CURS MICROBIOLOGIE

Conf. Univ. Dr. Maria Balasoiu

ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. TAXONOMIE BACTERIANĂ. CRITERII DE
CLASIFICARE A MICROORGANISMELOR

1. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI
Microbiologia studiază microorganismele şi activităţile lor.
Microorganismele sunt vieţuitoare care nu se pot vedea cu ochiul liber, ci numai la
microscop.
Termenul de microb a fost utilizat pentru prima oară în 1878 de către Sedillot
(chirurg la Academia de Ştiinţe din Paris), în ″ De l′ influence des decouvertes de M.
Pasteur sur les progres de la chirurgie″ . Adevărata natură a microbilor a fost descoperită
însă doar în a doua jumătate a secolului XX.
Observarea şi descrierea primelor microorganisme au fost făcute de către olandezul
Antonie van Leeuwenhoeck (1632-1723) între 1673-1675; cu ajutorul unui microscop de
fabricaţie proprie el a observat nişte ″ creaturi minuscule″ în apa de ploaie, apa din
vazele cu flori, urină, fecale pe care le descrie minuţios: forme rotunde (coci), alungite
(bastonaş), de virgulă, spiralate.
Nici Leeuwenhoeck şi nici contemporanii săi nu au realizat importanţa
extraordinară a descoperirii sale, atenţia savanţilor îndreptându-se nu spre ″ rolul acestor
vieţuitoare″ , ci spre ″ originea lor″ . Teoria adoptată de ei era ″ teoria generaţiei
spontane″ : animale ca muşte, şoareci, etc. se nasc din materie putrezită şi din noroi.
În 1650 Francesco Redi, plasând carne într-un borcan şi prezervând-o prin tifon de
contactul cu muştele demonstra indubitabil că ″ viermii″ (larvele) nu se nasc spontan
din carne, ci din ouăle depuse aici de către muşte, ca atare au părinţi definiţi.
Controversa însă a continuat. Un adept al ″ teoriei generaţiei spontane″ ,
Needham, în 1749, constata că microorganismele prezente în bulionul de carne dispăreau
după încălzire, dar reapăreau dacă acest bulion era păstrat pentru un timp, chiar într-un
recipient acoperit. Concluzia lui Needham a fost următoarea: dacă microorganismele
iniţial prezente, virtualii părinţi, au fost omorâţi prin încălzirea bulionului,
microorganismele depistate în final nu puteau să apară decât spontan.
Teoria lui Needham a fost combătută de Lazzaro Spallanzani (1729-1799) care a
demonstrat eroarea făcută de Needham: măsuri ineficiente pentru a împiedica pătrunderea
microorganismelor din aer în bulionul de carne fiert. El a închis ermetic flacoanele cu
bulion fiert. După mai multe zile, în flacoanele închise microorganismele nu apăreau, în
timp ce ele erau prezente în cele lăsate deschise.
Au urmat apoi o serie de experimente, având ca aspecte comune: distrugerea prin
căldură a microorganismelor din bulion (sterilizarea) şi prevenirea accesului în bulionul
sterilizat a unor elemente particulare, purtătoare de microorganisme.
Astfel, din anii 1860 teoria generaţiei spontane era complet discreditată.
Elaborarea teoriei microbiene a bolilor infecţioase este meritul lui Louis Pasteur
(1822-1895), fondatorul microbiologiei ca ştiinţă.
Primele observaţii ale sale apar în timpul experienţelor în care sarea de amoniu a
acidului paratartric, se descompune în acid tartric levogir, iar lichidul care îl conţine se
tulbură. Examinând lichidul la microscop el descoperă prezenţa unei ciuperci, Penicillium
glaucum, care metabolizează substratul.
Ulterior L. Pasteur a studiat: procesele de fermentaţie la solicitarea producătorilor
de vin şi a descoperit că fermentaţia se datora unor anumiţi microbi; a identificat
microorganisme care determinau boala viermilor de mătase şi a demonstrat că acestea se
transmit de la un vierme la altul răspândind boala; prin inactivarea sau atenuarea
microorganismelor cauzale a preparat vaccinuri pentru prevenirea turbării, antraxului,
holerei găinilor; a preparat vaccinul antirabic fără să cunoască natura virală a agentului
etiologic; căutând să împiedice fermentaţia care producea mari pagube producătorilor de
vinuri, el încălzeşte vinul la 60-70°C distrugând microorganismele responsabile - astfel a
introdus sterilizarea care-i poartă numele, pasteurizarea, folosită şi azi pe scară largă în
industria alimentară.
Împreună cu Joubert şi Chaamberland prezintă la 29 aprilie 1878 celebra lucrare:
″ La théorie des germes et ses applications à la médicine et à la chirurgie″ , lucrare care
a prezentat ideile fundamentale ale teoriei microbiene.
În aceeaşi perioadă, Tyndall descoperea cele două forme de existenţă a unei
bacterii: vegetativă (sensibilă la căldură) şi sporulată (rezistentă chiar şi la fierbere
îndelungată). El introduce o metodă de sterilizare fracţionată, prin încălzirea discontinuă
a produselor, cunoscută sub numele de tyndalizare.
Contemporan cu Pasteur a fost Robert Koch (1843-1910). Prima sa descoperire a
fost sporul bacilului cărbunos, în timp ce examina cultura acestui germene pe un preparat
nativ între lamă şi lamelă.
El introduce în practica bacteriologică examinarea morfologică a microbilor pe
frotiuri fixate şi colorate.
În cultivarea microbilor foloseşte gelatina pentru solidificarea mediilor de cultură şi
obţine primele colonii izolate.
Robert Koch a izolat: bacilul antraxului, bacilul tuberculozei (BK) în 1882 şi a
demonstrat cauzele acestei boli; vibrionul holeric şi calea de transmitere a bolii.
Teoria germenilor a fost sintetizată şi validată sub forma a trei postulate formulate
de Robert Koch în 1882 la şedinţa Societăţii de Ftiziologie din Berlin şi anume:
- în corpul tuturor bolnavilor de o anumită boală microorganismul care a determinat boala
se găseşte răspândit în raport cu simptomele şi cu leziunile observate;
- microorganismul se izolează din corpul bolnavului şi poate fi menţinut în culturi pure
pentru studii de laborator;
- acest microorganism inoculat la un animal receptiv reproduce o infecţie experimentală
asemănătoare cu cea naturală, putând fi reizolat din corpul animalului infectat.
Elevii şi colaboratorii lui Pasteur au continuat studiul agresiunii microbiene asupra
organismului animal.
Dezvoltarea microbiologiei a avut un impact deosebit asupra igienei, a
epidemiologiei bolilor transmisibile şi chirurgiei prin generalizarea antisepsiei şi asepsiei.
Astfel, Semmelweis (1818-1865), şeful clinicii vieneze de obstetrică, reduce mortalitatea
lehuzelor de la 18% la 1,27% obligând personalul sanitar şi studenţii care lucrau la
disecţia cadavrelor să se spele pe mâini cu clorură de var.
În acelaşi timp, Joseph Lister (1827-1912), chirurg din Edinburgh, introduce în
clinica sa asepsia prin pulverizarea acidului carbonic în sălile de operaţie.
 Elevul lui Pasteur, Ilia Mecinikov (1845-1916) a descoperit fagocitoza şi rolul
inflamaţiei în apărarea antimicrobiană.
Charles Richet a descoperit prima reacţie antigen-anticorp, adică reacţia de
antiglutinare, stabilind astfel bazele imunologiei.
Bazele geneticii au fost puse în 1940 prin experimentul lui Oswald Avery, Colin
M., Leod şi Maclyn Mc Carty.
Epoca „chimioterapiei antimicrobiene” a fost deschisă de Paul Ehrlich (1854-
1915) care a utilizat Salvarsanul (un compus arsenical) pentru terapia sifilisului,
descoperirea sulfamidelor de către Domagk (1932) şi descoperirea penicilinei de către
Alexander Fleming (1881-1955) în 1928, introdusă în practica medicală în 1941, după
purificarea şi stabilizarea ei de către doi chimişti de la Oxford: Florey şi Chain.

MICROBIOLOGIA ROMÂNEASCĂ
Întemeietorul microbiologiei româneşti este Victor Babeş (1854-1926), profesor de
bacteriologie şi anatomo-patolog la Bucureşti.
 1005 lucrări, printre care primul tratat de bacterologie din lume, scris în 1885
împreună cu Victor Cornil, tratat intitulat „Les bacteries et leur role dans l’etiologie,
l’anatomie et l’histologie pathologique des maladies infectieuses”;
 descoperiri: granulele metacromatice ale bacilului difteriei (corpusculul Babeş-Ernst);
40 specii microbiene; 2 specii protozoare, genul Babesielle; studii asupra turbării, leprei
şi pelagrei;
 a introdus la noi în ţară vaccinul antirabic, seroterapia antirabică şi seroterapia
antidifterică;
 organizează primul institut de cercetare medicală din România „Victor Babeş” şi
primul laborator de igienă şi bacteriologie din ţară.
Ion Cantacuzino (1863-1934) a fost profesor la catedra de medicină experimentală
din Bucureşti, efectuând studii în domeniul holerei, al imunităţii umorale şi al imunităţii
celulare.
 1913: aplică în armata română, aflată în plină epidemie de holeră, vaccinul antiholeric
cu vaccin omorât;
 1906: introduce în ţară vaccinarea antituberculoasă cu BCG;
 1910: înfiinţează primele sanatorii de TBC şi primele spitale de boli infecţioase;
 1921: Institutul de Seruri şi Vaccinuri „Ion Cantacuzino”.
Constantin Levaditi (1874-1953) a fost profesor la Institutul Pasteur din Paris. A
desfăşurat o activitate ştiinţifică deosebită în domeniile: imunologie, virusologie,
bacteriologie, parazitologie şi chimioterapie. Împreună cu elevul său Ştefan S. Nicolau
pun bazele învăţământului virusologic în ţara noastră, astăzi Institutul de Virusologie „Şt.
S. Nicolau”.
Alte personalităţi marcante ale microbiologiei româneşti: Prof. Dr. Nicolae Cajal,
Prof. Dr. C. Ionescu Mihăieşi, Prof. Dr. M. Ciucă, Prof. Dr. D. Combiescu, Prof. Dr.
Lidia şi I. Mesrobeanu, Prof. Dr. Eugenia M. Duca şi alţii.

2. TAXONOMIE
Taxonomie (taxinomie), provenind din grecescul „taxis” care înseamnă ordine,
aranjare, este ştiinţa clasificării organismelor.
Organismele vii au fost împărţite iniţial în 2 regnuri: vegetal şi animal.
 În secolul al XIX-lea s-a observat că microorganismele prezintă nu numai
asemănări, dar şi deosebiri faţă de cele 2 regnuri. Sesizând aceste diferenţe Haekel, în
1866, propune unirea microorganismelor cunoscute într-un regn aparte numit
PROTISTA, care să cuprindă: algele, protozoarele, fungii şi bacteriile.
În secolul al XX-lea, prin dezvoltarea mijloacelor de cercetare, s-a demonstrat că
microorganismele încadrate iniţial în acest regn diferă în mod fundamental unele de
celelalte. Astfel, celulele bacteriene au o dezvoltare mult mai simplă, fiind desemnate ca
celule de tip PROCARIOT, spre deosebire de alge, protozoare şi fungi, care posedă o
structură mai complexă de tip EUCARIOT.
Ca urmare, termenul de PROTISTA s-a restrâns numai pentru organismele
unicelulare de tip eucariot, iar bacteriile aparţin unui regn aparte numit PROCARIOTE,
din care fac parte: archaebacteriile, eubacteriile şi cyanobacteriile (algele albastre).

 EUBACTERIILE sunt:
- bacteriile clasice, care au forme variate şi perete celular;
- chlamydiile, care sunt bacterii cu parazitism intracelular obligatoriu, cu mecanism
unic de multiplicare în lumea bacteriilor;
- ricketsiile, care sunt bacterii cu habitat intracelular, dar cu diviziune directă (ca la
majoritatea bacteriilor);
- mycoplasmele, care sunt bacterii cărora le lipseşte peretele celular.

La acestea se adaugă:

VIRUSURILE, care sunt considerate microorganisme, cu toate că se deosebesc

fundamental de acestea. Ele sunt formate dintr-un singur acid nucleic (ADN sau ARN),
învelit de o capsulă proteică. Sunt incapabile să-şi determine propriile sinteze în afara
aparatului de sinteză al unei celule eucariote (parazitism intracelular).

PRIONII sunt entităţi infecţioase de dimensiuni foarte mici (5 nm) de natură proteică,
cauza unor boli ale SNC: boala KURU, Jacob-Creutzteld.

PARAZITII , organisme unicelulare(protozoare) sau pluricelulare(helminti)

FUNGII, organisme unicelulare – specii de Candida.

BACTERIOLOGIE

NOMENCLATURA BACTERIANĂ
Denumirea ştiinţifică a microbilor se face prin nume LATINIZATE. Se porneşte de
la un substantiv grec sau latin care denumeşte cel mai evident caracter al
microorganismelor reunite într-o unitate taxonomică şi primeşte un sufix latin.
CLASIFICARE TAXONOMICĂ
Clasificarea (gr. Kleiss-distribuţie; Classis-apel, grup, adunare, diviziune) este
aşezarea obiectelor, substanţelor, conceptelor, organismelor în grupe ordonate ierarhic în
funcţie de asemănări şi înrudiri stabilite prin anume criterii.
Prima clasificare a microbilor apare în opera botanistului Charles Linne în 1767,
operă numită „SYSTEMA NATURAE”, în clasa „chaos influsoria”. În prezent bacteriile
se clasifică după criteriile stabilite de Comitetul Internaţional de Sistematică a Uniunii
Internaţionale a Societăţilor de Microbiologie. Acest comitet editează, la intervale
regulate, un manual „BERGEY’S MANUAL OF DETERMINATIVE
BACTERIOLOGY”, în care se prezintă ultimele modificări ale taxonanomiei bacteriene.
Microorganismele fac parte din grupul Phyla ce conţine:
 clase
 ordine - primesc sufixul „ales” - ex: Spirochetales; Eubacteriales;
 familii - primesc sufixul „aceae” - ex: Enterobacteriaceae;
 triburi - primesc sufixul „ceae” - ex: Streptocaccocaceae;
 genuri - primesc sufixul: „us” (ex: Streptococcus, Staphylococcus); „um”
(Clostridium); „a” (Leptospira, Shigella, Salmonella); „as” (Pseudomonas);
 specii - Gen ( cu majusculă) + determinativ genitiv (cu literă mică). Ex:
Staphylococcus aureus, Bordetella pertussis, Haemophilus influensae, Pasteurella pestis
etc.
În specii se disting tipuri (serotip - diferă pe baza proprietăţilor antigenice; biotip -
diferă pe baza proprietăţilor metabolice; lizotip - diferă pe baza sensibilităţii la
bacteriofagii litici), variante şi tulpini (tabelul 1).

Stafilococ Streptococ β- Bacil tific

aureu hemolitic
Ordin Eubacteriales Eubacteriales Eubacteriales
Famil Micrococcace Lactobacteriaceae Enterobacteriac
ie ae (Streptobacteriaceae) eae
Trib - Streptococceae -
Gen Staphylococcu Streptococcus Salmonella
s
Speci Staphylococcu Streptococcus Salmonella
e s pyogenes grup A typhi
aureus

Tabelul 1: Exemple de încadrare taxonomică a unor bacterii

MORFOLOGIA ŞI STRUCTURA CELULEI BACTERIENE. SPORUL ŞI
SPORULAREA. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENE

1. MORFOLOGIA BACTERIILOR
Bacteriile sunt organisme unicelulare asexuate (celula somatică fiind şi celula
reproducătoare), procariote (cu nucleu alcătuit dintr-un unic cromozom, fără membrană
nucleară, fără nucleoli), haploide (cu unic set de gene), divizibile în celule identice.
 Dimensiunea, forma şi aşezarea bacteriilor, criteriu important pentru identificarea
lor, este posibilă cu ajutorul microscopului optic, utilizând preparatul nativ şi preparatul
fixat şi colorat (frotiu), dar detaliile morfologice şi structurale pot fi puse în evidenţă
numai prin microscopie electronică.

1.1. DIMENSIUNI
Dimensiunile bacteriilor se exprimă în micrometri (1µ = 10-3 mm), variaţiile fiind
în funcţie de specie, formă, mediu şi vârsta culturii. În general, dimensiunea bacteriilor
este cuprinsă între 1-10µ .
Cele mai mici bacterii sunt reprezentanţii genului Mycoplasma (diametrul 0,3-
0,8µ ), pe când cele mai mari ajung până la o lungime de 10µ (bacilul antraxului), 15-
20µ (spirochetele).
Formele filamentoase, cum sunt actinomicetele, pot atinge o lungime până la
500µ .

1.2. FORMĂ
În lumea bacteriilor se întâlnesc diferite forme tipice pentru o anumită specie, cu
unele variaţii în funcţie de condiţiile de mediu şi de vârstă. Se disting următoarele forme
fundamentale de bacterii: coci, bacili, cocobacili, vibrioni, spirili şi spirochete şi forme
filamentoase.

- Cocii sunt bacterii sferice (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus),

lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) cu diametrul
de 0,8-1µ .

- Bacilii sunt bacterii cu formă alungită de bastonaş cu dimensiuni între 1,5-10µ . La

bacili este importantă examinarea extremităţilor, aspectul acestora având rol în
identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta capetele rotunjite (familia
Enterobacteriaceae), tăiate drept (Bacillus anthracis-bacilul cărbunos), măciucate
(Corynebacterium diphteriae-bacilul difteric), în formă de suveică (Fuzobacterium).

- Cocobacilii sunt bacterii uşor alungite, fiind forme intermediare între coci şi bacili
(Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae).

- Vibrionii sunt bacterii încurbate în formă de virgulă: vibrionul holeric (Vibrio

cholerae), vibrionii saprofiţi (intestin, ape).

- Spirilii şi spirochetele sunt bacterii spiralate, lungi, foarte subţiri. În cazul spirililor
corpul bacteriei este rigid (genul Spirillum), pe când la spirochete corpul este flexibil şi
mult mai subţire (genurile Borrelia, Treponema şi Leptospira).

- Actinomicetele sunt bacterii foarte asemănătoare fungilor şi formează filamente sau

hife lungi şi ramificate care se rup, rezultând forme bacilare (Actinomyces).
1.3. AŞEZARE
Bacteriile sunt organisme unicelulare care se multiplică prin diviziune binară. La
unele specii, după diviziune urmează separarea completă a celulelor fiice, rezultând
bacterii izolate. La alte specii, după diviziune, celulele fiice rămân legate între ele,
determinând diferite tipuri de aşezare a celulelor. Aşezarea bacteriilor (figura 1) permite
uneori recunoaşterea genului, sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopul optic a
preparatelor colorate efectuate din culturi sau direct din produsul patologic recoltat de la
pacient.

Cocii se pot aşeza:

 în grămezi neregulate: germenii din genul Staphylococcus;
 în lanţuri la genul Streptococcus;
 în tetrade (patru indivizi aşezaţi simetric): genul Micrococcus;
 în baloturi de câte 8 indivizi aşezaţi simetric la genul Sarcina;
 în diplo, ca două flăcări de lumânare care se unesc prin bazele lor, la specia
Streptococcus pneumoniae;
 în diplo, ca două boabe de cafea care se privesc faţă în faţă prin concavităţile lor, la
genul Neisseria: N. gonorrhoeae (gonococ); N. meningitidis (meningococ).

Bacilii se pot aşeza:

 cel mai ades izolaţi şi în poziţii întâmplătoare unul faţă de celălalt: majoritatea
bacililor Gram negativi;
 grupaţi câte doi (diplobacili): genul Klebsiella;
 dispuşi în lanţuri (streptobacili): germeni din genul Bacillus (bacilul cărbunos);
 dispuşi în mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeşti:
Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis;
 în palisadă, ca scândurile unui gard: Mycobacterium leprae.
 Figura 1: Forme fundamentale şi aşezare la bacterii (după Dumitru Buiuc 1992)

2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

Unitatea morfofuncţională a bacteriilor este celula. Bacteriile au, ca tip de celulă,
celula procariotă, care se deosebeşte de celula eucariotă prin structura şi organizarea ei.
Diferenţele esenţiale între celula eucariotă şi celula procariotă sunt prezentate în tabelul
1.
 Caracter Celula eucariotă Celula procariotă

Dimensiuni - mari (10 - 100µ ) - mici (1 - 10µ )

- multicelulară, de obicei, - unicelulară (populaţii)
Organizare cu diferenţieri
funcţionale – ţesuturi
Modalităţi - mitoză sau meioză - diviziune directă
de (fisiune binară sau
reproducere sciziparitate)
- cromozomi 2n (diploid) - cromozom unic, inelar
Nucleu sau n (haploid) - moleculă ADN dublu
- nucleol prezent helix
- membrană nucleară - nucleol absent
prezentă (material ADN - membrană nucleară
concentrat) absentă (material ADN
dispus difuz cu
concentrare maximă la
centru)
- conţine steroli - nu are în structură
Membrana steroli (excepţie genul
Mycoplasma)
- este compartimentată - este necompartimentată
- organite tubulare - organite tubulare
prezente: reticul absente
endoplasmatic,
mitocondrii, aparat
reticular intern Golgi,
lizozomi
Citoplasmă - ribozomii fixaţi pe - ribozomi liberi în
reticulul endoplasmatic citoplasmă, sunt de 70 S
rugos, sunt de 80 S cu cu subunităţi de 30 S şi
subunităţi de 40 S şi 60 S 50 S
- organite particulare
prezente: mezozomi,
oxizomi, plasmide
Strat
periferic - membrana celulară - perete celular
corp celular
Elemente
- cilii (rar) - cili, fimbrii, capsulă
anexă
Forme de
- nu există - spori
rezistenţă

Tabel 1: Diferenţe între celula eucariotă şi procariotă (după V. Bîlbîe şi N. Pozsgi 1984)
 Bacteriile au o structură foarte complexă, fiind alcătuite din: componente
obligatorii şi componente facultative.
- Componentele obligatorii sau elementele intrinseci sunt prezente la toate speciile
bacteriene şi sunt reprezentate de: nucleu, citoplasmă, membrană citoplasmatică şi
perete celular.
- Componentele facultative sau elementele anexă sau extrinseci se găsesc doar la
unele specii bacteriene şi sunt reprezentate de cili sau flageli, fimbrii şi capsulă.
Deşi mult mai mici şi mai simple decât celulele eucariote, bacteriile sunt
asemănătoare cu acestea în ceea ce priveşte mecanismele funcţionale celulare, prezentând
o organizare complexă cu o arhitectură externă şi internă distinctă (figura 2).

Figura 2: Schema generală de organizare a celulei bacteriene (după V. Bîlbîe şi N. Pozsgi

1984)

2.1. ELEMENTE ANEXĂ (EXTRINSECI)

2.1.1. CILII (FLAGELII) BACTERIENI
Cilii sau flagelii sunt formaţiuni filamentoase ale speciilor microbiene mobile,
foarte lungi, subţiri, fragile. Sunt structuri helicoidale, prezenţi mai ales la bacili (familia
Enterobacteriaceae) dar şi la unii coci (enterococ).
Sunt formaţiuni implicate în locomoţie, a căror existenţă este controlată genetic.
Astfel, la E. Coli s-a stabilit că pentru sinteza cililor cooperează aproximativ 30 de gene,
a căror informaţie este necesară biosintezei constituenţilor structurali ai cilului, în
asamblarea acestora, precum şi în chemotaxie şi mobilitate.
Dispoziţia şi numărul cililor sunt caracteristice speciei (figura 3). S-au descris
bacterii atriche (fără cili), monotriche - cu un cil polar (Vibrio cholerae) sau subpolar
(enterococ), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei (Pseudomonas
fluorescens), amfitriche - cu cilii situaţi la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) şi
peritriche - cu cilii dispuşi pe întreaga suprafaţă a bacteriei (Salmonella, E. coli, Proteus,
etc.).
 bacterie
monotriche
bacterie
lofotriche bacterie
bacterie bacterie peritriche
atriche amfitriche

Figura 3 : Tipuri de celule bacteriene în raport cu dispoziţia cililor (după A. Ivanof şi M.

Ciupe, 1982)

Din punct de vedere al compoziţiei chimice, cilii conţin o proteină contractilă

denumită flagelina, asemănătoare cu miozina din celula musculară animală. În
compoziţia flagelinei, a fost descris un aminoacid caracteristic N-metil-lizina, care apare
în cursul sintezei flagelului, prin modificarea structurii chimice a lizinei, după
încorporarea acesteia în proteina flagelară.
Motilitatea cililor are la bază eliberarea de legături macroergice prin
descompunerea ATP → ADP + radical fosforic (acceptor de radical fosforic este
molecula de arginină).
Cilii se evidenţiază la microscopul optic numai pe fond întunecat sau după coloraţii
speciale (precedate de tehnici de tratare pentru precipitarea proteinelor flagelare şi
mordansare). Structura intimă a cililor bacterieni este furnizată de microscopia
electronică. Astfel a fost descrisă existenţa a trei componente morfologic distincte: corpul
bazal, cârligul şi filamentul terminal (figura 4).

- Corpul bazal (granulaţia bazală) reprezintă componenta cilului prin care acesta se
ataşează la corpul celulei bacteriene. Este o componentă structurală complexă, montată
în întregime în peretele celular şi membrana citoplasmatică. Este constituit din patru
discuri paralele, dispuse sub forma a două perechi pe o tijă care trece prin centrul lor.
 La bacteriile Gram negative există două perechi de discuri ce delimitează corpul
bazal: o pereche internă (inele M şi S) localizată în membrana citoplasmatică şi o
pereche externă situată spre cârlig (inele L şi P) în care discurile sunt mai distanţate.
Cele patru discuri au fost denumite M, S, P şi L după presupusa lor ataşare la nivelul
membranei citoplasmatice, spaţiului periplasmatic, stratului de peptidoglican şi respectiv
stratului lipopolizaharidic.
 La bacteriile Gram pozitive există o singură pereche de discuri ancorată în
membrana citoplasmatică.
La nivelul corpului bazal se află motorul ciliar, a cărui mişcare este transmisă
proteinei flagelare, ceea ce face ca cilul să se învârtească în sens orar (rostogolirea
bacteriei cu schimbarea direcţiei de mişcare) sau antiorar (deplasarea bacteriei în linie
dreaptă).
 Figura 4: Structura cililor (după George A. Wistreich, Max D. Lechtman 1988)
- cârligul cilului - un manşon îndoit în unghi drept;
- filamentul cilului - liber în afara celulei, cu lungime de 15-25 µ .
Cilii sunt organe de locomoţie pentru bacterii. Mobilitatea şi direcţia mişcării
cililor este asociată cu proprietatea de chemotaxie, care este o mişcare dirijată înspre
sau dinspre o substanţă chimică. Există o chemotaxie pozitivă care se referă la
mişcarea spre o concentraţie pozitivă a unei substanţe chimice (zaharuri, aminoacizi) şi
aceasta se întâlneşte în mod obişnuit când substanţa chimică reprezintă un avantaj pentru
celulă (substanţă nutritivă). Se vorbeşte şi de o chemotaxie negativă, o mişcare prin
care bacteria se depărtează de o substanţă chimică (fenolul, acizii, bazele), de obicei
când aceasta este dăunătoare, toxică pentru celulă. Stimulii chimici care induc
chemotaxia pozitivă sunt numiţi atractanţi, iar cei care induc chemotaxia negativă -
repelenţi.
Cilii sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante în identificarea bacteriilor
(exemplu Salmonella), stimulând un răspuns imun. În plus, pot îndeplini rolul de
receptori pentru virusuri şi în unele cazuri determină aderarea de epitelii (la vibrionul
holeric cilul intervine în aderarea de epiteliul intestinal).
În practica de rutină nu se evidenţiază flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin
examinarea lor pe un preparat nativ între lamă şi lamelă în care se urmăresc mişcările
bacteriilor, fie prin însămânţarea tulpinii pe un mediu semisolid prin înţeparea în
profunzime a mediului. Dacă bacteria creşte numai pe traseul de însămânţare este
imobilă, dacă difuzează în mediu, ea este mobilă.

2.1.2. FIMBRIILE (PILII)

Fimbriile sau pilii sunt prelungiri scurte, rigide şi groase evidenţiate mai ales la
speciile bacteriene Gram negative (speciile familiei Enterobacteriaceae, Neisseria
gonorrhoeae) şi mai puţin la bacteriile Gram pozitive (Streptococcus, Corynebacterium).
S-a constatat că în cadrul aceleaşi specii pot exista tulpini fimbriate şi tulpini nefimbriate.
Sunt elemente mai rezistente decât flagelii, în număr de 100-500/celulă, cu dispoziţie
peritrichă, cu evidenţiere numai prin microscopie electronică.
Din punct de vedere chimic sunt polimeri proteici de pileină care rezistă la tripsină,
pepsină, acizi, baze. Această natură proteică a pililor le conferă proprietăţi antigenice.
Funcţional, pilii se împart în două categorii:

- pili comuni sau pili de aderenţă (fimbri) a căror sinteză este controlată de gene
cromozomiale. Se găsesc în număr de 100-200 pe suprafaţa celulei şi au rol în aderarea
de diferite suprafeţe, în special epitelii, de unde şi denumirea de adezine, care iniţiază
procesul infecţios. Pilii comuni constituie un factor important de virulenţă (de exemplu
la gonococ). În afară de aderenţă, aceşti pili mai au şi proprietăţi antifagocitare.

- pilii “de sex” (sex pilii) sunt formaţiuni puţin mai lungi, flexibile, cu structură şi formă
diferită (sferică, formă de cupă, de disc), în număr de 1-4 pe celulă şi întotdeauna
codificaţi de formaţiunile genetice extracromozomiale - plasmide. Aceşti pili prezintă o
importanţă deosebită în transferul de material genetic între bacterii, formând punţi între
celula donatoare şi cea receptoare, în cursul procesului de conjugare. Sunt prezenţi mai
ales la bacteriile Gram negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas).
Ambele categorii de pili prezintă antigene specifice piliare şi pot fi receptori
pentru bacteriofagi.

2.1.3. CAPSULA
Unele microorganisme secretă la suprafaţă un înveliş extracelular ce înconjoară
peretele celular. În funcţie de structură şi de raporturile pe care le stabileşte cu celula
bacteriană, se poate vorbi de capsulă propriu-zisă, microcapsulă şi strat mucos
(glicocalix).

Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de
natură polizaharidică (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella, Haemophilus, Bordetella),
formând o reţea strânsă peste peretele celular (Streptococcus pneumoniae) sau având o
structură lamelară (Klebsiella). Mai rar, capsula poate fi de natură proteică (bacilul
cărbunos).
Rolul cel mai important al capsulei este legat de patogenitatea bacteriei (factor de
virulenţă): capsula împiedică fagocitarea bacteriilor care reuşesc, astfel, să scape de sub
acţiunea mecanismelor de apărare ale organismului. La speciile capsulate, pierderea
capsulei are ca rezultat pierderea virulenţei, fie direct, fie indirect prin efectul
chemotactic negativ al substanţelor pe care le conţine (exemplu: Streptococcus
pneumoniae, de tip S, capsulat, produce la şoarecele alb de laborator o septicemie
mortală, pe când varianta necapsulată nu este patogenă).
Capsula este o structură cu proprietăţi antigenice specifice care permit
diferenţierea unor serotipuri în cadrul speciei. Pe baza antigenului capsular se poate face
tipizarea bacteriilor (la Str. pneumoniae polizaharidul capsular determină peste 80 de
tipuri antigenice, iar la Haemophilus 6 tipuri antigenice).
Funcţiile capsulei:
 protejează bacteriile de diferiţi agenţi antibacterieni din mediu cum sunt:
bacteriofagii, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice;
 protejează bacteriile de acţiunea fagocitelor (factor de virulenţă);
 reprezintă sediul antigenelor capsulare, importante în identificarea acestor bacterii.

2.2. ELEMENTE INTRINSECI

2.2.1. NUCLEOIDUL (NUCLEUL) BACTERIAN
Materialul nuclear bacterian (nucleoidul) are o organizare primitivă în comparaţie
cu nucleul celulelor eucariote, în sensul că nu are membrană nucleară şi nici nucleoli,
aceasta fiind principala caracteristică structurală a celulelor procariote.
Din punct de vedere chimic ADN este constituit din baze azotate purinice
(adenină-A şi guanină-G), baze azotate pirimidinice (citozină-C şi timină-T), un zahar
(dezoxiriboză) şi acid fosforic. O bază azotată purinică sau pirimidinică legată de o
moleculă de dezoxiriboză şi de un radical fosforic reprezintă o unitate funcţională numită
nucleotid; nucleotidele, la rândul lor, sunt unite între ele prin componentele fosforice
formând un lanţ polinucleotidic (catenă). Structura dublu helicoidală a ADN (model
propus de Watson şi Crick în 1953) se realizează prin înfăşurarea a două lanţuri
polinucleotidice, orientate cu bazele spre interiorul structurii, astfel încât faţă în faţă să se
găsească întotdeauna fie adenina şi timina, fie citozina şi guanina. Structura spaţială astfel
formată se stabilizează prin două legături de hidrogen între timină şi adenină şi trei
legături de hidrogen între citozină şi guanină.
Funcţia nucleului bacterian constă în depozitarea informaţiei genetice necesară
autoreplicării precum şi pentru organizarea structurală şi funcţională a celulei bacteriene.
Constituie sediul eredităţii cromozomiale şi asigură toate caracterele specifice de specie
ale bacteriei respective.

- Autoreplicarea ADN (diviziunea nucleului) precede diviziunea celulară şi este de tip

semiconservativ, adică fiecare moleculă de ADN nou formată conţine un lanţ
polinucleotidic din molecula de ADN parentală şi un lanţ polinucleotidic nou sintetizat.
Nucleul are rol esenţial în multiplicarea bacteriilor. Diviziunea nucleului începe printr-
un clivaj longitudinal al cromozomului, catalizat de ADN-polimerază şi urmat apoi de
resinteza catenei complementare. În celulă apar două lanţuri bicatenare (identice între ele
şi identice cu parentalul) care se separă şi migrează spre polii celulei (împreună cu
mezozomii care s-au dedublat concomitent cu nucleul). Apare peretele despărţitor, iar
cele două celule se separă. În acest fel se transmit toate caracterele de specie la
descendenţi.

- Heteroreplicarea (sinteza proteinelor proprii bacteriei). Nucleul dirijează această

sinteză pe baza informaţiei conţinută în ADN. Informaţia genetică este transmisă de la
molecula de ADN la ribozomi prin intermediul ARN mesager (ARNm) sau
informaţional (prima transcripţie). Sinteza de ARNm (lanţ unic de nucleotide, fiecare
nucleotid având în structură riboză, o bază azotată - guanina, citozina, adenină sau uracil-
şi o moleculă de acid fosforic) este catalizată de ARN-polimerază pe modelul constituit
de unul din lanţurile ADN. Moleculele de ARNm migrează apoi în citoplasmă la sediile
de sinteză a proteinelor reprezentate de ribozomi, unde vor servi ca tipar sau matriţă
pentru asamblarea acizilor aminaţi în lanţuri polipeptidice (a doua transcripţie).
Aminoacizii de structură activaţi enzimatic sunt transportaţi din citoplasmă la ribozomi
de molecule de ARN de transport sau solubil (ARNt) specifice fiecărui aminoacid.
În afară de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare
mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide şi care se replică
independent de cromozomul bacterian.

2.2.2. CITOPLASMA
Situată între materialul nuclear şi faţa internă a membranei citoplasmatice,
citoplasma este un sistem coloidal complex alcătuit din aproximativ 80% apă, în care se
găseşte o cantitate mare de molecule organice mici (rezultate ale metabolismului
bacterian), ioni anorganici, enzime şi acizi ribonucleici (ARN ribozomal, ARN de
transport, ARN mesager). În funcţie de specie, în citoplasma bacteriilor se mai pot găsi:
plasmide, vacuole şi incluzii. Este necompartimentată fiind lipsită de unele organite
celulare prezente la celulele eucariote, cum sunt reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi,
mitocondriile.

a. Ribozomii
Principalele elemente ale citoplasmei, sunt structuri sferice, mai mici decât
ribozomii celulelor eucariote, şi reprezintă sediul sintezelor proteice din celulă.
Au constanta de sedimentare de 70S (compleţi), ce se menţine stabilă în prezenţa
unei anumite concentraţii de Mg2+ şi K+ din citoplasmă. În absenţa ionilor de Mg2+ are loc
disocierea ribozomilor în subunităţi de 50S şi 30S (incompleţi), subunităţi care reprezintă
ţintă pentru acţiunea unor antibiotice (streptomicină, eritromicină, cloramfenicol).
Din punct de vedere chimic sunt alcătuiţi din 60% ARN şi 40% proteine. O parte de
ribozomi se asociază formând polizomi (mai ales în timpul sintezelor proteice), alţii sunt
liberi, iar o a treia categorie se ataşează mezozomilor sau membranei citoplasmatice.
La nivelul ribozomilor sunt sintetizate toate enzimele necesare metabolismului
care caracterizează fiziologia bacteriei.

b. Mezozomii
Sunt structuri membranare care se formează prin invaginarea membranei
citoplasmatice sub formă de buzunar sau în deget de mănuşă, prezente la bacteriile
Gram pozitive şi ocazional la cele Gram negative. Ei formează în citoplasmă cavităţi
deschise spre spaţiul periplasmic (spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi peretele
celular) şi sunt în contact direct cu materialul nuclear. Au o organizare mai complexă la
bacteriile Gram pozitive şi sunt mai rudimentari la bacteriile Gram negative.
Funcţiile mezozomilor
 participă la replicarea cromozomului bacterian şi diviziunea celulară;
 sediul unor enzime hidrolitice care îndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la
celulele eucariote;
 sinteza şi secreţia unor exoenzime (penicilinaza sau cefalosporinaza);
 participă la reacţiile de fosforilare oxidativă şi oxidoreducere (minor).

c. Plasmidele
Organite specifice celulei procariote, reprezintă unităţi genetice
extracromozomiale prezente numai la unii indivizi bacterieni (se pot transfera de la un
individ bacterian la altul). Sunt molecule circulare de ADN, mici, capabile să se replice
independent de cromozomul bacterian şi care sunt responsabile de ereditatea
extracromozomială (rol în transmiterea unor caractere cum este rezistenţa la antibiotice).

d. Incluziile granulare (depozite de substanţe de rezervă)

Descrise la unele specii bacteriene, sunt formaţiuni structurale inerte, temporare,
de diferite dimensiuni, variind în funcţie de specia bacteriană şi condiţiile de mediu.
Compoziţia lor chimică este diferită, ele putând fi de:
- glicogen (la specii din familia Enterobacteriaceae);
- asemănătoare amidonului (la unii bacili aerobi sporulaţi - genul Clostridium);
- lipide (la genul Bacillus);
- polimetafosfaţi (sau incluziile de volutină descrise de Babeş şi Ernst la bacilii
difterici), etc.
Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene şi
reprezintă un material de rezervă care poate fi folosit ca sursă de energie.

e. Vacuolele
Vacuolele, alte organite intracitoplasmatice, sunt formaţiuni sferice, care conţin
substanţe lichide sau gazoase, înconjurate de un înveliş lipoproteic unistratificat.

f. Oxizomii
Reprezintă sediul enzimelor de oxidoreducere. Sunt organite specifice celulei
procariote. În oxizomi se găsesc citocromii, citocromoxidaza, flavin-enzima etc., iar în
oxizomi şi materialul solubil se găsesc şi enzimele ciclului Krebs: SDH (se găseşte în
cantitate crescută în oxizomi şi în cantitate scăzută în materialul solubil); malic-DH (se
găseşte în cantităţi egale, atât în oxizomi, cât şi în materialul solubil); aconitază,
izocitric-DH, α -Ketoglutaric-DH (se găsesc în cantităţi scăzute în oxizomi şi în cantităţi
crescute în materialul solubil).

2.2.3. MEMBRANA CITOPLASMATICĂ

Apare ca un strat foarte subţire care înconjoară citoplasma şi este foarte aderentă
de peretele celular. Este o membrană fină (6,5-7nm), elastică, lipsită de rezistenţă
mecanică, reprezentând zona unde se produc fenomenele de permeabilitate osmotică şi
selectivă (membrană “semipermeabilă”).
Pe secţiune, membrana apare trilaminată, având drept compoziţie chimică două
straturi fosfolipidice dispuse cu părţile hidrofobe faţă în faţă. Printre moleculele
fosfolipidice se găsesc molecule proteice (grupări polare, permeaze-translocaze), situate
fie la nivelul unuia dintre cele două straturi fosfolipidice, fie le traversează fiind expuse la
ambele feţe ale membranei.
Funcţional, membrana îndeplineşte următoarele roluri:
 este o membrană semipermeabilă, care reglează schimburile ce au loc între celula
bacteriană şi mediul extern, atât prin procese active specifice, cât şi prin procese de
difuziune pasivă;
 secretă numeroase enzime hidrolitice ce se eliberează în mediul înconjurător unde
scindează macromoleculele în molecule mai mici, ce pot fi transportate în interiorul
celulei;
 participare la sisteme chemotactice: la nivelul membranei sunt prezenţi receptori
asupra cărora acţionează stimulii chimici din mediu cu rol de atracţie (atractanţi) sau de
respingere (repelenţi);
 îndeplineşte funcţia bioenergetică, de eliberare a energiei prin fosforilare oxidativă.
În membrană este structurat lanţul respirator şi unele enzime din ciclul Krebs
(dehidrogenaze), membrana procariotă preluând funcţia mitocondriilor din celula
eucariotă;
 participă activ la creşterea şi diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului
bacterian;
 reprezintă structura celulară ţintă pentru detergenţi care, utilizaţi ca substanţe
dezinfectante alterează structura acesteia, sau pentru unele antibiotice care interferează
cu funcţia biosintetică a membranei (polimixinele).

2.2.4. PERETELE CELULAR

Peretele celular este o structură unică pentru bacterii, responsabilă de forma şi
rigiditatea celulei (participă minor la osmoză), localizată la exteriorul membranei
citoplasmatice şi prezentă la toate bacteriile, cu excepţia reprezentanţilor genului
Mycoplasma şi Archaebacteriilor. Peretele este format dintr-un strat bazal, asemănător la
toate bacteriile şi un strat al structurilor superficiale, foarte diferenţiat, în funcţie de care
bacteriile manifestă caractere tinctoriale diferite: bacterii Gram pozitive, Gram negative
şi acido-alcoolorezistente.

Structura stratului bazal

Reţeaua de peptidoglican (mureina) este structura chimică responsabilă de
rigiditatea peretelui celular şi care asigură forma şi rezistenţa mecanică a bacteriei.
Reţeaua de peptidoglican, prezentă la toate bacteriile, este formată din 3 porţiuni (figura
5):

- “Scheletul de bază” alcătuit din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-

glucozamină (N-Ac-Glc) şi acid N-acetil-muramic (N-Ac-Mur);

D-ALA

N-Ac-Glc  N-Ac-Mur  N-Ac-Glc  N-Ac-Mur

L-ALA (GLY) 5

D-GLU

L-LYS
 
D-ALA

N-Ac-Glc  N-Ac-Mur  N-Ac-Glc  N-Ac-Mur

L-ALA (GLY) 5

D-GLU

L-LYS

D-ALA
(GLY) 5

Figura 5: Reţeaua de peptidoglican (după C. Voiculescu, 1996)

- Componenta peptidică formată din punţi tetrapeptidice identice, transversale, între

unităţile de N-Ac-Mur a două lanţuri vecine. Structura acestor punţi diferă la bacteriile
Gram pozitive de cele Gram negative şi chiar de la specie la specie. În această structură
intră D şi L aminoacizi: L-alanina, D-glutamină, L-lizină (sau diaminopimelic la
bacteriile Gram negative), D-alanină. Această componentă se sintetizează iniţial ca un
pentapeptid, dar într-un peptidoglican complet se găseşte sub formă de tetrapeptid
deoarece ultimul aminoacid, D-alanina, este înlăturat când un lanţ peptidic se leagă de un
altul vecin;

- Punţi “încrucişate” de pentaglicină (între poziţia 4 şi 3 a două punţi tetrapeptidice

vecine) la bacteriile Gram pozitive. La bacteriile Gram negative, tetrapeptidele se leagă
între ele printr-o simplă legătură peptidică.

Structura stratului structurilor speciale

Se deosebesc trei tipuri de structuri speciale: Gram pozitiv, Gram negativ şi acido-
alcoolorezistent.

a. Bacterii Gram pozitive (caracteristici particulare)

Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este relativ mai gros, dar cu o
compoziţie mai simplă. Peptidoglicanul reprezintă 50-90% din greutatea uscată a
peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm şi conţine până la 200 de lanţuri paralele de
mureină, legate tridimensional pentru a forma o reţea groasă. Stratul structurilor speciale
este redus şi alcătuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul
ribitoltheicoic şi gliceroltheicoic. Aceştia pot pătrunde până la membrana citoplasmatică
(acizii theicoici cu glicerol) legându-se covalent de aceasta - acizii theicoici de membrană
sau numai până la perete - acizii theicoici de perete (acizi theicoici cu ribitol). Acizii
theicoici intervin în special în creşterea şi diviziunea celulei. Ei reprezintă determinanţi
antigenici majori care stau la baza identificării serologice a unor bacterii, fiind substanţe
care, pătrunse în organism, induc un răspuns specific din partea sistemului imun al
organismului.
De asemenea, la unele specii, se evidenţiază şi prezenţa de polizaharide: polimeri
de manoză, arabinoză, galactoză, glucozamină şi polimeri de zaharuri “acide” (acid
glucuronic, acid manuronic).
Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este sensibil la acţiunea lizozimului
(enzimă hidrolitică prezentă în lacrimi, mucus, salivă) care rupe legăturile dintre acidul
N-acetil muramic şi N-acetilglucozamină, autolizinelor bacteriene (enzime muralitice)
care intervin în diviziunea celulei bacteriene, penicilinei care inhibă sinteza
peptidoglicanului.

b. Bacterii Gram negative (caracteristici particulare)

Peretele este mai subţire dar mult mai complex structurat, multistratificat.
Peptidoglicanul are o grosime de 4-5 nm, reprezentând numai 10% din greutatea uscată a
bacteriei. Stratul superficial este însă mult mai complex decât la bacteriile Gram pozitive,
alcătuit din spaţiul periplasmic, membrană externă şi lipopolizaharidul de perete (LPS).
Principalele diferenţe structurale ale peretelui celular bacterian la bacteriile Gram
pozitive şi Gram negative sunt prezentate în figura 6.

Figura 6: Diferenţele structurale ale peretelui celular la bacteriile Gram pozitive şi

Gram negative (după Murray, Drew, Kobayashi, Thompson, 1990)

Spaţiul periplasmic
Este un compartiment cu funcţie de stocare ce se întinde de la membrana citoplasmatică
până la membrana externă. Lărgimea spaţiului periplasmic este variabilă, depinzând de:
starea fiziologică a celulei; condiţiile de cultivare.
El conţine peptidoglicanul şi un gel care favorizează nutriţia bacteriei prin conţinutul în
enzime degradative (fosfataze, nucleaze, proteaze). Tot aici sunt prezente enzimele de
inactivare ale unor antibiotice (betalactamaze, cefalosporinaze). Enzimele stocate la
nivelul spaţiului periplasmic sunt eliberate prin membrana externă în funcţie de necesităţi
şi aceasta este una din explicaţiile marii capacităţi de adaptare la mediu a bacteriilor
Gram negative spre deosebire de cele Gram pozitive care, neavând membrană externă,
eliberează enzimele imediat ce sunt sintetizate.

Membrana externă
Este asemănătoare ca structură cu membrana citoplasmatică fiind formată dintr-un
strat dublu de fosfolipide în care sunt inclavate proteine de o diversitate foarte mare:
unele dintre acestea străbat membrana şi pot ajunge până la peptidoglican, altele sunt
ataşate pe faţa internă sau externă a membranei şi proemină în spaţiu sau la suprafaţă, iar
altele sunt libere (figurile 7 şi 8).
În membrana externă există proteine majore (porine, non porine) şi proteine
minore. Porinele sunt cele care penetrează ambele feţe ale membranei externe şi
formează pori sau canalicule, prin care difuzează spre interiorul celulei molecule cu
greutate moleculară până la 600 D. Substanţele nutritive ajung din exteriorul celulei până
la spaţiul periplasmic, unde se petrec evenimente metabolice de degradare în substanţe ce
pot fi transportate prin membrana citoplasmatică în interiorul celulei. A doua categorie de
proteine majore, non porinele, sunt fie receptori pentru pili sexuali, fie enzime care
reglează sinteza capsulei bacteriene. Proteinele minore funcţionează ca transportori
transmembranari specifici pentru moleculele mici (ionii Fe3+, vitamine).

Figura 7: Peretele celular la bacteriile Gram negative (după Murray, Drew,

Kobayashi, Thompson 1990)

 Lipopolizaharidul de perete (LPS)

Deasupra membranei externe a bacililor Gram negativi se află lipopolizaharidul de
perete (LPS) sau endotoxina bacililor Gram negativi. LPS este o toxină termolabilă care
se eliberează în mediul înconjurător numai după liza acestor bacterii, fiind foarte
reactivă în organismul gazdă.
În structura lipopolizaharidului intră: lipidul A, miezul sau “core” şi unităţi
monozaharidice repetitive.
- lipidul A cu o structură particulară, responsabil de toxicitate: produce febră,
activează mecanismele apărării antiinfecţioase şi, în exces, produce şocul endotoxic cu
evoluţie gravă, chiar fatală;

- miezul sau “core” (polizaharid), numit şi antigen R, comun tuturor bacteriilor Gram
negative;

- unităţi monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie şi tip şi

constituie antigenul O al bacteriilor Gram negative (figura 8).

Figura 8: Peretele celular la bacteriile Gram negative (după Murray, Drew, Kobayashi,
Thompson, 1990)

c. Bacteriile acido-alcoolo rezistente

Dintre aceste bacterii, bacilul tuberculos şi bacilul leprei, reprezentanţi ai genului
Mycobacterium, sunt de interes medical. Aceste bacterii au peretele celular asemănător
cu cel al bacteriilor Gram pozitive. Structurile speciale conţin lipide până la 30%,
aproape jumătate din acestea fiind reprezentate de acidul micolic şi o ceară ce conferă
acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite şi rezistenţă crescută la factorii de mediu.
Astfel dacă, după o încălzire de scurtă durată ce topeşte cerurile, un colorant pătrunde în
celula bacteriană, decolorarea acesteia sub acţiunea acizilor sau alcoolilor nu se mai
produce ca la alte bacterii. Acest caracter se numeşte acido-alcoolorezistenţă. Aceste
bacterii se colorează foarte slab în coloraţia Gram, evidenţierea lor făcându-se la cald prin
tehnica Ziehl-Neelsen.

d. Bacterii cu perete alterat sau formele L

 Sunt bacterii cu stratul bazal viciat sub acţiunea unor factori din mediu ca, de

exemplu, lizozimul, care lizează peptidoglicanul, şi penicilina care împiedică sinteza

acestuia.

e. Bacterii fără perete celular

Există bacterii lipsite în mod natural de perete celular, care nu pot avea o formă

constantă, forma lor fiind variabilă în funcţie de mediul în care se află. Exemplu:

Mycoplasma (cu formă cocoidală, de pară, alungită sau filamentoasă).

Funcţiile peretelui celular:

 asigură forma, rezistenţa mecanică şi osmotică a bacteriei;
 participă la diviziunea celulei şi în creşterea acesteia, urmând membrana
citoplasmatică în formarea septurilor transversale care separă celula mamă în celule
fiice; protoplaştii şi sferoplaştii, lipsite de perete celular, nu se divid;
 stochează unele enzime în spaţiul periplasmic la bacteriile Gram negative ce vor fi
eliberate după necesităţi;
 prezintă receptori pentru bacteriofagi (virusuri care parazitează bacteriile) prin
proteinele de membrană externă, iniţiind infecţia virală a celulei bacteriene;
 este sediul antigenelor de suprafaţă, fiind deci implicat în răspunsul imun al
macroorganismului;
 este sediul unor factori de patogenitate;
 are rol în procesul de sporulare;
 reprezintă ţinta de acţiune pentru unele antibiotice şi detergenţi;
 prin structura diferită separă cele două categorii de bacterii în coloraţia Gram (Gram
pozitive şi Gram negative) sau conferă caracter de acidoalcoolorezistenţă.

3. SPORUL ŞI SPORULAREA
Unele bacterii se transformă în spori care apar endocelular şi care pot supravieţui
ani şi zeci de ani în condiţii nefavorabile de dezvoltare. Ei au o rezistenţă crescută la
factorii de mediu, la agenţii fizici (căldură, radiaţii), chimici (acizi, dezinfectanţi), chiar
şi la coloranţi (evidenţierea se face folosind coloraţii speciale). Există trei genuri de
bacterii Gram pozitive sporulate ce prezintă importanţă pentru bacteriologia medicală:
Clostridium şi Bacillus (bacili) şi Sporosarcina (coci).
Dintr-o bacterie vegetativă se formează un singur spor, care, în condiţii favorabile
de viaţă, va da naştere unei singure celule bacteriene cu toate proprietăţile ei iniţiale.
 Forma sporului poate fi rotundă sau ovală. Diametrul sporilor este mai mic la
bacilii sporulaţi aerobi nedepăşind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe când la genul
anaerob Clostridium, sporul are un diametru mai mare decât bacteria, producând
deformarea acesteia. Acest caracter al sporului este important în identificarea bacililor
Gram pozitivi anaerobi.

Poziţia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi centrală, ca la

Clostridiile gangrenei gazoase, subterminală la bacilul cărbunos (Bacillus anthracis),
sau terminală, ca la bacilul tetanic (Clostridium tetani).
În coloraţiile obişnuite sporul apare ca o zonă incoloră în corpul bacterian. El se
evidenţiază însă prin coloraţii speciale, la cald, care permeabilizează învelişurile sporale
(coloraţia Moller). Pe preparatele native între lamă şi lamelă efectuate din culturi, sporii
apar ca nişte formaţiuni rotunde, refringente.
Ultrastructura şi compoziţia chimică a sporilor asigură acestora o mare rezistenţă
la factorii nocivi, ce poate fi explicată atât prin starea de deshidratare (apă 40-50%, faţă
de 80-98% la formele vegatative) care anulează schimburile cu mediul extern şi scade
sensibilitatea la căldură, cât şi de numeroasele sale învelişuri protectoare.
SPORULAREA SAU SPOROGENEZA
Este un proces complex, guvernat de aproximativ 200 de gene din celula
bacteriană, gene care sunt activate în condiţii nefavorabile de mediu, altfel aceste gene
sunt represate. Sporularea presupune formarea unor structuri noi şi dispariţia altor
structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei.
Din punct de vedere morfologic, sporularea începe prin migrarea cromozomului
într-o zonă a celulei (de regulă, polară). Urmează invaginarea membranei citoplasmatice
cu înglobarea cromozomului (ADN) într-un înveliş dublu (“prespor”). Se sintetizează
apoi peptidoglicanul (reţea subţire) pe partea interioară a stratului intern, urmată de
sinteza de peptidoglican (reţea groasă) între cele două straturi. Stratul extern se îngroaşe
şi el (conţine o proteină “keratin-like”). Continuă cu deshidratare, creşterea
concentraţiei de Ca++ şi liza restului formei vegetative.

STRUCTURA SPORULUI
Este diferită de la specie la alta dar organizarea generală se aseamănă. De la interior
spre exterior, sporul este format din:
 core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear înconjurat de membrana
citoplasmatică. Aici este depozitat ADN (genomul complet), unele enzime respiratorii
(citocromi, flavoproteine) şi o substanţă care are rol în rezistenţa sporului la căldură -
dipicolinatul de calciu (singura evidenţiere în natură);
 peretele sporal (cortexul intern), format din peptidoglican şi care este peretele
celular primordial;
 cortexul sporal (membrana externă), care este stratul cel mai gros al sporului,
transparent şi care conţine un peptidoglican cu o structură particulară, mai lax, foarte
sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie în transformarea sporului
în forma vegetativă;
 tunica proteică formată din proteine chitinoase cu numeroase legături disulfitice.
Ea este impermeabilă, fiind responsabilă de rezistenţa sporilor la unele dezinfectante;
 exosporiumul este prezent numai la unii spori şi conţine lipoproteine şi zaharide.

GERMINAREA SPORULUI
În condiţii de mediu favorabile (umiditate, Mg++, temperatura 35°-40°C),
sporul germinează şi va da naştere unei bacterii vegetative identice cu aceea în care
s-a format. Germinarea are loc în trei etape: activarea sporului, iniţierea şi
dezvoltarea sporului.
- Activarea sporului se produce când acesta întâlneşte condiţii favorabile de
viaţă, dar şi un factor mecanic sau chimic care să lezeze învelişul sporal (lizozimul).
- Iniţierea este declanşată de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori
triggerul este L-alanina, iar pentru alţii adenozina, glucoza. Acesta duce la activarea
unei enzime autolitice care degradează cortexul sporal. Are loc absorbţia de apă,
eliberarea dipicolinatului de calciu şi degradarea unor compuşi sporali.
- Dezvoltarea sporului: protoplastul sporal se transformă în bacterie
vegetativă, care trece printr-o perioadă metabolic activă de refacere a
constituenţilor celulari normali şi a echipamentului enzimatic complet.

4. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENE

Făcând abstracţie de formele de transfer „sexuat” de material genetic (conjugarea),
regula generală a diviziunii celulei bacteriene este fisiunea binară - diviziune directă -
sciziparitate, având drept rezultat apariţia a două celule fiice de dimensiuni egale, cu
material genetic identic.
Diviziunea celulei bacteriene cuprinde 2 faze: septarea şi separarea; diviziunea
nucleară.

Septarea şi separarea
La microscopul electronic, se poate observa că diviziunea începe cu invaginarea
membranei citoplasmatice, în asociere cu mezozomul (adeseori la nivelul acestuia).
Astfel se produce un sept transversal complet, mai gros decât peretele celular.
- La bacteriile Gram pozitive noul perete se sintetizează în zona ecuatorială a celulei

mamă. Separarea are loc prin formarea unui perete despărţitor de la periferie spre interior,

ca un diafragm care se închide treptat, clivajul celor două celule având loc, cel mai

adesea, după una-două generaţii, formând lanţuri, grămezi.

- La bacteriile Gram negative, sinteza noului perete este mai difuză, în diferite zone ale

vechiului perete celular, cu strangulare treptată a citoplasmei şi separare imediată.

Diviziunea nucleară

Segregarea cromozomului bacterian implică mai multe secvenţe:

 ataşarea inelului cromozomial pe mezozom, totdeauna cu o zonă de pe molecula de

ADN cromozomial denumită „replicator”;
 separarea celor două lanţuri ale moleculei de ADN cromozomial cu răsucirea lor în
dublu sens, cu îndepărtarea consecutivă a acestor în spaţiu, unul faţă de celălalt, având
mezozomul ca punct de sprijin “pivot”;
 diviziunea mezozomului în lungul axului său;
 apariţia celor două celule fiice, având fiecare cate un lanţ ADN parental, ancorat de
mezozomul propriu;
 formarea în fiecare celulă fiică a câte un nou lanţ ADN, complementar (folosind ca
matrice lanţul ADN parental).
În felul acesta, fiecare din cele două celule fiice rezultate din diviziune va purta de
regulă material genetic identic cu cel cuprins în cromozomul celulei parentale - ½ din
ADN-ul celulei parentale - (model de diviziune „semiconservativ”).

METABOLISM BACTERIAN
Definiţie: totalitatea reacţiilor biochimice care au loc în celula bacteriană, precum
şi cele determinate de microorganism în mediul înconjurător. Scop final: creşterea şi
multiplicarea bacteriei.
Cuprinde:
1. Reacţiile catabolice: prin aceste reacţii substratul nutritiv se fragmentează în unităţi
componente, cu eliberare de energie;
2. Reacţiile metabolice intermediare: prin care energia rezultată din primele reacţii este
înmagazinată în compuşi macroergici;
3. Reacţii anabolice: reacţii prin care celula bacteriană îşi sintetizează substanţele
proprii, cu consum energetic.
Observaţie: Toate aceste reacţii sunt catalizate de enzime a căror activitate este controlată
genetic, astfel încât intensitatea lor să fie cât mai eficient adaptată condiţiilor în care
bacteria creşte şi se înmulţeşte.

1. REACŢIILE CATABOLICE (METABOLISM ENERGETIC)

Se desfăşoară în 4 faze: descompunerea extracelulară a substanţelor organice,
absorbţia substanţelor, pregătirea subtanţelor pentru oxidare şi oxidarea substanţelor.

1.1. Descompunerea extracelulară a substanţelor organice în unităţi mai mici sub

acţiunea unor exoenzime. La bacteriile care au ca habitat omul substanţele din mediul
ambiant pot fi: proteine, acizi nucleici, colagen, lipide, mucopolizaharide, pentru
descompunerea cărora bacteriile secretă exoenzime hidrolitice, care pot fi în acelaşi timp
şi factori de patogenitate.

1.2. Absorbţia substanţelor din mediul extern, care se desfăşoară prin intermediul a 3
mecanisme:
 pasiv, în funcţie de concentraţia unei substanţe în interiorul şi exteriorul celulei (ex:
glicerolul);
 activ, prin procesul de fosfarilare a substanţei ce urmează a fi absorbită, cu consum
energetic (ex: glucoza, pentru a fi absorbită, trebuie transformată în glucozo-6-fosfat);
 activ, prin legarea substaţei de proteine transportoare (permeaze), cu consum
energetic. Astfel se absorb substanţe pe care celula bacteriană le depozitează în
concentraţii foarte mari faţă de concentraţia din mediu. Dacă celula bacteriană este
lipsită de o permează, cum este permeaza pentru lactoză, aceasta nu poate fi absorbită
nici dacă bacteria, complet lipsită de lactoză, se află într-o soluţie cu conţinut foarte mare
de lactoză.
O menţiune specială trebuie făcută pentru fier (Fe), necesar bacteriilor în
multiplicare. În ţesuturi Fe nu se găseşte în stare liberă, ci legat de proteine (transferina,
siderofilina). Bacteriile au dezvoltat mecanisme ingenioase de absorbţie a Fe prin
secreţia sideroforilor, substanţe chelatoare de Fe, care scot Fe din combinaţiile sale,
făcându-l absorbabil.

