Estudios de localización y caracterización enzimática de dinucleosido-

trifosfatasa y adp-ribosa pirofosfatasa en fracciones subcelulares

particuladas
 Autores: Diego Bernet Prieto
 Directores de la Tesis: José Carlos Cameselle Viña (dir. tes.)
 Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 1994
 Idioma: español
 Materias:
o Química
 Bioquímica
 Enzimología
o Ciencias de la vida
 Biología celular
 Citología
 Resumen

o LA DINUCLEOSIDO-TRIFOSFATASA (NP3NASA; EC 3.6.1.29) ES UNA ENZIMA QUE

HIDROLIZA ESPECIFICAMENTE DINUCLEOSIDO-TRIFOSFATOS, COMO DIADENOSINA-TRIFOSFATO
(AP3A) PRODUCIENDO ADP Y AMP COMO PRODUCTOS. SE CONOCIA LA EXISTENCIA DE FORMAS
CITOPLASMATICA Y MITOCONDRIAL DE NP3NASA. EN ESTA TESIS SE HA ESTUDIADO LA
LOCALIZACION SUBMITOCONDRIAL DE ESTA, POR MEDIDAS DE LATENCIA, PRECIPITABILIDAD Y
EXTRACCION CON DIGITONINA, EN MITOCONDRIAS PURIFICADAS DE HIGADO DE RATA. POR
COMPARACION CON MARCADORES ENZIMATICOS DE FRACCIONES SUBMITOCONDRIALES SE HA
DEMOSTRADO QUE LA NP3NASA MITOCONDRIAL ESTA LOCALIZADA EN LA MATRIZ DE DICHO
ORGANULO. LA ADP-RIBOSA PIROFOSFATASA (ADPRIBASA; EC 3.6.1.13) HIDROLIZA ADP-RIBOSA
LIBRE, NO LIGADA A PROTEINAS, PRODUCIENDO AMP Y RIBOSA-5-FOSFATO. SE CONOCIA LA
EXISTENCIA DE TRES ADPRIBASAS CON DIFERENTES ESPECIFICIDADES DE SUSTRATO Y CATION
DIVALENTE ACTIVADOR EN LA FRACCION SOLUBLE DE HIGADO DE RATA: ADPRIBASA-I,
ADPRIBASA-MN Y ADPRIBASA-II. EN ESTA TESIS SE HA DEMOSTRADO QUE EXISTE UNA ADPRIBASA,
PARECIDA A LA ADPRIBASA-I, QUE SE MANTIENE ASOCIADA A MITOCONDRIAS SOMETIDAS A
CENTRIFUGACION EN GRADIENTES DE SACAROSA Y ESTA LOCALIZADA EN LA MATRIZ
MITOCONDRIAL. ESTA ADPRIBASA MITOCONDRIAL SE HA PURIFICADO Y CARACTERIZADO
PARCIALMENTE. SE HAN DESCRITO PROPIEDADES DE ESTA ENZIMA QUE NO ERAN CONOCIDAS
PARA LA ADPRIBASA-I. POR ELLO SE HAN REALIZADO ESTUDIOS COMPARATIVOS CON ESTA, QUE
HAN LLEVADO A LA CONCLUSION DE QUE SE TRATA DE ENZIMAS PARECIDAS, CON DISTINTA
LOCALIZACION SUBCELULAR Y, QUIZAS, CON ALGUNA LIGERA DIFERENCIA DE PROPIEDADES
CINETICAS Y/O MOLECULARES.

o Referencias

Prieto, D. B. (1994). Estudios de localización y caracterización enzimática de dinucleosido-

trifosfatasa y adp-ribosa pirofosfatasa en fracciones subcelulares particuladas (Doctoral
dissertation, Universidad de Extremadura).}
 Ontogenia de la actividad enzimática cerebral degradadora de TRH y
encefalinasanálisis subcelular
 Autores: Francisco Javier Gil Goicouria
 Directores de la Tesis: Luis Casis Saenz (dir. tes.)
 Lectura: En la Universidad del País Vasco - Euskal Herriko Unibertsitatea ( España ) en 1997
 Idioma: español
 Materias:
o Ciencias de la vida
 Fisiología humana
 Neurofisiología
o Psicología
 Psicología experimental
 Actividad cerebral
 Resumen

