FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO DE CONTROL FISICOQUÍMICO Y

MICROBIOLÓGICO DE MEDICAMENTOS

Estudiante: Código:

Práctica 7: CONTROLMICROBIOLÓGICO DE FORMAS FARMACEUTICAS LIQUIDAS

ESTÉRILES

OBJETIVOS:

Al final de esta práctica, los estudiantes estarán en capacidad de:

1. Identificar y utilizar las normas para el control de calidad microbiológico de formas

farmacéuticas líquidas estériles.

2. Identificar y aplicar los ensayos de control de calidad a una forma farmacéutica líquida
estéril asignada, mediante el desarrollo de las técnicas analíticas utilizadas para verificar
la calidad de la misma; interpretar los resultados obtenidos y tomar decisiones sobre la
calidad del producto.

1. INTRODUCCIÒN

Toda fabricación de productos estériles parenterales gira alrededor de controlar 3 elementos

críticos y básicos:
1. Esterilidad
2. Partículas
3. Pirógenos o endotoxinas

Dado que las pruebas de esterilidad constituyen un procedimiento exacto cuya asepsia debe
garantizarse para lograr una interpretación correcta de los resultados, es importante que el
personal esté debidamente entrenado y calificado. Para lograr las condiciones asépticas, el
entorno de la prueba debe adaptarse y tomar las precauciones necesarias para evitar la
contaminación, además es conveniente controlar el área de trabajo.

El análisis de esterilidad no garantiza que todo el lote de producto sea estéril, las limitaciones del
ensayo son de dos clases:

1. Biológicas: los medios de cultivo prescritos solo recuperan un espectro amplio aunque limitado
de microorganismos. Además el uso de membranas de 0,45 µm limitan el tamaño de los gérmenes
recuperables a este tamaño de poro.

2. Probabilísticos: estadísticamente se demuestra que no es posible detectar pequeños niveles

de contaminación por mucho que se aumente el tamaño de la muestra.

Para garantizar la esterilidad en todo el lote se debe validar el proceso de esterilización o los
procedimientos asépticos

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2. CONSULTA POR PARTE DE LOS ESTUDIANTES:

2.1Realizar el procedimiento utilizado en el laboratorio con un diagrama de flujo esquematizado

que representen las acciones que realizara en la práctica.

2.2¿Para qué se utilizan los caldos Tioglicolato y Tripticasa soya?

2.3Porque es necesario evitar la presencia de endotoxinas y pirógenos en productos estériles

parenterales

2.4Realice un paralelo entre la prueba de pirógenos y de endotoxinas y de un ejemplo de un

producto que se realice cada una de las pruebas.

2.5¿A qué hace referencia la sensibilidad de la prueba de endotoxinas y que se debe hacer con el
producto a analizar una vez establecida esta sensibilidad?

2.6Cuáles son los principales elementos que se deben tener en cuenta para fabricación de
productos estériles parenterales

2.7Cuál es la principal diferencia que existe entre los dos métodos utilizados para la prueba de
Esterilidad?

2.8Cuáles son los principales elementos que se deben tener en cuenta para fabricación de
productos estériles parenterales

2.9Cuál es la principal diferencia que existe entre los dos métodos utilizados para la prueba de
Esterilidad?

2.10 Cuáles son las cepas de microorganismos de prueba adecuados para usar en la prueba de
promoción del crecimiento y en la prueba de validación

2.11 ¿Cuál es la diferencia entre pirógenos, endotoxinas y exotoxinas? ¿y por qué las
exotoxinas no representan un problema tan grande como las endotoxinas?

2.12 Cuáles son las pruebas de aptitud que deben cumplir los medios de cultivo empleados en
la prueba de esterilidad.

2.13 ¿Qué proceso convierte el agua purificada en agua para inyectables con la que se realiza
la solución salina?

3. FUNDAMENTO TEORICO

La prueba de esterilidad se puede realizar por dos métodos:

1. Filtración por membrana :se utiliza cuando la naturaleza del producto lo permite, es decir, para
preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas y para preparaciones
miscibles con (o solubles en) disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos solventes no
posean un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.

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Se emplean filtros de membrana de tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm, cuya eficacia
para retener microorganismos ha sido establecida, de materiales por ejemplo:

 Nitrato de celulosa: para soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohólico.
 Acetato de celulosa: para soluciones con alto contenido alcohólico.

2. Inoculación Directa del medio de cultivo: se utiliza cuando la naturaleza del producto no
permite su filtración, por ejemplo las suspensiones estériles o aquellos productos reacciones con
los medios de cultivo y generen turbidez.

