Una biorefinería de residuos de cáscaras de cítricos para la producción de etanol y

metano
Maria Patsalou, Charis G. Samanides, Eleni Protopapa, Stella Stavrinou, Ioannis Vyrides, Michalis
Koutinas – Chipre – 2019
Resumen
Este artículo aborda el desarrollo de una biorrefinería de residuos de cáscaras de cítricos (CPW) que
emplea tecnologías de bajo impacto ambiental para la producción de etanol y metano. Se compararon
tres levaduras principales para la producción de etanol en fermentaciones discontinuas usando CPW
pretratado mediante hidrólisis ácida y una combinación de hidrólisis ácida y enzimática. Las
condiciones más eficientes para la producción de hidrolizados a base de CPW incluyeron el
procesamiento a 116 ° C durante 10 min. Pichia kudriavzevii KVMP10 logró la mayor producción de
etanol que alcanzó 30.7 g / L en fermentaciones realizadas a temperaturas elevadas (42 ° C). Se
introdujo una biorrefinería sin desperdicio utilizando residuos sólidos de biorrefinería en
fermentaciones de digestión anaeróbica por lotes repetidas que lograron la formación de metano de
342 ml / gVS (sólidos volátiles). La producción de metano aplicando CPW no tratada y seca alcanzó
un nivel similar (339–356 ml / gVS) al uso de la corriente lateral, lo que demuestra que el bioproceso
desarrollado constituye una alternativa avanzada a los métodos intensivos en energía para la
producción de biocombustibles.
1. Introducción
Los residuos de frutas y verduras representan el 20–50% de los residuos domésticos en varios países,
mientras que los residuos de cáscaras de cítricos (CPW) comprenden un residuo principal en la
categoría específica [1]. La producción mundial de cítricos (naranja, limón, lima, kinnow, naranja
dulce, etc.) constituye más de 121 × 106 t anuales, mientras que el sector industrial de fabricación de
jugo genera alrededor de 25 × 106 t de CPW [2]. El CPW formado durante el procesamiento de la
fruta consiste principalmente en cáscaras y pulpa prensada (semillas y membranas de segmentos), que
representan el 50% del peso de la fruta [3,4].
Las opciones de gestión actuales para CPW incluyen enterrar en vertederos y la aplicación como
alimento para animales después del secado. Sin embargo, el proceso de deshidratación térmica de
CPW para producir alimentos para animales consume mucha energía y no siempre es rentable [5],
mientras que el producto final consiste en un alimento para animales bastante pobre, debido al bajo
contenido de proteínas y la alta cantidad de azúcares [6]. Además, el desecho incluye materia orgánica
elevada (aproximadamente el 95% del total de sólidos) y contenido de agua (aproximadamente 80-
90%), así como un pH bajo (3–4), lo que hace que la CPW sea inapropiada para el vertedero según el
último Marco de Residuos de la UE Directiva 2008/98 / CE [7].
Aunque la eliminación de CPW se opone a las regulaciones de la UE, los desechos podrían servir
como materia prima valiosa para la fabricación de biocombustibles y otros productos básicos.
Específicamente, CPW comprende altos niveles de pectina, celulosa, hemicelulosa y azúcares
solubles, mientras que 0.5% g / g de aceites esenciales se incluyen en forma húmeda [8,9]. El D-
limoneno, que constituye el componente principal de los aceites esenciales en CPW, es un compuesto
terpénico con propiedades antimicrobianas y aplicabilidad en la industria alimentaria, cosmética y
farmacéutica [10]. Por lo tanto, las industrias de procesamiento de cítricos generalmente recuperan
aceites esenciales de los flujos de residuos producidos como un componente extraíble de valor
agregado [11].
