento de crecimiento y las características de la
canal. ( SI) Análisis de asociación entre diferentes genotipos (DD, tipo de deleción homocigótica; ID, tipo heterocigoto; II, tipo de inserción
homocigótica) y peso corporal del pollo en la población de recursos diseñados F2 (XH y WRR). ( C) Análisis de asociación entre diferentes
genotipos (DD, ID o II) y longitud de la pierna de pollo en la población de recursos diseñada F2 (XH y WRR). ( RE) Análisis de asociación entre
diferentes genotipos (DD, ID o II) y el diámetro de la pierna de pollo en la población de recursos diseñados F2 (XH y WRR). El número de aves
DD, ID y II fue de al menos 270, 90 y 55, respectivamente. Los datos se presentan como mínimos cuadrados medios (LSM) ± Error de soporte (SE);
* * p < 0,05, ** p < 0,01,

* * * *p < 0.001, **** p < 0.0001.

Genotipo

Rasgos DD CARNÉ DE IDENTIDAD II Valor P

Peso de la carcasa 1292.81 ± 14,49 (282) 1366,99 ± 21,99 (99) 1399,27 ± 29,63 (55) 0,0004

Peso semi-eviscerado 1180,75 ± 13,75 (282) 1252,57 ± 20,58 (99) 1278,36 ± 27,74 (55) 0,0003

Peso eviscerado 1023,85 ± 12.14 (282) 1086.07 ± 18,17 (99) 1108,54 ± 24,49 (55) 0,0004

Peso muscular del pecho 88,17 ± 1,1 (282) 93,58 ± 1,67 (99) 95,56 ± 2,25 (55) 0,0009

Peso muscular de la pierna 112,75 ± 1,44 (282) 119,22 ± 2,18 (99) 120,9 ± 2,94 (55) 0.0044

Peso de las plumas 62,87 ± 0,73 (282) 66,62 ± 1,1 (99) 68,72 ± 1,49 (55) 0,0001

Espesor de la grasa subcutánea 4.17 ± 0,09 (282) 4.13 ± 0,13 (99) 3.97 ± 0,18 (55) 0,5816

Peso de la grasa abdominal 28,1 ± 1,15 (282) 26,75 ± 1,74 (99) 28,74 ± 2,35 (55) 0,7081

Tabla 1. La mutación de inserción corta se asoció con rasgos de la canal. Se realizaron comparaciones múltiples para calcular las diferencias en las
medias de mínimos cuadrados (LSM) mediante la prueba de rango múltiple de Duncan. Los números de aves DD (tipo de deleción homocigótica), ID
(tipo heterocigoto) y II (tipo de inserción homocigótica) fueron al menos 270, 90 y 55. Los datos se presentaron como (LSM) ± Error estándar (SE).

La mutación de inserción ocurrió en estas especies. Estos resultados sugieren que esta mutación de inserción corta surgió temprano en la domesticación del pollo y
respondió fuertemente a la reciente selección intensa para un rápido crecimiento y alto peso corporal.

Selección diferencial de alelos de inserción en pollos de engorde modernos. La selección positiva provoca la propagación y concentración de
alelos ventajosos entre las poblaciones, lo que resulta en una reducción de la diversidad en los loci seleccionados y, potencialmente, la fijación en algunas
poblaciones. Para identificar la evidencia de selección diferencial en miR-15a-16 durante la domesticación en pollos, por pares Fst Los valores se calcularon en
12 poblaciones de pollos. Los resultados indican que se detectó una firma de selección significativa entre pollos de engorde comerciales y otras líneas. Entre
estas dos líneas de pollos de engorde, hubo poca diferenciación. Se encontró un valor de diferenciación extremadamente alto (más de 0.5) entre pollos
salvajes y líneas de engorde, lo que sugiere que la mutación de inserción fue altamente seleccionada en los pollos modernos de tipo carne. Además, la
mayoría de las razas indígenas y estas líneas comerciales tenían importantes

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Razas Personaje Fre (I) Ref. De población #