El caldo Tioglicolato o Fluid Thioglycollate Medium (FTM) es un medio de cultivo que permite el
desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes y
se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las
anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio. Debido a su
capacidad para favorecer el crecimiento, esta fórmula fue adoptada por la Farmacopea de Estados
Unidos (USP), el AOAC y la Farmacopea Europea (EP) como prueba de esterilidad y medio de
enriquecimiento.

Debido a su bajo potencial de oxidación –reducción, el caldo Tioglicolato no es el medio preferente

para aerobios estrictos, tales como los no fermentadores, Micrococcus y organismos similares,
para dichos organismos se debe utilizar el caldo de Tripticasa de soya o caldo de infusión de
cerebro y corazón.

La resazurina es un indicador de oxidación-reducción: presenta un color rosa con la muestra

oxidada y es incolora cuando está reducida. La pequeña cantidad de agar ayuda al mantenimiento
de un bajo potencial de oxidación-reducción, al estabilizar el medio contra las corrientes de
convección, por lo que mantiene la anaerobiosis a mayores profundidades del medio.

Pirógenos:
Esencialmente los pirógenos son sustancias que administradas por vía parenteral y en
dependencia de la dosis, son capaces de provocar una respuesta febril, shock y muerte. Existe una
gran variedad de pirógenos entre los que se encuentran el ácido lipoteicoico, el peptidoglicano, las
endotoxinas y ciertos virus, hongos, esteroides y enterotoxinas.
Los pirógenos son productos del metabolismo microbiano que producen fiebre. Pueden ser
exotoxinas de bacterias grampositivas (termolábiles) o endotoxinas que constituyen la pared
celular de las bacterias gram-negativas (termos resistentes).
Las endotoxinas son parte integral de las paredes celulares de bacterias Gram negativas formadas
por glucosaminas, fosfatos y ácidos grasos, y son extraordinariamente más resistentes al calor
seco que las esporas bacterianas.
La propiedad toxica de la membrana externa de estas bacterias es responsable de algunos
síntomas de infección a los que dan lugar. Estas propiedades toxicas se asocian a una parte del
LPS, más concretamente al lípido A.

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La prueba de endotoxinas bacterianas es una prueba in Vitro basada en la formación de un gel o
en la aparición de un color en presencia de endotoxinas bacterianas. La prueba de lisado de
amebocitos limulus (LAL), es una prueba bioquímica realizada en un tubo de ensayo y es más
simple, más rápida y de mayor sensibilidad, permite determinar el contenido de endotoxinas
bacterianas en forma cuantitativa o semi-cuantitativa permitiendo así establecer límites de
aceptabilidad en términos de concentración limite en UE/ml o UE/mg.

En tanto que el ensayo de pirógenos en conejos es capaz de detectar cualquier sustancia

pirogénica, el ensayo del LAL solo detecta endotoxinas. Este aspecto a primera vista es, sin lugar a
dudas, una desventaja para la implementación del ensayo en la liberación de producto terminado.
Sin embargo, los primeros defensores de la aplicación del LAL en la industria farmacéutica
plantearon que esta característica no era un inconveniente determinante, debido a que las
endotoxinas eran el pirógeno más relevante por las razones que se detallan a continuación:
En primer lugar, como las bacterias gram-negativas son tan ubicuas, capaces incluso de colonizar
el agua destilada, puede esperarse que ellas y/o sus endotoxinas estén presentes en cierto nivel
en la mayoría de los artículos, contaminando comúnmente las materias primas y el equipamiento
empleado para la producción de inyectables. Ellas son el pirógeno que más se ha encontrado entre
los lotes contaminados y debido a su alta resistencia a la destrucción térmica y química, sobrevive
a los métodos ordinarios de esterilización.
Por último, las endotoxinas se caracterizan sobre todo por su potente actividad biológica, por lo
que son capaces de producir profundos cambios fisiológicos cuando son administradas por vía
parenteral. Una dosis de 1-10 ng/kg de endotoxina puede provocar una respuesta febril en el
hombre.

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 4. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

Normas de seguridad
El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad para sustancias químicas.

El trabajo en el laboratorio de Microbiología requiere de unas normas básicas en el manejo, el orden y

el cuidado del material por parte de las personas que laboran allí. Toda muestra que va a ser
manipulada en el laboratorio de la universidad debe ser considerada altamente tóxica, infecciosa
o contaminante; trabajando bajo estos parámetros, el estudiante debe reconocer que su salud y la de
las personas que trabajan con él son lo más importante.