1.3. Pregătirea subtanţelor pentru oxidare se face prin reacţii de decarboxilare,

dezaminare, fosforilare.

1.4. Oxidarea substanţelor se face cu eliberare de energie; are loc cu pierdere de

electroni (ioni de H2). Substanţa care se va oxida se numeşte donor, iar substanţa care se
reduce se numeşte acceptor de H2. În urma oxidării rezultă o substanţă oxidată, o
subtanţă redusă şi o anumită cantitate de energie (substanţă energogenetică: glucoza).
În funcţie de acceptorul final de H2 există 3 tipuri de oxidaţie:
 respiraţia bacteriană este procesul în care acceptorul final de H2 este O2 atmosferic;
donorul este o substanţă organică; transferul de electroni este efectuat prin lanţul
respirator;
 fermentaţia bacteriană constă în procese de oxidare parţială a substratului, donorul
şi acceptorul final de H2 fiind o substanţă organică;
 respiraţia anaerobă este procesul în care donorul este o substanţă organică, iar
acceptorul final de H2 este O2 prezent într-o sare anorgranică (nitrat sau sulfat) care se
va reduce;
Observaţie: termenul de respiraţie anaerobă folosit de bacteriologi se referă la fermentaţia
în absenţa O2.

1.4.1. RESPIRAŢIA BACTERIANĂ

Pentru bacteriile aerobe este legată de sistemul membranar al bacteriilor
(membrana citoplasmică, mezozomi). Cantitatea de energie eliberată este mai mare decât
cea eliberată prin fermentaţie, deoarece oxidării de substrat îi urmează oxidaţia de
transfer, în care electronii sunt transportaţi pe lanţul respirator până la acceptorul final de
hidrogen (oxigenul atmosferic) şi fosforilarea oxidativă. Astfel, la degradarea completă a
unei molecule de glucoză bacteriile obţin 38 molecule de ATP.
Lanţul respirator sau lanţul transportorilor de electroni are în componenţă
citocromi, flavoproteine, ubichinone.
 Citocromii reprezintă transportori de electroni, aparţinând unui grup conţinând fier
(hem). Atomul central al citocromilor este fierul ce poate trece din stare oxidată (Fe3+)
în stare redusă (Fe2+). Conţinutul bacteriilor în citocromi diferă în funcţie de specie şi
condiţiile de creştere.
 Flavoproteinele reprezintă proteine ce conţin o coenzimă derivată din riboflavină
(B2). Exemplu: FAD (flavinadenindinucleotid).
 Quinonele reprezintă substanţe neproteice cu funcţie de transport a proteinelor în
sistemul transportor de electroni. Exemplu: proteine cu fier şi sulf (cu 2, 4, 8 atomi de
sulf instabil).

1.4.2. FERMENTAŢIA BACTERIANĂ foloseşte compuşi organici ca donori şi

acceptori de electroni. Ea se produce pe următoarele căi metabolice:

 Glicoliza Embden-Meyerhof, în care dintr-o moleculă de glucoză rezultă 2 molecule

de acid piruvic şi 2 molecule de ATP.

 Fermentaţia secundară a acidului piruvic (figura 6), care poate fi:

NAD → NADH

ACID PIRUVIC ……………….…… ACID LACTIC

# lactică:

Exemple: bacilii lactici şi unii streptococi din intestin.

# alcoolică:
ACID PIRUVIC …………..…….. ACETALDEHIDĂ
NADH
NAD

ALCOOL ETILIC

Exemple: drojdii.

# acidă mixtă: NADH NAD

ACID PIRUVIC ACID LACTIC
CO2

ACID OXALACETIC ACETIL-CoA + ACID FORMIC

NADH NADH ADP + P

NAD NAD ATP
ACID SUCCINIC ALCOOL ETILIC ACID ACETIC H2 + CO2
 Exemple: Escherichia coli şi alte bacterii intestinale.

# butilen-glicolică:
NADH NAD
ACID PIRUVIC ACID ACETOLACTIC
CO2

2,3 - BUTILENGLICOL NAD NADH ACETONĂ

Exemple: Enterobacter, Bacillus.

# propionică:
ACID PIRUVIC ACID ACETIC
CO2

2 CO2 ACID OXALACETIC

(legaţi de enzime) NADH
NAD

ACID SUCCINIC

CoA
PROPIONIL-CoA

ACID 2-PROPIONIC

2-METIL-MALONIL-CoA 2-SUCCINIL-CoA

CO2
Exemple:
ACIDULPropionibacterium,
PIRUVIC Veillonella (anaerobi nesporulaţi).
ACETIL-CoA
# butiric-butanolică:
CO 2

ACETONĂ ACETOACETIL-CoA ACID ACETIC

NADH NADH
NAD NAD

ISOPROPANOL CROTONIL-CoA ALCOOL ETILIC

NADH
NAD
BUTIRIL-CoA

ACID BUTIRIC BUTANOL

 Exemple: Clostridium.

Figura 6: Fermentaţia secundară a acidului piruvic (după V. Bîlbîie, 1984,1985)

 Căi alternative de metabolizare a glucozei: şuntul fosfaţilor şi calea Entner-

Doudoroff (pentru Pseudomonas).
Observaţie: Comparând cele două procese, fermentaţia şi fosforilarea prin transport de
electroni, se poate spune că fermentaţia este un proces primitiv de eliberare de energie,
întâlnit la bacteriile anaerobe care au apărut primele, în condiţiile în care atmosfera
pământului era lipsită de O2. După apariţia O2 s-au dezvoltat procesele fosforilării
oxidative.
În glicoliză, dintr-un mol de glucoză se sintetizează 2 moli de ATP, pe când prin
respiraţie, prin activitatea coordonată a glicolizei, ATC şi lanţului respirator, se
sintetizează 38 moli ATP.

1.4.3. RESPIRAŢIA BACTERIANĂ ANAEROBĂ

Foloseşte compuşi anorganici (nitriţi, nitraţi, sulfaţi) în transferul de electroni
prin lanţul respirator (aceştia se reduc), în absenţa O2 molecular. În cazul bacteriilor strict
anaerobe, O2 poate fi chiar toxic, datorită formării unui radical liber reactiv, denumit
″ superoxid″ .
Unele bacterii aerobe, ca bacilul piocianic, în absenţa oxigenului, pot obţine
energia necesară prin respiraţie anaerobă (de exemplu, respiraţia nitriţilor), proces numit
denitrificare.

2. REACŢII INTERMEDIARE
Sunt reacţiile în care energia rezultată în urma oxidării va fi transformată în
energie chimică sub formă de ATP şi tioesteri: Acetyl-CoA. Energia stocată va fi eliberată
la nevoie pentru amorsarea unor reacţii catabolice sau pentru sinteza unor molecule cu rol
structural sau funcţional.

3. REACŢII ANABOLICE
Sunt reacţii prin care celula bacteriană îşi sintetizează substanţe cu rol structural
(macromolecule) şi funcţional (enzime), din compuşi simpli, rezultaţi în timpul reacţiilor
catabolice sau intermediare şi cu consum energetic. La aceasta se adaugă sinteza unor
substanţe cu rol de rezervă energetică (incluzii de polizaharide şi lipide).
 Posibilitatea reacţiilor de biosinteză diferă de la o specie la alta. Astfel, unele
bacterii sunt capabile să sintetizeze toţi aminoacizii, nucleotidele, monozaharidele şi
coenzimele, din substanţe simple. Alte bacterii sunt lipsite de unele linii metabolice, fiind
dependente de aportul din exterior al substanţelor ce se sintetizeză pe aceste căi.
Bacteriile de interes medical se situează între cele două extreme.

Totalitatea proceselor prin care bacteria îşi procură, din mediul înconjurător,
substanţele necesare supravieţuirii, creşterii şi înmulţirii reprezintă nutriţia bacteriană.
Cu cât o specie bacteriană are mai multe necesităţi, cu atât ea este mai dependentă de
macroorganismul parazitat.
Pentru sinteza elementelor structurale propii şi a unor enzime de adaptare la
condiţiile mediului ambiant bacteriile necesită: surse de azot, surse de carbon, O2, fosfor,
ioni anorganici, factori de creştere.

După sursa de energie folosită în respiraţie bacteriile pot fi:

 bacterii fotosintetizante care utilizează ca sursă energetică lumina solară.
Pigmenţii fotosintetici din bacterii sunt denumiţi bacterioclorofilă a, b, c, d. Bacteriile
mai conţin şi diferiţi pigmenţi carotenoizi care determină colorarea coloniilor. Aceşti
carotenoizi absorb energia joasă, care este transferată moleculelor de bacterioclorofilă
pentru a fi folosită în fotosinteză.
 bacterii chimiosintetizante (majoritatea bacteriilor cunoscute) folosesc drept sursă
de energie substanţele chimice din mediul de creştere, şi anume substanţe anorganice:
amoniac, NO2, H2S.

După sursa de carbon, bacteriile se clasifică în:

 bacterii de tip autotrof: bacterii capabile să-şi sintetizeze toţi metaboliţii esenţiali,
plecând de la compuşi anorganici, sursa de carbon fiind CO2. Ele pot trăi independent
de materia organică, în mediul natural sau artificial de nutriţie. Ele sintetizează materie
organică din materie anorganică, contribuind esenţial la circuitul substanţelor în natură.
Aceste bacterii pot fi: sulfobacterii şi nitrobacterii, care la rândul lor pot fi nitrifiante
(nitrobacter) şi denitrifiante (anaerobe).
 bacterii de tip heterotrof: reprezintă majoritatea speciilor bacteriene (toate bacteriile
din patologia umană şi animală). Aceste bacterii necesită pentru biosintezele proprii atât
materie organică, cât şi anorganică. Bacteriile heterotrofe pot fi: fotoheterotrofe
(bacterii ce folosesc lumina ca sursă de energie şi componente organice ca sursă primară
de carbon) şi chimioheterotrofe (bacterii care obţin necesarul de carbon şi energie din
metabolismul unui singur compus organic).
 bacterii mixotrofe: bacterii care folosesc ca sursă de carbon atât substanţe organice,
cât şi CO2.

În ceea ce priveşte sursa de azot: azotul reprezintă aproximativ 10% din greutatea
uscată a bacteriilor. Majoritetea bacteriilor obţin preferenţial azotul din săruri de amoniu
(Escherichia coli, Salmonella). Alternativ, poate fi utilizat azotul organic (aminoacizi sau
polipeptide) sau, de către un număr limitat de bacterii, azotul atmosferic ori cel din
nitriţi. În toate aceste cazuri însă azotul este iniţial convertit la amoniac. Azotul organic
poate fi utilizat şi direct prin reacţii de transaminare.
 După sursa de carbon şi de azot pe care bacteriile le pot folosi bacteriile
heterotrofe pot fi :
 bacterii care folosesc carbon din surse organice şi azot molecular atmosferic. Din
această categorie fac parte specii aerobe (Azotobacterr) şi anaerobe (Clostridium);
 bacterii care folosesc carbon organic şi azot din combinaţii anorganice. Carbonul
este furnizat de glucide, alcooli, acizi graşi. Azotul rezută din amoniac, sărurile de
amoniu. Exemple: bacteriile saprofite din mediul extern, Escherichia coli nepatogen din
intestin.
 bacterii care folosesc atât azotul cât şi carbonul organic. În această categorie intră:
- bacterii saprofite din mediul extern, intestin, de pe suprafaţa mucoaselor;
- bacterii mai pretenţioase (frecvent patogene) care necesită factori de creştere, acid
nicotinic, substanţe complexe din lichide organice (ascită, sânge). Exemple: Brucella,
Haemophilus, Salmonella, Shigella.
- bacterii foarte pretenţioase: nu cultivă pe medii artificiale (exemplu: Treponema
pallidum) sau prezintă parazitism intracelular strict (Rickettsii, Mycoplasme,
Chlamydii).

După necesarul de oxigen bacteriile se clasifică în:

 bacterii strict aerobe: sunt bacterii care se dezvoltă numai în prezenţa O2
atmosferic, folosind exclusiv respiraţia aerobă (O2 atmosferic este folosit ca acceptor
final de H2). Exemple de astfel de bacterii: Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium
diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, etc.
 bacterii strict anaerobe: bacterii care nu se dezvoltă decât în absenţa O2, prezenţa
lui fiind foarte toxică chiar la o presiune de 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reacţie
energogenetică exclusiv fermentaţia în condiţii anaerobe, deci oxidaţia de substrat. Ele
sunt lipsite de superoxiddismutază care transformă radicalul superoxid în H2O2 şi
catalază, catalază care descompune apa oxigenată. Exemple: Clostridium, Bacteroides,
Fusobacterium.
 bacterii facultativ anaerobe: bacterii care se dezvoltă atât în prezenţa O2, cât şi în
absenţa sa. Ele folosesc respiraţia aerobă, fermentaţia, chiar şi respiraţia anaerobă.
Exemple: majoritatea speciilor de interes medical (enterobacteriile).
 bacterii anaerobe aerotolerante: bacterii care folosesc numai fermentaţia în
prezenţa aerului atmosferic, fără participarea O2. Ele tolerează O2 în mediu pentru că, fie
au în echipamentul enzimatic superoxiddismutază şi catalază, fie pentru că enzimele
există în mediu. Exemplu: germenii din genul Steptococcus.
 bacterii microaerofile: bacterii care folosesc respiraţia şi fermentaţia, la care se
adaugă o concentraţie mai mare de CO2 decât cea din atmosferă. Exemple: genul
Neisseria, Brucella, Campylobacter (necesită 6-10% CO2).

CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

CULTIVARE

1. DEFINIREA TERMENILOR
 Creşterea (în sensul termenului “growth” din limba engleza) reprezintă
augmentarea componentelor microorganismului (celulei bacteriene). De exemplu,
creşterea trecătoare a volumului celular, prin extinderea incluziilor lipidice, nu reprezintă
o “creştere” bacteriană în sensul definiţiei de mai sus.

Multiplicarea este un proces la nivel de populaţie bacteriană consecutiv creşterii,

constând din înmulţirea prin diviziune directă, în generaţii succesive, a indivizilor dintr-
o populaţie de bacterii.

Cultivarea se referă la toate fenomenele legate de creşterea şi multiplicarea

bacteriilor în afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a
unor condiţii cât mai aproape de cele naturale, adecvate necesităţilor metabolice ale
speciei respective.

Creşterea şi înmulţirea bacteriilor este rezultatul nutriţiei şi al metabolismului

bacterian.
Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare. S-a facut un calcul ipotetic din
care rezultă că, dacă la fiecare 20 de secunde are loc o diviziune, dintr-o celulă bacteriană
cultivată într-un mediu nelimitat ar lua naştere într-o zi 1x1021 celule, ceea ce ar
corespunde unei mase de 4.000 de tone. În realitate, o asemenea rată de înmulţire a
bacteriilor nu este posibilă, fiind impiedicată de epuizarea substanţelor nutritive şi a
factorilor de creştere, pe de o parte, şi de acumularea metaboliţilor toxici, pe de altă parte.

2. CONDIŢII DE CREŞTERE ŞI MULTIPLICARE LA BACTERII

Principalele condiţii de care depind creşterea şi multiplicarea bacteriilor, atât în
mediu natural, cât şi in vitro (cultură), sunt: suportul nutritiv, pH-ul, temperatura,
presiunea de oxigen, presiunea ionică, etc.

2.1. SUPORTUL NUTRITIV

Acesta este asigurat de: prezenţa donatorilor şi acceptorilor de hidrogen, surse de
carbon, surse de azot, prezenţa substanţelor minerale (sulf, fosfor, activatori enzimatici -
magneziu, fier, potasiu, calciu), factori de creştere (aminoacizi, purine şi pirimidine,
vitamine din grupul B, ca şi vitaminele A şi D, acizi graşi).
În ceea ce priveşte substanţele minerale necesare creşterii şi multiplicării
bacteriilor:
 fosforul din structura acizilor nucleici, a fosfolipidelor, a acizilor teichoici, a
nucleotidelor macroergice (ATP, GTP) sau coenzimele (NADP, flavine) este asimilat ca
ion fosfat;
 sulful din structura unor aminoacizi, a coenzimei A poate fi asimilat din surse variate:
compuşi organici, H2S, SO42-;
 K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ sunt activatori enzimatici; Fe2+ face parte din structura
citocromilor, a peroxidazelor; Mg2+ împreună cu K+ asigură funcţionalitatea ribozomolor;
Ca2+ intră în structura dipicolinatului de calciu din spori. Împreună cu Cl- şi Na+, aceşti
ioni sunt asimilaţi ca săruri minerale;
 micronutrienţii (Zn, Mn, Co, Cu) sunt asiguraţi în formă minerală prin apa de
robinet sau impurităţi ale altor ingrediente folosite pentru prepararea mediilor de cultură
sau chiar din sticlăria de laborator.

2.2. TEMPERATURA
Temperatura optimă de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. În
funcţie de această temperatură, bacteriile se împart în psihrofile, care se înmulţesc optim
la 200C dar şi sub această temperatură, mezofile, cu temperatura optimă cuprinsă între 20-
400C şi termofile, care se înmulţesc optim la peste 450C. Bacteriile mezofile sunt cele
patogene deoarece se înmulţesc la temperatura organismului, fiind denumite şi bacterii
“homeoterme”.

Bacterii Temperatura Temperatura Temperatura

minimă 0C optimă 0C maximă 0C
PŞ 0 15-20 30
IHROFIL
E
Mezofile 2-25 18-45 30-50
Termofile 25-45 Peste 55 60-100

Limitele de temperatură în care aceste bacterii pot să crească sunt însă mai mari şi
variază de la specie la specie. Astfel, gonococul şi meningococul nu suportă temperaturi
mai mari de 1-20C faţă de temperatura optimă, spre deosebire de enterobacterii, care cresc
în limite foarte largi.
Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicaţia practică a
acestui aspect fiind sterilizarea.
Temperaturile moderat scăzute, ca, de pildă, cea de + 40C din frigidere, nu distrug
bacteriile, dar opresc în general înmulţirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest
motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului
bacteriologic se păstrează în aceste condiţii. Totuşi, există tulpini microbiene care se
înmulţesc şi la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de
Pseudomonas aeruginosa, ce se înmulţesc la + 50C. Acest aspect trebuie luat în calcul de
către medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicaţia etiologică a unui germene într-o
infecţie se bazează pe criteriul numeric.
Congelarea. Dacă o suspensie bacteriană este supusă îngheţului la temperaturi nu
prea mici faţă de 00C, cristalizarea apei determină formarea unor spaţii ce conţin soluţii
concentrate de săruri care nu cristalizează decât la temperaturi mult mai joase (-200C
pentru NaCl de exemplu), când soluţiile devin saturate şi pot cristaliza. Aceste
concentraţii ridicate de săruri minerale, la care se adaugă cristalele de apă, vor leza
structurile bacteriene. Prin îngheţare nu vor fi omorâte toate celulele unei suspensii, dar
îngheţul şi dezgheţul repetat scad foarte mult numărul de bacterii viabile.
Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-100C) nu este
destul de scăzută pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optimă este cea
realizată de CO2 (-780C) sau de azotul lichid (-1800C). Conservarea bacteriilor, a
virusurilor prin congelare este favorizată de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid.
Aceşti agenţi chimici induc o solidificare amorfă, vitroasă care înlocuieşte solidificarea
prin cristalizare.

2.3. PH-UL
Bacteriile se pot dezvolta în limite largi de pH, cele patogene pentru om
dezvoltându-se optim la un pH de 7,2-7,4. Există şi excepţii ca, de pildă, bacteriile din
genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 şi vibrionul holeric la pH de 9,0. Lactobacilii,
prezenţi în flora vaginală normală se dezvoltă chiar şi la un pH de 3,9.
Unele bacterii modifică ele însăşi, prin procesele metabolice, pH-ul mediului.
Această modificare poate opri înmulţirea sau chiar distruge cultura. Din acest motiv,
multe medii au în compozitia lor soluţii tampon care menţin pH-ul în limite convenabile.
Modificarea de către o bacterie a pH-ul unui mediu poate avea valoare deosebită în
identificarea unui microb şi poate fi sezizată prin adaugarea în mediu a unui indicator de
pH. Foarte multe bacterii se identifică biochimic prin proprietatea lor de a fermenta
diferite zaharuri. Această capacitate se evidenţiază tocmai prin însămânţarea unei bacterii
pe mai multe medii ce conţin fiecare alt zahar şi un indicator de pH. În cazul fermentării,
acidifierea va determina schimbarea culorii mediului.

2.4. UMIDITATEA
Apa liberă este absolut necesară creşterii şi multiplicării microbilor. Necesarul de
apă variază în funcţie de specie. Astfel, datorită conţinutului sărac în apă a unor alimente
cum sunt gemul de fructe, pâinea, unele sorturi de caşcaval, arahidele, etc., multiplicarea
bacteriilor este practic imposibilă, în timp ce mucegaiurile se pot dezvolta foarte bine
chiar şi în aceste condiţii.
Pentru a aprecia umiditatea, se compară conţinutul în apă a vaporilor deasupra apei
curate, care se noteaza cu 1, cu conţinutul în vapori deasupra mediului de cultură.
Bacteriile de interes medical au nevoie de o umiditate de 0,98, pe când ciupercile cresc şi
la o umiditate de 0,80.
Prin liofilizare (desicare bruscă la - 780C), care este o metodă de conservare a
microbilor, se extrage practic întreaga apă liberă din celulele bacteriene, ceea ce are ca
urmare creşterea stabilităţii biopolimerilor şi încetarea metabolismului. Bacteriile
liofilizate se păstrează ani de zile.
2.5. CONCENTRAŢIA DE BIOXID DE CARBON
Cu toate că bacteriile de interes medical nu pot folosi bioxidul de carbon ca sursă
de carbon, acesta este absolut necesar reacţiilor de carboxilare în biosinteza unor
substanţe proprii celulei bacteriene (purine, aminoacizi, pirimidine etc.).
Necesarul de bioxid de carbon al bacteriilor este diferit. Astfel, unele specii
(Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae) sunt dependente de prezenţa lui în
concentraţii ridicate până la 10% în atmosfera în care se dezvoltă, pe când altele ca, de
exemplu, Staphilococcus aureus se dezvoltă în concentraţia obişnuită de bioxid de carbon
din atmosferă (0,003%), dar nu şi într-o atmosferă complet lipsită de bioxid de carbon.
Astăzi, incubarea produselor patologice din care se urmăreşte izolarea bacteriilor se
efectuează în termostate de CO2 (6%), deoarece dezvoltarea lor este superioară celei din
termostatele obişnuite.

2.6. ULTRASUNETELE
 Ultrasunetele, cu o anumită frecvenţă, sunt bactericide. Bacteriile şi virusurile sunt
distruse de ultrasunete într-un interval de o oră. Ultrasonarea microorganismelor se
foloseşte mai puţin pentru sterilizare, cât pentru a obţine diferite componente bacteriene
sau virale, cum sunt: enzime, perete celular, acizi nucleici bacterieni, în scopul cercetării
acestora.

2.7. PRESIUNEA HIDROSTATICĂ

Bacteriile obişnuite sunt rezistente la presiunea atmosferică. Formele vegetative
suferă alterări la 300 de atm şi sunt omorâte la 600 atm, presiune întâlnită în oceane la o
adâncime de 6000 m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce creşterea lor
filamentoasă scăzându-le capacitatea de diviziune.

2.8. PRESIUNEA OSMOTICĂ

Bacteriile se înmulţesc optim pe medii izotonice, rezistenţa lor la variaţiile
presiunii osmotice fiind incomparabil mai mare decât cea a celulelor organismelor
superioare. Această rezistenţă se datorează peretelui celular. Bacteriile din genul
Mollicutes, lipsite de acţiunea protectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la
variaţii mici ale presiunii osmotice.
Într-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasmă şi vor
muri. Acest fenomen se numeşte plasmoliză.
Dacă presiunea osmotică a mediului este foarte scăzută, apa va pătrunde în celulă,
care se va umfla devenind turgescentă. Moartea bacteriei se produce prin plasmoptiză.
Creşterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri stă la
baza conservării unor alimente.
Există însă bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile să se
înmulţească în soluţii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus şi Enterococcus).
Pe baza acestei proprietăţi se prepară unele medii de îmbogăţire şi selective aşa cum este
mediul hiperclorurat Chapmann pentru stafilococi. Acesta conţine 7,5g NaCl la 100 ml de
mediu, spre deosebire de mediile obişnuite care conţin doar 5g/l. Dintre bacteriile
osmofile menţionăm şi pe cele zaharofile, care sunt capabile să se înmulţească pe medii
cu un conţinut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important pentru unele
medicamente, ca de pildă, siropurile care, în ciuda conţinutului ridicat de zaharoză, se pot
altera în urma contaminării cu aceste bacterii.

2.9. ELECTRICITATEA
Electricitatea sub formă de curenţi galvanici, curenţi de joasă sau înaltă frecvenţă,
nu afectează bacteriile.
Dacă însă curentul electric este trecut printr-un mediu lichid, bacteriile pot fi
afectate sub acţiunea unor ioni sau produşi chimici rezultaţi în urma electrolizei.

2.10. RADIAŢIILE
2.10.1. Radiaţiile neionizate - razele ultraviolete (UV)
Puterea bactericidă a razelor luminoase devine perceptibilă la o lungime de undă
de 330nm, crescând pe măsura scăderii lungimii de undă a luminii UV. Timpul necesar
distrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanţa de sursa de emisie
şi mediul în care se găsesc microorganismele.
 Mecanismul bactericid al razelor UV constă în inducerea formării în celula
bacteriană a unor dimeri de timină care înterferează replicarea ADN. Alterările altor
elemente structurale bacteriene sunt neglijabile.

2.10.2. Radiaţiile ionizate

Mecanismul bactericid al acestor raze constă în formarea în celulă a unor radicali
cu viaţă scurtă şi protoni. Aceşti produşi vor altera bazele azotate şi legăturile dintre ele.
Efectul bactericid al razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbită,
temperatură, presiunea parţială a oxigenului, conţinutul în substanţe organice, prezenţa
unor substanţe protectoare (alcoolii alifatici sau substanţe bogate în grupări sulfhidrilice),
specia microorganismului şi conţinutul în apă.
Sporii sunt în general mai rezistenţi decât formele vegetative ale bacteriilor,
excepţie fiind o bacterie nesporulată, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistent
microorganism la radiaţii. El rezistă la doze de 200 de ori mai mari decât restul bacteriilor
datorită faptului că este echipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a
alterărilor acizilor nucleici.

3. CULTIVAREA BACTERIILOR
Aşa cum arătam mai sus, cultivarea reprezintă oferirea unor condiţii optime de
dezvoltare pentru anumite specii bacteriene în afara mediului extern sau a organismului,
adică în medii artificiale de cultură.
Din punct de vedere al posibilităţii cultivării microorganismelor bacteriene, se
disting: culturi bacteriene în mediu lichid şi culturi bacteriene în mediu solid.
Cunoaşterea necesităţilor nutritive ale bacteriilor este foarte importantă în
bacteriologia medicală, deoarece stă la baza preparării mediilor de cultură destinate
izolării diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice.
Cultivarea bacteriilor în scop diagnostic pune în esenţă două probleme:
 alegerea unui mediu de cultură optim, care să permită izolarea tuturor bacteriilor care
ar putea fi prezente în produsul de examinat;
 obţinerea bacteriilor în culturi pure, pentru a putea fi identificate.

3.1. CONDIŢII GENERALE PENTRU CULTIVAREA BACTERIILOR

Un mediu de cultură trebuie să conţină apă, substanţe organice, minerale,
oligoelemente şi factori de creştere. Pentru satisfacerea acestor necesităţi se utilizează
diferite substraturi biologice nutritive complexe care au în compoziţia lor aceste
îngrediente. Astfel:
- Peptonele, care se obţin prin hidroliză enzimatică sau acidă a proteinelor de origine
animală (de exemplu făina de oase). Ele nu au o compoziţie chimică foarte bine definită,
iar prin conţinutul în peptide şi aminoacizi constituie o sursă universală de azot, pentru
toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic în prepararea tuturor mediilor de cultură.
- Extractul de carne, ce se obţine prin deshidratarea decoctului de carne de vită.
Aceasta conţine cantităţi importante de creatinină, xantină, hipoxantină, acid uric, acid
adenilic, glicol, uree, glutamină ca sursă de azot, precum şi glicogen, hexozofosfaţi, acid
lactic etc., ca sursă de carbon.
- Extractul de drojdie, care se obţine prin cultivarea controlată a drojdiilor şi care
conţine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B.
- Clorura de sodiu, care se adaugă la mediile uzuale într-o concentraţie de 0,9%.
Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentraţia poate creşte până la 10%.
- Mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot îmbogăţi mediile,
deoarece constituie surse de carbon uşor accesibile unor bacterii.

3.2. CULTIVAREA MICROBILOR PE MEDII LICHIDE

unui produs pe medii lichide are dezavantajul că nu permite însă obţinerea unei
culturi proprii.
Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide diferă. Astfel, bacteriile
aparţinând familiei Enterobacteraceae tulbură uniform mediul, altele, ca de pildă
bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia), formează pelicule la suprafaţa
mediului. Altele formează agregate care se dezvoltă sub formă de grunji ce se depun pe
peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secretă în
mediu pigmenţi difuzabili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps. aeruginosa).