El cambio climático global asociado con la liberación extensiva de gases de efecto invernadero ha
generado preocupaciones sobre la aplicación de hidrocarburos fosilizados como la principal fuente de
energía [12]. Por lo tanto, en los últimos años, la explotación de nuevos recursos renovables para la
producción de biocombustibles como un reemplazo para el uso de la fuente no renovable de petróleo
ha recibido mucho interés en la investigación mundial [13]. La capacidad de los microorganismos para
utilizar recursos renovables para la síntesis de biocombustibles es aprovechada por la industria actual
que fabrica biocombustibles (por ejemplo, bioetanol, biometano, biobutanol), principalmente a partir
de la caña de azúcar, el maíz y el trigo [14]. Sin embargo, varios estudios han investigado la aplicación
de CPW como una materia prima prometedora para la producción de biocombustibles a través del
bioprocesamiento, utilizando diferentes enfoques de pretratamiento y microorganismos.
Debido a las propiedades antimicrobianas del d-limoneno, la valorización de CPW para la producción
de etanol y metano requiere la eliminación de aceites esenciales para evitar la inhibición del
biosistema [10,15]. Se han empleado varios métodos de pretratamiento para la extracción de aceites
esenciales, incluida la explosión de vapor [10,16,17], la esterilización hidrotérmica [15,18], el estallido
[19] y el secado [20,21]. Sin embargo, los aceites esenciales y la pectina constituyen productos de alto
valor agregado, que no se extrajeron en varios estudios existentes. Otros enfoques de valorización
basados en CPW produjeron productos extraíbles y de fermentación utilizando enfoques intensivos en
energía, que incluyen temperaturas elevadas de hidrólisis ácida, bajas temperaturas de fermentación de
etanol que contribuyen a costos adicionales de enfriamiento y separación, y digestión anaeróbica en
condiciones termofílicas.
El estudio actual exploró tecnologías alternativas y de bajo impacto ambiental para la valorización de
CPW mediante el desarrollo de una estrategia de biorrefinería. La hidrólisis ácida diluida a baja
temperatura como un procedimiento único y combinado con la hidrólisis enzimática se evaluó como
un método de pretratamiento de CPW, después de la extracción de aceites esenciales (por destilación)
y pectina. El hidrolizado formado se probó para la producción de etanol empleando la cepa
termotolerante Pichia kudriavzevii KVMP10, que se comparó con dos levaduras industriales a
temperaturas de fermentación elevadas, con el objetivo de reducir los costos de producción de
biocombustibles. Se apuntó un proceso de cero desperdicio, empleando residuos sólidos de
biorrefinería (BR) para la producción de metano, que se comparó con el uso de CPW y residuos secos
de cáscaras de cítricos (DCPW), lo que constituye el primer estudio con nuestro conocimiento que
compara los residuos específicos de cítricos basados fracciones en la digestión anaerobia.
2. Resultados y discusión
2.1. La estrategia de biorefinería de CPW
La biorrefinería actual apuntaba a la valorización de CPW mediante la eliminación de aceites
esenciales y pectina, así como la fermentación del hidrolizado formado como materia prima de
fermentación para la producción de bioetanol. Se estableció un concepto de cero residuos mediante el
refinamiento de las fracciones sólidas restantes a través de la digestión anaeróbica para la producción
de metano. Específicamente, el primer paso incluyó la extracción de aceites esenciales mediante
destilación, mientras que los residuos sólidos restantes del proceso se secaron y se aplicaron a la
hidrólisis ácida diluida en condiciones variables. Así, la pectina se extrajo del hidrolizado generado
mediante precipitación con la adición de etanol, mientras que el hidrolizado se aplicó posteriormente a
la destilación para la eliminación del etanol. Después del aislamiento de pectina, el hidrolizado se
fermentó a bioetanol, probando la efectividad de tres cepas de levadura (P. kudriavzevii KVMP10,
Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae), mientras que los residuos sólidos restantes de
la hidrólisis ácida diluida se digirieron anaeróbicamente para la generación de metano (Figura 1 )
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de la biorrefinería de residuos cero utilizada para la valorización de residuos
de cáscaras de cítricos (CPW).

2.2. Producción de etanol

La producción industrial de etanol se realiza actualmente mediante hidratación catalítica de etileno
(método químico) [22] y fermentando materias primas agrícolas (método bioquímico) [14]. El etanol
puede servir como fuente de energía verde, que se produce principalmente con almidón, azúcar y
carbohidratos, como el maíz, la papa, la melaza, la caña de azúcar y la biomasa lignocelulósica [23].