o EL PRESENTE TRABAJO DE INVESTIGACION MUESTRA DIFERENTES ACTIVIDADES

AMINOPEPTIDASICAS DEGRADADORAS DE ENCEFALINAS Y DE LA TRH DURANTE EL PRIMER MES
DE DESARROLLO POSTNATAL, EN DIFERENTES FRACCIONES SUBCELULARES DE LA CORTEZA Y
SUBCORTEZA CEREBRAL, Y DEL CEREBELO.LA ACTIVIDAD SENSIBLE A PUROMICINA DE LA
FRACCION SINAPTOSOMAL PRESENTA CAMBIOS SIGNIFICATIVOS DURANTE LA PRIMERA SEMANA
COINCIDIENDO CON EL DESARROLLO AXONAL Y DENDRITICO. EN ESTA MISMA FRACCION
SINAPTOSOMAL, LA ACTIVIDAD DE LA PGA I PRESENTA CAMBIOS CON EL DESARROLLO PARALELOS
AL RESTO DEL SISTEMA DE LA TRH. AL CONTRARIO EN LAS FRACCIONES NUCLEARES, CITOSOLICAS
Y EN LOS HOMOGENADOS SIGUEN UNOS PATRONES DE DESARROLLO ANTIPARALELOS AL RESTO
DEL SISTEMA DE LA TRH. ESTOS RESULTADOS PODRIAN SUGERIR LA IMPLICACION DE ESTOS
ENZIMAS EN EL DESARROLLO DEL SNC, Y QUE PUEDEN TENER DIFERENTES FUNCIONES
DEPENDIENDO DE LA REGION Y DE LA FRACCION SUBCELULAR EN QUE SE ENCUENTREN.

o Referencias

Goicouria, F. J. G. (1997). Ontogenia de la actividad enzimática cerebral degradadora de TRH y

encefalinas: análisis subcelular (Doctoral dissertation, Universidad del País Vasco-Euskal Herriko
Unibertsitatea).
LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE Cu EN PLANTAS DE ALTRAMUZ Y SOJA B Sánchez-
Pardo*, P Zornoza Departamento de Química Agrícola, Facultad de Ciencias, Universidad
Autónoma de Madrid, Madrid, España *Contacto: beatriz.sanchezpardo@uam.es

RESUMEN En este trabajo se ha estudiado la compartimentación de Cu a nivel celular y subcelular,

con la finalidad de estimar los posibles mecanismos de bioacumulación implicados en estrategias
de detoxificación frente al exceso de Cu en plantas de altramuz y soja. En general, el Cu se
acumula mayoritariamente en la fracción soluble de las hojas y en el apoplasto de la raíz. No
obstante, ante una situación de exceso, las paredes celulares de las raíces de soja tienen mayor
capacidad que las de altramuz para secuestrar Cu, mostrando un gradiente decreciente desde el
córtex externo al cilindro central. En las hojas, la acumulación de Cu en la fracción soluble se
intensifica principalmente en las de altramuz y, especialmente, en el simplasto de las células del
parénquima lagunar. Si bien, bajo exceso de Cu, ambas leguminosas localizan principalmente el Cu
en la epidermis inferior.

INTRODUCCIÓN La contaminación por Cu es un problema importante tanto a nivel ambiental

como de salud pública. Elevados niveles de Cu pueden darse de forma natural en algunos suelos,
pero en la actualidad, las principales fuentes de contaminación son debidas a actividades agrícolas
modernas, mineras, industriales y urbanas (Yruela, 2009). El Cu es un elemento esencial para el
crecimiento y desarrollo de plantas, sin embargo, cuando está presente en altas concentraciones
(> 20 mg kg-1 MS) es altamente fitotóxico, ya que afecta a diversos procesos bioquímicos y
fisiológicos, llegando a producir una fuerte inhibición del crecimiento o incluso la muerte de la
planta (Yruela, 2009). La mayoría de las plantas que crecen en medios contaminados por metales
pesados desarrollan fundamentalmente, dos tipos de estrategias frente a ellos. Una sería
restringiendo su absorción y transporte, y la otra, incluiría procesos de acumulación, básicamente
por compartimentación en orgánulos, como las vacuolas o recurriendo a la complejación del metal
con ligandos orgánicos. Por tanto, el conocimiento de las pautas de distribución de Cu u otro metal
pesado en las células y tejidos, podría proporcionar una información esencial sobre las distintas
estrategias de bioacumulación que desarrollan los vegetales, tal como sugieren diversos autores
(Ke y col., 2007; Liu y col., 2009). En la última década, se han empleado distintos métodos para
estudiar la localización de los metales pesados en los tejidos y órganos vegetales. Entre ellos se
encuentran espectroscopía electrónica por pérdida de energía (Rau y col., 2006), técnicas de
microsonda con radiación sincrotón y fluorescencia de rayos X (Shi y col., 2004), espectrometría de
energía dispersiva de rayos X (Ni y col., 2005) y la técnica de centrifugación diferencial (Ke y col.,
2007). En este trabajo, se ha utilizado la centrifugación en gradiente para determinar la
concentración y la 338 distribución subcelular de Cu en diversos órganos de plantas de altramuz y
soja tratadas con 1,6 y 24 µM Cu. Si bien esta metodología, no excluye la posibilidad de que se
produzca una redistribución de los elementos durante la etapa de preparación de las muestras
como observan diversos autores (Ke y col., 2007; Liu y col., 2009). Por ello para estudiar los
patrones de localización subcelular de Cu y verificar los resultados cuantitativos obtenidos
mediante la metodología anterior, se ha recurrido a un método no invasivo basado en microscopía
electrónica de barrido a baja temperatura y difracción de rayos X (LTSEM-EDXMA).