Realizar limpieza y desinfección a las superficies, elementos y equipos de trabajo al final de cada
procedimiento y al finalizar la jornada de trabajo.

Equipos de protección personal

Cada alumno debe llegar a las prácticas con calzado cerrado, usar durante toda la práctica Bata de
laboratorio, Guantes de látex, Gafas de seguridad, Gorro y Tapa bocas, no abandonar el laboratorio o
caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos. Se debe usar pantalones largos ya que
pueden impedir que sufra lesiones con materiales corto punzantes y con sustancias químicas o
contaminación con materiales biológicos, no se debe usar maquillaje.
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

Manejo de Residuos Biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio de Microbiología en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales
están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. No mezclar material contaminado con el material no contaminado.

3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos obtenidos durante el desarrollo de la práctica. Si
tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le indicará la
forma correcta de hacerlo.

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 5. METODOLOGIA.

MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja de trabajo

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Tubos despirogenizados 100 x 75 paquete por salón

1 U:N
mm
Gradilla para tubos de 100 x 75 mm U:N
1
Jeringas desechables estériles U:N
3
Filtros de membrana de 0,45 micras U:N
2
Agujas estériles U:N
5
Mechero de alcohol U:N
1
Erlenmeyer con desprendimiento U:N por salón
2
lateral x 1000 ml
Embudos de polisulfona x 250 ml U:N
2
Mangueras U:N por salón
2 juegos
Manifold de 3 puestos U:N por salón
1
Frasco Schott1000mL U:N por salón
5
Frasco Schott 100 mL U:N
3
Espátula cuchara metálica U:N por salón
4
Magnetos de agitación grandes U:N por salón
3
Magnetos de agitación medianos U:N por salón
1
Caja de Petri 90 x 15 mm U:N por salón
1

REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja de trabajo.
ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Caldo Tioglicolato
Csp150 ml U:N
Agar caso U:N
Csp10 ml
Caldo Caso U:N
Csp150 ml

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 Bacto peptona U:N
Csp300 ml
Agua libre de pirógenos y estéril 30 ml por grupo U:N Por grupo
( bolsas para inyección x x10mL ( 3 bolsas)
Kit pyrosate U:N por salón
1 por grupo
BBL- crystal U:N por salón
1
Solución salina 0.9 %, bolsa por 1 bolsa para U:N Para dos grupos
500mL dos grupos

EQUIPOS

Tabla 3. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja de trabajo
ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Incubadora 35ºC por salón

1 por grupo U:N
Baño María U:N por salón
1 por grupo
Termómetro U:N
1 por grupo
Cronómetro U:N
1
Cabina de Flujo laminar U:N por salón
1 por grupo
Bomba de vacío U:N por salón
1

SOLUCIONES

Tabla 4. Listado de soluciones necesarias para el desarrollo de la práctica por pareja de trabajo

No Aplica

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

SOLUCIÓN SALINA X 1 L
Descripción y demás pruebas: según farmacopea vigente.

ANALISIS DE ESTERILIDAD POR FILTRACION POR MEMBRANA:

PRE- PROCEDIMIENTO Y ALISTAMIENTO:

 Antes de proceder con el análisis exponer una caja de Petri con agar caso durante toda la
prueba: control ambiental.
 Sanítece con alcohol etílico 70% todos los materiales antes de ingresarlos a la cabina de flujo
laminar.
 Sanitíce muy bien las manos enguantadas con alcohol etílico 70% y permita que se evapore el
alcohol dentro de la cabina de flujo laminar. Nunca saque las manos mientras está ejecutando la
prueba.
 Dentro de la cabina tomar el equipo de filtración de polisulfona (ver anexo 1), estéril, protegido
con papel para autoclave. Retirar el papel.
 Girar levemente la parte superior del equipo de filtración para retirar el embudo (ver anexo 2).
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 Con pinzas estériles (en autoclave, o pasadas por alcohol etílico puro y por la flama del
mechero) colocar el filtro de celulosa (de 0,45 um tamaño de poro y 47 mm de diámetro), con la
parte brillante o cuadriculada hacia arriba, y sobre la parte porosa del receptáculo (en la base del
filtro). Los filtros de celulosa estériles se encuentran en empaques individuales estériles de papel-
plástico, tener en cuenta buenas condiciones de asepsia al momento de retirar el filtro del
empaque para no causar su contaminación. Se recomienda realizar todo el procedimiento dentro
de cabina (ver anexo 2).
 Colocar de nuevo el embudo estéril sobre el receptáculo y fijar girando levemente este. Revisar
que el embudo se encuentre fijo a la base del equipo de filtración (ver anexo 2).