Los azúcares se pueden convertir directamente en etanol, mientras que los materiales almidonados y
celulósicos se deben pretratar primero utilizando principalmente enzimas o productos químicos para
hidrolizar los polímeros en azúcares [24]. Aquí, CPW se ha aplicado como material celulósico, que
incluye un contenido significativo adicional de azúcares solubles que podrían aplicarse para la
producción de un hidrolizado rico en fuentes de carbono para fermentaciones de etanol. La cepa
termotolerante P. kudriavzevii KVMP10 se probó y comparó con dos levaduras industriales (K.
marxianus y S. cerevisiae) para la producción de etanol a partir de hidrolizados de CPW en
condiciones de fermentación tecnológicamente favorables. Por lo tanto, se aplicó una temperatura
elevada de bioprocesos (42 ° C) en un intento de reducir los costos operativos asociados con un menor
uso de energía para enfriamiento y un menor riesgo de contaminación [25,26].
2.2.1. Producción de etanol utilizando hidrolizados de CPW obtenidos por hidrólisis ácida
La hidrólisis ácida diluida de CPW cumplió el doble objetivo de descomponer los polímeros (celulosa,
hemicelulosa) en azúcares solubles, mientras que consistía en un paso de procesamiento esencial para
el aislamiento de pectina [27]. Por lo tanto, se produjeron seis hidrolizados de CPW utilizando tres
temperaturas de hidrólisis (108 ° C, 116 ° C, 125 ° C) durante 10 minutos y 20 minutos,
respectivamente. Las condiciones óptimas para la sacarificación de CPW a través de la hidrólisis ácida
diluida se identificaron como 116 ° C durante 10 minutos, en función de la concentración de etanol
producido y el rendimiento del producto final durante las fermentaciones (Figura 2, Tabla 1). Por lo
tanto, la concentración de etanol y el rendimiento del producto alcanzaron 5.8 g / L y 0.48 gethanol
(eth) g − 1 de azúcar total consumida (TSC), respectivamente, usando P. kudriavzevii KVMP10,
mientras que K. marxianus y S. cerevisiae produjeron 4.6 g / L y 4.2 g / L de etanol, respectivamente.
Aunque, la mayor concentración de etanol (6,7 g / L) se obtuvo utilizando el hidrolizado generado a
125 ° C durante 20 min con la aplicación de P. kudriavzevii KVMP10, el rendimiento del producto
disminuyó significativamente a 0,32 geth g − 1TSC. Se realizó una prueba t (p <0.05) para evaluar
estadísticamente las diferencias entre los valores medios de la concentración de etanol. Se observó una
diferencia estadística significativa entre los títulos de etanol obtenidos en las fermentaciones de P.
kudriavzevii KVMP10 y S. cerevisiae, utilizando ambos hidrolizados que exhiben la mayor formación
de producto (116 ° C durante 10 min y 125 ° C durante 20 min). Sin embargo, el título del
biocombustible obtenido en las fermentaciones de P. kudriavzevii KVMP10 alimentadas con los
hidrolizados mencionados anteriormente no fue estadísticamente diferente. En general, en casi todos
los experimentos realizados con K. marxianus y S. cerevisiae, el aumento en la duración de la
hidrólisis redujo el título y el rendimiento del producto final, lo que indica la posible formación de
inhibidores a una duración de preprocesamiento elevada. Esto está en línea con estudios previos que
demuestran el efecto inhibitorio que puede ocurrir en las fermentaciones de etanol de K. marxianus
[28] y S. cerevisiae [29] alimentadas con materias primas pretratadas empleando temperaturas y
duración de hidrólisis ácida aumentadas. Específicamente, los hidrolizados derivados del
pretratamiento con ácido dieron como resultado un bajo rendimiento del producto en fermentaciones
de K. marxianus [28], mientras que la presencia de productos de hidrólisis ácida (derivados de furano,
ácidos débiles, fenólicos) inhibió el crecimiento de S. cerevisiae y causó una reducción en el etanol.