Pollo salvaje Kauai * Salvaje 6.3% 24 29

Red Junglefowl Ancestro salvaje 0.0% 66 35

Pollo Xinghua huevo de carne 14,1% 252

Pollo Wenchang huevo de carne 22,9% 48

Pollo gushi huevo de carne 7.6% 82

pollo amarillo enano huevo de carne 4.6% sesenta y cinco

Pollo con cuello desnudo huevo de carne 20,5% 39

Pollo Qingyuan huevo de carne 13,2% 72

Pollo tibetano huevo de carne 10.0% 10 35

Lucha contra el pollo huevo de carne 18,8% 8 35

White Rock Chicken 1 parrilla 73,5% 81

White Rock Chicken 2 parrilla 69,6% 69

Tabla 2. Frecuencia alélica de mutación de inserción en miR-15a-16 entre pollos salvajes, indígenas y comerciales. Las aves se genotiparon mediante
análisis de los conjuntos de datos de secuenciación del genoma de la base de datos SRA.
* *Kauai es una isla hawaiana con varios tipos de pollos salvajes.

firmas de diferenciación ( Fst > 0.4) A diferencia de, Fst los valores entre las líneas indígenas fueron casi inferiores a 0.1, lo que indica que no hay una
diferenciación obvia (Tabla 3).

Discusión
El peso corporal es uno de los rasgos más heredables, con una heredabilidad de aproximadamente 0.24 ~ 0.47% a diferentes edades en pollos 22)
En este estudio, caracterizamos una mutación causal que afecta el peso corporal en el pollo. Integramos nuestro mapeo QTL anterior para el peso corporal por
GWAS con el perfil de expresión del hígado para reducir el número de genes candidatos potencialmente vinculados a mutaciones causales. Nuestros resultados
respaldaron miR-16 como un gen candidato altamente probable, basado en la ubicación en la región QTL principal por GWAS, y una expresión significativamente
diferente en el hígado y el tejido muscular de pollos de crecimiento rápido versus lento. La expresión elevada de miR-16 también suprimió el crecimiento de
células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1. Se identificó que una mutación de inserción de 54 pb en el flujo ascendente de precusor era una mutación
causal que interrumpía la génesis de miR-16 y contribuía al aumento de peso durante la mayor parte de la fase de crecimiento. Varias observaciones
independientes apoyan la inserción de 54 pb como la mutación causal: (1) miR-15a-16 es una transcripción independiente grande (más de 5 kb), lo que sugiere
que miR-15a-16 estaría regulado por múltiples factores de transcripción y empalmes alternativos. (2) La mutación de inserción de 54 pb cambió el patrón de
empalme alternativo miR-16. El análisis de isoformas alternativas demostró que la mutación de inserción introdujo tres sitios de empalme alternativos novedosos
en lugar de 5 ′ sitio de empalme terminal de miR-16 maduro. También dos sitios estaban dentro de la región de inserción. (3) La mutación de inserción de 54 pb
causó una menor expresión de miR-16. En ambos en vivo tejido y in vitro En los experimentos con células, el tipo de inserción dio como resultado una menor
abundancia de miR-16 maduro. (4) La mutación de inserción se asoció con un alto peso corporal y rendimiento de crecimiento. En la población F2, esta mutación
se asoció significativamente con la mayoría de los rasgos de crecimiento, como el peso corporal, el tamaño de los huesos y la masa muscular ( p < 0,01). ( 5) La
mutación de inserción se seleccionó durante la selección comercial de pollos de engorde. El análisis de frecuencia de alelos mostró que el alelo de inserción
tendía a la fijación en las poblaciones comerciales modernas de pollos, pero no en las indígenas y salvajes ( Fst > 0.4) En conjunto, nuestros hallazgos revelaron
una nueva mutación causal en miR-16 que contribuye a la regulación genética del peso corporal.

Mediante el análisis de la diferencia de transcriptoma hepático entre líneas de alto y bajo peso, redujimos el número de genes candidatos ubicados
en la región QTL a tres candidatos principales que mostraron expresión diferencial, SUCLA2, CKAP2 y miR-16. Según la anotación funcional, SUCLA2 es
una enzima mitocondrial que cataliza la reacción inversa de succinil-CoA y ADP o GDP para succinato y ATP o GTP 23) La eliminación o mutación de
SUCLA2 conduce a elevar el ácido metilmalónico, lo que resulta en una serie de fenotipos complejos que comprenden atrofia muscular, hipercinesia,
discapacidad auditiva severa y retraso del crecimiento postnatal 24) CKAP2 es una proteína asociada a microtúbulos que es crítica para la progresión
mitótica normal 25) Aunque se informó que tanto SUCLA2 como CKAP2 estaban relacionados con la regulación del crecimiento, ninguno de los SNP
ubicados en ellos alcanzó significación en todo el genoma en el crecimiento de pollos. Para miR-16-1, los dos loci de rs13972116 y rs14916980, ubicados
hacia arriba y hacia abajo del precursor mostraron un gran efecto sobre el crecimiento del pollo 8) Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que miR-16
debería ser un gen causal que regula el crecimiento del pollo. Identificamos una inserción de 54 pb cerca de miR-16 como una mutación causal que
probablemente afecta el aumento de peso corporal al interrumpir la expresión de miR-16.