3.2.1. Fazele creşterii şi multiplicării bacteriilor în mediu lichid

Dacă se cultivă o populaţie bacteriană în mediu lichid, se disting următoarele faze:
faza de “lag”, faza de creştere exponenţială (logaritmică), faza staţionară şi faza de
declin.

a. Faza de “lag”
În această fază, care succede imediat însămânţării mediului lichid cu bacterii, are
loc o “adaptare” a germenilor la condiţiile mediului respectiv. Se produc, pe baza
metabolismului bacterian normal, enzime şi metaboliţi care ating la un moment dat un
prag limită de concentraţie în mediu, când se declanşează multiplicarea.
În cazul trecerii unei populaţii bacteriene de pe un mediu pe alt mediu, deosebit sub
raportul compoziţiei sale, îndivizii bacterieni sunt în marea lor majoritate incapabili de a
creşte şi de a se multiplica în acest mediu. În acest caz, faza de “lag” reprezintă perioada
necesară unor mutante din populaţia bacteriană pentru ca, prin multiplicarea lor, să
determine augmentarea numărului de indivizi în întreaga populaţie bacteriană.
Sensibilitatea bacteriilor faţă de chimioterapice este crescută. La majoritatea bacteriilor
de interes medical, durata ei este în jur de 1/2 oră, iar la formele sporulate 3-4 ore.

b. Faza exponenţială (logaritmică)

Odată cu terminarea fazei de “lag”, multiplicarea populaţiei bacteriene se produce
la o rată înaltă şi anume în progresie geometrică: o celulă dă naştere prin diviziune la
două celule fiice, care, la rândul lor, se divid determinând apariţia a câte două noi celule
bacteriene (creşterea exponenţială a numărului de indivizi pe unitatea de volum a
mediului). Această rată de multiplicare poate fi exprimată matematic prin formula:
N = N0kt , unde: N este numărul de celule în cultură la timpul t, N0 este numărul
iniţial de celule în cultură, iar k reprezintă o constantă, semnificând rata la care logaritmul
natural al numărului de celule creşte cu timpul.
Pentru a înţelege mai bine procesul măririi numărului de indivizi bacterieni în
cursul fazei exponenţiale, trebuie clarificată şi noţiunea de “generaţie”. O generaţie se
exprimă prin dublarea numărului de celule (fiind vorba de o diviziune celulară binară).
Numărul de generaţii/oră reflectă, de fapt, corelativ, mărirea numărului de celule în
general. Deci, numărul de celule în populaţie (N) creşte în raport direct cu generaţiile (g),
astfel:
g N
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32

Faza exponenţială continuă până ce se produc trei fenomene: epuizarea rezervelor

nutritive din mediu, acumularea produşilor toxici rezultaţi din metabolismul activ al
germenilor în cultură şi dezechilibrul de concentraţie ionică (cu scăderea valorii pH-
ului).
Pentru bacteriile aerobe, factorul care se epuizează primul în cultura în mediu
lichid (vas închis) este oxigenul. Dacă se introduce aer steril continuu (metoda culturilor
continue, agitate), populaţia bacteriană poate fi menţinută în faza exponenţială timp
indefinit.
Durata acestei perioade este dependentă de aceleaşi condiţii de mediu ca şi faza
precedentă dar şi de specie. Astfel E. coli are un timp de generaţie de aproximativ 10
minute, iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore. Sensibilitatea la antibiotice a
microbilor rămâne crescută.

c. Faza staţionară
Multiplicarea bacteriilor în progresie logaritmică nu mai este posibilă, rata de
înmulţire scade treptat până când bacteriile trec în faza staţionară. Numărul bacteriilor
rămâne constant, de unde s-ar putea deduce că numărul bacteriilor rămâne constant
deoarece ele nici nu se înmulţesc şi nici nu mor. În această fază, celulele nu mai cresc, ci
are loc o activitate metabolică endogenă, prin care celula îşi sintetizează rezerve de
energie şi produşi intermediari necesari menţinerii în viaţă în noile condiţii. Încetarea
multiplicării în faza staţionară se datorează în principal epuizării unui factor nutritiv
esenţial din mediu, numit factor limitant şi acumulării unor produşi toxici cum sunt, de
pildă, acizii organici care, prin scăderea pH-ului mediului, limitează multiplicarea
bacteriilor. În această fază scade sensibilitatea tulpinilor la chimioterapice.
Dată fiind schimbarea condiţiilor de viaţă ale bacteriilor, acestea vor prezenta
modificări ale morfologiei şi fiziologiei lor, atât unele faţă de altele, cât şi comparativ cu
faza exponenţială. Acum, bacteriile Gram pozitive nu mai reţin cristalul violet şi apar
Gram negative pe frotiurile colorate.
În faza staţionară celulele conţin cantităţi mari de polizaharide şi lipide, substanţe
pe care nu le găsim în faza de multiplicare exponenţială. La începutul fazei staţionare,
unele specii produc anumiţi metaboliţi secundari (antibiotice, colicine, exotoxine) cu
distribuţie taxonomică foarte riguraoasă.
Iniţierea sporogenezei la bacteriile sporulate se petrece la sfârşitul fazei
exponenţiale sau la începutul fazei staţionare.
 Durata fazei staţionare este în general de câteva ore.

d. Faza de declin
La un moment dat, proporţia de celule care mor depăşeşte rata de multiplicare a
celulelor viabile, până când multiplicarea încetează complet.
Pentru celula bacteriană, “moartea” înseamnă pierderea capacităţii de a se
reproduce (divide). Cauzele instalării acestei faze sunt: acumularea de cataboliţi,
epuizarea rezervelor nutritive, consumul oxigenului (în cazul bacteriilor aerobe).
Numărul de celule care mor la fiecare interval de timp poate fi apreciat indirect prin
evaluarea scăderii numărului celulelor supravieţuitoare, după formula:
S = S0-kt, unde: S reprezintă numărul de celule supravieţuitoare la timpul t, S0
reprezintă numărul de celule supravieţuitoare la timpul 0, iar k este o constantă.
Deci, ca şi în cazul fazei de declin, se observă o curbă exponenţială, dar, de această
dată, curba arată descreşterea numărului de celule vii, proporţional cu timpul. Faza de
declin durează mai multe zile.

3.2.2. Curba de creştere şi înmulţire a bacteriilor în culturi continui

Când se urmăreşte obţinerea unei mase mari microbiene sau a unor produşi
bacterieni pentru cercetare, preparare de vaccinuri, diversele industrii (farmaceutică,
alimentară etc), cultivarea bacteriilor se face în sisteme deschise, în care mediul de
cultură este permanent înlocuit cu un mediu proaspăt, îndepărtându-se în acelaşi timp
masa nou formată de bacterii. Bacteriile vor fi mereu în faza logaritmică, curba de
înmulţire având un aspect liniar. În acest fel se obţin culturile continui, pentru realizarea
cărora este necesar un chimiostat sau un turbistat.

3.3. CULTIVAREA BACTERIILOR PE MEDII SOLIDE

Introducerea mediilor de cultură solide a însemnat un progres uriaş în tehnicile de
diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distinctă a microbilor, sub forma de colonii
izolate. O colonie bacteriană este o micropopulaţie ce rezultă din înmulţirea unui singur
microb pe un mediu, vizibilă în general cu ochiul liber.
Cel mai simplu mediu solid este geloza simplă, ce se obţine prin adăugarea la
bulion a unei substanţe gelificabile, care de regulă este geloza, un polizaharid obţinut din
alga marină agar-agar. La acest mediu simplu se pot adăuga diferite ingrediente (sânge de
oaie, ser, ascită, extract de drojdie etc) pentru a putea cultiva bacteriile pretenţioase.
Caracterele culturale sunt foarte importante în identificarea microbilor. Ele se
apreciază fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, în
general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenţa, aderenţa la mediu,
activitatea hemolitică şi unele modificări pe care microorganismele le produc în mediul
respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate, care se suspendă omogen în ser
fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe când coloniile aceleiaşi specii, cu
suprafaţă rugoasă, relief şi margini neregulate şi care aglutinează spontan în ser fiziologic
- colonii de tip R (rough). În general, cu unele excepţii, coloniile S aparţin tulpinilor
virulente, pe când cele R sunt nevirulente.
Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numărătoarea de
germeni într-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece în multe
infecţii criteriul de implicare etiologic este numărul bacteriilor în produsul de examinat
(infecţii urinare).

4. ÎNMULŢIREA BACTERIILOR ÎN ORGANISM

Urmărind curba de multiplicare a bacteriilor într-un mediu limitat, putem deduce
că după pătrunderea în organism a unui mic număr de microbi, se poate produce o
infecţie. Un astfel de exemplu este meningita, în care meningococul se înmulţeşte foarte
rapid punând viaţa pacientului în pericol dacă nu se intervine cu un tratament
antiinfecţios.

In În
Microorganism vitro vivo
20-30 4-6 ore
E. coli şi Staphilococcus minute
Salmonella 30 minute 5-12 ore
typhimurium
Mycobacterium 24 ore câteva zile
tuberculosis
Mycobacterium leprae Nu se 2 săptămâni
cultivă
Treponema pallidum Nu se 30 ore
cultivă
(modificat după Roitt, 1994)

Pe de altă parte, însă, nu toate bacteriile se divid repede. Bacilul tuberculos, de

pildă, al cărui timp de generaţie este de 24 ore, se va înmulţi lent şi va produce o infecţie
cu evoluţie insidioasă, cronică.
În organism, creşterea şi multiplicarea bacteriilor este diferită de multiplicarea in
vitro, fiind stressată de necesităţi nutritive (prin competiţie cu flora normală) şi prin
mecanismele de apărare antiinfecţioasă. Condiţiile pe care microorganismele le
întâlnesc în organism le selectează pe acelea care cresc în anumite limite de temperatură,
osmolaritate şi pH.
Agenţii infecţioşi pe care îi găsim numai în organismele infectate vor supravieţui in
vitro numai în condiţiile de temperatură, osmolaritate şi pH apropiate organismului
nostru.
Microorganismele care au şi alt habitat decât omul cresc în limite mai largi,
necesităţile nutritive ale unui microb reflectând, în general, habitatul lui. Astfel,
gonococii, care trăiesc aproape numai în organismul uman, au pretenţii nutritive mai mari
necesitând pentru cultivarea in vitro medii speciale, pe când E. coli, Pseudomonas
aeruginosa şi alte specii, care supravieţuiesc frecvent în mediul înconjurător, numai medii
minimale.
La aspectele menţionate se adaugă habitatul în organism al agenţilor infecţioşi.
Astfel, bacteriile cu habitat extracelular sunt expuse acţiunii anticorpilor,
complementului, fagocitozei, spre deosebire de bacteriile ce se înmulţesc intracelular şi
care sunt protejate de acţiunea acestor factori şi scapă uneori supravegherii
imunologice.
 Bacteriile dezvoltă mecanisme adaptative care să ocolească barierele ce se opun
înmulţirii lor. Precizăm că şi în condiţiile în care multiplicarea bacteriilor este oprită,
simpla lor prezenţă în organism poate constitui un permanent stimul imunologic cu
urmări benefice sau dimpotrivă, dăunătoare.Multe lichide se folosesc cel mai adesea
pentru înmulţirea unor microbi care se găsesc în număr mic într-un anumit produs. Cel
mai simplu mediu folosit în laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepară din
decoct de carne de vacă, peptonă şi clorură de sodiu. Cultivarea

GENETICA BACTERIANĂ

Ereditatea reprezintă însuşirea generală a tuturor vieţuitoarelor de a transmite

caracterele specifice speciei la urmaşi.

Variabilitatea reprezintă modificarea zestrei ereditare a bacteriilor, ceea ce dă naştere

unor tulpini bacteriene noi, care prin virulenţă şi rezistenţa la chimioterapice, se
adaptează mai bine condiţiilor de mediu şi înlocuiesc bacteriile mai puţin adaptabile.

EREDITATEA LA BACTERII
Suportul material al eredităţii

Caracterele unei bacterii sunt determinate genetic. Exprimarea

manifestă a acestor caractere constituie fenotipul.

Organizarea materialului genetic la bacterii

Genomul bacterian este alcătuit din repliconi, formaţiuni genetice ce se pot replica
independent:
- cromozomul bacterian;
- elemente genetice extracromozomiale (plasmide; genomul bacteriofagilor);
- elemente genetice transpozabile (fragmente de inserţie şi transpozonii-Tn).

1. CROMOZOMUL BACTERIAN
Majoritatea genelor bacteriene se află în cromozomul bacterian haploid, care
codifică informaţiile absolut necesare supravieţuirii speciei în condiţii normale.
Cromozomol de Escherichia coli este format din:
 o moleculă circulară dublu spiralată de ADN ce reprezintă 80% din greutatea lui;
 o componentă proteică: ARN-polimeraza (reprezintă 10% din greutatea sa);
 ARNm şi ARNr în curs de sintetizare (10% din greutatea sa).
2. ELEMENTE GENETICE EXTRACROMOZOMIALE
Aceste elemente genetice sunt reprezentate de bacteriofagi şi plasmide.

2.1. PLASMIDELE
Sunt formaţiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere în citoplasmă,
reprezentate de molecule circulare de ADN, care se replică independent de cromozom.
Denumirea lor a fost dată în 1952 de către Lederberg. Importanţa lor practică a fost
evidenţiată în 1963 de către Watanabe, care a demonstrat posibilitatea transmiterii prin
plasmide a rezistenţei la antibiotice a bacteriilor.
Plasmidele pot fi:
– conjugative: plasmidele care se pot transfera singure la alte bacterii (ex. plasmida
de rezistenţă la antibiotice - plasmidul R);
– neconjugative: plasmidele care nu pot părăsi ele singure bacteria de origine, ci
numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (ex. plasmidul
ce codifică secreţia de β -lactamază la stafilococul aureu);
– episomi: plasmidele care se pot integra (prin recombinare) în cromozomul bacterian,
pierzându-şi astfel autonomia de replicare (ex. factorul de sex F - plasmidul F - factor de
fertilitate).
Determinanţii genetici de la nivelul plasmidelor sunt: esenţiali (codifică
informaţiile legate de replicarea autonomă) şi accesorii (care codifică caractere fenotipice
neesenţiale supravieţuirii celulei bacteriene în condiţii naturale). Exemple de determinanţi
genetici accesorii: gene de transfer (tra); gene de secreţie a unor toxine; gene de rezistenţă
la antibiotice (factor R); gene de rezistenţă la unii ioni şi compuşi organo-metalici; gene
pentru secreţia colicinelor (factor col); gene de metabolizare a unor substraturi.
Unele plasmide nu au efect manifest fenotipic. Acestea sunt plasmidele criptice.
Plasmide importante pentru practica medicală: plasmidele de virulenţă, plasmidul
care conferă bacteriei rezistenţă la antibiotice (plasmidul R), plasmidul F.

 Plasmidele de virulenţă: au determinanţi genetici ce determină sinteza unor factori

de virulenţă la bacterii. Exemple: secreţia de enterotoxină (termolabilă şi termostabilă)
la Escherichia coli; factori de colonizare la Escherichia coli; hemolizina (stafilococul
aureu, streptococul faecalis, Eschirichia coli ); exfoliatina la stafilococul aureu;
invazivitatea la Shigella.

 Plasmidele de rezistenţă la chimioterapice -R-: sunt molecule circulare de ADN, ce

conţin 2 regiuni: genele care codifică rezistenţa la antibiotice - „R”, unice sau multiple,
şi genele care conferă plasmidului capacitatea de a se transfera -„FTR”. Rezistenţa de
natură plasmidică este întâlnită în proporţie de peste 90% la tulpinile din spital
(Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Proteus).

 Plasmidul F (plasmidul de sex, factorul de fertilitate) conţine genele de transfer

tra. Plasmidul F se poate transmite, prin conjugare, altor celule bacteriene. El se poate
integra în cromozomul bacterian putând media transferul de gene cromozomiale de la o
celulă bacteriană donor la receptor.
 În funcţie de factorul F bacteriile se împart în:
- bacteria F-: lipsite de factor F (celule femele, receptoare de material genetic);
- bacteria F+: masculine, au factor F; sunt celule donatoare;
- bacteria Hfr. (high frequency of recombination): au factorul F integrat în cromozom;
sunt celule masculine;
- bacteria Fγ: au factorul F+ ca plasmid autonom, după ce acesta a fost integrat în
cromozom şi l-a părăsit rupând un fragment ADN din cromozom; sunt celule donoare
masculine.

VARIABILITATEA LA BACTERII
Bacteriile respectă aceleaşi legi ale eredităţii, unitare lumii vii, cu unele
particularităţi dictate de organizraea materialului genetic. Astfel, în timpul diviziunii
succesive, toţi descendenţii unei bacterii sunt identici între ei şi identici cu celula din
care provin.
Variabilitatea la bacterii poate fi explicată prin:

– variaţia fenotipică: reprezintă schimbarea unor însuşiri bacteriene ca adaptare la

condiţiile mediului înconjurător, fără să intervină vreo modificare în genomul bacterian;

– variaţia genotipică: rezultă din modificarea genomului.

În 1943 s-a dovedit faptul că modificările proprietăţilor unei populaţii bacteriene
sunt rezultatul unor variaţii rare la un număr mic de celule care se selectează şi dau
naştere unei populaţii noi.
Variabilitatea la bacterii se realizează prin: mutaţii, transfer de material genetic şi
transpoziţie.

1. MUTAŢIA
Mutaţia reprezintă modificarea spontană a genomului bacterian, modificare ce
constă în schimbarea secvenţei de nucleotide dintr-o genă. Ele pot fi: punctiforme,
inversii, deleţii, inserţii, mutaţii secundare.

1.1. Mutaţiile punctiforme afectează un singur nucleoid în cadrul unei gene şi sunt
reversibile. Consecinţe:
- înlocuirea unui codon cu altul duce la înlocuirea unui aminoacid cu altul în structura
unui polipeptid. Aceste mutaţii sunt numite „mutaţii în sens greşit”;
- apariţia unui codon nonsens. Mutaţia nonsens împiedică sinteza în continuare a unui
polipeptid, iar dacă ea se produce la începutul genei ce codifică un polipeptid se numeşte
mutaţie polară şi acesta nu se va mai sintetiza deloc.

1.2. Inserţia şi deleţia înseamnă adăugarea, respectiv pierderea a 2 până la sute sau
chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaţie duce la
modificarea importantă a secvenţei de aminoacizi, fiind denumită „mutaţie cu schimbare
de proiect”.
1.3. Mutaţii secundare sunt de 2 feluri: mutaţii reverse, care restabilesc o secvenţă
nucleotidică ce s-a modificat şi mutaţii supresoare, ce permit exprimarea funcţiei
anterioare a unei gene care a suferit o mutaţie, fără restabilirea codonilor iniţiali. Aceasta
datorită sintezei unui ARNt care „ştie” să citească un codon nonsens.
Rata de mutaţie reprezintă raportul dintre frecvenţa şi unitatea de timp. Este rară şi
variază de le genă la genă între 10-6 şi 10-10.
Consecinţele mutaţiilor duc la apariţia unor indivizi cu caractere noi, cum ar fi:
- rezistenţa la chimioterapice;
- structură antigenică modificată;
- pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi;
- pierderea capacităţii de sinteză a unui metabolit.
Din punct de vedere medical interesează în mod deosebit mutaţia spre
chimiorezistenţă, care se poate produce:
- dintr-o dată - „one step” (bacteria devine rezistentă brusc, „peste noapte”, la un
antibiotic);
- în mai multe etape - „multi step” (se produc mutaţii multiple, succesive, până ia
naştere o mutantă rezistentă la concentraţii crescute de antibiotic).
Mutaţiile naturale sunt rare. Mutaţiile induse sunt determinate de agenţi mutageni:
radiaţii X, UV, derivaţi acridinici, agenţi alchilanţi. Aceşti agenţi selectează mutanta
pentru ca aceasta să se transforme într-o populaţie bacteriană cu proprietăţi noi, pot duce
la „pierderea integrală” a unui plasmid, printr-o modificare ce produce deficienţe ale
mecanismului de replicare, astfel încât plasmidele nu vor mai fi „moştenite” de celulele
fiice.

2. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC

Se realizează între 2 celule bacteriene, una denumită donor, cealaltă receptor, prin
procese ca: transformarea, transducţia, conjugarea.

2.1. TRANSFORMAREA
Reprezintă transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor,
sub formă de ADN pur, eliberat prin liza celulei donor sau prin extracţie chimică.

2.2. TRANSDUCŢIA
Reprezintă un transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta,
mediat de bacteriofagi (figura 2).
Unii bacteriofagi sunt capabili să transfere orice genă bacteriană (transducţie
generalizată) sau pot transfera numai anumite gene (transducţie specializată).
 Figura 2: Transducţia (după Murray, Drew, Kobayashi, 1990)

Transducţia generalizată este mediată de fagi litici, care, după pătrunderea în celula
bacteriană, se multiplică şi determină liza celulei gazdă.
În timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmentează. Se poate
întâmpla ca unul dintre aceste fragmente, cu o dimensiune apropiată de cea a genomului
fagic, să se integreze în capsula bacteriofagului, în locul genomului fagic.
Aceşti bacteriofagi sunt defectivi şi nu se vor mai putea replica, dar pot pătrunde în
alte celule bacteriene, injectându-le ADN, ce provine din cel al celulei donoare. ADN se
va integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, rezultând caractere noi
ca modificări patogenice bacteriene, rezistenţă la chimioterapice.

Transducţie specializată este mediată de fagii temperaţi.

După pătrunderea în celula bacteriană a ADN bacteriofagului temperat, ADN
suferă un proces de circularizare după care se inseră în cromozom prin recombinare
sub formă de profag (pe baza homologiei între 10 perechi de baze ale ADN fagic şi
bacterian). Profagul devine parte integrantă a cromozomului bacterian, se va replica odată
cu acesta, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazdă.

2.3. CONJUGAREA
Reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una
receptoare printr-un proces de împerechere, ce se realizează prin contactul direct dintre
cele 2 celule. Astfel se pot transmite plasmide şi gene cromozomiale (prin intermediul
factorului F+).

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI, CHIMICI ŞI BIOLOGICI

ASUPRA BACTERIILOR

DEFINIREA TERMENILOR
Pentru înţelegerea mai clară a acţiunii unor agenţi fizici şi chimici asupra
bacteriilor, se impune mai întâi definirea unor noţiuni.

Un agent bacteriostatic este acela care are proprietatea de a stopa multiplicarea

bacteriilor. Multiplicarea reapare după îndepărtarea agentului respectiv.
 Un agent bactericid are proprietatea de a omorî (inactiva definitiv) celula
bacteriană, procesul fiind ireversibil: chiar după îndepărtarea agentului, nu se mai
produce multiplicarea bacteriană. În acest caz, este vorba de liza celulei bacteriene sau,
mai rar, de păstrarea intactă a morfologiei celulare, dar cu oprirea funcţiilor cardinale ale
celulei.

Sterilizarea reprezintă acţiunea prin care se obţine suprimarea oricărei flore

microbacteriene.

Dezinfectantul este o substanţă (agent) folosită pentru inactivarea

microorganismelor de pe unele suprafeţe (mese, podele), dar care, datorită toxicităţii sale
marcate, nu poate fi aplicat în ţesuturi umane.

Dezinfecţia este procesul de inactivare a microorganismelor de pe suprafeţe

(“obiecte” neanimate).

Antisepsia constă în aplicarea unor substanţe bactericide sau bacteriostatice în

scopul de a omorî sau inhiba dezvoltarea florei patogene în plăgi.

Asepsia cuprinde toate măsurile care impiedică contaminarea cu agenţi infecţioşi

a unei plăgi.

Conservarea reprezintă prevenirea alterării prin agenţi microbieni ai unor

produse degradabile cum sunt alimentele sau medicamentele.

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ASUPRA BACTERIILOR

Dintre cei mai imoprtanţi agenţi fizici care pot influenţa viabilitatea şi puterea de
multiplicare a bacteriilor, menţionăm: căldura, uscăciunea, (desicarea), presiunea
mecanică şi osmotică, radiaţiile, electricitatea etc.

1. CĂLDURA
Temperaturile ridicate (căldura) prezintă în general (cu excepţia grupului restrâns
al bacteriilor termofile) o acţiune bactericidă. Temperaturile joase sunt mai puţin nocive,
cele mai multe specii bacteriene rezistând un timp în stare latentă, fără multiplicare
(“hibernare bacteriană”). În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare, bacteriile se
împart în: mezofile (370C); criofile sau psihrofile (25-300C sau mai puţin); termofile (55-
650C).
Căldura acţionează diferenţiat asupra formelor vegetative şi, respectiv, asupra
sporilor bacterieni. Astfel, asupra formelor vegetative, temperatura de 1000C, realizează
un efect bactericid complet în 2-3 minute, pe când sporii rezistă chiar 15 minute la
temperatura de 1200C. Trebuie precizat faptul că există o corelaţie temperatură-timp, în
ceea ce priveşte efectul sterilizant.
Rezistenţa la acţiunea căldurii a diferitelor specii bacteriene este variabilă şi
anume:
a. Forme vegetative (exemplu: Mycobacterium tuberculosis).
 Timp Temperatura
30 minute 580C
20 minute 590C
2 minute 650C

b. Spori. În ceea ce priveşte timpul de distrucţie prin căldură, se pot descrie următoarele
diferenţe de specie:

SPECIE TIMP DE DISTRUCŢIE (MINUTE)

0
100 C 1050C 1100C 1150C 1200C 1300C
Bacillus 2-15 5-10
anthracis
Clostridiu 5-90 5-25
m tetani
Clostridiu 5-45 5-27 10-15 4 1
m
perfringen
s
Clostridiu 300- 40- 32-90 10-40 4-20
m 530 120
botulinum
Clostridiu 150 45 12
m
sporogene
s
Bacterii Mai 420 120 15 6-30 1,5-10
din sol multe
ore

În tabelul de mai jos redăm corelaţia între timpul de distrucţie prin căldură uscată
şi temperatură, pentru diferitele specii bacteriene aflate în forma sporulată:

TIMP DE DISTRUCTIE (MINUTE)

SPECIE 120 0
1300 1400C 1500C 1600C 1700C 1800C
C C
Bacillus >180 60- 9-90 3
anthracis 120
Clostridiu 120 60 15-60 25 20-25 10-15 5-10
m
botulinum
Clostridiu 50 15- 5
m 35
perfringen
s
Clostridiu 20- 5-15 30 12 5 1
 m tetani 40
Bacterii 180 30-90 15-60 15
din sol

Pentru a aprecia eficienţa sterilizării prin căldură, se folosesc următorii parametrii:

- “timp de moarte termică”: reprezintă cel mai scurt interval de timp necesar inactivării
unei suspensii bacteriene la o anumită temperatură şi în anumite condiţii.
- “timp de reducere decimală” (valoarea “D”): reprezintă intervalul de timp (în minute)
necesar reducerii numărului de celule vii cu 90% din valoarea iniţială (cu 9 log 10 ).

1.1. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ USCATĂ

Căldura uscată omoară microorganismele prin oxidarea distructivă a
componentelor celulare. Cei mai rezistenţi spori sunt distruşi de căldura uscată la 1600C,
timp de 60 minute. Căldura uscată de 1000C distruge în 60 de minute bacteriile care sunt
omorâte prin căldură umedă la 600C în 30 minute. Sporii fungilor sunt distruşi în 60 de
minute la 1150C, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse între 120-1600C. În laboratorul
de microbiologie se utilizează următoarele tehnici de sterilizare: încălzirea la roşu,
flambarea, sterilizarea la pupinel şi sterilizarea cu raze infraroşii.

- Încălzirea la roşu în flacară a obiectelor se aplică anselor bacteriologice în laboratorul

de microbiologie.

- Flambarea (trecerea prin flacară pentru câteva secunde) se aplică gâtului

baloanelor, eprubetelor după deschidere şi înainte de închiderea lor, pipetelor înainte de
utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizează prin
flambare instrumente de mică chirurgie, după ce se stropesc cu alcool, dar temperatura
produsă nu este suficient de înaltă pentru a asigura o sterilizare optimă.

- Sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalică cu
pereţi dubli între care se găseşte un strat de azbest care împiedică pierderile de căldură.
Mai este prevăzut cu o sursă de căldură care este energia electrică şi un termoregulator. În
interior pupinelul este prevăzut cu rafturi pentru obiectele de sterilizat. Temperatura de
sterilizare la pupinel este de 1600C timp de 1 oră sau de 1800C timp de ½ de oră. La
pupinel se sterilizează întreaga sticlărie de laborator, instrumentarul de stomatologie,
seringi fără armătură metalică, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie să fie
supraîncărcat, pentru ca aerul să poată circula nestingherit printre obiectele de sterilizat.

- Sterilizare cu raze infraroşii este folosită pentru sterilizarea seringilor fără armătură
metalică la o temperatură de 1800C. Sterilizarea se poate efectua şi la 2000C în vid,
aplicându-se instrumentelor chirurgicale.

1.2. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ UMEDĂ

Căldura umedă este mai eficientă decât căldura uscată, distrugând bacteriile la o
temperatură mai scăzută şi în timp mai scurt. Formele vegetative ale majorităţii
bacteriilor, fungilor şi virusurilor animale sunt omorâte de căldura umedă în 10 minute la
temperaturi cuprinse între 500C (Neisseria gonorrhoeae) şi 650C (Staphilococcus aureus).
O susceptibilitate deosebită faţă de căldură o prezinta Treponema pallidum, care este
distrusă în 10 minute la 430C. Rezistenţă maximă la căldura umedă o are, însă, Bacillus
stearothermophylus, a cărui formă vegetativă se poate multiplica la 80 0C. O parte din
virusurile animale au o rezistenţă crescută faţă de căldura umedă, ca, de pildă, virusul
poliomielitic care este inactivat la 600C după 30 de minute şi virusul hepatitei B care,
dacă se află în ser, rezistă 10 ore la 600C. Mulţi bacteriofagi au o rezistenţă mai mare la
căldura umedă decât bacteria gazdă, aceasta fiind distrusă la 600C în 15-30 de minute, iar
bacteriofagul la temperaturi cuprinse între 65-800C.
Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor şi a fungilor sunt mai rezistente
decât formele vegetative, dar nu atât de rezistente ca şi sporii bacterieni.
Rezistenţa sporilor bacterieni variază la diferite specii, dar chiar şi între tulpinile
aceleiaşi specii. Astfel, majoritatea sporilor de Cl. tetani sunt distruşi prin fierbere la
1000C în 10 minute, dar s-au semnalat tulpini ai căror spori rezistă la fiebere 1-3 ore,
fiind cei mai rezistenţi patogeni ce pot infecta o plagă. Rezistenţa lor determină
standardele minime pentru sterilizarea chirurgicală: 10 minute la 1210C sau 30 de
minute la 1150C fără a socoti timpul de încălzire. Unii spori de Cl. botulinum rezistă la
fierbere la un pH de 7 până la 8 ore, iar la autoclavare 10-40 minute la 1150C.
Omorârea microorganismelor prin căldură umedă se produce prin coagularea
proteinelor structurale şi inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenţi
spori sunt distruşi prin expunere la căldură umedă la 1210C timp de 30 de minute.

- Fierberea este de fapt o metodă de dezinfecţie deoarece ea nu distruge toate formele

sporulate. Se efectuează la 1000C timp de ½ de oră şi se aplică siringilor şi
instrumentelor de mică chirurgie atunci când nu este posibilă altă metodă. Fierberea se
mai foloseşte în epidemii la sterilizarea apei.

- Pasteurizarea a fost introdusă de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizată şi

acum pentru sterilizarea unor alimente lichide care nu suportă temperaturi prea ridicate
(lapte, bere, sucuri de fructe). Metoda constă în încălzirea lichidului: la 620C pentru 30 de
minute (pasteurizare joasă), la 710C timp de 15 minute (pasteurizare medie), la 80-850C
timp de 3-5 minute (pasteurizare înaltă ) sau introducerea unor vapori filanţi la o
temperatură de 130-1500C sub presiune pentru câteva secunde (ultrapasteurizare).
Pasteurizarea este o metodă eficientă deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta în
lapte (Mycobacteium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus şi Brucella) nu sunt
bacterii sporulate, numărul lor reducându-se după pasteurizare cu 97-99%. Coxiella
burnetii nu este distrusă prin pasteurizare joasă.