rendimiento y productividad [29]. Por lo tanto, considerando que el rendimiento general de K.
marxianus y S. cerevisiae disminuyó, el menor rendimiento del producto de P. kudrivzevii KVMP10 y
la elevada demanda de energía esperada con la aplicación de 125 ◦C durante 20 minutos en hidrólisis,
el uso de 116 ◦ Se seleccionó C durante 10 minutos como condiciones adecuadas para la hidrólisis de
CPW. Estos resultados están de acuerdo con otros estudios que demuestran que las condiciones
óptimas para la hidrólisis ácida diluida de CPW comprenden la aplicación de 116 ° C durante 10-13
minutos con el uso de 0.5% (v / v) H2SO4 y 5-6% (w / v) sólidos secos de la materia prima (rm)
[30,31]

Figura 2. Título de etanol alcanzado en Pichia kudriavzevii KVMP10, Saccharomyces cerevisiae y fermentaciones de
Kluyveromyces marxianus de hidrolizados obtenidos mediante tratamiento con ácido diluido de CPW.

Una variedad de enfoques de pretratamiento de CPW han sido evaluados previamente para la
producción de etanol por diferentes levaduras. La producción del biocombustible se investigó en
fermentaciones de S. cerevisiae, utilizando un hidrolizado derivado de CPW obtenido mediante la
aplicación de explosión de vapor, así como hidrólisis de ácido diluido y recuperación de pectina,
logrando un rendimiento de 0.43 geth g-1 TSC [16,32 ] S. cerevisiae también se aplicó para la
producción de bioetanol utilizando hidrolizados de CPW obtenidos mediante esterilización
hidrotérmica, explosión de vapor y una combinación de estallido e hidrólisis enzimática, lo que
demuestra la producción de etanol de 42 g / L [15], 60 L / material de arrastre [33] y 46,2 g / L,
respectivamente [19]. El residuo de la cáscara de naranja se pretrató mediante hidrólisis ácida y
enzimática en dos etapas, mientras que el hidrolizado formado se utilizó como materia prima de
fermentación para la producción de bioetanol por S. cerevisiae y Mucor indicus, logrando
concentraciones de producto final de 30,3 g / L y 15 g / L con un rendimiento de 0,46 geth g − 1 TSC
y 0,39 geth g − 1TSC, respectivamente [21,34].
Tabla 1. Consumo de azúcares reductores y título final de etanol en fermentaciones de hidrolizados
ácidos.

2.2.2. Optimización del proceso de fermentación.

El título final de etanol logrado usando los hidrolizados obtenidos fue bajo en comparación con la
literatura relevante. Por lo tanto, se evaluaron varios parámetros para mejorar la producción de etanol
a través de la biorrefinería propuesta. El efecto de la suplementación con fuente de nitrógeno se probó
inicialmente para aumentar la producción de biocombustibles. Sin embargo, aunque los compuestos
nitrogenados pueden mejorar sustancialmente la velocidad de fermentación del etanol [35,36], el uso
de extracto de levadura como fuente de nitrógeno no demostró ningún efecto notable sobre la
formación de etanol en todas las fermentaciones de levadura realizadas.
La hidrólisis ácida y enzimática se combinó como pretratamientos secuenciales para mejorar la
producción de etanol, debido al aumento potencial de la liberación de azúcares fermentables. La
adición de la etapa de pretratamiento enzimático en la biorrefinería mejoró sustancialmente el título de
bioetanol a 9,2 g/L en fermentaciones de P. kudriavzevii KVMP10, dando como resultado un
rendimiento del producto de 0,42 geth g − 1TSC. Los procesos de pretratamiento que implican dos
pasos pueden ser más eficientes en la sacarificación de biomasa lignocelulósica, liberando mayores
concentraciones de azúcares simples que mejoran la generación de etanol [19,21]. Así, la hidrólisis
ácida y enzimática aplicada secuencialmente de CPW fue capaz de producir rendimientos de azúcar
sustancialmente elevados que alcanzaron 0,58 gtotal de azúcar g − 1 materia prima seca [30].