Aunque no se ha informado previamente de ninguna relación directa entre miR-16 y el peso corporal, se demostró que miR-16 desempeña un papel
fundamental en la regulación del crecimiento y desarrollo de órganos mediante la mediación de varias vías de señalización relacionadas con el crecimiento,
incluidas la señalización nodal, la señalización PI3K / AKT, Señalización MAPK y señalización FGF 14-16. In vitro, miR-16 indujo la detención de G1 en células A549 al
dirigirse a múltiples genes del ciclo celular como CCND1, CCND3 y CCNE1 20) Nuestros resultados fueron consistentes con informes anteriores, ya que nuestro
estudio también indicó que miR-16 impactó el desarrollo embrionario de pollo al inhibir significativamente la proliferación de células de fibroblastos de embriones de
pollo DF-1. Además, miR-16 promueve la apoptosis celular mediante la regulación del gen Bcl2 en tumores y enfermedades hepáticas. 26,27. En conjunto, estos datos
sugieren que miR-16 podría afectar el crecimiento corporal al reprimir el crecimiento de varios tipos de células e inducir la apoptosis.

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Kauai salvaje Pollo Xinghua Wenchang Enano


Pollo Gushi Amarillo Pollo con cuello Pollo Pollo Lucha
Rock contra el pollo White
popular pollos selva roja ave pollo pollo desnudo Qingyuan tibetano pollo # 1

Red Junglefowl - 0,0102

Pollo Xinghua 0,0009 0,0194

Pollo Wenchang 0,0783 0,1067 0,0538

Pollo gushi - 0,0162 - 0,0186 0.0014 0,0831

Pollo amarillo enano - 0,0110 - 0,0182 0,0187 0.1356 0,0003

Pollo con cuello desnudo 0,0576 0,0787 0,0323 - 0,0109 0,0604 0.1145

Pollo Qingyuan 0,0101 0,0356 - 0.0023 0,0247 0.0073 0,0366 0.0093

Pollo tibetano - 0,0240 0,0195 - 0,0266 0,0215 - 0,0365 0.0011 - 0.0011 - 0,0238

Lucha contra el pollo 0,0526 0.1137 - 0.0043 - 0,0301 0,0263 0,1263 - 0,0448 - 0,0207 - 0,0188

White Rock Chicken # 1 0.5750 0,5879 0.6194 0,3997 0.6138 0.6473 0.4262 0,5331 0,5143 0.4259

White Rock Chicken # 2 0,5319 0,5406 0,5871 0.3497 0.5789 0.6150 0,3759 0,4913 0,4629 0.3685 - 0.0030

Tabla 3. Índice de fijación por pares ( Fst) entre pollos salvajes, indígenas y comerciales. Todas Fst GENEPOP 4.5 probó los valores estadísticos
con corrección de Bonferroni. El valor de corte se estableció en p < 0.002 al 5% de intervalo de confianza.

La selección artificial dio forma a la cantidad y distribución de la variación genética durante el proceso de domesticación, y también en el desarrollo reciente
de razas y poblaciones de producción comercial, especialmente en aves. Como resultado, muchos alelos beneficiosos se fijaron o casi se fijaron en razas
específicas a medida que ocurrían cambios genéticos en la diferenciación de la población que acompañaba el proceso de domesticación. 28) En nuestro estudio,
las frecuencias alélicas de inserción de 54 pb en los pollos ancestrales, indígenas y modernos mostraron una diferenciación poblacional significativa. Los pollos
de engorde comerciales tuvieron la mayor frecuencia de alelos, hasta un 70%, mientras que las antiguas aves de la jungla roja eran cero y las razas autóctonas
eran solo del 6-20%. La frecuencia de inserción de alelos en pollos salvajes de la isla de Kauai fue de 6.3% (n = 24) con poca diferencia de las aves de la selva
roja. Esto fue consistente con un informe anterior de que las gallinas Kauai mostraron una mezcla de gallinas domésticas y antiguas aves de la selva roja
durante las últimas décadas. 29) El primer análisis estadístico también demostró que el alelo favorable para el crecimiento de la mutación de inserción miR-16 se
acercaba a la fijación en las líneas comerciales de rápido crecimiento ( Fst > 0.4) durante la selección artificial reciente luego de una domesticación a largo plazo.