- Tyndalizarea constă în încălzirea produsului de sterilizat 3 zile la rând, în baie de

apă la 56-1000C câte o oră. Temperatura se alege în funcţie de produsul de sterilizat.
Metoda se aplică lichidelor care nu suportă temperaturi ridicate, ca de exemplu:
vaccinuri, medii de cultură ce conţin zaharuri în concentraţie mare, proteine, gelatină
etc. Formele vegetative sunt distruse în prima zi, iar sporii se transformă în forme
vegetative ce vor fi distruse zilele următoare. Reamintim, însă, că sporii bacteriilor
termofile nu se distrug prin această metodă.
- Autoclavarea este metoda folosită pentru instrumentarul de chirurgie iar în
laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a materialului
infecţios. Sterilizarea are loc într-o atmosferă saturată de vapori de apă la 1200C, la o
presiune de 1 atm, timp de 30 de minute, în aparate speciale numite autoclave.

2. USCĂCIUNEA (DESICAREA)
Sensibilitatea bacteriilor la uscăciune este diferită, în funcţie de specie şi chiar
tulpină. În general, bacteriile sunt rezistente la uscăciune în forma sporulată şi, pentru
unele specii, chiar în formă vegetativă (Mycobacterium tuberculosis persistă în picături
de spută uscată şi la întuneric).
Rezistenţa relativă a bacteriilor la uscăciune, precum şi la temperaturile scăzute, a
stat la baza punerii la punct a uneia dintre cele mai folosite metode pentru conservarea
microorganismelor.
Liofilizarea. Este vorba de uscarea (desicarea) treptată în vid, la temperaturi
foarte joase (-400C până la -700C). În stare liofilizată, bacteriile pot fi conservate la
temperatura camerei mult timp (ani).

3. PRESIUNEA MECANICĂ
Majoritatea bacteriilor rezistă la presiuni foarte mari (3.000 atm, formele
vegetative; 12.000-20.000 atm, formele sporulate).

4. PRESIUNEA OSMOTICĂ
Bariera osmotică a celulei bacteriene este membrana citoplasmatică. În mediu
hiperton (cu concentraţie înaltă de ioni şi macromolecule organice) are loc procesul de
plasmoliză: apa din celulă iese în mediu, citoplasma se retractă, odată cu membrana
citoplasmatică, în timp ce peretele celular, rigid, nu-şi modifică forma. În mediu hipoton
(cu concentraţie scăzută de ioni şi molecule organice) se produce fenomenul invers, de
plasmoptiză: pătrunderea apei în celula bacteriană, care devine turgescentă, procesul
evoluând până la liza celulară (mai ales dacă, în prealabil, peretele celular, rigid şi
rezistent, a fost îndepărtat prin lizozim -protoplaşti- sau prin antibiotice inhibitorii ale
sintezei acesteia -sferoplaşti).

5. RADIAŢIILE
Radiaţiile se pot clasifica în: radiaţii ionizante (X, γ , catodice) şi în radiaţii
ultraviolete.

5.1. RADIAŢIILE IONIZANTE

Categoriile de radiaţii ionizante sunt următoarele:
- Radiaţiile X sunt produse de generatoare speciale; au lungimea de undă λ =0,1nm-
40nm.
- Radiaţiile γ sunt produse de izotopi (cobalt 60); au lungimea de undă λ =0,1nm-
10nm.
- Radiaţiile catodice sunt produse în dispozitive speciale, numite acceleratori de
electroni; sunt compuse dintr-un flux de electroni cu viteză foarte mare (“acceleraţi”);
puterea lor de penetrare este de peste 1x106 volţi.
Radiaţiile ionizante au ca mecanisme de acţiune denaturarea proteinelor, acizilor
nucleici celulari şi formarea de radicali liberi şi peroxizi.
 Denaturarea proteinelor şi acizilor nucleici celulari se realizează prin puterea mare
de penetrare a acestor radiaţii cu dezintegrarea structurilor primare, secundare şi
terţiare ale proteinelor (mai ales la nivelul grupărilor polare), cu “ruperea” lanţurilor
acizilor nucleici (ARN monocaternar prezintă şanse de refacere, pe când, ADN bicatenar
suferă o degradare definitivă).
 Efectul de ionizare se realizează prin formarea de radicali liberi (OH şi H2O) în apa
mediului, prin flux fotonic cu energie înaltă cu efect letal şi formarea de peroxizi (R-O-
O-R), ce acţionează ca agenţi oxidanţi.

5.2. RADIAŢIILE ULTRAVIOLETE

Radiaţiile ultraviolete prezintă o lungime de unda λ =40nm-390nm, iar activitatea
lor bacteriană maximă este de 260nm. Aceste radiaţii se absorb selectiv la nivelul
acizilor nucleici, îndeosebi ADN, determinând formarea dimerilor pirimidinici toxici.
Modificările induse în celulele bacteriene prin razele ultraviolete sunt reversibile, prin
procesele de fotoreactivare şi restaurare la întuneric.
 Fotoreactivarea: radiaţiile luminoase pot activa o enzimă celulară care clivează
dimerii pirimidinici toxici.
 Restaurarea la întuneric (“dark repair”) constă în faptul că, la întuneric, are loc
acţiunea succesivă a trei enzime (o endonuclează - care desprinde dimerul pirimidinic de
pe ADN; o exonuclează - care formează “lacune” de-a lungul moleculei alterate de
ADN, prin clivare secvenţială; o ADN-polimerază - care umple lacunele, folosind ca
matrice porţiunea omologă din lanţul geamăn de ADN, nealterat. Prin fotoreactivare şi
restaurare la întuneric, se selectează indivizi bacterieni rezistenţi la efectul radiaţiilor.
Aplicaţiile radiaţiilor ultraviolete în laboratorul de microbiologie se referă în
principal la folosirea lor ca agenţi sterilizanţi. Astfel, radiaţiile ultraviolete se utilizează
pentru sterilizarea încăperilor, boxelor, hotelor, sălilor de operaţii, meselor de laborator,
etc.

6. ULTRASUNETELE
Ultrasunetele reprezintă vibraţii cu frecvenţă mai mare decât cea a undelor sonore
(peste 16.000 hertzi). Ele se obţin cu ajutorul cristalelor piezoelectrice. Ultrasunetele au
un puternic efect bactericid, producând relativ rapid distrucţia celulei bacteriene. De
altfel, una dintre cele mai eficiente metode de dezintegrare a corpilor microbieni - etapa
preliminară analizei chimice a bacteriilor în laborator - este ultrasonarea suspensiei
bacteriene.

7. ELECTRICITATEA
Curentul electric, ca atare, exercită acţiuni minore asupra bacteriilor. În schimb, el
poate influenţa compoziţia fizico-chimică a mediului, cu efecte secundare bactericide:
creşterea temperaturii peste valorile optime desfăşurării normale a metabolismului
bacterian; ionizarea clorului din compuşii cloruraţi; formarea de ozon.

8. FILTRAREA
Sterilizarea anumitor lichide care conţin substanţe alterabile prin căldură, se face
cu ajutorul filtrelor. Lichidele termolabile sunt trecute prin filtre sterilizante, care reţin
microorganismele, permiţând trecerea lichidului astfel sterilizat.
Filtrele folosite sunt de mai multe feluri, în funcţie de compoziţie:
- filtre Chamberlan din porţelan, numite şi bujii, în formă de lumânare;
- filtre Berkefeld din pământ de infuzorii (Kisselgur), putând fi recondiţionate
după folosire;
- filtre Seitz din placă de azbest şi celuloză; după dimensiunea porilor, pot fi:
clarifiante (cu pori mari) sau sterilizante (cu pori de dimensiuni foarte reduse) - EKS1,
EKS2;
- filtre de metilen celuloza (Millipore, Sartorius), ce prezintă o porozitate de 0,2
microni.

ACŢIUNEA AGENŢILOR CHIMICI ASUPRA BACTERIILOR

Pentru a putea intra în uzul curent, se impune întrunirea următoarelor condiţii
generale pe care trebuie să le îndeplinească un agent chimic dezinfectant:
- să aibă o puternică acţiune antimicrobiană (bactericidă), în concentraţii relativ
reduse;
- să prezinte un grad înalt de solubilitate în apă;
- să nu fie foarte toxic pentru organismul uman, chiar în aplicaţii externe;
- să nu se combine cu materii organice de pe tegumente, care să-l inactiveze;
- să-şi exercite efectele bactericide cu intensitate apropiată atât la temperatura
camerei, cât şi la cea a corpului uman;
- să aibă capacitate mare de penetrare; pe cât posibil, să nu degaje un miros
neplacut; să aibă un cost relativ scăzut.

1. AGENŢI CHIMICI CU ACŢIUNE ANTIBACTERIANĂ

1.1. FENOLUL ŞI DERIVAŢII FENOLICI
Fenolul (C6H5OH) sau acidul carbolic este un bun denaturant al proteinelor
precum şi un detergent. Acţiunea sa bactericidă presupune liza celulelor bacteriene. El se
poate folosi ca dezinfectant în concentraţie de 2,5% la decontaminarea băilor, a
podelelor de spital, a ploştilor etc., fiind însă iritant. Este activ faţă de majoritatea
bacteriilor, inclusiv faţă de bacilul tuberculozei şi spori. În concentraţie de 1%, se
foloseşte pentru conservarea vaccinurilor.
(4-alil-2- methoxifenol). Ultimul este folosit în stomatologie.

1.2. ALCOOLII
Deşi dezinfectanţi cu putere mai slabă decât a fenolilor, alcoolii, prin gruparea
“alkyl” (R-CH2OH) acţionează bactericid, dar numai asupra formelor vegetative. S-a
demonstrat, de pildă, ca sporii de bacil cărbunos rezistă timp de 20 de ani în alcool
absolut..

1.3. HALOGENII ŞI COMPUŞII HALOGENAŢI

Halogenii cei mai utilizaţi ca antiseptice şi dezinfectante sunt clorul şi iodul,
ambele cu acţiune puternic bactericidă şi sporicidă. Mecanismul de acţiune al
halogenilor se bazează pe proprietăţile lor oxidante.
Clorul a fost introdus ca dezinfectant de O.W. Holmes la Boston în anul 1835 şi de
Semmelweis la Viena în 1847 pentru a preveni transmiterea febrei puerperale prin
mâinile medicilor.
- clorul gazos în concentraţie de 2-30/00 este folosit pentru potabilizarea apei, dar
concentraţia trebuie să fie mai mare dacă apele au conţinut crescut de substanţe organice,
deoarece acestea fixează şi inactivează clorul;
- hipocloritul de sodiu se foloseşte tot pentru dezinfecţia apei, a veselei şi a WC-
urilor, la curăţirea suprafeţelor în industria alimentară, în unităţi de alimentaţie publică
etc.;
- cloramina este folosită ca dezinfectant pentru veselă, lenjerie, în concentraţie de
2-3% şi ca antiseptic în concentraţie de 1%;
Iodul este un oxidant puternic şi se combină ireversibil cu proteinele bacteriene.
Se foloseşte sub formă de:
- soluţie alcoolică 1-2% ca antiseptic cutanat;
- tinctura de iod care conţine 4-5% iod şi 2-5% iodură de potasiu se utilizează tot
ca antiseptic cutanat pentru antiseptizarea pielii înainte de intervenţii chirurgicale. Atât
soluţia alcoolică cât şi tinctura nu pot fi aplicate direct pe plăgi deoarece au efect
distructiv asupra ţesuturilor;
- iodoforii, care conţin iod complexat cu un detergent anionic, au o serie de
avantaje: au o penetrabilitate foarte bună a pielii, nu sunt iritanţi, deoarece iodul este
eliberat treptat din combinaţie şi nu pătează lenjeria. Un exemplu este betadina, un
complex hidrosolubil al iodului cu polivinilpirolidina. Preparatul poate fi folosit pentru
antiseptizarea plăgilor superficiale.
Dezavantajul antisepticelor cu iod este alergizarea pe care o produc la unele
persoane.

1.4. ACIZII ŞI BAZELE

Efectul bactericid al acizilor şi bazelor se datorează denaturării brutale a
proteinelor bacteriene.
Acizii. Acţiunea dezinfectantă a unui acid creşte, în general, paralel cu gradul de
disociere electrolitică. Cei mai bactericizi acizi în ordine descrescătoare a activităţii lor
sunt: acidul azotic, clorhidric, persulfuric şi permenganic. Acizii organici au o acţiune
bactericidă mai slabă. Acizii minerali se folosesc mai rar în dezinfecţie. Astfel, în
laboratoare se utilizează amestecul sulfocromic pentru dezinfecţia şi degresarea pipetelor.
Ca antiseptice se folosesc mai frecvent:
- acidul boric: 2-3% în soluţii apoase, 10% în unguente şi 0,005-1,6% pentru
colire. Nu se aplică sugarilor (este toxic) şi nu se aplică pe plăgi întinse;
- acidul acetil glacial: diluat 28-32% se utilizează în dermatologie şi stomatologie
ca antiseptic, astringent, cauterizant şi antifungic.
 Bazele, ca si acizii, sunt active în funcţie de gradul de disociere. Bazele cu
proprietăţi puternic bactericide sunt: KOH, NaOH, LiOH, NH4OH. Se pare că acţiunea
bazelor se datorează nu numai radicalilor rezultaţi prin disociere, ci şi bazelor nedisociate
(cu efect bactericid) care pătrund în celula bacteriană. Dintre baze, Ca(OH)3 este folosit la
văruirea încăperilor, iar soluţia caldă de NaOH 5%, ca dezinfectant.
Sensibilitatea la acizi şi baze este diferită de la specie la specie. Astfel,
mycobacteriile sunt relativ rezistente la acizi şi baze, NaOH şi H 2SO4 fiind folosite pentru
lichefierea sputei în scopul izolării bacilului tuberculos.

1.5. SĂRURILE
Dintre săruri, cele ale metalelor grele au efectul bactericid cel mai puternic.
Astfel, ionii de Hg şi Ag sunt activi într-o proporţie de 1/1000000. Acţiunea lor
bactericidă se datorează combinării lor cu grupări active ale enzimelor pe care le
inactivează. Eficienţa lor depinde, însă, mai degrabă de densitatea culturii bacteriene
decât de concentraţia lor, deoarece ei sunt absorbiţi repede şi preferenţial de bacterii,
atingând în bacterii concentraţii mari în defavoarea concentraţiei de mediu.
- clorura de mercur (sublimatul) 10/00 se foloseşte în laboratoare ca dezinfectant
pentru pipete şi lame;
- merthiolatul, care este un compus organic al mercurului, este folosit drept
conservant pentru seruri şi vaccinuri în concentraţie de 1/10.000 şi ca dezinfectant în
concentraţie de 1/1.000;
- nitratul de argint în concentraţie de 1% se folosea în profilaxia oftalmiei
gonococice la nou-născut înainte de introducerea penicilinei în terapie;
- colargolul, protargolul şi argirolul sunt compuşi de argint care se folosesc sub
formă de colire şi unguente în concentraţie de 1-1,5%;
- compuşii organici ai arsenului, bismutului, antimoniului au fost utilizaţi în
trecut în tratamentul sifilisului şi a unor infecţii produse de unele protozoare;
- sulfatul de cupru este folosit cu succes ca fungicid, dar nu în medicină, ci în
agricultură;
- oxidul de zinc se foloseşte ca antiseptic, astringent şi caustic în dermatologie.

1.6. FORMALDEHIDA ŞI GLUTARALDEHIDA

Formaldehida înlocuieşte atomii labili de H din grupările NH2 sau –OH, frecvente
în nucleoproteine şi din grupările –COOH şi –SH ale proteinelor. Este la fel de activă faţă
de spori ca şi faţă de formele vegetative, probabil pentru că poate pătrunde uşor în celula
bacteriană datorită dimensiunilor reduse ale moleculei şi pentru că reactionează în lipsa
apei.
Formaldehida este un gaz, forma obişnuită de prezentare fiind o soluţie de 37%
numită formalina. În concentraţie de 0,1% a fost utilizat mult timp în prepararea
vaccinurilor prin detoxifierea toxinelor.
Se poate utiliza sub formă gazoasă sau lichidă pentru sterilizarea diferitelor
suprafeţe. Formaldehida gazoasă este pusă în libertate dintr-un polimer,
paraformaldehida şi este folosită la dezinfecţia încăperilor, a mobilierului şi în general a
obiectelor care nu pot fi sterilizate prin căldură. Ea nu deteriorează obiectele supuse
dezinfecţiei (îmbrăcăminte, obiecte de matal, lemn, piele etc.), dar are o acţiune iritantă
asupra conjunctivei şi căilor respiratorii.
 Glutaraldehida 2% în soluţie apoasă este mai activă decât formolul şi mai puţin
iritantă. Este mai activă în mediu alcalin fiind bactericidă, sporicidă şi virulicidă. Este
indicată în sterilizarea unor instrumente medicale ce nu pot fi supuse sterilizarii prin
căldură, ca, de pildă, citoscoape, echipament de anestezie, materiale plastice şi
termometre.

1.7. DEZINFECTANŢII GAZOŞI

Succesul obţinut în prevenirea toxiinfecţiilor alimentare nu a putut fi nici pe departe
reeditat în infecţiile ce se transmit pe cale aeriană. Pulverizarea fenolului în sălile de
operaţie introdusă de Lister a fost rapid abandonată. Pulverizarea propilenglicolului sau a
dietilenglicolului în concentraţii mici, netoxice pentru om, reduc mult numărul de
bacterii din aer, dar aceşti produşi sunt foarte sensibili la umiditate pe de o parte, iar pe de
altă parte nu distrug bacteriile de pe mobilier, suprafeţe ce constituie de fapt una din
sursele bacteriilor din aer.
- Oxidul de etilen este un gaz foarte solubil în apă, fiind cel mai potrivit dezinfectant
gazos pentru suprafeţe uscate. Este însă destul de costisitor şi are o toxicitate reziduală.
Se utilizează la sterilizarea materialelor care nu suportă temperaturi ridicate: obiecte din
plastic, echipament chirurgical, cărţi, obiecte din piele care au foat contaminate de
pacienţi contagioşi. Fiind explosiv, se utilizează în amestec de 90% cu CO2.

1.8. SĂPUNURILE ŞI DETERGENŢII (AGENŢI TENSIOAC-TIVI)

Săpunurile au o acţiune moderat bactericidă datorită acizilor graşi nesaturaţi pe
care îi conţin (acizii oleic, linoleic şi linolenic) mai ales asupra florei Gram pozitive.
Flora Gram negativă, mai ales cea din grupa coliformilor, este mai sensibilă la săpunuri
ce conţin acizi graşi saturaţi. Nu se cunoaşte exact mecanismul bactericid al săpunurilor,
ele fiind folosite mai ales pentru îndepărtarea mecanică a microbilor de pe piele, prin
spălare. În săpunuri se pot încorpora diferite antiseptice care intensifică acţiunea
antibacteriană a acestora.
Detergenţii sunt substanţe tensioactive sintetice. Din punct de vedere chimic, ei se
împart în: detergenţi anionici (ce includ alcooli sulfataţi, alkilaril sulfonaţi etc.),
detergenţi cationici (care sunt compuşi cuaternari de amoniu, în care cei 4 atomi de
hidrogen sunt înlocuiţi prin radicali organici), detergenţi neionici (care sunt poliesteri şi
eteri formaţi din condensarea unor acizi graşi, alcooli şi fenoli) şi, în sfârşit, detergenţi
amfoteri (care conţin atât grupări anionice cât şi cationice). Dintre detergenţi, importanţi
ca antiseptice şi dezinfectante, sunt cei anionici, cationici şi amfoteri.

1.9. ANTOGONIŞTII METABOLICI

Reprezintă agenţii chimici care interferă cu o reacţie normală între o enzimă
specifică şi substratul respectiv, în procesul metabolic. Antagonistul acţionează prin
combinarea cu o parte a enzimei (cu apoenzima-suportul proteic, cu coenzima-partea
activă, sau cu activatorul mineral), împiedicând ataşarea enzimei pe substrat.
Combinarea antagonistului cu enzima se face datorită marii afinităţi a acesteia faţă de
anumite situsuri (regiuni) din molecula proteinei enzimatice. Exemple: oxidul de carbon
sau cianurile se combină cu atomul de fier din enzimele porfirinice, blocând rolul
acestora în respiraţia celulară bacteriană.
Antagoniştii metabolici pentru bacterii se împart în:
 - antagonişti ai proceselor energetice: oxid de carbon, cianuri, dinitrofenol;
- antagonişti ai biosintezelor: p-fluorofenilalanina, care înlocuieşte competitiv
fenilalanina din lanţul proteic normal, cu apariţia unei proteine modificate, nefuncţionale.

1.10. COLORANŢII
Coloranţii trifenilmetanici, cum sunt cristal-violetul, metil-violetul şi verdele
briliant, sunt substanţe puternic bacteriostatice, slab bactericide, active mai ales pe
bacteriile Gram pozitive. Violetul de genţiană se poate folosi ca antiseptic în concentraţie
de 0,2%.
Coloranţii tiazinici, cum este albastrul de metilen, se folosesc ca antiseptici externi
în concentraţii de 0,2-0,5%. Albastrul de metilen poate fi administrat ca antiseptic intern
în infecţiile urinare (urodezinfectante).
Dintre coloranţii acridinici, cel mai utilizat este rivanolul (lactat de metacridina) în
concentraţii de 1-2%, la antiseptizarea plăgilor chirurgicale şi traumatice.

1.11. ALŢI DEZINFECTANŢI

Peroxidul de hidrogen într-o concentraţie de 3% este folosit ca antiseptic, dar nu
este recomandabil, susceptibilitatea bacteriilor fiind diferită.
Permanganatul de potasiu (KMnO4) este un antiseptic uretral sau vaginal în
concentraţie de 1/1.000.
Acidul peracetic (CH3-CO-O-OH), agent puternic oxidant, este folosit sub forma de
vapori pentru sterilizarea camerelor unde cresc animale “germ-free”, pentru care este însă
toxic.

ACŢIUNEA AGENŢILOR BIOLOGICI ASUPRA BACTERIILOR.

BACTERIOFAGUL ŞI FENOMENELE DE BACTERIOFAGIE
In anul 1915, Twort a observat caracterul vitros (sticlos) al unor colonii de
stafilococ. După 2 ani (1917), d’Herelle a izolat un principiu litic din filtratele de fecale
de la bolnavi cu dezinterie bacilară. Cele două descoperiri se datorau existenţei unor
virusuri ale bacteriilor, capabile să lizeze celula bacteriană (bacteriofagi).
Din anul 1920, Jules Bordet şi Mihail Ciucă au descris fenomenul de “lizogenie”
(infecţia simbiotică a bacteriei cu bacteriofag, fără liza celulară, însoţită de modificări ale
bacteriei purtătoare).

1. MORFOLOGIA ŞI COMPOZIŢIA CHIMICĂ A BACTE-RIOFAGULUI

1.1. FAGII ADN
O particulă de bacteriofag cu morfologie tipică, cuprinde: capul şi coada (figura 1).
- Capul conţine un miez de acid nucleic şi un înveliş proteic. Miezul de acid nucleic este
format din ADN cuprinzând circa 50% din greutatea uscată a bacteriofagului. Învelişul
proteic (capsida) dă forma poligonală a capului şi este format din subunităţi identice de
proteină. De fapt, învelişul formează în spaţiu o prismă hexagonală.
- Coada este partea cu care bacteriofagul se ataşează de suprafaţa celulei bacteriene.
Coada variază în ceea ce priveşte complexitatea structurală, de la un bacteriofag la altul
(bacteriofagul T2 de Escherichia coli prezintă o coadă cu complexitate foarte mare).
 În general, coada are trei părţi: miezul lacunar, teaca contractilă şi placa bazală
terminală. Placa bazală terminală are formă hexagonală, purtând ataşate “fibrele cozii”.

Figura 1: Morfologia şi stadiile funcţionale ale unui bacteriofag (după Murray, Drew,
Kobayashi, 1990)

Coada bacteriofagului se poate găsi în două stadii funcţionale: stadiul relaxat şi

stadiul contractat.

- în stadiul relaxat, teaca contractilă acoperă aproape în întregime miezul lacunar, iar
fibrele cozii nu sunt vizibile;

- în stadiul contractat, teaca terminală contractilă apare scurtată, miezul lacunar este
vizibil pe o mai mare întindere, iar placa terminală prezintă fibrele cozii evidente.
Proteinele care formează capsida capului, miezul lacunar al cozii, teaca contractilă
şi fibrele cozii sunt distincte.
În afară de forma tipică de morfologie a bacteriofagilor, pot exista şi alte forme,
atipice: bacteriofagi fără coadă (unii bacteriofagi ADN) sau bacteriofagi filamentoşi -
cu morfologie variată (bacteriofagi “fd” în formă de baghetă, cu ADN al capului şi
proteinele de înveliş legate în reţea, însă insuficient precizată ca structură a subunităţilor
componente).

1.2. FAGII ARN

Descrişi mai curând, fagii ARN (f2, MS2, R17, OB) prezintă morfologie aparte. Unui
asemenea tip de bacteriofag i se descriu:
- un miez de ARN monocatenar (cu greutate moleculară de 4x106 daltoni şi având o
structură “autocomplementară” complexă, de tip terţiar);
- capsidă formată din circa 180 unităţi (capsomere). Proteinele capsidale sunt de două
categorii şi anume:
 de inveliş, cu greutate moleculara de 14.000 daltoni (“proteina A” fagică);
 de maturare, cu greutate moleculară de 40.000 daltoni (ARN- polimeraza- ARN-
dependentă).
Fagii ARN intervin în fenomenele de conjugare cromozomială (fixare de fimbriile
bacteriei donatoare F+), ca şi în lizogenizarea unor bacterii intestinale.

2. TIPURI DE RELAŢIE BACTERIOFAG-BACTERIE

Bacteriofagul este un virus bacterian, a cărui gazdă este deci o bacterie. Ataşarea
bacteriofagului de suprafaţa celulei bacteriene depinde de existenţa pe această suprafaţă a
unor receptori.
Din punct de vedere al ataşării, se disting genetic bacterii lizosensibile (care permit
ataşarea şi intrarea bacteriofagului) şi bacterii lizoresistente (care nu permit ataşarea şi
intrarea bacteriofagului).
Lizorezistenţa naturală (genetică) trebuie deosebită de rezistenţa unei bacterii la
“infecţia” cu bacteriofag, datorită purtării de către bacterie, în intrior, a unui fag temperat
(fenomen de lizogenie).
Se cunosc două categorii de relaţii bacteriofag-bacterie şi anume: relaţii de tip litic
şi relaţii de tip simbiotic.

2.1. RELAŢII BACTERIOFAG-BACTERIE DE TIP LITIC

În acest tip de relaţie, pătrunderea bacteriofagului în celula bacteriană lizosensibilă
se soldează cu moartea celulei (cu unele rare excepţii), precum şi cu eliberarea din
celulă a unor particule de bacteriofag neoformate.
“Infecţia” fagică de tip litic implică mai multe etape şi anume: adsorbţia,
penetrarea, replicarea intracelulară, maturarea particulelor fagice neoformate, eliberarea
particulelor fagice neoformate.

a. Adsorbţia
Datorită prezenţei receptorilor pe suprafaţa celulei bacteriene lizosensibile,
particulele de fag se adsorb pe această suprafaţă şi anume prin ataşarea cozii (fibrelor
cozii) pe receptori. Pe suprafaţa unei celule bacteriene, se pot ataşa până la 100 particule
fagice.
Ataşarea pe receptori se bazează pe proprietatea de specificitate: receptorii unei
celule bacteriene sunt înalt specifici pentru anumiţi bacteriofagi. Specificitatea de
receptori fagici se datoreşte naturii chimice a peretelui celular bacterian (dispoziţia
reţelei de mucopeptide). De pildă, pentru bacteriofagii de Escherichia coli T3, T4, T7,
receptorii se găsesc în stratul lipopolizaharidic din peretele celular, în vreme ce pentru
bacteriofagii T2 şi T6, în stratul de lipoproteine din perete.
Există o “competiţie” pe receptori între doi fagi (celula Escherichia coli cu fagB/2
ataşat, nu permite ataşarea suplimentară a fagului T2).

b. Penetrarea
 Odată ataşat, bacteriofagul “injectează” acidul nucleic al capului în celula
bacteriană, trecând din stadiul relaxat în stadiul contractat al cozii. Faptul că acidul
nucleic al capului intră în celulă, iar proteina de înveliş rămâne în exteriorul celulei, a fost
demonstrat prin marcarea acidului nucleic fagic (ADN ) cu izotopul Td3H şi, respectiv, a
proteinei de înveliş (capsidei) cu izotopul S35.
De la această regulă, fac excepţie bacteriofagii filamentoşi ”fd”, care pătrund în
întregime în celula bacteriană (ADN + proteina).

c. Replicarea intracelulară
Replicarea bacteriofagilor ADN
După câteva minute de la pătrunderea acidului nucleic fagic (perioada de
“eclipsă”), ADN-ul fagic începe să “comande” prin genele sale, în celula bacteriană
gazdă, sinteza unor proteine “precoce” (“early proteins”), din care fac parte enzimele
necesare sintezei crescute de ADN de tip fagic. Dintre aceste enzime, cea mai importantă
este o nouă ADN-polimerază (fag- dependentă), dar şi altele, ca:
nucleosidtrifosfatkinaza, timidil-sintetaza.
Concomitent are loc “paralizarea” ADN celular (oprirea sintezelor celulare
codificate de ADN propriu).
În continuare, “copiile” de ADN fagic (rezultate din acţiunea enzimelor “precoce”)
determină, folosind aparatul de sinteză al celulei (ribozomi), formarea de neoproteine
fagice “tardive” (“late proteins”), care se asamblează în jurul moleculelor de ADN fagic,
dând naştere capsidei capului şi celorlalte componente proteice ale particulelor fagice
neoformate.