PROCEDIMIENTO PARA LA MUESTRA:

 Filtrar 100 ml del producto a través del filtro de membrana estéril (ver anexo 2).
 Lavar la membrana con 100 ml de caldo peptona
 Desarmar el equipo de filtración retirando el embudo (ver anexo 2).
 Cortar la membrana por la mitad con la ayuda de aguja estéril ensamblado en el cilndro de la
jeringa.
 Colocar una mitad en el frasco schott que contiene el Caldo Tioglicolato (FTM), cerrarlo
inmediatamente. Colocar la otra mitad en caldo caso (TSB), cerrarlo inmediatamente
 Identificar los frascos con el nombre de la muestra, grupo y fecha.
 Lleve a incubar el FTM a 30 - 35 ºC y el TSB a temperatura ambiente por 14 días cada uno.
 La norma exige verificar el aspecto de los medios diariamente durante los 14 días de la prueba
pero en este caso, por motivos de logística y tiempo, el aspecto de los medios de cultivo se
revisara únicamente después de 3, 8 y 14 días de incubación.

PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL NEGATIVO:

 Realizar todo el procedimiento anterior con 100 ml de caldo peptona (en lugar del producto):
este será el control negativo.
 Lavar la membrana con 100 ml de caldo peptona
 Lleve a incubar el FTM a 30 - 35 ºC y el TSB a temperatura ambiente por 14 días cada uno.
 La norma exige verificar el aspecto de los medios diariamente durante los 14 días de la prueba
pero en este caso, por motivos de logística y tiempo, el aspecto de los medios de cultivo se
revisara únicamente después de 3, 8 y 14 días de incubación.

PREINFORME Y LECTURAS:

 Diligenciar el resultado en la casilla respectiva del preinforme:

 En FTM si observa turbidez significa presencia de crecimiento microbiano.
 En TSB si observa turbidez significa presencia de crecimiento microbiano.
 Al cabo de este tiempo, si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto
examinado cumple con la prueba de esterilidad.
 Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la
prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resulto inválida
por causas no relacionadas con el producto examinado.

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La prueba puede considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes
condiciones:
1. Los datos del monitoreo microbiológico de la cabina de flujo laminar demuestran una falla.
2. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un error.
3. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
4. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el
crecimiento de esta especie(s) puede atribuirse de manera inequívoca a errores con respecto al
material o a la técnica usados al realizar el procedimiento.
 De ser necesario realice coloración de gram identifique la contaminación presentada utilizando
la prueba de BBL Cristal.

Interpretación de resultados:

1ª siembra Resultado positivo invalido

Resultado negativo Resultado positivo 2ª siembra con igual No. Unidades que la 1a

APROBADO RECHAZADO Resultado negativo Resultado positivo

APROBADO RECHAZADO
ANEXOS
ESQUEMA DE EQUIPO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA EN
POLISULFONA

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 ANALISIS DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS POR TECNICA LAL:

Determine la UE/mL presentes en el producto según las instrucciones del inserto del kit Pyrosate.

Instrucciones.
 Kit Pyrosate®: límite de sensibilidad 0,25 UE/ml
 Solución Salina: No contiene más de 0,5 UE/ml
Para evitar una reacción positiva derivada de las endotoxinas presentes en la solución salina
(presentan una concentración no mayor a 0,5 UE/ml) y asociar el resultado específicamente a las
endotoxinas presentes en la muestra, se realiza una dilución ½ con agua estéril (punto uno,
numeral 5.5.2.1), reduciendo, de esta manera, la concentración de endotoxinas de la solución
salina a menos de 0.25 UE/ml, menor al límite de detección de la prueba (0,25 UE/ml)

Preparación del kit Pyrosate®.

 Agregar 1 mL de Agua estéril y 1 mL de solución salina a un tubo apirogenos( 2 mL) o agregar
2 mL de Agua Estéril y 2 mL de solución salina a un tubo apirogeno ( 4 mL), con esta alternativa se
facilita tomar la muestra según la micropipeta o pipeta y tamaño del tubo que tenga disponible

Concentración= Soluto + Solvente

Soluto
 Tomar 0,5 mL de la Muestra con la ayuda de la pipeta y transferirlo al tubo Azul SPL
 Mezclar suavemente el contenido (20 a 60 seg)
 Con la misma pipeta retire 0.25 mL del tubo SPL y transfiéralo al tubo rojo PPC
 Mezclar suavemente el contenido (20 a 60 seg)
 Incubar a la temperatura indicada por el periodo de tiempo especificado en el inserto del kit
(revisar inserto para conocer temperatura y tiempo de incubación). Usualmente las condiciones son
37 °C por 23 o 25 o 27 min o según el kit.
 Reporte el resultado en el preinforme.