La inserción de 54 pb no se ha informado previamente en estudios de selección de barrido o re-secuenciación de pollos. A través de la alineación de novo de
los fragmentos de inserción con estos datos del genoma reportados de distintas poblaciones, encontramos que esta mutación de inserción existe en múltiples
poblaciones, por ejemplo en los pollos salvajes de Kauai. 29) En un extenso estudio sobre la selección del genoma completo durante la domesticación de pollos, se
detectaron 1.300 deleciones y varios barridos selectivos putativos en ocho poblaciones diferentes de pollos domésticos, así como aves de la selva roja, y se
encontró que los barridos selectivos más fuertes contenían los genes TSHR y SH3RF2 6) Sin embargo, utilizando la tecnología de lecturas de secuenciación de 36
pb, solo se pudieron detectar de manera confiable mutaciones indel de 100 pb o más. Para las mutaciones de inserción o eliminación cortas (40–100 pb) en el
genoma, es difícil realizar pruebas utilizando el panel SNP actual o los métodos de secuenciación posterior, debido a las lecturas cortas y la estrategia de
ensamblaje 30) La mejor estrategia futura para la detección indel es combinar la secuenciación profunda con la secuenciación tradicional de lectura larga o la
secuenciación molecular única y el ensamblaje de novo.

En resumen, a través de la localización conjunta de un QTL para el peso corporal identificado por GWAS y elementos expresados ​diferencialmente en el hígado,
hemos mapeado bien miR-16 como el gen candidato principal probablemente vinculado a una mutación causal para varios rasgos de crecimiento y composición
corporal. Una mutación de inserción de 54 pb en 145 pb aguas arriba del precursor miR-15a-16 se identificó como la mutación causal, lo que resultó en un aumento del
peso corporal, el tamaño del hueso y la masa muscular al interrumpir el empalme alternativo durante la biogénesis de miR-16. Además, el análisis de frecuencia de
alelos mostró diferencias significativas en distintas poblaciones de pollos durante la domesticación, tendiendo a la fijación en pollos de engorde comerciales ( Fst > 0.4)
En total, nuestros hallazgos proporcionaron nuevos conocimientos para ayudar a comprender la regulación del peso corporal y proporcionan un biomarcador que puede
contribuir a mejorar la selección genética para mejorar el rendimiento en las aves de corral.

Métodos Declaración de ética. Todos los protocolos experimentales en este estudio cumplieron con las pautas del Comité de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad Agrícola del Sur de China (SCAU) (Guangzhou, República Popular de China). Todos los experimentos con animales de este estudio
fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la SCAU con el número de aprobación SCAU # 0011.

Animales Se utilizaron un total de 12 poblaciones para el análisis de frecuencia de alelos del indel de 54 pb en los 5 ′
región de pre-miR-15a-16, que incluye 2 razas salvajes (pollos salvajes de Kauai y aves de la selva roja), 8 pollos indígenas (pollo
Xinghua, pollo Wenchang, pollo Gushi, pollo de cuello desnudo, pollo Qingyuan (QY), pollo de pelea, pollo amarillo enano y pollo
tibetano) y 2 razas comerciales (pollo White Rock # 1 y # 2).

Se construyó una población familiar diseñada con F2 para el análisis de asociación genética. Catorce pollos indígenas Xinghua (XH; una raza de
crecimiento lento que contiene 10.71% de alelos de inserción) y 14 pollos blancos de roca recesiva (WRR, una raza de crecimiento rápido que contiene
63.33% de alelos de inserción) se entrecruzaron para generar un F2

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población de recursos por apareamiento recíproco. Un total de 450 aves en 14 familias de hermanos completos se criaron en corrales de piso con dietas basadas en
maíz y soya que cumplían con todos los requisitos de la NRC. Se midieron y registraron los crecimientos detallados y los rasgos de la canal después de la eclosión
(días 1–90) y el sacrificio a los 90 días de edad.
Se usaron tejidos de hígado de 3 QY indígenas y 3 pollos WRR comerciales de aproximadamente 7 semanas de edad para el análisis de microarrays de
miRNA. Se usaron otras 8 aves de XH y WRR (n = 4 por población) para confirmar el patrón de expresión de miR-16. En nuestro estudio anterior, se usaron tejidos
hepáticos de 3 XH indígenas y 3 pollos WRR comerciales de aproximadamente 7 semanas de edad para el análisis de microarrays de ARNm 31) Los pollos QY y XH
son poblaciones con un rendimiento de crecimiento similar y, por lo tanto, se utilizan para representar poblaciones con las mismas características generales de
crecimiento y para contrastar con WRR de rápido crecimiento.