Replicarea bacteriofagilor ARN

Când ARN fagic intră în celula bacteriană, acţionează el însuşi ca un mesager la
nivelul ribozomilor, unde se sintetizează mai întâi o ARN-sintetază, care asigură apoi
formarea de “copii” de ARN fagic, care, la rândul lor, “codifică” în ribozomi sinteza de
proteine pentru formarea capsidei particulelor neoformate. O fază intermediară în
replicarea bacteriofagilor ARN este formarea unui ARN dublu catenar, rezultat din
lanţul de ARN al particulelor fagice pătrunse în celulă (lanţ ”plus”), legat complementar
cu un lanţ, rezultat din acţiunea ARN-sintetazei de tip fagic (lanţ “minus”).

d. Maturarea particulelor fagice neoformate

Prin asamblarea dintre moleculele de acid nucleic fagic nou formate în celulele
gazdă şi proteinele fagice “tardive”, de asemenea nou sintetizate, după modelul
“codificat” de acidul nucleic fagic, rezultă noile particule de bacteriofag.

e. Eliberarea particulelor fagice neoformate

La un moment dat, particulele fagice care “umplu” spaţiul celular bacterian, produc
“explozia” peretelui celular şi membranei citoplasmatice, cu liza celulară concomitentă
şi cu eliberarea în mediul exterior a particulelor fagice neoformate, capabile ca, în
prezenţa altor celule bacteriene lizosensibile să reia ciclul de tip litic.
Şi de această dată, excepţia o fac bacteriofagii filamentoşi “fd”, care trec prin
membrana citoplasmatică şi perete, fără a determina liza consecutivă a celulei.
2.2. RELAŢII BACTERIOFAG-BACTERIE DE TIP SIMBIOTIC
 Fenomenul intrării unui bacteriofag într-o celulă bacteriană, fără a determina liza
acesteia şi integrarea materialului genetic fagic în cromozomul bacterian, poartă
numele de “lizogenie”.
În acest tip de relaţie bacteriofag-bacterie, după ataşarea şi penetrarea
bacteriofagului în celula gazdă, nu se produce replicarea independentă a acidului nucleic
fagic, ci acesta se integrează în ADN celular (cromozomul bacterian), replicându-se odată
cu replicarea ADN celular (diviziunea celulei). Bacteriofagii capabili de a stabili o
relaţie de tip simbiotic cu bacteria purtatoare sunt denumiţi “profagi” sau “bacteriofagi
temperaţi”.
Etapele “infecţiei” fagice de tip simbiotic sunt: adsorbţia, penetrarea acidului
nucleic fagic, “circularizarea” ADN fagic, cuplarea ADN fagic circular cu ADN
bacterian.
Bacteriile care conţin în interior fagi temperaţi se numesc “bacterii lizogene”.
Ele sunt rezistente (“imune”) la “infecţia” cu un alt bacteriofag omolog. Acest fenomen
se datoreşte eliberării în citoplasma celulei lizogene a unei substanţe “represor”, care
inhibă multiplicarea unui fag litic pătruns în celulă.
Substanţa “represor” acţionează şi asupra profagului existent în celula lizogenă,
împiedicând desprinderea acestuia din inelul comun ADN fagic-ADN bacterian şi,
respectiv, iniţierea sintezelor fagice pentru declanşarea “infecţiei” de tip litic.
Inducţia reprezintă procesul prin care un fag temperat (profag) aflat într-o celulă
bacteriană lizogenă, trece în forma sa litică (“virulentă”), adică îşi desprinde acidul
nucleic din cromozomul bacterian şi iniţiază sinteze de tip fagic la nivelul aparatului
ribozomul celular, cu determinarea lizei celulei şi eliberării de particule fagice “virulente”
în mediu, capabile să reia un ciclu de tip litic în alte celule lizosensibile. Fenomenul de
inducţie se datoreşte inactivării sau distrugerii substanţei “represor” (figura 2).
Agenţii capabili să producă fenomenul de inducţie (agenţi inductori) pot fi variaţi:
temperatura de 440C, iradierea cu ultraviolete, agitaţia mecanică, etc. Agenţii inductori ar
acţiona, după unii autori, prin determinarea în celulă a sintezei unei substanţe
“inductor”, care inactivează secundar substanţa “represor”. Natura acestei substanţe
“inductor” nu este încă cunoscută. Pe de altă parte, apar o serie de proprietăţi noi ale
celulei. De exemplu: tulpinile de Corynebacterium diphteriae, prin lizogenizare (purtarea
unui fag temperat) devin toxigene (producătoare de toxină difterică). De asemenea, unii
streptococi beta hemolitici sunt capabili de a sintetiza toxina eritrogenă numai în cazul
când poartă în interior fagi temperaţi specifici.
 Figura 2: Lizogenie-Inducţie (după Murray, Drew, Kobayashi, 1990)

Acest fenomen de schimbare a unor proprietăţi ale celulei bacteriene, prin

prezenţa profagului, poartă numele de “conversie”. Intrarea fagului temperat în celulă
determină exprimarea unor gene celulare preexistente, represate până atunci. “Conversia“
lizogenă diferă de “transducţie”, la care genele care caracterizează noile proprietăţi sunt
cuprinse exclusiv în genomul fagului infectant.

3. IMPORTANŢA FENOMENULUI DE BACTERIOFAGIE ÎN

MEDICINĂ
Genetica bacteriofagilor. Bacteriofagii prezintă două însuşiri genetice importante
şi anume: stabilitatea tipului şi rata joasă de variaţie genetică. Fenomenele genetice
legate de bacteriofag sunt: mutaţia fagică, transducţia, recombinarea fagică, restricţia şi
modificarea.

 Mutaţia fagică. Toate proprietăţile unui bacteriofag sunt controlate de genele din
acidul nucleic fagic. Mecanismul de mutaţie genetică se aplică şi la bacteriofag, ca şi la
bacterii, celulele animale sau virusuri animale. Deci, cu prilejul replicării fagului în
celula bacteriană, pot apărea indivizi prezentând o “greşeală” în molecula de ADN, care
conferă particulei neoformate proprietăţi noi.

 Transducţia. Este fenomenul introducerii în genomul (cromozomul) bacterian a

unor gene cu ajutorul materialului genetic fagic, cu apariţia consecutivă de proprietăţi
noi ale celulei bacteriene, codificate de genele fagice introduse în ADN celular.

 Recombinarea fagică. Când pe suprafaţa aceleiaşi celule bacteriene, se adsorb

simultan doi sau mai mulţi bacteriofagi ADN înrudiţi, dar uşor diferiţi genetic, ambii pot
“infecta” celula şi se pot reproduce. În acest caz, unii din indivizii fagici neoformaţi
sunt recombinaţi, adică posedă proprietăţi ale ambelor categorii de particule fagice
infectante. De exemplu: dacă o celulă de Escherichia coli este supusă contactului cu doi
fagi T2, unul care produce plaje cu dimensiuni mici, precoce, iar altul care produce plaje
cu dimensiuni mari, tardiv, se obţin particule recombinate, care dau plaje cu dimensiuni
mari, precoce.

 Restricţia şi modificarea. S-a observat că o anumită categorie de bacteriofagi se

multiplică la o rată înaltă în anumite tulpini de Escherichia coli şi la o rată joasă în alte
tulpini aparţinând aceleiaşi specii bacteriene. Aceasta se explică prin faptul că, în celula
bacteriană ar exista două enzime complementare, una modificatoare (care acţionează
asupra ADN fagic, făcându-l apt de a funcţiona ca “matrice”), alta restrictivă (care
degradează orice formă de ADN din celulă care nu a fost “modificat” de enzima
modificatoare). În cazul “infecţiei” cu bacteriofag a celulei bacteriene, o parte din ADN
pătruns din exterior nu este modificat, deci este supus degradării, iar o altă parte,
modificat fiind, nu mai este degradat şi iniţiază sintezele de tip fagic proprii ciclului litic.
Fenomenul de restricţie se întâlneşte mai ales la tulpini bacteriene unde activitatea celor
două enzime este astfel coordonată, încât un număr relativ mic de molecule de ADN
fagic funcţionează ca “matrice” pentru determinarea apariţiei particulelor fagice
neoformate.

BACTERIOCINELE
Reprezintă substanţe de natură proteică, elaborate de anumite specii bacteriene,
care au efect bactericid (litic) asupra unor tulpini de bacterii de aceeaşi specie sau din
specii înrudite cu a tulpinii secretoare. Acţiunea bactericidă depinde de existenţa pe
suprafaţa bacteriei a unor receptori specifici. Din acest punct de vedere, se disting:
bacterii bacteriocino-sensibile (cu receptori) şi bacterii bacteriocino-rezistente (fără
receptori). Efectul bacteriocinelor este letal. De asemenea, trebuie reţinut că elaborarea de
bacteriocine de către un individ bacterian echivalează cu liza celulei bacteriene secretoare
însăşi.
Bacteriocinele prezintă o greutate moleculară relativ mare (50.000-80.000 daltoni)
şi un spectru antibacterian mult mai larg decât al antibioticelor. Acţiunea litică a
bacteriocinelor este puternică, fiind suficientă o singură moleculă pentru a produce liza
unei celule. Ca şi în cazul bacteriofagilor, celulele bacteriene în funcţie de specie şi
tulpină, au o susceptibilitate diferită faţă de bacteriocine, datorită prezenţei de receptori
pe suprafaţa peretelui celular bacterian.
Mecanismele intime ale activităţii intracelulare a bacteriocinelor comportă
următoarele secvenţe: depolimerizarea ADN nuclear, inhibiţia sintezei de proteine
bacteriene (prin impiedicarea citirii de către ribozom a mesajului înscris pe ARN
mesager); creşterea permeabilităţii membranei citoplasmatice (cu compromiterea
barierei osmotice şi selective a celulei).
Din punct de vedere practic, spectrul de activitate al unei bacteriocine, elaborată de
anumite specii sau tulpini bacteriene, poate fi utilizat ca indicator, el fiind caracteristic.
Metoda de testare a spectrului bacteriocinelor se numeşte bacteriocinotipie
(caracterizarea unei tulpini bacteriene circulante în populaţia umană, pe baza spectrului
litic al bacteriocinelor elaborate). Bacteriocinotipia are, deci, importanţă epidemiologică,
alături de lizotipie, pentru caracterizarea unor tulpini de Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa (implicate în etiologia unor infecţii interioare).
 NOŢIUNI DE CHIMIOTERAPIE ANTIBACTERIANĂ

1. INTRODUCERE
Părintele chimioterapiei antiinfecţioase este Paul Ehrlich, care, după numeroase
sinteze şi cercetări asupra compuşilor arsenicali, obţine, în anul 1909, salvarsanul
(compusul 606) activ asupra Treponemei pallidum şi altor spirochete.
Ehrlich a fost primul care a formulat principiile chimioterapiei:
 Chimioterapicul trebuie să prezinte o “toxicitate selectivă”, adică să aibă efect
inhibant net asupra bacteriilor infectante, dar să fie relativ nenociv pentru organismul
uman bolnav. Aceasta constituie diferenţa fundamentală între agenţii chimioterapici şi
substanţele dezinfectante uzuale, care sunt foarte active faţă de bacterii, dar greu de
tolerat de către organismul uman, în concentraţiile lor eficiente (bactericide sau
bacteriostatice).
 Există o înrudire particulară de ordin chimic între germen şi chimioterapic. Aceasta
duce la posibilitatea apariţiei dependenţei microorganismului faţă de chimioterapic.
 Din cea de-a doua caracteristică a chimioterapiei, rezultă necesitatea folosirii
combinate (asociate) a mai multor chimioterapice.
În anul 1929, Fleming descoperă penicilina, secretată de mucegaiul Penicillinum
notatum, dar introducerea ei în terapie s-a produs abia după un deceniu, fiind meritul a
doi chimişti de la Oxford, Florey şi Chain.
Studiind acţiunea bactericidă a unor coloranţi, Domagk (1934) descoperă că
prontozilul roşu administrat la şoareci, îi protejează de efectul letal al infecţiei
experimentale cu streptococi beta hemolitici, în ciuda faptului că in vitro este lipsit de
activitate bactericidă.
Trefouel şi Niti (1935) arată că, în organismul şoarecilor, prontozilul se
descompune într-un compus cu acţiune bacteriostatică, numit sulfamidă.

2. DEFINIŢIE
Chimioterapicele sunt substanţe capabile să exercite, în doze mici, un efect
inhibitor asupra bacteriilor. Acest efect poate fi: letal (bactericid) sau numai de
împiedicare a multiplicării microorganismului (bacteriostatic).
În trecut, sub denumirea de chimioterapice, erau desemnate substanţele
antimicrobiene obţinute prin sinteză chimică (sulfamide, sulfone, nitrofurani, etc.), iar
sub cea de antibiotice, substanţele de origine biologică, secretate de bacterii şi
mucegaiuri. Cu timpul însă, unele antibiotice s-au obţinut mai uşor pe cale sintetică decât
pe cale biologică (de exemplu: cloramfenicolul), motiv pentru care, termenul de
chimioterapic antiinfecţios este utilizat astăzi pentru orice substanţă folosită în
tratamentul infecţiilor, indiferent de origine.
Introducerea chimioterapiei antiinfecţioase a dus la o creştere spectaculoasă a ratei
de supravieţuire după infecţii. Astfel, în decurs de 50 de ani, a apărut, sub presiune
selectivă, fenomenul de rezistenţă. Ca urmare, producerea de chimioterapice
antiinfecţioase, a devenit o industrie care, fiind în permanenţă concurenţă cu apariţia
tulpinilor rezistente, caută noi produşi faţă de care microorganismele să fie sensibile.
Introducerea unui nou chimioterapic în practica medicală este evaluată la 200
milioane de dolari şi parcurge mai multe etape care durează aproximativ 10 ani.

3. CLASIFICARE
Clasificarea chimioterapicelor poate fi efectuată după mai multe criterii şi anume:
structură chimică, origine, scopul folosirii, spectru de activitate, mecanism de acţiune,
după felul în care îsi exercită efectul antibacterian, etc.

3.1. DUPĂ STRUCTURA CHIMICĂ

În tabelul 1, sunt cuprinse categoriile de chimioterapice antibacteriene, cu
reprezentanţii lor mai însemnaţi, ţinând seama de criteriul compoziţiei chimice.

3.2. DUPĂ ORIGINE

Se disting:
- Antibiotice produse de microorganisme (Penicilina, Polimixina, Bacitracina).
- Produşi de semisinteză, preparaţi în laborator (sinteză) pe baza unui nucleu sintetizat de
către un microorganism (Meticilina, din familia penicilinelor).
- Produşi de sinteză chimică integrală - chimioterapice sintetice (sulfamidele, Acidul
nalidixic, penicilinele sintetice, etc.).

3.3. DUPĂ SCOPUL FOLOSIRII

Din acest punct de vedere, se cunosc chimioterapice: antibacteriene, antifungice,
antiparazitare, antivirale.
În cadrul capitolului de faţă, ne vom referi în speţă la chimioterapicele
antibacteriene.

Categorie Preparate comerciale

chimio
terapi
ce
Betalactamine Peniciline: Penicilina G (injectabilă)
Penicilina depozit-Moldamin
(injectabilă)
Penicilina V (administrare orală)
Ampicilina
Oxacilina, Cloxacilina
Carbenicilina
 Cefalosporine: Cefalotin, Cefazolin,
Cefamicina
Aminoglicoside Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina,
Neomicina
Spectinomicina
Polimixine Polimixina B, Polimixina E (Colistin)
Alte antibiotice Cloramfenicol
Tetracicline
Macrolide: Eritromicina, Oleandomicina,
Spiramicina
Lincomicina
Clindamicina
Acid fusidic
Novobiocin
Vancomicina
Rifampicina (Rifamicina)
Chimioterapice Sulfamide, Trimetropin (Biseptol)
antibacteriene Acid nalidixic (Negram)
considerate Nitrofurane (Nitrofurandoid)
“nonantibiotice” Tiosemicarbazona
Isoniazida
Acidul paraaminosalicilic (PAS)

Tabel 1: Clasificarea antibioticelor după structura chimică

3.4. DUPĂ SPECTRUL DE ACTIVITATE

După acest criteriu chimioterapicele pot fi: cu spectru larg şi cu spectru îngust
(sau relativ îngust).

a. Chimioterapicele cu spectru larg (Cloramfenicolul, tetraciclinele, Ampicilina,

sulfamidele, cefalosporinele).
Ca efecte adverse, pot determina:
 Alergii-anafilaxie, rash cutanat, nefrite, granulocitopenii, anemii hemolitice;
 Toxicitate: tromboflebite după administrarea intravenoasă, hipoprotrombinemie;
 Suprainfecţii: cefalosporinele din a doua şi a treia generaţie. Acestea au un spectru de
acţiune mai scăzut asupra bacteriilor Gram pozitive (stafilococi, enterococi), fiind astfel
posibile suprainfecţii cu aceste microorganisme şi cu fungi.

b. Chimioterapicele cu spectru îngust (sau relativ îngust):

- Acţiune predominantă asupra bacteriilor Gram pozitive (majoritatea penicilinelor,
Eritromicina, Streptomicina, Clindamicina).
- Acţiune predominantă asupra unor bacterii Gram negative (Cicloserina, Kanamicina,
peniciline, sulfamide, Gentamicina, cefalosporine)
- Acţiune predominantă asupra bacilului tuberculos: Streptomicina, Hidrazida acidului
izonicotinic (HIN), Acidul paraaminosalicilic (PAS).
- Acţiune predominantă asupra spirochetelor: Penicilina, Salicilatul de bismut.

3.5. DUPĂ FELUL ÎN CARE ÎŞI EXERCITĂ EFECTUL ANTI- BACTERIAN

Chimioterapice bacteriostatice: împiedică multiplicarea germenilor bacterieni

(Cloramfenicol, sulfamide);
Chimioterapice bactericide: au efect letal asupra celulei bacteriene, fie în faza de creştere
logaritmică (Penicilina), fie în faza de lag (Streptomicina).

3.6. DUPĂ MECANISMUL DE ACŢIUNE

- Agenţi care acţionează asupra structurilor de suprafaţă ale celulei bacteriene (perete
celular, membrana citoplasmatică);
- Agenţi care interferă cu sinteza proteinelor celulei bacteriene;
- Agenţi care interferă cu sinteza acizilor nucleici în celula bacteriană.

4. METODE DE TESTARE A SENSIBILITĂŢII BACTERIILOR FAŢĂ DE

CHIMIOTERAPICE

În scopul aprecierii sensibilităţii sau rezistenţei bacteriilor la chimioterapice,

se folosesc metode in vitro şi in vivo.

7.1. METODE IN VITRO (ANTIBIOGRAMA)

Există, în principiu, două posibilităţi de testare a activităţii antibacteriene a

chimioterapicelor: antibiograma în diluţii şi antibiograma difuzimetrică.

Antibiograma în diluţii. Prin antibiograma în mediu lichid, în diluţii crescânde

de antibiotic, se poate stabili precis concentraţia minimă inhibitorie (CMI) şi

concentraţia minimă bactericidă (CMB) a antibioticului faţă de o anumită specie

bacteriană. Se foloseşte în cercetare, deoarece este pretenţioasă din punct de vedere

tehnic, presupune un consum mare de materiale şi depăşeşte în general necesităţile

clinice.

Antibiograma difuzimetrică. În examenele bacteriologice de rutină se utilizează

antibiograma difuzimetrică, în mediu solid, după tehnica Kirby-Bauer. Ea constă în

însămânţarea tulpinii de cercetat pe suprafaţa unui mediu solid şi aplicarea unor

microcomprimate de antibiotice pe suprafaţa mediului. După o termostatare de 16 ore

se apreciază sensibilitatea germenului în funcţie de diametrul zonei de inhibiţie care

apare în jurul microcomprimatului de antibiotic. Fiecare firmă producătoare de

microcomprimate livrează, împreună cu acestea, o listă din care rezultă

corespondenţa diametrului zonei de inhibiţie măsurat în mm şi sensibilitatea la

fiecare microcomprimat.

Recent s-a introdus o altă variantă de antibiogramă pe mediu solid, testul E,

care permite stabilirea precisă a CMI. În loc de microcomprimate se aplică pe mediul

de cultură însămânţat fâşii de hârtie de filtru împregnate cu antibiotic în

concentraţie crescândă. Astfel, la un capăt al fâşiei concentraţia este minimă, iar la

celălalt capăt, maximă. După diametrul zonei de inhibiţie corespunzătoare fiecărei

concentraţii, se va putea calcula CMI.

Cunoscând CMI pentru antibioticele la care un germene este sensibil, nivelul

seric maxim care se poate realiza şi capacitatea de difuziune a antibioticului în

focarul infecţios, se va putea alege varianta optimă de tratament.

7.2. METODE IN VIVO

 Se bazează pe titrarea activităţii inhibitorii antimicrobiene a unui chimioterapic

în umorile bolnavului căruia i se aplică tratamentul cu acel chimioterapic. Testarea

se face faţă de tulpini standard de bacterii din specia celei incriminate în etiologia

cazului, sau faţă de tulpini standard cunoscute a fi foarte sensibile la acel

chimioterapic (exemplu: tulpina de stafilococ şi tulpina Marbury de Bacillus

subtilis, etc). În paralel, se introduce o scară etalon de chimioterapic (diluţii

succesive de chimioterapic, pornind de la o concentraţie bine determinată), în

vederea comparării cu seria de diluţii test (ser sanghin sau alte umori, în diluţii).

Testarea sensibilităţii la chimioterapice prin antibiogramă se va face la tulpini

izolate, înainte de introducerea în terapia cazului a antibioticelor sau altor

chimioterapice.

PROCESUL INFECŢIOS

PROCESUL INFECŢIOS este definit ca un ansamblu de fenomene

fiziopatologice şi clinice, apărute în urma conflictului dintre microorganism (dotat cu
multiple şi variate mijloace de agresiune), şi organism (înarmat cu posibilităţi complexe
de apărare).

INFECŢIA se poate defini ca totalitatea modificărilor biologice care se

declanşează în organismul uman la pătrunderea agentului infecţios, modificări care
sunt la baza alterării homeostaziei organismului.

Un caracter important al infecţiei îl constituie specificitatea etiologică (un anumit

agent infecţios produce o anumită boală infecţioasă).
Specificitatea etiologică a fost enunţată prin postulatele lui Robert Koch. Astfel,
pentru a incrimina un agent microbian drept agent etiologic al unei infecţii, trebuie
îndeplinite următoarele condiţii:
- izolarea constantă a germenului din leziunea specifică;
- obţinerea lui în cultură pură şi întreţinerea lui prin treceri succesive pe medii de
cultură;
- reproducerea experimentală a bolii, prin inocularea culturii de germen la animalul de
laborator;
- izolarea aceluiaşi tip de germen din leziunile animalului de laborator.
 CARACTERELE GENERALE ALE INFECŢIEI
1. PATOGENIE
În orice infecţie au loc următoarele evenimente:
- contaminarea (întâlnirea macroorganismului cu agentul infecţios);
- pătrunderea microorganismului;
- multiplicarea germenilor în organismul gazdă prin eludarea rezistenţei
antiinfecţioase;
- apariţia injuriilor morfologice şi funcţionale, datorate atât acţiunii directe a
agentului infecţios, cât şi reacţiilor de apărare ale organismului;
- deznodământul infecţiei: vindecarea (cu sau fără sechele); exitusul; coexistenţa pe
timp îndelungat a celor doi parteneri ai infecţiei (agentul infecţios şi organismul).

1.1. CONTAMINAREA
Reprezintă întâlnirea organismului cu microbul patogen şi are loc prin depunerea
acestuia pe învelişuri (tegumente şi mucoase care căptuşesc cavităţile natural deschise),
sau pătrunderea prin leziuni (soluţii de continuitate între mediul intern al organismului şi
mediul extern).
Prima întâlnire a organismului cu microbii se realizează la naştere, când nou-
născutul vine în contact cu microorganismele prezente în canalul vaginal şi pe pielea
mamei. Până la naştere el a fost protejat de membranele fetale şi placentă, placentă ce
permite pătrunderea unui număr foarte redus de microorganisme din circulaţia mamei,
cum ar fi, de pildă, unele virusuri (rujeolos, rubeolic, HIV, citomegalic), bacterii
(Treponema pallidum), unii paraziţi (Toxoplasma gondii).
După naştere nou-născutul se poate apăra de microorganismele cu care vine în
contact datorită anticorpilor pe care îi primeşte de la mamă, pe cale sanguină, la care se
adaugă cei din colostrul şi laptele matern. Aceşti anticorpi îi asigură o protecţie relativă
faţă de infecţie, până când va începe să-şi dezvolte propriile mecanisme de apărare
antiinfecţioasă.
În timpul vieţii extrauterine o parte din microorganismele cu care organismul vine
în contact va dispărea, o parte va coloniza tegumentele şi mucoasele şi doar o mică parte
vor produce infecţii propriu-zise.

Contaminarea poate fi exogenă şi endogenă.

 CONTAMINAREA EXOGENĂ se produce prin contactul organismului cu

agentul infecţios din mediul înconjurător. Căile de contaminare pot fi: hidrică,
alimentară, respiratorie, contact sexual, muşcături de animal, înţepături de insecte, prin
plagă murdărită cu pământ, contaminări iatrogene prin instrumente medicale (seringă,
catetere, endoscoape) etc.

 CONTAMINAREA ENDOGENA înseamnă contaminarea cu germeni de pe

suprafaţa tegumentelor şi mucoaselor. Aceste microorganisme produc infecţii dacă
traversează barierele anatomice şi pătrund în ţesuturi (exemplu: E. Coli ce face parte din
flora normală a intestinului, pătruns la nivelul căilor urinare, va determina infecţie la
acest nivel).
 De remarcat, este faptul că nu orice contaminare este urmată de infecţie. Apariţia
sau nu a infecţiei este condiţionată de gradul de patogenitate şi numărul bacteriilor
contaminante, de starea de rezistenţă a organismului, la rândul ei influenţată de
factorii de mediu extern (umezeala excesivă, extremele de temperatură pot favoriza
apariţia unor infecţii). Pe de altă parte, agenţii infecţioşi din flora normală a
organismului, care nu produc infecţii la individul sănătos, le vor produce la persoanele
cu rezistenţa generală a organismului scăzută (subnutriţie, carenţa de vitamine, oboseală,
sarcină), la pacienţii cu anumite boli endocrine (diabet, hipotiroidie, insuficienţă
suprarenală etc.), în cursul tratamentelor imunosupresive sau la pacienţii cu deficienţe
imune genetice sau dobândite etc.

1.2. PĂTRUNDEREA GERMENILOR ÎN ORGANISM (POARTA DE INTRARE)

Poarta de intrare este locul de colonizare (înmulţire) primară şi pătrundere a

microbului în organism. Această poartă poate fi o mucoasă sau tegumentul, intacte sau
lezate. Unele specii au poartă de intrare unică şi foarte specifică, altele au porţi de
intrare multiple. Aceste diferenţe sunt condiţionate: de sursa şi calea de contaminare, de
condiţiile de înmulţire oferite de fiecare mucoasă sau tegument (pH, temperatură, grad de
umiditate), ca şi de existenţa unor receptori celulari specifici pe care microbii se fixează
în mod selectiv.
Exemple de bacterii cu poartă de intrare unică: bacilul tific, vibrionul holeric,
produc infecţia numai dacă ajung în organism pe cale digestivă; speciile Shigella
infectează numai prin mucoasa colonului; gonococul şi Treponema pallidum, pentru a
produce bolile venerice, pătrund prin mucoasa genitală şi în mod excepţional pe alte căi.
Exemple de bacterii care pot pătrunde în organism pe mai multe căi, determinând infecţii
cu diferite localizări: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis.
În funcţie de specie, tulpină şi variantă genetică a bacteriei infectante,
microorganismele pătrund în organismul gazdă pe diferite căi:
- calea respiratorie: streptococii β -hemolitici, stafilococi patogeni, pneumococi,
meningococi, Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis,
Haemophilus influenzae, Pasteurella pestis.
- calea digestivă: Salmonella, Shigella, vibrionul holeric, Escherichia coli, Bacillus
anthracis, Clostridium botulinum, stafilococi, streptococi.
- calea genitală: gonococi, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum.
- calea cutanată (soluţii de continuitate de la nivelul pielii): streptococi β -hemolitici,
stafilococi patogeni, Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthracis.
- căi urinare: Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa,
streptococi de grup D (enterococi).
Unele microorganisme pot trece direct prin pielea intactă, datorită unor mişcări
de înşurubare, cum este cazul bacteriilor spiralate ale genului Leptospira. Altele pot
traversa epiteliul mucoasei respiratorii, digestive, a tractului genito-urinar, conjunctiva.
Microorganismele care reuşesc să pătrundă pe aceste căi dispun de mecanisme speciale
de aderenţă, ce depăşesc mecanismele rezistenţei naturale (lacrimi, mucus, mişcările
cililor vibratili).
 Alţi agenţi infecţioşi pătrund direct în sânge sau ţesuturile profunde prin leziuni
traumatice, muşcătura unor animale (virusul rabic), înţepătura unor insecte (Yersinia
pestis, Plasmodium falciparum) sau acte medicale (injecţii, transfuzii) efectuate fără
respectarea normelor de asepsie (HIV, virusul hepatitei B, C, rickettsii, etc.)

1.3. MULTIPLICAREA GERMENILOR

Numărul de microorganisme care pătrund în organism (mărimea inoculului) este
prea mic, în mod obişnuit, pentru a iniţia infecţia. Agenţii infecţioşi trebuie să învingă
mecanismele de apărare antiinfecţioasă ale gazdei şi să se înmulţească la un nivel
corespunzător pentru a produce simptome. Indiferent de gradul ei de patogenitate, este
necesară adaptarea bacteriei la noile condiţii oferite la poarta de intrare: când acestea
sunt favorabile, bacteria se înmulţeşte şi secretă factori enzimatici de virulenţă şi uneori
toxine care vor determina leziunea iniţială. Cu cât bacteria este mai patogenă, cu atât
este necesar un număr mai redus pentru a declanşa infecţia (pesta, bruceloza,
leptospiroza); în schimb, este necesar un număr mare de bacterii pentru a produce, de
exemplu, febra tifoidă, lepra.
Multiplicarea microorganismelor se poate face intracelular sau extracelular.
Microorganismele cu habitat extracelular sunt supuse acţiunii complementului (C′ ),
lizozimului, anticorpilor, fagocitozei etc., pe când cele cu habitat intracelular sunt
protejate de aceşti factori. Eliminarea din organism a microorganismelor cu habitat
intracelular se face prin distrugerea celulelor în care se află, ceea ce duce la producerea
de leziuni tisulare.

1.4. LOCALIZAREA INFECŢIEI

Unele bacterii rămân localizate la poarta de intrare şi se multiplică numai într-o
zonă relativ limitată, fără a invada organismul - bacterii neinvadante. Exemplu:
bacteriile toxigene (speciile genului Clostridium, Corynebacterium diphteriae,
Salmonalla, Shigella, vibrionul holeric). După multiplicarea la poarta de intrare a
microorganismului, este secretată toxina care este vehiculată de sânge în organism,
toxină care este responsabilă de apariţia bolii. În cazul bacilului botulinic, acesta îşi
secretă toxina numai în condiţii de anaerobioză, la 30°C (în conservele alimentare), fără
să pătrundă în organism, boala fiind practic o intoxicaţie ce se produce prin consumul
alimentelor conservate.
În cazul altor bacterii, infecţia se poate propaga de la poarta de intrare prin
contiguitate (din aproape în aproape) şi prin diseminare la distanţă pe cale sanguină
sau/şi limfatică, cu fixarea germenilor în anumite zone de elecţie. În acest caz rezultă
infecţia sistemică sau generalizată. Bacteriile se numesc bacterii invadante (Salmonella
typhi, E. coli patogen, stafilococii patogeni).

Infecţiile bacteriene cu caracter invadant prezintă 3 faze distincte:

- faza de invadare a ţesuturilor învecinate porţii de intrare, însoţită sau nu, de
reacţia ganglionilor limfatici loco-regionali;
- faza de generalizare a infecţiei, pe cale sanguină şi/sau limfatică, cu apariţia
bacteriemiei (prezenţa în sânge a bacteriei infectante). Când prezenţa bacteriilor în sânge
se soldează cu multiplicări secundare, cu focare de diseminare în ţesuturi, apare
septicemia;
- faza de cantonare în zonele de elecţie. Exemplu: meningococii (Neisseria
meningitidis) pătrund pe cale respiratorie, apoi trec în circulaţie, pentru ca, în final, să se
fixeze la nivelul meningelui; pneumococii (Diplococcus pneumoniae) pătrund pe cale
respiratorie şi se fixează la nivelul arborelui bronho-alveolar sau la nivelul meningelui;
speciile familiei Enterobacteriaceae pătrund pe cale digestivă şi rămân cantonate în
intestin, chiar dacă în unele cazuri prezintă şi descărcări bacteriemice.
La cele două categorii de bacterii (neinvadante şi invadante) se adaugă a treia
categorie, bacteriile sensibilizante, care prin infecţie sensibilizează organismul. Acesta
va răspunde prin reacţii imunopatologice ce îi sunt nocive şi generează leziuni. Exemplu:
bacilul tuberculos.
În plus, există posibilitatea ca aceeaşi bacterie să fie în acelaşi timp invazivă,
toxigenă şi sensibilizantă. Un astfel de exemplu este Streptococcus pyogenes, dotat cu
enzime invazive, cu capacitatea de a secreta eritrotoxina (responsabilă de apariţia
scarlatinei) şi de a produce prin mecanism alergic cardita reumatismală, reumatismul
poliarticular acut, glomerulonefrita acută difuză.