MATERIALES Y MÉTODOS Las semillas de altramuz cv. Marta y soja cv. Williams se esterilizaron con
hipoclorito sódico (10%, v/v) durante 30 min y posteriormente se lavaron varias veces con agua
destilada. La germinación se llevó a cabo en oscuridad (28ºC; 3 días). Producida la nascencia, se
colocaron sobre unos recipientes de cultivo con capacidad para 3 L de disolución nutritiva y bajo
oxigenación continua. El experimento se llevó a cabo en cámara de cultivo bajo condiciones
ambientales controladas: Temperatura: 20-25ºC; fotoperiodo: 11-13h; humedad relativa: 40-60%;
intensidad luminosa: 520 µmol m-2 s -1 . El sistema de cultivo fue hidroponía sin sustrato. La
composición de la disolución nutritiva control fue la siguiente (mM): 1,5 Ca(NO3)2; 4,0 KNO3; 1,5
KH2PO4; 1,0 MgSO4. Los micronutrientes se suministraron como (µM): 36 Fe-EDDHA; 33
MnSO4..H2O; 1,6 ZnSO4.7H2O; 0,1 (NH4)6Mo7O24.4H2O; 46 H3BO3 y 1,6 CuSO4.5H2O (pH 5-
5,5). La disolución nutritiva se renovó semanalmente y cada dos días se reponía con agua el
volumen inicial. Las dosis de Cu utilizadas fueron 1,6 (control) y 24 µM (CuSO4.5H2O).El diseño
experimental correspondió a un sistema de bloques completos al azar. Se realizaron cuatro
replicados por dosis de Cu y en cada recipiente de cultivo se pusieron 3 plantas. A los 35 días de
exposición a los tratamientos de Cu, se llevó a cabo el muestreo del material vegetal. Para ello, las
plantas de altramuz y soja se dividieron en raíz y vástago y éste último a su vez en hojas y tallos y
se estimaron los pesos frescos de cada órgano. A continuación, las muestras se introdujeron en N2
líquido y se almacenaron en un congelador (MDF-U72V SANYO) a -78ºC. Posteriormente, se realizó
un fraccionamiento subcelular mediante centrifugación diferencial siguiendo las metodologías
propuestas por Hernández y col. (1998) y Wu y col. (2005). La concentración de Cu en la fracción
soluble, pared celular y orgánulos se determinó mediante espectrofotometría de absorción
atómica. Además, en muestras “in vivo” de hojas y raíces se llevó a cabo el microanálisis de
elementos mediante microscopía electrónica de barrido a baja temperatura y difracción de rayos X
(LTSEM-EDXMA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Concentración y distribución subcelular de Cu La concentración de Cu en las distintas fracciones

subcelulares de hojas y raíces de plantas de altramuz y soja sometidas a 1,6 y 24 µM de Cu, se
muestra en la Fig. 1. Los valores correspondientes a los cloroplastos en las hojas y leucoplastos en
las raíces, membranas y otros orgánulos se han considerado como una única fracción a la que se
ha denominado, orgánulos. Las hojas de las plantas de altramuz tratadas con 1,6 µM acumulan el
Cu, casi a parte iguales, entre la pared celular, soluble y orgánulos. Las hojas de soja, lo acumulan
principalmente en la fracción soluble y en pared celular y en menor proporción en los orgánulos.
En condiciones de exceso de Cu, 339 aumenta la acumulación del metal en todas fracciones de las
hojas de altramuz, pero especialmente en la soluble (15 veces). Este hecho sucede de forma
similar en las hojas de soja tratadas con 24 µM, aunque con mayor intensidad en los orgánulos y
en la fracción soluble (5 veces). La fracción soluble está constituida mayoritariamente por el Cu
localizado en el citosol y en la vacuola (Liu y col., 2009). Para asegurar un funcionamiento normal
del metabolismo celular, la concentración de los metales pesados en el citosol debe ser más baja
que en la vacuola, jugando por tanto este orgánulo un importante papel los procesos de
detoxificación y homeostasis celular (Hall, 2002). Algunos autores han detectado en las hojas de
ciertas especies, una acumulación mayor de los metales en esta fracción, y más concretamente en
las vacuolas, como es el caso del Cd en altramuz (Vázquez y col., 2007); Cr en Leersia hexandra (Liu
y col., 2009); Mn en cebada (Wu y col., 2007) y Ni (Frey y col., 2000) y Zn (Küpper y col., 1999) en
Thlaspi caerulescens. Con respecto al Cu, resultados similares se han observado en Armenia
marina (Neumann y col., 1995) y Enteromorpha flexuosa (Andrade y col., 2004), donde la mayor
parte del metal se encuentra localizado en las vacuolas, unido a fenoles, polipéptidos y
fitoquelatinas. Por el contrario, en Avicennia marina (MacFarlane y Burchett, 2000), Azolla (Sela y
col., 1988), Daucus carota (Ke y col., 2007) y Elsholtzia splendes (Peng y col., 2005) se deposita
mayoritariamente en la pared celular. Lindon y Henriques (1998) encuentran que las vacuolas no
juegan un papel muy importante en la detoxificación del Cu en plantas de arroz.

BIBLIOGRAFÍA

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