Cultivo de células. Se obtuvo una línea celular de fibroblastos de embrión de pollo (DF-1) del Cell Bank of Committee on Type Culture
Collection de la Academia de Ciencias de China. Se cultivó en DMEM (Invitrogen) con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco) y 0.2% de
penicilina / estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C con 5% de CO 2)

Aislamiento de ADN y ARN. Las muestras de ADN se aislaron de sangre de pollo que contenía EDTA siguiendo el método estándar de fenol /
cloroformo. El ARN total se aisló del hígado y los músculos usando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad y
cantidad de ARN se probaron utilizando el sistema Bioanalizador Agilent 2100 de acuerdo con el kit Nano Agilent RNA 6000 (Agilent) y las
instrucciones de los fabricantes de Nanodrop2000.

Análisis de microarrays. Seis tejidos hepáticos de QY y WRR (n = 3 de cada línea) se analizaron en la matriz de miARN GeneChip (Affymetrix).
Para cada muestra, 1 μ g de ARN total se marcó usando el kit de etiquetado de ARN de biotina FlashTag (Genisphere). La tinción de la matriz, el lavado y
el escaneo se realizaron de acuerdo con los protocolos estándar de Affymetrix utilizando el GeneChip Scanner 3000. Los datos sin procesar se
analizaron con la Suite Partek Genomics
6.4 (www.partek.com) y normalizado utilizando el método Robust Multichip Analyzes (RMA). Después de la normalización de los datos, la significación se
determinó mediante análisis ANOVA y reducción de falsos positivos ( p < 0,01). La expresión de ARNm se basó en nuestros datos de microarrays anteriores 31) El
conjunto de datos de microarrays se depositó en Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE80580.

PCR en tiempo real. Para determinar la relación entre la mutación y el nivel de expresión de miARN, se realizó una PCR en tiempo real para
detectar miR-15a y miR-16 maduros. El kit de transcripción inversa miScript (Qiagen) y el kit de PCR miBR SYBR Green (Qiagen) se utilizaron para la
síntesis de ADNc y la detección de la cantidad de PCR, respectivamente. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos del
fabricante. U6 se usó para normalizar la expresión relativa. La información preliminar se proporciona en la Tabla complementaria S5. La expresión
relativa de miRNA se calculó utilizando 2 - ∆ Connecticut o comparativo 2 - ∆∆ Connecticut métodos 32, el último de los cuales se utilizó para estimar el cambio de
expresión entre dos muestras diferentes.

Variación genética y genotipado. Se realizó una secuenciación directa de PCR para identificar variaciones de la primaria de miR-15a-16 en 20 aves de
líneas XH y WRR. Para obtener información adicional sobre el fenotipo, se utilizaron 12 poblaciones diferentes para evaluar la frecuencia de alelos de la
mutación de inserción corta mediante amplificación por PCR y detección de gel. Los cebadores relacionados se proporcionaron en la Tabla suplementaria S5.
Utilizamos los conjuntos de datos de secuenciación de alto rendimiento disponibles en la base de datos NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para explorar la
información del genotipo de miR-15a-16 en pollos de todo el mundo. Blast-2.3.0 (ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST) se utilizó para alinear las
lecturas limpiadas con secuencias complementarias de alelos de inserción y eliminación (100 pb, incluida la región indel).