2. ASPECTELE CLINICE ŞI ETAPELE EVOLUTIVE ALE INFECŢIEI

Manifestările clinice ale infecţiei sunt multiple, fiind influenţate de o serie de
variabile, cum sunt: factorii genetici ai gazdei şi ai agenţilor infecţioşi, doza infectantă,
calea de pătrundere, factorii de patogenitate ai microbilor, rezistenţa antiinfecţioasă a
gazdei, factorii de mediu etc.
Din punct de vedere al manifestărilor clinice, infecţiile bacteriene pot fi: inaparente,
latente şi aparente.

- Infecţii inaparente, evoluează asimptomatic (fără semne clinice evidente deşi

germenul este prezent în organism), dar prezenţa ei se confirmă prin reacţii serologice
sau intradermoreacţii (IDR) pozitive, ceea ce atestă contactul organismului cu acel
antigen (bacterie, virus, fung) şi deci instalarea imunităţii. Apărute în mod spontan,
infecţiile inaparente realizează “imunizările oculte” în masa populaţiei. Uneori însă,
astfel de persoane reprezintă o sursă de infecţie pentru colectivitate ("purtători
sănătoşi”).

- Infecţiile latente nu se manifestă clinic, deşi agenţii infecţioşi (bacterii, virusuri sau
protozoare), pot persista vii în organism timp îndelungat. Infecţia se poate însă activa şi
deveni clinic evidentă datorită unor factori favorizanţi. De exemplu: herpesul este activat
de o iritaţie mecanică locală, febră, căldură excesivă, stress, ultraviolete etc. Bruceloza,
sifilisul, tuberculoza pot prezenta perioade de latenţă cu recidive posibile, manifestate
clinic. Unele infecţii latente virale pot produce transformări celulare până la tumori
(virusuri oncogene, v. Herpes tip 2, v. Citomegalic).

- Infecţii aparente clinic care pot fi, după sediul unde evoluează infecţia, localizate sau
generalizate.
Infecţiile localizate sunt acele infecţii în care bacteria se înmulţeşte la poarta de
intrare şi determină leziuni minime: abcese, furuncule, flegmoane, angine, etc.
Depăşiind poarta de intrare, unele bacterii produc infecţia numai dacă ajung în organul
de elecţie: bacilul tific şi vibrionul holeric în intestinul subţire, bacilul dizenteric în
colon, unde se înmulţesc şi determină simptomele de boală.
În unele cazuri infecţia progresează din aproape în aproape (prin contiguitate)
afectând ţesuturile vecine: infecţia rinofaringelui poate invada căile respiratorii
superioare (bronhiile) şi apoi chiar pe cele inferioare, alveolele pulmonare (zonă normal
sterilă) determinând pneumonii şi bronhopneumonii. De asemenea, infecţia vaginală
netratată, se poate extinde până la uter şi anexe; procesele inflamatorii apendiculare
generează peritonite.

Infecţii generalizate. Uneori, în absenţa tratamentului, infecţia se poate generaliza

pe cale sanguină sau limfatică, determinând bacteriemii sau septicemii.

BACTERIEMIA este pătrunderea în sânge a unui număr redus de bacterii, într-

un interval de timp limitat, fără manifestare clinică importantă, organismul învingând
de obicei infecţia. Bacteriemia este fie discontinuă, când bacteriile sunt mobilizate dintr-
un focar septic acut (pneumonie), sau subacut (osteomielită), fie fugară, când bacteriile
sunt aspirate printr-o ruptură vasculară posttraumatică, chirurgicală, postextracţională
(stomatologie). Uneori însă, bacteriemia explică localizarea tardivă a unei infecţii, spre
exemplu tuberculoza osoasă consecutiv infecţiei pulmonare.

SEPTICEMIA este revărsarea permanentă sau intermitentă în sânge a unor

bacterii dintr-un focar infecţios existent: endocardita bacteriană, abces care comunică cu
un vas sanguin, un cateter venos infectat, etc. Septicemia se însoţeşte de febră
caracteristică, frison şi o stare generală alterată care necesită tratament de urgenţă.
Localizarea secundară a infecţiei netratate sau incorect tratate în diverse organe,
constituie septico-pioemia (dată de bacterii pioemice cu înmulţire extracelulară) sau
granulia (dată de bacterii facultativ intracelulare). Septicemia este însoţită cel mai adesea
de „toxemie”, datorată difuziei concomitente de exoenzime-agresine, toxine (endotoxina
bacteriilor Gram negative când se produce o liză masivă a acestora în sânge), produşi de
catabolism şi alterare tisulară.

Infecţiile generalizate evoluează în mai multe etape:

a. Etapa (perioada) de incubaţie: intervalul parcurs de la pătrunderea germenului

infectant în organism până la apariţia primelor simptome de boală. Durata ei (ore, zile,

săptămâni) depinde atât de microorganism (specie sau tulpină) cât şi de rezistenţa

organismului. În general, cu cât perioada de incubaţie este mai scurtă, bacteria este mai

virulentă şi infecţia mai severă.

În funcţie de durata medie a perioadei de incubaţie există:

- boli cu incubaţie scurtă, 1-7 zile: toxiinfecţii alimentare, meningite, difteria,
gonoreea;
- boli cu incubaţie medie, 8-21 zile: febra tifoidă, tetanos etc.;
- boli cu incubaţie lungă, zeci de zile: hepatita B (60-180 zile);
- boli cu incubaţie foarte lungă, ani de zile: tuberculoza, lepra, SIDA.
Unele boli au o perioadă fixă de incubaţie: rujeola, rubeola, variola, varicela.

b. Debutul bolii reprezintă momentul apariţiei primelor semne de boală, de regulă

necaracteristice: febră, scăderea apetitului, stare generală alterată, dureri de cap, dureri

musculare, articulare etc. Debutul poate fi brusc sau insidios.

c. Perioada de stare se caracterizează prin apariţia semnelor clinice şi paraclinice

specifice bolii (digestive, respiratorii, manifestări cutanate, semne de iritaţie meningeală
etc.)

d. Perioada de declin (defervescenţă): în cazul unei evoluţii favorabile semnele majore

ale bolii diminuă până la dispariţia totală, brusc, in crisis (ca în pneumonia
pneumococică) sau lent, progresiv, in lisis (ca în febra tifoidă).

e. Perioada de convalescenţă este perioada în care se refac leziunile şi se restabilesc

funcţiile perturbate. Este o perioadă foarte importantă pentru că acum pot apărea:
recăderi, complicaţii, cronicizarea infecţiei.
În cazul unei evoluţii favorabile se produce vindecarea, cu sau fără sechele. De
regulă, vindecarea poate fi totală, însă în anumite cazuri, bolnavul poate rămâne purtător
de germeni sau poate să prezinte sechele funcţionale sau organice. În cazul unei evoluţii
nefavorabile, boala evoluează spre exitus sau cronicizare.
În cazul vindecării trebuie făcută distincţia între vindecarea clinică şi cea bacteriologică,
care nu se suprapun totdeauna. Vindecarea bacteriologică reprezintă momentul când nu
se mai izolează germenul cauzal în produsele bolnavului. Dacă are loc vindecarea
clinică, dar nu şi cea bacteriologică (germenul se izolează din produsele fostului bolnav
după dispariţia semnelor clinice), apare starea de “purtător” (exemplu: Salmonella,
Shigella, E. coli patogen).

3. EFECTELE NOCIVE ALE INFECŢIEI

3.1. Alterări organice şi funcţionale determinate de agentul infecţios
Alterările mecanice (obstrucţii) se datorează reacţiei inflamatorii a gazdei ca
răspuns la prezenţa microorganismului (exemplu: în difterie obstruarea căilor respiratorii
prin falsele membrane).
Distrucţie celulară. Efectul distructiv depinde de celulele implicate, de numărul lor
şi de viteza evoluţiei infecţiei. Această distrucţie celulară are loc prin enzimele eliberate
de microorganisme (hemolizine, leucocidine), dar în special prin toxinele acestora.
Unele toxine acţionează în apropierea porţii de intrare (Shigella) sau acţionează la
distanţă de locul unde sunt produse (Corynebacterium diphteriae).
 Alterări ale metabolismului celular apar în unele infecţii care evoluează fără
leziuni celulare. Sunt cauzate de toxinele eliberate de bacterii: tetanos (toxina determină
modificări ale metabolismului celulelor motoare producând paralizii spastice); botulism
(toxina botulinică împiedică eliberarea de acetilcolină la nivelul sinapselor colinergice
producând paralizia flască); holeră, diareea malignă a nou-născutului (toxinele
-vibrionului holeric, E. coli enterotoxigen- determină creşterea nivelului AMP-ului ciclic
în celulele epiteliului intestinal, cu eliminarea unor cantităţi mari de apă în intestin cu
apariţia diareei).

3.2. Alterări datorate reacţiilor de apărare antiinfecţioase

Simptomele infecţiilor sunt produse nu numai de microorganismul infectant, ci şi
de reacţiile gazdei.
Puroiul este o consecinţă a inflamaţiei şi constă dintr-un amestec de leucocite vii
şi distruse, bacterii, exudat. El rezultă prin migrarea rapidă a leucocitelor (în special
granulocite neutrofile) în focarul infecţios, sub acţiunea unor stimuli chemotactici. Prin
distrugerea leucocitelor se eliberează hidrolaze din granulaţiile lizozomale care lezează
ţesuturile învecinate, cu extinderea zonei afectate.
Abcesul rezultă atunci când puroiul se constituie într-o colecţie. În cazul existenţei
unor deficienţe genetice ale funcţiilor leucocitelor, pot apare infecţii purulente recurente,
chiar în prezenţa unui tratament corect cu antibiotice.
Febra. O temperatură mai mare de 37°C atrage atenţia asupra posibilităţii existenţei
unui proces infecţios. Însă, lipsa febrei nu exclude o infecţie, după cum, nici prezenţa
febrei nu defineşte o infecţie (febră prin mari distrucţii celulare). Asigură mobilizarea
mijloacelor de luptă ale organismului, prin activarea metabolismului şi a circulaţiei
sanguine. Mecanismul producerii febrei recunoaşte excitarea centrilor termoreglatori,
cu predominenţa termogenezei, prin diferite citokine: interleukină-1(IL-1), factorul de
necroză tumorală, alfa interferon. De asemenea, doze mici ale endotoxinelor bacteriilor
Gram negative produc febră, în timp ce dozele mari induc şocul endotoxic şi coagulare
intravasculară diseminată.
Răspunsul imun, atât umoral cât şi celular, în anumite condiţii şi când depăşeşte
anumite limite fiziologice, poate avea un efect nociv asupra organismului.
- Răspunsul imun umoral. Înfecţiile induc formarea de anticorpi specifici. Anticorpii se
combină cu antigenele infecţioase sau unele produse ale acestora (toxine, enzime).
Complexele antigen-anticorp induc un răspuns inflamator, prin intermediul sistemului
complementului, în scopul eliminării agentului infecţios sau neutralizării produşilor lor
toxici.
La persoanele cu predispoziţie alergică, răspunsul imun umoral nu are
întotdeauna un efect protector. În aceste cazuri, se poate produce sensibilizarea
organismului faţă de antigenele bacteriene cu apariţia stării de hipersensibilitate
mediată umoral (de tip I, II, III). Exemplu: complicaţiile alergice poststreptococice
(cardita reumatismală în care apare starea de hipersensibilitate de tip II şi
glomerulonefrita acută difuză în care apare starea de hipersensibilitate de tip III).
- Răspunsul imun celular este mediat de limfocitele T citotoxice, K (ucigaşe), NK
(natural ucigaşe) şi macrofage. Atunci când acesta depăşeşte în intensitate limitele
fiziologice este asociat cu inflamaţia cronică. Acest aspect se întâlneşte frecvent în
infecţiile cu germeni cu habitat predominent intracelular (tuberculoză, lepră) şi infecţiile
virale.

MECANISMELE DE BAZĂ ALE PROCESULUI INFECŢIOS

Procesul infecţios se realizează prin acţiunea combinată, antagonistă, a două categorii
de factori: factorii de patogenitate ai bacteriei şi factorii de rezistenţă ai organismului
infectat.

1. FACTORII DE PATOGENITATE AI BACTERIEI

Patogenitatea se defineşte prin capacitatea unor bacterii de a produce boală. În
cazul bacteriilor, patogenitatea se exprimă prin două proprietăţi ale germenului: virulenţă
şi toxinogeneză.

1.1.VIRULENŢA
Este capacitatea unei bacterii de a pătrunde, a se adapta, a se multiplica, a
invada şi a determina leziuni specifice în ţesuturile pentru care are tropism (invazie
microbiană). Virulenţa este un caracter de tulpină. Exemple: în cadrul speciei
Corynebacterium diphteriae există tulpini toxigene virulente şi tulpini netoxigene, deci
nepatogene; patogenitatea tulpinilor de pneumococ variază în funcţie de cantitatea
materialului capsular.
Virulenţa unei tulpini microbiene se apreciază prin comparaţie cu o tulpină

standard a cărei virulenţă este cunoscută şi se exprimă prin DLM (doza letală minimă)

sau DL50 (doza letală medie). DLM este numărul total de germeni necesari sau

cantitatea de toxină necesară pentru a omorî toate animalele dintr-un lot experimental,

iar DL50 numărul de germeni sau cantitatea de toxină necesară pentru a omorî 50%

dintr-un lot de animale experimentale.

Virulenţa se realizează prin factori corpusculari şi factori enzimatici.

1.1.1. FACTORII DE VIRULENŢĂ CORPUSCULARI

Aceşti factori sunt legaţi de anumite elemente din structura celulei bacteriene,
elemente care conferă bacteriei protecţie împotriva mijloacelor de apărare ale
organismului şi favorizează pătrunderea în ţesuturi.

a. Capsula
Are efect antifagocitar (inhibă înglobarea bacteriilor de către fagocite), favorizând
invazia microbului în ţesuturi. Acţionează, de asemenea, şi împotriva anticorpilor locali
sau altor substanţe bactericide. Exemple de bacterii capsulate: pneumococul (materialul
capsular este de natură polizaharidică), bacilul cărbunos (de natură polipeptidică), unele
tulpini de stafilococi şi streptococi, Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens.
Unele bacterii (Klebsiella, bacilul cărbunos), deşi mai virulente când sunt capsulate,
posedă şi alţi factori de patogenitate.

b. Compuşi ai peretelui bacterian

Anumite componente situate în straturile superficiale ale bacteriei, imprimă

acesteia o virulenţă deosebită, având rol antifagocitar. Exemple: proteina M de la
streptococul β -hemolitic grup A, factorul parietal de virulenţă de la stafilococul
aureu, factorul cord de la bacilul Koch, factorul de ataşare la mucoasa intestinală la E
coli patogen şi Shigella, antigenul Vi (de înveliş) la unele tulpini de bacil tific.

c. Mobilitatea
Bacteriile mobile sunt mai virulente decât cele imobile. Mobilitatea deosebită a
treponemelor (spirochete) şi leptospirelor (spirili), care pătrund în organism prin pielea şi
mucoasele intacte, este realizată prin mişcările de tirbuşon ale corpului celular.
Mobilitatea poate fi realizată şi prin intermediul cililor, fie ca atribut de specie (la
Proteus) fie consecutiv activării aderenţei la mucoasa intestinală prin cili (caracter indus
de plasmida „de colonizare” la E. coli patogen).

d. Fimbriile

Oligomeri proteici ce apar ca apendici filamentoşi la suprafaţa celulei bacteriene,

fimbriile au rol în ataşarea germenilor pe receptorii de pe suprafaţa celulelor

susceptibile de la poarta de intrare. Structurile principale bacteriene care pot funcţiona

ca adezine sunt:

- pilii comuni (adezine piliale) care permit o aderare crescută de celulele epiteliale.

Exemple: fimbriile P (prezente la tulpinile de Escherichia coli pielonefritogene);

fimbriile S (la tulpinile de E. Coli implicate în meningite); fimbriile K88 şi K89 (la

tulpinile de E. Coli enterotoxigene ce produc diareea malignă a nou-născutului); fimbriile

ce conţin N-metilfenilalanină (la unele bacterii Gram negative, la Pseudomonas,

Neisseria, Bacteroides, Vibrio). În plus, există posibilitatea ca aceeaşi tulpină bacteriană

să conţină mai multe tipuri de adezine ce sunt codificate de anumite zone cromozomiale

sau plasmidice. Această diversitate genetică permite adaptarea tulpinii la condiţiile

diferite oferite de organismul gazdă.

- adezine nepiliale, ca de exemplu, glicocalixul, microcapsula, proteine de membrană

externă la bacteriile Gram negative, ca şi unele substanţe din organism. O astfel de

substanţă care are proprietatea de a adera la suprafeţele mucoase este fibronectina, o

glicoproteină plasmatică ce se găseşte în spaţiul extracelular. Unele bacterii care pătrund

în organism aderă la rândul lor de fibronectină şi, prin intermediul ei, de suprafaţa

celulelor epiteliale. Astfel de microorganisme sunt Streptococcus pyogenes,

Staphilococcus aureus, Treponema pallidum.

1.1.2. FACTORI ENZIMATICI DE VIRULENŢĂ (EXOENZIME)

Sunt substanţe elaborate de bacteria infectantă şi eliminate înafara ei, care
determină modificarea ţesuturilor locale, favorizând diseminarea bacteriilor în
organism, din aproape în aproape, cu invadarea ţesuturilor dincolo de poarta de intrare.

a. Coagulaza
Enzimă secretată de stafilococii patogeni, care, in vitro, coagulează plasma citratată
(test important de patogenitate). În organism ea favorizează formarea în focarul
inflamator a unei “pelicule” de fibrină care protejează germenii împotriva fagocitării şi
altor factori de apărare nespecifică şi specifică.

b. Fibrinolizina
Enzimă activatoare de plasminogen („kinază”), care determină digestia fibrinei din
focarul inflamator, astfel încât bacteriile pot străbate această barieră. Capacitatea de
elaborare a fibrinolizinei reprezintă unul din testele de patogenitate pentru unii germeni
(exemplu: stafilococi patogeni, streptococi patogeni).

c. Hialuronidaza
 Depolimerizează acidul hialuronic din substanţa fundamentală a ţesutului
conjunctiv şi din cimentul intercelular al epiteliilor, potenţează invazivitatea germenilor.
Exemplu: stafilococul aureu, streptococul β -hemolitic grup A, Clostridium perfringens.

d. Enzime hidrolitice
Din grupul acestor enzime fac parte: colagenazele, lecitinazele, neuraminidazele,
lipazele, proteazele, nucleazele.
- Colagenaza, enzimă proteolitică de depolimerizare a colagenului din ţesutul
conjunctiv. Exemplu: Clostridium perfringens.
- Lecitinaza (“alfa-toxina”) care determină hidroliza lecitinei din membranele
celulare. Exemplu: Clostridium perfringens.
- Neuraminidaza, prezentă la multe bacterii şi virusuri, hidrolizează mucoproteinele
de pe suprafaţa celulelor, expunându-le atacului.

e. Enzime citolitice
Din categoria enzimelor citolitice fac parte hemolizinele şi leucocidinele, enzime
cu efect hemolitic sau de distrugere a leucocitelor. Au efect antifagocitar, favorizând
indirect invazia. Exemplu: streptolizinele streptococului β -hemolitic grup A
(streptolizina “O” şi streptolizina “S”); hemolizinele intrinseci: β -hemolizine
responsabile de hemoliza completă; α -hemolizine responsabile de hemoliza incompletă.
Pe lângă bacteriile cu habitat extracelular, bacterii care sunt supuse, cu succes,
mecanismelor de apărare antiinfecţioasă a organismului, există şi bacterii cu habitat
intracelular: facultativ intracelular (bacilul Koch, Brucella) şi obligatoriu intracelular
(Chlamydia trachomatis). Prezenţa lor intracelulară le asigură protecţie împotriva
mijloacelor de apărare ale organismului, inclusiv cele imune. Bacteriile cu habitat
intracelular sunt cele mai invazive bacterii deoarece, supravieţuirea lor în diverse celule
şi mai ales în fagocite, favorizează diseminarea lor în organism. Pătrunse în celulele
fagocitare, bacteriile ajung la ganglionii limfatici şi apoi în circulaţia generală, unele
dintre ele trecând, la adăpostul fagocitelor, chiar bariera hematoencefalică.

1.2. TOXINOGENEZA
Este definită drept capacitatea unor germeni de a elabora toxine, substanţe
solubile cu efect toxic pentru ţesuturile organismului infectat. Ele se împart în exotoxine
şi endotoxine.

1.2.1. EXOTOXINELE
Sunt substanţe toxice (proteine solubile şi filtrabile), eliberate de bacteria vie în
mediul ambiant al germenului: fie în mediul de cultură fie în organismul infectat.
Sunt elaborate în special de bacterii Gram pozitive şi prezintă o acţiune strict
specifică, determinând manifestări clinice caracteristice.

a. Proprietăţi fizico-chimice
- sunt holoproteine termolabile (excepţii: toxina botulinică ce este înalt termostabilă,
enterotoxina stafilococică);
- se transformă prin învechire şi sub acţiunea formolului (4%0) în vaccinuri eficiente,
toxoizii-anatoxine, produşi netoxici, cu imunogenitate păstrată;
- sunt sensibile la radiaţii şi variaţii de pH.

b. Proprietăţi biologice

Toxicitate
Aprecierea gradului de toxicitate se face prin stabilirea valorii DLM (doza letală

minimă). Efectele toxice apar după o perioadă de latenţă, puterea toxică este mare, doza

letală minimă este mică. Se distinge net tropismul selectiv pentru anumite teritorii:

- neurotropism: toxina botulinică, toxina tetanică, toxina difterică;

- miotropism: toxina difterică;
- enterotropism: enterotoxina stafilococului, enterotoxina vibrionului holeric, E. coli
patogen, Shigella dysenteriae;
- dermotropism: exotoxina bacilului cărbunos, eritrotoxina;
- tropism pentru mucoasa căilor respiratorii: toxina difterică, toxina secretată de
Bordetella pertussis.
Pentru unele specii bacteriene, exotoxinele pot reprezenta unicul factor de
patogenitate responsabil de toată simptomatologia bolii (Corynebacterium diphteriae,
Clostridium tetani, Clostridium botulinum). Pentru alte bacterii (bacilul cărbunos,
stafilococ) exotoxina completează doar ceilalţi factori de patogenitate (numai unii dintre
stafilococii patogeni sunt enterotoxici, producând toxiinfecţii alimentare).

Antigenitate

Au specificitate antigenică înaltă, sunt puternic imunogene, sunt neutralizabile

prin anticorpi specifici.

1.2.2. ENDOTOXINELE
Sunt produşi toxici prezenţi la bacilii Gram negativi, făcând parte integrantă din

structura lor şi care se pun în libertate numai după moartea (liza) acestor bacterii.

Endotoxina este lipopolizaharidul (LPS) din membrana externă a peretelui

celular al acestor bacterii şi joacă un rol important în patogenia infecţiilor produse de

aceste microorganisme. Exemplu la enterobacterii complexul glucido-lipido-polipeptidic:

Salmonella typhi, E. Coli, Shigella, Y. pestis.

a. Proprietăţi fizico-chimice
- sunt heteroproteine (proteine complexe) formate dintr-un suport de proteine simple
plus o grupare prostetică (de obicei de natură lipido-glucidică). Majoritatea
endotoxinelor sunt complexe glucido-lipido-polipeptidice;
- sunt solubile, dar nu difuzează în mediul ambiant al germenului (ele se eliberează
numai odată cu liza celulei bacteriene);
- sunt termostabile;
- rezistente la tratamentul cu alcool;
- nu se transformă în toxoizi sub acţiunea formolului.

b. Proprietăţi biologice

Toxicitate
Toxicitatea endotoxinelor este mai redusă comparativ cu cea a exotoxinelor. Doza
letală minimă este mare. Efectele toxice au loc fără perioadă de latenţă. Au un tropism
mai difuz, manifestările toxice sunt variate:
- tulburări hemodinamice la nivelul capilarelor şi arteriolelor, până la colaps
periferic;
- modificări ale formulei leucocitare (leucopenie);
- efect hiperglicemiant;
- febra, determinată de eliberarea din macrofage (sub acţiunea endotoxinelor) a
pirogenilor endogeni (IL-1, TNF) care acţionează pe centrii termoreglării din
hipotalamus;
- activarea complementului pe cale alternativă, ceea ce favorizează chemotaxia
fagocitelor în focarul infecţios cu liza bacteriilor;
- activarea macrofagelor care vor secreta enzime lizozomale în cantităţi crescute, cu
creşterea capacităţii lor fagocitare ;
- activarea limfocitelor B cu accentuarea producerii de anticorpi;
- coagulare diseminată intravasculară, datorită activării sistemului coagulării prin
factorul XII Hageman.
În cantităţi mici determină reacţii de alarmă benefice organismului (febră,
activarea C′ pe cale alternativă, activarea macrofagelor, stimularea limfocitelor B), în
timp ce în cantităţi mari, determină şocul endotoxic fatal, fie prin acţiunea directă a
endotoxinei, fie prin substanţele eliberate de neutrofile în urma lizei lor datorată
endotoxinei bacteriene. Şocul endotoxic (clinic: hipotensiune, coagulare intravasculară
diseminată) poate apărea şi în cazul administrării unor perfuzii în care endotoxina provine
de la bacili Gram negativi omorâţi prin sterilizare (figura 1).
 C3b2Bb, rezultat în urma clivării fiziologice, se leagă de suprafaţa bacteriilor, fiind
protejat astfel de inactivare. La stabilizarea C3b2Bb participă şi o proteină plasmatică,
properdina (P);
 deci activarea complementului pe calea alternativă este rezultatul stabilizării C3b2Bb
(a C3 convertazei) ce poate fi determinată, printre altele, de prezenţa bacteriilor.

2. FACTORII DE REZISTENŢĂ A ORGANISMULUI INFECTAT

Organismul este expus în toate etapele vieţii la diferite infecţii, cea mai mare

receptivitate întâlnindu-se la copii sub 1 an şi bătrâni. La aceste vârste extreme infecţiile

evoluează de obicei mai sever, datorită posibilităţilor mai reduse de apărare ale

organismului. Unele boli endocrine (diabet, hipotiroidie, insuficienţă suprarenală),

subnutriţia, carenţa de vitamine, oboseala, sarcina, etc., scad rezistenţa generală a

organismului, favorizând apariţia diferitelor infecţii.

Organismul gazdă poate contribui la desfăşurarea procesului infecţios prin

mecanisme de rezistenţă nespecifică şi specifică (tabel 2).

- Rezistenţa nespecifică, naturală, înnăscută faţă de agenţii infecţioşi este comună

tuturor indivizilor unei specii;

- Rezistenţa specifică, dobîndită (imunitatea antiinfecţioasă) se dezvoltă pe

parcursul vieţii, ca urmare a contaminării continue cu diverşi agenţi infecţioşi.

Tipuri de Exemple
rezistenţă
Naturală, - Barierele externe (mecanică, chimică,
înăscută, biologică);
nespecifică - Factori interni umorali (sistemul
complementului) şi celulari (inflamaţia,
Dobîndită natural fagocitoza).
- Transfer placentar de anticorpi de la
mamă la făt (pasivă);
Dobîndită - După contactul cu un agent infecţios.
 artificial - Administrare de antitoxine (pasivă);
- Vaccinare (activă).

Tabel 2: Tipuri de rezistenţă (după Moldovan Roxana, 1997)

Mecanismele rezistenţei naturale sunt distincte de cele ale rezistenţei dobîndite, dar,
ele nu pot fi separate, deoarece se intrică şi acţionează sinergic.

2.1. REZISTENŢA NESPECIFICĂ (NATURALĂ, ÎNNĂSCUTĂ, DE SPECIE)

Reprezintă starea de rezistenţă cu care sunt dotaţi toţi indivizii unei specii faţă de
anumiţi agenţi infecţioşi. Răspunsul de apărare nespecifică este de o intensitate relativ
egală, indiferent de natura agentului agresiv bacterian, şi indiferent de numărul de
contacte anterioare pe care organismul le-a avut cu agentul respectiv.
Fiecare specie este genetic rezistentă la anumite infecţii, dar şi susceptibilă la
altele. Astfel, omul este singura specie care face în mod natural sifilis, scarlatina,
gonoreea, animalele fiind rezistente în mod natural. Această rezistenţă antiinfecţioasă se
explică prin condiţiile impropri pe care un organism le oferă microorganismului faţă de
care este rezistent şi prin lipsa receptorilor celulari specifici pentru agentul infecţios
respectiv.
Dar, rezistenţa antiinfecţioasă prezintă variaţii de rasă şi variaţii individuale,
chiar în cadrul aceleiaşi specii. Este cunoscut faptul că în timpul unor epidemii, unii
indivizi fac forme grave de boală infecţioasă, alţii forme fruste, iar unii chiar infecţii
clinic inaparente. Această variaţie individuală a rezistenţei la infecţii este determinată de
structura generală a mecanismelor de apărare şi în special de prezenţa diferitelor
antigene de histocompatibilitate.
Factorii de apărare nespecifică pot fi împărţiţi în: barierele cutanate şi mucoase,
reacţia febrilă, factorii interni umorali şi celulari.

2.1.1. BARIERELE CUTANATE ŞI MUCOASE

Tegumentele şi mucoasele constituie bariere mecanice, chimice şi biologice,

eficiente în prevenirea pătrunderii microbilor în organism (tabelul 3).