Se aplicó el reciclaje del residuo líquido restante después de la extracción de aceite esencial en el
proceso de hidrólisis en un intento por aumentar aún más la concentración de monosacáridos en la
formación de hidrolizado y etanol, así como para reutilizar el agua de proceso generada para la
aplicación en la planta. El reciclaje del agua residual contribuyó a un aumento de tres veces en la
concentración de etanol que alcanzó 30.7 g / L en fermentaciones de P. kudriavzevii KVMP10
realizadas a 42 ° C, mientras que la producción de biocombustibles también se mejoró en cultivos de
K. marxianus que alcanzaron 26.3 g / L. Sin embargo, la producción de etanol a partir de S. cerevisiae
se mantuvo en niveles bajos con la reutilización del almacenamiento, posiblemente debido a la elevada
temperatura de proceso empleada. Los hallazgos actuales demuestran que P. kudriavzevii KVMP10
constituye un productor de etanol más eficiente con la aplicación de hidrolizados de CPW en
comparación con las levaduras industriales analizadas (K. marxianus y S. cerevisiae). Además, el
aumento de la producción de etanol se logró a una temperatura de fermentación elevada, lo que
concuerda con otros estudios que destacan que las cepas de P. kudriavzevii son productores robustos
de etanol que exhiben tolerancia múltiple a altas temperaturas y ambientes ácidos [37]. Las principales
novedades de los resultados obtenidos son que se logró una alta producción de etanol a partir de CPW
en condiciones de pretratamiento suave y condiciones de fermentación severas, mientras que el ahorro
de recursos valiosos se logró mediante el reciclaje del agua de proceso. Por lo tanto, de acuerdo con la
reutilización de agua lograda, el residuo sólido restante de la hidrólisis de CPW se aplicó en la
digestión anaeróbica para producir biogás dirigido a la operación de una biorrefinería de cero residuos
como se describe a continuación.
2.3. Digestión anaeróbica de residuos de biorrefinería
La biometanización de CPW se ha estudiado principalmente después de la extracción de aceites
esenciales, que tiene el doble propósito de generar un producto de valor agregado y reducir la
inhibición de la digestión anaeróbica causada por las propiedades antimicrobianas del aceite [5]. Sin
embargo, aunque los aceites esenciales se extrajeron de CPW en varios estudios antes de su uso en la
producción de metano [10,32], la CPW no tratada también se ha utilizado en la digestión anaerobia de
fragmentos de cítricos frescos o secos (cáscara, pulpa y semillas) bajo termofilia [ 17,38] y
condiciones mesofílicas [20,39]. Aquí, la producción de metano se probó usando sólidos de
biorrefinería BR, que quedaban como una corriente secundaria de la hidrólisis ácida de CPW, y su
capacidad para producir el biocombustible se comparó con la aplicación de CPW no tratada y DCPW
en condiciones mesofílicas.
2.3.1. Producción de metano utilizando BR, CPW y DCPW
Se evaluó la producción de biogás y metano a partir de BR, así como CPW y DCPW con la adición de
6 g / L como contenido inicial de sólidos volátiles (VS) en la digestión anaerobia (Figura 3). Durante
el primer lote, DCPW exhibió una producción sustancialmente mayor de metano a los 35 días, en
comparación con el resto de los materiales, generando 303 ml. El uso de BR demostró una inhibición
prolongada del biogás durante los primeros 15 días del proceso, acumulando altos niveles de acetato
que alcanzaron los 9,7 g / L (Figura 4), mientras que la CPW también causó la inhibición de la
formación de metano. Sin embargo, la concentración de acetato se redujo posteriormente en el
experimento alimentado con BR, lo que resultó en una producción de metano que alcanzó los 264 ml a
los 35 días, de manera similar a la producción de biocombustibles a partir de CPW. Después de 36
días, se realizó un lote posterior mediante realimentación del mismo contenido de cada material en
fermentaciones. El efecto inhibitorio se redujo sustancialmente en el segundo lote, con respecto a la
cinética de la producción de metano, lo que indica una posible adaptación del lodo a cada material.