Transcripción de MiR-16 y empalme alternativo. Para determinar la secuencia primaria de miR-15a-16, integramos datos de secuenciación de alto
rendimiento (GSM694305, SRP038897 y GSE28080) de la base de datos NCBI SRA (www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) y 5 ′ RACE secuencias de clonación.
Blast-2.3.0 (ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/exe-cutables / LATEST) se usó para alinear las lecturas limpiadas con la secuencia complementaria de Chr 1:
168.69–168.70 Mb. 5 5 ′ RACE y 3 ′ RACE PCR se realizó utilizando el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Takara) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Los productos de PCR fueron clonados en pMD-18T (Takara) y secuenciados por Invitrogen Co. Ltd (Guangzhou, China). Los segmentos de
inserción o eliminación con secuencia flanqueante de 20 pb se clonaron en el vector indicador pCMV-Firefly-3 ′ UTR para probar empalmes alternativos en los
segmentos de inserción. Los vectores recombinados se transfectaron con vectores pRL-TK en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1, por separado.
Después de 36 h después de la transfección, las células se cosecharon para detectar la actividad de luciferasa utilizando el sistema de ensayo de indicador de
luciferasa dual (E1910) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). La actividad de la luciferasa de renilla sirvió como control de normalización.
Si se produjo el evento de empalme, la estabilidad del ARNm del gen de la luciérnaga se destruyó, lo que resultó en una actividad reducida de la luciferasa.
Para investigar los impactos de la mutación de inserción en miR-16 maduro, se construyeron fragmentos de aproximadamente 1300 pb de longitud, incluido el
precursor de miR-15a-16 y la región de mutación en pcDNA3.1 (+). Finalmente, dos vectores, incluido el vector de inserción pcDNA3.1 y pcDNA3. El vector de
1 deleción se transfectó en células de fibroblastos de embrión de pollo DF-1 para analizar los niveles de expresión de miARN maduro. La estructura
secundaria de ARN estaba formada por sistemas blandos Mfold (http://unafold.rna.albany.edu/). La información preliminar se proporciona en la Tabla
complementaria S5.

Ensayo MTT. Se usaron miARN miméticos (Qiagen) para sobreexpresar miR-16, con un imitador de ARN aleatorio negativo como control. El kit de ensayo de
proliferación MTT (Invitrogen) se usó para probar los efectos de proliferación celular de miR-16, que se realizó mediante 6 repeticiones para cada grupo. En
resumen, 5 × 10 4 4 las células por pocillo se sembraron en placas de 48 pocillos y se incubaron durante 24 h, y luego se transfectaron mímicos 20 nM en las líneas
celulares con mediciones realizadas

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cada 24 h de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de ensayo de proliferación MTT (Invitrogen). Las curvas de proliferación fueron valores
calculados de densidad óptica a 570 nm.

Diferenciación poblacional. El índice de fijación de diferentes poblaciones ( Fst) se estimó que caracteriza la diferenciación de la población
entre razas indígenas, salvajes y comerciales mediante el uso de los programas GENEPOP 4.5 33)

Análisis de asociación de la mutación indel de 54 pb con rasgos fenotípicos. El SAS V8 (SAS Institute, 1996) realizó análisis de
asociación de rasgos de marcador y los efectos genéticos se analizaron utilizando el siguiente modelo GLM:

Y = + µ+ + + +
S yo BGF
j k X
miijkx (1)

donde Y es una observación de rasgo, μ es la media general de la población, S es el efecto fijo del sexo (masculino o femenino), B es el efecto fijo de la eclosión, G
es el efecto fijo del genotipo, F es el efecto aleatorio de la madre y e es el error aleatorio residual. Se realizaron comparaciones múltiples para calcular la media
mínima cuadrada (LSM) mediante la prueba de rango múltiple de Duncan. Los detalles se informan en nuestro estudio anterior. 34)

Análisis estadístico. La importancia de las diferencias entre los grupos contrastados se calculó mediante una prueba T de Student no emparejada. p < 0.05
y p < 0.01 fueron considerados significativos y altamente significativos, respectivamente.

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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31472090), el Programa de Nuevos Talentos Excelentes del Siglo
en la Universidad (NCET-13-0803), el Sistema Nacional de Tecnología de la Industria de Broilers (nycytx-42-G1-04) y Fundación para Talentos de Alto
Nivel en Educación Superior de Guangdong, China. Los financiadores no desempeñaron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el
análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Contribuciones de autor
XJ llevó a cabo la mayoría de los estudios de genética molecular, análisis estadístico y redactó el manuscrito; HL realizó parte del trabajo de
laboratorio; SJL revisó el manuscrito; XZ participó en el diseño de este experimento;
QN participó en el diseño y coordinación del estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Información Adicional
Información suplementaria acompaña este documento en http://www.nature.com/srep

Intereses financieros en competencia: Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Cómo citar este artículo: Jia, X. et al. Una mutación de inserción corta altera la génesis de miR-16 y provoca un aumento del peso corporal en el pollo
domesticado. Sci. Reps. 6, 36433; doi: 10.1038 / srep36433 (2016).

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Científico Informes El | 6: 36433 | DOI: 10.1038 / srep36433 11

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