La ventaja de utilizar el kit Pyrosate® es que está formulado para eliminar los falsos positivos
debido a los (1→3)-β-D-glucanos, y no requiere el uso de buffers para llevar el pH de la mezcla de
reacción entre 6,0 y 8,0.

Tenga en cuenta la siguiente tabla para la lectura:

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 Tubo Control (PPC)
Formación de gel (+)
Formación de gel (+)
No Formación de gel (-)
No Formación de gel (-)
Tubo de la muestra (SPL)
Formación de gel (+)
No Formación de gel (-)
Formación de gel (+)
No Formación de gel (-)
Resultado
Ensayo válido.
La muestra contiene ≥ 0,25 UE/ml
Ensayo válido.
La muestra contiene < 0,25 UE/ml
Ensayo no válido. Repita el análisis
Ensayo no válido. Repita el análisis

Nota: el lubricante de silicona de las jeringas inhibe el ensayo (en caso de que la muestra esté
envasada en una jeringa).

PAUTAS PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS

Elabore un certificado de análisis y este será su informe final. Siga las reglas del juego del
planeador y dar status de calidad UNICAMENTE AL ANALISIS DE ESTERILIDAD Y
ENDOTOXINAS.

Recuerde que debe incluir:

1. INFORMACION GENERAL
2. INFORMACIÓN DE LA MUESTRA
3. ANÁLISIS REALIZADOS Y RESULTADOS OBTENIDOS
4. DECISION DE CALIDAD.
5. DATOS DE LOS ANALISTAS Y DEL RESPONSABLE DE APROBAR O RECHAZAR O
RETENER.
6. DATOS Y CÁLCULOS EFECTUADOS EN LA OBTENCIÓN DE LOS RESULTADOS: no
se incluye en el informe, sin embargo en el cuaderno debe quedar registrado los
modelos de cálculo de cada una de las operaciones realizadas.
7. HOJA DE EQUIPOS: no se incluye en el informe, sin embargo en el cuaderno debe
quedar registrado.
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS: Incluya en los análisis del resultado una discusión
profunda y argumentada de la definición de status y cualquier recomendación
adicional. Informe al terminar lecturas.
TIPS PARA LA DISCUSION DE RESULTADOS:
 De acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba de esterilidad, determine si el
producto cumple con la especificación de esterilidad. En caso de no cumplir el ensayo
de esterilidad, sugiera una ruta de investigación y determine la validez de la prueba.

 Explique el procedimiento a seguir antes de dar la alerta a Producción ya sea porque el

producto no cumple esterilidad y/o endotoxinas bacterianas.

 Explique las implicaciones que tendría para un paciente suministrarle un producto

intravenoso que no cumple el ensayo de esterilidad ni el de endotoxinas bacterianas.

9. BIBLIOGRAFÍA

10. ANEXOS: Incluya fotos de los resultados en FTM, TSB y LAL test, las cuales no
cuentan en el espacio asignado.

6. BIBLIOGRAFIA

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6.1 USP 40 -NF 36, (2018), Farmacopea de los Estados Unidos de América. Formulario
Nacional, edición 38, volumen 1, 2 y 3, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville,
MD.

7. MATERIALES PARA LA PRACTICA:

Material utilizado por salón:

Equipo de Filtración de Polisulfona, con receptáculos

Kit Pyrosate de 0,25 UE/ml
Solución Salina x 500 mL : 1 bolsa para dos grupos
Caldo Peptona en un recipiente con la cantidad total por salón, teniendo en cuenta que
cada grupo requiere 300 mL (100 mL para la muestra, 200 mL para el control negativo)

Material utilizado por equipo de estudiantes: (dos personas)

Cajas Petri con Agar caso (TSB): 1

Embudos estériles para equipo de filtración: 2 unidades
Pinzas estériles: 2
Mechero: 1 unidad
Filtros de celulosa estéril 0,45 um y 47 mm de diámetro: 2 unidades van dentro del
receptáculo.
Caldo Peptona en frasco Shott: 2 frascos de 150 ml c/u, o un frasco de 300 mL o
un recipiente con la cantidad total por salón.
Caldo Tioglicolato en frasco Shott: 2 frascos de 100 ml c/u
Caldo Caso en frasco Shott: 2 frascos de 100 ml c/u
Jeringas desechables estériles con aguja : 4

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