Específicamente, la tasa de producción de metano fue de 11.3 mL / d, 15.9 mL / d, y 7.5 mL / d
durante el primer experimento del lote, mientras que en el segundo lote, la tasa aumentó a 14.9 mL/d,
25.6 mL / d, y 13,6 ml / día para CPW, DCPW y BR, respectivamente. Después de la segunda
realimentación de cada material, la tasa de producción de metano se incrementó aún más solo en la
digestión de DCPW, alcanzando 27.2 mL / d. Además, la formación acumulativa de metano aumentó
significativamente con el uso de BR, alcanzando 314 ml. Después de 78 días, se aplicó una segunda
realimentación de cada material para evaluar si la producción de metano aumentó aún más. La
producción de metano aumentó ligeramente en el tercer lote, alcanzando 305-320 ml, para todos los
materiales probados. Los datos obtenidos demuestran la capacidad de BR para generar cantidades
significativas de metano a un nivel similar al uso de CPW seco o no tratado. Además, aunque la
producción de metano es consistente con otros estudios que alcanzaron una formación similar de
biocombustible a partir de CPW [10,20,39], la producción del biocombustible logrado aquí en
condiciones mesofílicas fue comparable a la de los estudios que emplean temperaturas de digestión
anaeróbica termofílica [10,32 ] Por lo tanto, el enfoque seguido no solo permite el desarrollo de una
biorrefinería sin desperdicio, sino que también proporciona ganancias de energía significativas, debido
a la temperatura sustancialmente reducida utilizada en la digestión anaerobia.
Figura 3. Producción acumulada de metano utilizando 6 gVS / L de CPW no tratado (), residuos secos de cáscara de
cítricos (DCPW) () y residuos sólidos de biorefinería (BR) (). Se realizó una fermentación de control sin la adición de
CPW (), mientras que todos los experimentos se realizaron a 37 ° C. Las líneas discontinuas representan el momento
en que se aplicó la realimentación del sustrato.

Figura 4. Concentración de ácidos grasos volátiles, (A) formiato, (B) propionato, (C) acetato, (D) butirato y (E)
valerato, formados durante la digestión anaeróbica de CPW no tratado (), DCPW (), sólido BR (), y en el experimento
de control ().
Aunque el uso de DCPW en la digestión anaeróbica resultó en la producción más alta de metano en el
primer lote en comparación con la aplicación de CPW y BR, el cálculo del rendimiento del bioproceso
mostró que el empleo de CPW en el sistema mejoró la conversión global de residuos en energía
( Figura 5). El rendimiento de metano, definido como ml de metano producido por g de materia prima
(rm) utilizada, fue sustancialmente mayor, con la aplicación de CPW sin tratar que oscila entre 72 y 84
ml de metano g − 1rm, respectivamente. Sin embargo, el empleo de DCPW y BR dio como resultado
un rendimiento de proceso similar y más bajo que alcanzó 42-51 ml de metano g − 1rm para ambos
materiales. Se esperaba un rendimiento de metano mejorado realizado con el uso de CPW, dado el
mayor contenido orgánico que queda en el material específico para el tratamiento en la digestión
anaeróbica en comparación con DCPW y BR, donde se han eliminado los compuestos volátiles y / o
los carbohidratos hidrolizados. Esta conclusión se aclaró mediante la prueba t (p <0.05) realizada para
identificar diferencias estadísticamente significativas en los valores medios obtenidos para la
producción final de metano (ml) por g de rm con cada materia prima en los dos primeros lotes.
Además, se observó un aumento estadísticamente significativo (p <0.05) en el volumen de biogás
producido por g de rm entre 35 días y 112 días con el uso de BR, lo que demuestra la adaptación
potencial del cultivo al material específico después del primer lote. La comparación directa de las tres
fracciones diferentes de residuos cítricos demostró que incluso BR podría producir altos contenidos de
metano, destacando la aplicabilidad de las corrientes secundarias de biorrefinería para la valorización a
través de la digestión anaerobia.