Sediu Mecanisme de protecţie

Piele - Barieră mecanică
- Secreţia de acizi graşi
- Acidul lactic, rezultat al metabolismului
local
- Uscăciunea relativă a pielii
Cavitatea - Enzimele (lactoperoxidaza, lizozimul şi
bucală anticorpii din salivă
- Actiunea de spălare a salivei
Aparat - Tusea şi strănutul
 respirator - Mişcarea firelor de păr din vestibulul nazal
care captează microbii
- Enzimele şi capacitatea surfactantă a
mucusului
- Mişcările cililor vibratili
- Macrofagele alveolare
Tract digestiv - PH-ul gastric (1-2)
- Enzimele şi anticorpii din mucus
- Mişcările peristaltice
- Flora intestinului gros
Ochi - Lizozimul din lacrimi
- Acţiunea de spălare a lacrimilor
Ureche - Acţiunea antimicrobiană a cerumenului
Aparatul - Ph-ul vaginal, flora locală
genitourinar - PH-ul urinii
- Acţiunea de spălare a urinii

Tabel 3: Bariere cutaneo-mucoase (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

a. Bariere mecanice
Sunt reprezentate de integritatea pielii şi mucoaselor, integritate care este cel mai
important obstacol în calea pătrunderii bacteriilor dincolo de poarta de intrare. Această
integritate este asigurată de: straturile cornoase ale epidermului, “capcanele anatomice”
la nivelul mucoaselor (meatele nazale), înglobarea bacteriilor în masa de mucus cu
reţinerea lor, mişcarea cililor epiteliului căilor respiratorii superioare, îndepărtarea
mecanică a bacteriilor prin secreţiile naturale de la nivelul mucoaselor (salivă, spută,
secreţii nazo-faringiene), peristaltismul intestinal.

b. Bariere chimice
- pH scăzut de la suprafaţa tegumentelor (pH=5-6), asigurat de acizii graşi cu
moleculă lungă din secreţia glandelor sebacee, are un puternic efect nociv pentru
germenii patogeni (streptococii de grup A, bacilii difterici);
- lizozimul, existent în salivă, secreţia lacrimală, secreţia nazo-faringiană, mucusul
cervical, lichidul prostatic, este o proteină cu greutate moleculară mică, cu efect de liză a
bacteriilor prin desfacerea componentelor glucidice din peretele bacterian;
- acidul clorhidric din sucul gastric (pH=2) are puternic efect bactericid asupra
tuturor germenilor ce pătrund odată cu alimentele, asigurând sterilitatea stomacului şi
duodenului;
- secreţia biliară cu efect puternic bactericid, ceea ce explică lipsa bacteriilor în
duoden şi prima porţiune a jejunului; bila interferează funcţiile vitale ale membranei
celulare având şi o acţiune neutralizantă asupra unor toxine bacteriene;
- pH acid al vaginului, rezultat în urma metabolizării glicogenului de către bacilii
lactici, reprezintă de asemenea un mijloc eficient de apărare contra microbilor.

c. Bariere biologice
 Sunt reprezentate de flora comensală de pe tegumente şi mucoase. Coexistenţa în

acelaşi ecosistem a diferitelor specii, tulpini şi variante bacteriene, ca şi asocierea altor

agenţi (fungi, paraziţi, virusuri) este marcată puternic de relaţia de antagonism

bacterian, care asigură o protecţie biologică eficientă, cu precădere în cazul căilor

respiratorii superioare, intestinului, tegumentului, vaginului (Exemplu: speciile de

Lactobacillus din vagin, menţin în mod normal un pH acid, nefavorabil dezvoltării altor

bacterii).

Mecanismele prin care flora normală se opune multiplicării florei patogene sunt:
- competiţia pentru acelaşi receptor celular;
- competiţia pentru un substrat nutritiv;
- secreţia unor produşi secundari toxici,
- stimularea sistemului imun, cu producerea anticorpilor naturali, care vor reacţiona
încrucişat cu antigenele florei patogene.
Administrarea abuzivă de antibiotice cu spectru larg poate distruge echilibrul dintre
speciile florei normale şi unele specii condiţionat patogene sau patogene, cu apariţia
diareei prin dezvoltarea necontrolată a unei singure specii. Exemplu: S. aureus, Candida
albicans, Clostridium difficile, care fac parte din flora normală şi care se menţin la
individul sănătos în anumite limite tocmai datorită antagonismului bacterian.

2.1.2. REACŢIA FEBRILĂ

Ea însoţeşte, de regulă, o infecţie bacteriană. Implică o dereglare a mecanismelor
sistemului termoreglator (central şi periferic), cu predominanţa termogenezei. Centrii
termoreglatori din hipotalamus vor fi excitaţi de către diferiţi factori pirogeni ca:
 endotoxinele bacteriilor Gram negative (lipopolizaharidul din peretele celular al
acestor germeni acţionează asupra macrofagelor ce vor secreta pirogeni endogeni:
interleukină-1 (IL-1), factorul de necroză tumoral (TNF-alfa);
 alţi “pirogeni endogeni” secretaţi de macrofage, monocite, granulocite, ca urmare a
acţiunii altor bacterii, virusuri, hormoni steroizi, limfocite T, complexe imune circulante
(figura 3).
Reacţia febrilă, din punct de vedere al apărării antiinfecţioase nespecifice,

asigură mobilizarea mijloacelor de luptă ale organismului, prin activarea

metabolismului şi a circulaţiei sanguine. O temperatură de 38,5°-39°C accentuează

distrugerea agenţilor infecţioşi, prin creşterea producţiei de imunoglobuline şi a activării

fagocitozei. Însă, febra prelungită poate fi asociată cu efecte nevaforabile (creşterea

activităţii cardiace, la un pacient cu funcţie cardiovasculară compromisă, poate determina

apariţia convulsiilor; modificările metabolice pot duce la deshidratare şi pierdere de

electroliţi; creşterea susceptibilităţii la efectele unor toxine microbiene).

ENDOTOXIN
E
BACTERIENE

BACTERII
VIRUSURI GRANULOCITE
STEROIZI MONOCITE FEBRĂ
CIC MACROFAGE
Ly T IMUNE CELULE TUMORALE

IL-1
(PIROGEN
ENDOGEN)

Figura 3: Reacţia febrilă (după C. Voiculescu, 1996)

2.1.3. FACTORII INTERNI AI APĂRĂRII NESPECIFICE

În cazul în care bacteriile patogene au învins barierele mucoase sau cutanate,

difuzarea lor este împiedicată în mod normal, de ţesutul conjunctiv intercelular. Uneori

însă, acesta poate fi distrus de unele enzime bacteriene proteolitice: proteinaze,

fibrinolizine, colagenaze, streptochinaze. Factorii interni ai apărării nespecifice sunt

încadraţi în două categorii: factori umorali şi factori celulari.

a. FACTORI UMORALI
a.1. Polipeptidele bazice din unele ţesuturi au efect bactericid (pătrund prin peretele
bacterian şi alterează funcţiile osmotice a membranei citoplasmatice, ducând în final la
moarte celulară). Exemple: polipeptidele bazice cu efect asupra bacilului cărbunos,
spermina şi spermidina cu efecte asupra bacilului Koch şi stafilococului aureu.

a.2. Lizozimul este o mucopeptidază care hidrolizează legăturile peptidoglicanului din

peretele celular al bacteriilor, acestea devenind sensibile la liza osmotică. Acţionează
puternic asupra bacteriilor Gram pozitive. Bacteriile Gram negative nu sunt sensibile la
acţiunea lizozimului, deoarece peptidoglicanul este acoperit de membrana externă. Dacă
aceste bacterii sunt supuse iniţial acţiunii complementului, acesta va leza membrana
externă dezvelind peptidoglicanul, sensibil acum la acţiunea lizozimului.

a.3. Splenocitina din splină care acţionează pe bacilii Gram negativi: Salmonella, E.
coli patogen.

a.4. Betalizina, proteină bazică de origine trombocitară, cu efect inhibitor asupra

multiplicării florei Gram pozitive, cu efect distructiv la nivelul membranei celulare.

a.5. Lactoferina este o proteină care leagă fierul şi care este în competiţie cu bacteriile
cărora le este esenţial în multiplicare.

a.6. Opsoninele sunt substanţe care aderă de suprafaţa unui microorganism făcându-l
accesibil fagocitozei. Există opsonine specifice (anticorpi de tip IgG implicaţi în
apărarea antiinfecţioasă dobândită) şi nespecifice (C3b, fibronectina). Exemplu: C3b,
produsă în timpul activării complementului, se leagă de glicoprotein-receptorul pentru
C3b prezent pe membrana fagocitelor. Fiind legat de fagocit microbul va fi fagocitat
eficient.

a.7. Stress-ul infecţios antibacterian ce constă din punerea în activitate a axului

hipotalamus – hipofiză anterioară – corticosuprarenală cu eliberare de glucocorticoizi.
Însă, în cantitate mare, glucocorticoizii scad mijloacele de apărare ale organismului
(figura 4).

HIPOTALAMUS

NOCIV
HIPOFIZĂ

ACTH
SALUTAR

SUPRARENALĂ

Figura 4: Stress-ul antiinfecţios (după C. Voiculescu, 1996)

a.8. Proteina C reactivă îşi trage numele de la faptul că reacţionează, printre altele, cu
proteina C a pneumococului. Această proteină se ataşează pe unele bacterii sau fungi şi
promovează învelirea acestora cu molecule de complement (C′ ). Învelirea celulelor cu
fracţiuni de C′ produce facilitarea fagocitării celulelor respective.

a.9. Fibronectina, glicoproteină care favorizează adeziunea celulelor de suprafeţe,

acţionează ca opsonină faţă de bacteriile Gram pozitive. Ea se găseşte la suprafaţa
mucoaselor, impiedicând, prin proprietatea de a se lega de flora Gram pozitivă,
colonizarea mucoaselor cu floră Gram negativă (de exemplu mucoasa faringiană).

a.10. Sistemul complementului (C′ , alexina)

Complementul este o componentă complexă a serului normal. Este format din
aproximativ 25 de proteine plasmatice („componente”) care se activează succesiv una
pe cealaltă într-o ordine dată („activare în cascadă). Aceste componente sunt produse în
marea lor majoritate de către ficat. Macrofagele reprezintă al doilea sediu important de
sinteză a componentelor complementului. A mai fost demonstrată sinteza limitată a unora
din factorii acestuia în fibroblaste şi celulele intestinale. Se comportă ca proteine de fază
acută: rata sintezei lor se accelerează în cursul infecţiilor sau altor injurii.
Cantitatea de complement prezentă în plasmă este relativ constantă.
- Creşterea activităţii globale a complementului se poate produce în infecţii sau procese
neoplazice.
- Scăderea nivelurilor plasmatice ale complementului se datorează fie unui consum
exagerat al acestuia (în bolile de complexe imune), fie unei sinteze reduse (cum este
cazul insuficienţei hepatice).

ACŢIUNE BIOLOGICĂ
Există 2 căi de activare a complementului, cu punct de plecare diferit, dar, care

converg spre aceiaşi produşi finali:

- calea clasică (comună), a cărei activare presupune prezenţa anticorpilor specifici, deci
un contact prealabil cu agentul etiologic respectiv. Activarea pe această cale se produce,
de regulă, în prezenţa complexelor antigen-anticorp. Astfel, bacteriile cu care
organismul a mai venit în contact, pătrund în organism şi întâlnesc anticorpii
corespunzători cu care vor forma complexe antigen-anticorp.
 câte o moleculă de C1q şi de C1s şi două molecule de C1r formează unitatea de
recunoaştere (C1qrs) ce se va lega de complexul antigen-anticorp;
 unitatea de recunoaştere va cliva C4 şi C2 în C4a, C4b şi C2a, C2b; o moleculă C1qrs
poate secţiona un număr mare de molecule C4 şi C2 înainte de a fi inactivată prin
intervenţia unei molecule de reglare, numită inhibitorul lui C1 (C1 INH), care disociază
C1qrs;
 componentele C4b şi C2a vor forma C4b2a ce reprezintă C3 convertaza căii clasice,
care va cliva C3 în C3a şi C3b. C3b este piesa esenţială în reacţiile următoare (figura 5).

- calea alternativă, mai veche din punct de vedere filogenetic, se activează în absenţa
anticorpilor specifici, deci face parte din rezistenţa antiinfecţioasă naturală. Activarea
pe această cale este declanşată de mai mulţi factori: polizaharide, acizi theicoici,
bacterii Gram pozitive sau Gram negative, endotoxine bacteriene, paraziţi
(tripanozoma), levuri (Candida albicans), agregatele de imunoglobuline (agregate
termic, nu prin complexare cu antigene).

Figura 5: Sistemul complementului

În plasma normală C3 este supus permanent unei activări spontane discrete prin
clivarea în C3a şi C3b.
 C3b se combină cu factorul B (enzimă proteolitică), rezultând C3bB;
 după legarea sa de substrat, factorul B este clivat proteolitic în fragmentele Ba şi Bb
de o enzimă prezentă în plasmă în stare activă, factorul D; în urma acţiunii factorului D
se va obţine Ba iar C3bB va deveni C3b2Bb;
 C3b2Bb este C3 convertaza căii alternative. Această convertază, rezultată în mod
fiziologic, ar putea cliva cantităţi mari de C3, dacă nu

FORMAREA COMPLEXULUI DE ATAC AL MEMBRANEI

Deci, ambele căi produc enzime specifice („C3 convertaze”) care vor acţiona
asupra componentei C3 a sistemului (elementul crucial al cascadei), cu scindarea sa în
două fragmente: C3a şi C3b.
- C3a, agent inductor de inflamaţie, are proprietăţi chemotactice şi „anafilatoxice”
(degranularea mastocitelor cu eliberarea histaminei şi creşterea permeabilităţii
vasculare).
- C3b, care se depune pe bacterii sau pe alte celule ţintă, poate produce eliminarea
acestora prin două mecanisme: imunoaderenţa şi liza. O serie de fagocite (granulocitele
neutrofile, macrofage) exprimă pe suprafaţă receptori specifici pentru C3b. C3b
mijloceşte pe această cale ataşarea celulelor ţintă pe fagocite („imunoaderenţă”) şi
ingurcitarea lor ulterioară. Această învelire cu C′ a ţintelor, care pregăteşte şi facilitează
fagocitoza, a fost denumită „opsonizare”.
În acelaşi timp, C3b, poate media continuarea activării în cascadă a sistemului,

care se va finaliza prin asamblarea unui complex enzimatic (C5, 6, 7, 8, 9) pe suprafaţa

celulei ţintă. Acest complex a fost denumit „complex de atac a membranei” deoarece

provoacă soluţii de continuitate care duc la liza celulei atăcate (bacterie, celulă infestată

de virus sau alte organisme invadatoare).

Etapele principale ale formării complexului de atac al membranei sunt:

 ambele C3 convertaze se combină cu C3b formând C5 convertaza (C3b2BbP

pentru calea alternativă şi C3b4b2a pentru calea clasică);
 C5 convertaza secţionează C5 cu generare de C5a (anafilatoxină) şi fragmente active
C5b;
 C5b se fixează pe suprafaţa celulei (bacteriei). De remarcat este faptul că moleculele
C5b sunt foarte instabile şi sunt inactivate rapid dacă rămân libere în plasmă; în schimb,
ele devin stabile dacă reuşesc să se ataşeze unui substrat sau membrană celulară, pe care
începe procesul de asamblare a complexului de atac;
 de C5b se vor lega în continuare C6, C7, C8 care se găsesc libere în ser şi se
asamblează pe molecula C5 numai în momentul activării ei, fără intervenţia vreunei
enzime proteolitice. Se formează complexul C5b678, care are capacitate litică redusă.
Celulele ţintă pot fi lizate doar atunci când densitatea unor asemenea complexe este
foarte mare;
 în continuare, mai multe molecule de C9, care polimerizează, se ataşează de
complexul C5b678, ducând la creşterea considerabilă a puterii litice. Structura proteinei
C9 este asemănătoare cu a perforinelor prezente în granulaţiile celulelor citotoxice;
 se formează, astfel, un complex de atac al membranei celulare (C5b6789) cu liza
consecutivă a celulei bacteriene.

b. FACTORII CELULARI
Sunt reprezentaţi de fagocitoză şi inflamaţie.
b.1. FAGOCITOZA
Constituie un proces esenţial, prezent pe toată durata infecţiei. Reprezintă reacţia de
apărare celulară a organismului şi constă dintr-un mecanism de îndepărtare a
microorganismelor şi a celulelor lezate, prin înglobarea lor de către anumite celule ale
organismului (fagocite) specializate pentru această funcţie.
Aceste celule migrează la locul de pătrundere al bacteriilor în organism, le
înglobează şi le distrug în interiorul lor, prin fagolizozomi (enzimatic). Se realizează în
acest fel localizarea infecţiei, care clinic se manifestă prin inflamaţie cu simptomele
caracteristice: rubor, tumor, calor, dolor, şi functio laesa. În acest fel o infecţie minoră
poate fi învinsă, printr-o bună apărare locală, iar puroiul rezultat din resturile celulelor
distruse, conţine bacterii moarte (puroi steril). De cele mai multe ori însă, infecţia
progresează, determinând diferite manifestări clinice.

CATEGORII DE CELULE CU PROPRIETĂŢI FAGOCITARE (FAGOCITE)

În fagocitoză intervin două categorii principale de celule: microfagele şi
macrofagele. Aceste celule au capacitatea de a migra dirijat spre locul unde sunt
particule străine. Migrarea lor în ţesuturi este favorizată de substanţele chemotactice:
C5a, C5b şi alţi factori produşi în cursul inflamaţiei. Ele au pe suprafaţa lor receptori
pentru fragmentul Fc al imunoglobulinei G (IgG) şi receptori pentru fracţiunea C3b a
complementului şi pot dezvolta mecanisme puternic microbicide. Se mai numesc şi
fagocite profesioniste, pentru a putea fi deosebite de celulele fibroblaste, endoteliale şi
reticulare care alcătuiesc fagocitele neprofesioniste; acestea îndeplinesc o activitate
fagocitară mai redusă, deoarece sunt lipsite de receptorii prezenţi pe fagocitele
profesioniste şi mai ales nu dezvoltă mecanisme bactericide.

MICROFAGE

- Granulocitele neutrofile realizează fagocitarea corpilor bacterieni integri sau

fragmentelor de germeni. Capacitatea de fagocitoză este mărită de procesul de
opsonizare, opsoninele fiind anticorpi de tip IgG. După înglobare, antigenele străine
sunt distruse datorită: enzimelor lizozomale şi lactoferinei (din granulaţiile specifice
neutrofile); mieloperoxidazei, elastazei, catepsinei, beta-glucuronidazei (din granulaţiile
azurofile). Ele sunt celule “kamikaze” ale apărării antiinfecţioase, deoarece sosesc
primele la locul injuriei. După digestia materialului fagocitat, foarte frecvent, leucocitele
sunt distruse.

- Polimorfonuclearele eozinofile iau parte la apărarea antiparazitară. Conţin enzime ce

metabolizează histamina şi leucotrienele fiind astfel capabile să joace rol important în

limitarea reacţiilor alergice. Ele conţin şi proteine toxice (proteina majoră bazică) ce

duce la distrugerea celulelor epiteliale din tractul respirator ducând la inflamaţie cronică
în astmul bronşic. Ele fagocitează complexe antigen-anticorp precum şi unele resturi

antigenice ce rezultă din răspunsul imun şi care în alte condiţii ar duce la boli autoimune.

- Polimorfonuclearele bazofile (echivalentul mastocitelor tisulare) au granulaţii mari ce

conţin numeroşi mediatori chimici şi precursorii acestora, ca, de exemplu: histamina,
prostaglandine, leucotriene, factori activatori ai trombocitelor. Aceşti mediatori sunt
eliberaţi, la nevoie, în cantităţi reduse. Elaborarea lor masivă poate fi dăunătoare cu
apariţia reacţiilor alergice de tip I: astm bronşic, urticarie, febră de fân etc.

MACROFAGELE
Pot fi mobile, prezente în sânge (monocitele) şi fixe, dar uşor mobilizabile, ce fac
parte din sistemul reticulo-endotelial (sistem fagocitar mononuclear). Exemple:
macrofagele din splină şi ganglionii limfatici; celulele Kuppffer din ficat; histiocitele din
ţesutul conjunctiv; unele celule ale nevrogliei.
În tabelul 5 sunt prezentate comparativ principalele proprietăţi şi funcţii ale
polimorfonuclearelor şi celulelor sistemului reticulo-endotelial.

Polimorfonucleare Sistem fagocitar mononuclear

Proprietăţi Funcţii Proprietăţi Funcţii
- Au origine - Sunt foarte - Origine medulară -
medulară mobile Fagocitoz
a
- Sunt celule cu - Sunt primele - Sunt celule cu
viaţă scurtă care se viaţă lungă - Funcţie
deplasează la secretorie
- Au pe locul infecţiei - Au pe suprafaţă
suprafaţă receptori pentru C3
receptori pentru - Reprezintă şi Fc a IgG - Celule
C3 şi Fc a IgG prima linie de asociate
celule care - Au un număr mic răspunsul
- Au un număr fagocitează de lizozomi ui imun
mare de (numărul creşte în
lizozomi - Digeră total macrofagul
bacteriile “activat”)
fagocitate
- Nu au
- - Eozinofilele mieloperoxidază
Mieloperoxidaz înglobează
a prezentă în complexe
lizozomi antigen-anticorp - Cuprinde
monocitul sanguin
- Sunt active şi macrofagele
neutrofilele, tisulare.
apoi eozinofilile Macrofagele diferă
morfologic între
 ele, dar
funcţionează
identic

Tabel 5: Caractere ale fagocitelor polimorfonucleare şi celulelor sistemului fagocitar

mononuclear (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

Macrofagele fagocitează macromolecule inerte, microorganis-mele opsonizate, pe

care le distrug în mare parte (tabel 6).
Unele microorganisme (micobacterii, listerii, brucele, toxoplasme) supravieţuiesc

şi se înmulţesc în macrofage. În acest caz, macrofagele protejează microorganismele

respective, servind ca factor de diseminare a infecţiei.

Funcţie Exprimare
1. Fagocitoză - Reprezintă a doua linie de celule care

fagocitează ;

- Nu digeră complet microorganismele;

2. Funcţie - Înglobează resturi celulare şi tisulare,
secretorie “curăţind” teritoriul lezat.

- Enzime cu acţiune asupra proteinelor prezente

în mediul extracelular: colagenaze, elastaze,
proteaze lizozomale, activatori ai
plasminogenului;
- Secreţie de factori antiinfecţioşi: lizozim,
fracţiuni ale complementului (C2, C4, probabil
C3, C5), interferon;
- Factori ce modelează funcţia altor celule:
proteina mitogenă asupra limfocitului T şi a
timocitului;
3. Cooperare - Citotoxine asupra celulelor străine şi tumorale;
cu sistemul - Reglatori ai activităţii celulare: prostaglandine;
imun - Factori de diferenţiere: factorul de “stimulare
al coloniilor”, care stimulează diferenţierea
celulei suşă medulare în linia granulocitară.

- Intervine în declanşarea şi reglarea răspunsului

imun.
 Tabel 6: Funcţiile celulelor sistemului fagocitar mononuclear (după A. Ivanof şi M.
Ciupe, 1982)

ETAPELE FAGOCITOZEI
Sunt reprezentate de: chemotaxie, adsorbţia particulelor pe fagocit, ingestia
particulelor în fagocit şi digestia intracelulară.

CHEMOTAXIA
Reprezintă mobilizarea unidirecţională, dirijată a polimorfonuclearelor spre
locul unde se eliberează factori chemotactici. Aceşti factori pot fi atât de origine
bacteriană (formilmetionil-leucil-fenilalanina), cât şi factori ai organismului gazdă, ce
apar în cursul inflamaţiei: C5a, kalicreina produsă de ţesuturile lezate, prostaglandine
(E2, D2), tromboxan, leucotriene (B4), amine vasoactive, fragmente de colagen, de
fibrină (tabel 7). Sub influenţa factorilor chemotactici fagocitele părăsesc capilarele prin
diapedeză.
Pentru fiecare dintre factorii chemotactici, fagocitele au receptori specifici. În urma
interacţiunii dintre aceşti factori şi receptorii celulari prezenţi pe suprafaţa PMN, se
produc modificări ale fagocitului.

Componente bacteriene Componente ale organismului

- Proteine bacteriene,
îndeosebi N-formil-
metionil-peptide;
- Unele lipide bacteriene.
- Componente din sistemul complement:
C5a, C5,6,7, obţinute prin activare;
- Proteine serice: Kallikreina, fragmente
de fibrină;
- Histamina;
- Derivaţi arahidonici;
- Produse ale limfocitelor (limfokine);
- Unii factori eliberaţi de neutrofile.

Tabel 7: Factori chemotactici (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

ADSORBŢIA (ATAŞAREA) PARTICULELOR PE SUPRAFAŢA FAGOCITELOR

Ataşarea pe suprafaţa fagocitului poate fi întâmplătoare sau dirijată. Contactul
întâmplător depinde de şansa de coliziune între fagocite şi particule. În cel de-al doilea
caz, fagocitele migrează către bacterii sau alte particule datorită chemotaxiei. S-a
demonstrat că unele extracte bacteriene sau corpi bacterieni integri atrag leucocitele
(chemotaxie pozitivă).
Dar, în mod normal, pentru ca să permită ataşarea fagocitului, suprafaţa celulei
bacteriene trebuie modificată, şi această pregătire în vederea fagocitării se numeşte
opsonizare. Opsonizarea se poate realiza prin mecanisme specifice, deoarece presupun
participarea anticorpilor rezultaţi în urma unui răspuns imunitar. Este vorba de
intervenţia IgG, care se leagă de fagocite prin fragmentul Fc, realizând o punte între
antigenele de suprafaţă şi receptorul de pe fagocit, sau prin acţiunea combinată a
complementului şi a anticorpilor, aşa cum se întâmplă în cazul IgM. IgM nu se pot fixa
pe suprafaţa fagocitului, dar intervin formând complexe imune care activează
complementul, activare din care rezultă fracţiunea C3b pentru care există receptori pe
fagocit (figura 6).
Opsonizarea se poate realiza şi prin mecanisme nespecifice, prin intervenţia
proteinei C reactive, a fibronectinei, C3b, alfa 2-glicoproteinei serice.

Figura 6: Etapele fagocitozei

Un factor potenţator al ataşării particulelor este şi aşa numita fagocitoză de

suprafaţă, prin care microorganismele sunt captate mai uşor dacă sunt prinse pe
suprafeţe rugoase. Aceasta se poate realiza prin plasarea microorganismelor pe
suprafeţele dintre leucocite, între leucocite şi suprafeţele tisulare, sau în interstiţiile
cheagurilor de fibrină.
Adsorbţia particulelor pe suprafaţa fagocitului este inhibată de anumiţi factori:
hiperosmolaritatea mediului, concentraţii crescute de glucoză şi, respectiv, scăzute de
fosfaţi în mediu etc.

INGESTIA (ÎNGLOBAREA) PARTICULELOR ÎN FAGOCIT

După ataşare, particulele sunt înglobate într-o vacuolă formată de membrana

citoplasmică prin emitere de pseudopode. Procesul necesită energie, care provine de

obicei din glicoliză. După înglobarea particulei, vezicula fagocitară se deplasează spre

interiorul celulei.

Etapa de ingestie (înglobare) se desfăşoară cu ritmuri şi intensităţi diferite, în

funcţie de intervenţia unor factori potenţatori sau inhibitori. Din prima categorie,

amintim existenţa în membrana fagocitului a unor proteine „contractile” din familia

actino-miozinei, care asigură emiterea de pseudopode şi formarea „pungilor”. Factorii

inhibitori sunt mai puţin bine studiaţi, un rol probabil în acest sens avându-l

prostaglandinele din seria E şi leucotrienele din grupul B.

DIGESTIA
Vacuola formată (fagozom) va fuziona cu lizozomii (grupaţi în jurul vacuolei)
rezultând fagolizozomii. Formarea fagolizozomilor este un proces însoţit de dispariţia
granulaţiilor intracitoplasmatice (degranulare). Liza granulelor ar avea loc la contactul cu
peretele pungii fagocitare şi constă în eliberarea enzimelor lizozomale, care sunt diverse
substanţe cu acţiune microbicidă, care vor declanşa digestia. În acelaşi timp, are loc o
activare puternică a metabolismului oxidativ al PMN.
Distrugerea microbilor se petrece prin 2 mecanisme: O2-dependente şi O2-
independente.

 Mecanismele O2-dependente
Sunt consecinţa “exploziei respiratorii”, o cale metabolică de respiraţie în stare
dormantă într-o celulă inactivă. Intensificarea bruscă a metabolismului („explozia
respiratorie”) duce la formarea unor compuşi de tipul: ionilor de superoxid (O3-), oxigen
atomic (O-), radicali hidroxili, peroxid de hidrogen (H2O2) şi hipoclorit (HOCl). Toţi
aceşti produşi au efect puternic bactericid.
Fenomenul digestiei intracelulare a particulelor are o complexitate deosebită. În
esenţă, au loc următoarele secvenţe:
- eliberarea enzimelor lizozomale din fagolizozomi în interiorul vacuolei;
- eliberarea în vacuolă şi a altor enzime celulare: mieloperoxidaza, o enzimă foarte
activă stocată în PMN, care în mediu acid existent în fagolizozom duce la formarea unor
halogeni cu efect puternic microbicid;
- activarea proceselor oxidative şi anume: utilizarea intensă de către celulă a
oxigenului molecular, care, sub acţiunea catalitică a NADPH
(nicotinadenindinucleotidfosfat redus), se transformă în superoxid; superoxidul este
clivat, datorită superoxid-dismutazei, în oxigen molecular şi peroxid de hidrogen;
- peroxidul de hidrogen, în cooperare cu mieloperoxidaza, determină dezagregarea
particulelor fagocitate; peroxidul de hidrogen eliberat în fagocit este un agent bactericid
puternic, dar combinarea cu mieloperoxidază îi creşte de 50 de ori activitatea.
 Mecanismele bactericide independente de O2
Aceste mecanisme care intervin în omorârea microorganismelor, se datorează unor
enzime:
- enzime hidrolitice (catepsina, glicozidaza, arilsulfatază) care digeră peretele celular
bacterian;
- defensine: proteine cationice care se leagă de peretele celular şi determină formarea
unor canale ce străpung peretele, atât la bacteriile Gram pozitive, cât şi la cele Gram
negative;
- lizozimul, prezent în granulaţiile lizozomale, ce atacă peptidoglicanul;
- histone nucleare sau pH-ul acid din fagolizozom, care împiedică viaţa
microorganismului fagocitat;
- lactoferina care spoliază mediul de fier necesar bacteriilor pentru multiplicare.
În digestia intracelulară a particulelor mai pot interveni şi mecanisme adiţionale, ca:
apariţia în citoplasmă a ionului de clor oxidat, cu puternică acţiune bactericidă; folosirea
de către celulă a căii scurtate hexozo-monofosfat, în vederea sintezei ulterioare de
superoxid (O2¯), peroxid de hidrogen (H2O2), acidul hipocloros (HOCl).
Omorarea microorganismelor fagocitate este urmată de digerarea completă a
acestora prin activitatea unor hidrolaze. În PMN se produce degradarea completă a
microorganismului, spre deosebire de macrofage, în care particula fagocitată este
degradată parţial, incomplet, antigenele fiind apoi prezentate sistemului imun.

Calea hexozomonofosfaţilor

NADPH Superoxid Mielo

O2 O2¯ H2O2 HOCl

oxidaza dismutaza peroxidază

b.2. INFLAMAŢIA
Este un proces natural de apărare antiinfecţioasă, un mecanism important de
rezistenţă naturală, dar care este reglat în evoluţie de procese imune şi de foarte multe ori
procesul inflamator este dependent de factori imunitari.
Constă dintr-un ansamblu de procese clinice şi fiziopatologice de apărare celulară
nespecifică, declanşat de diferiţi agenţi, cu deosebire infecţioşi, dar şi de iritanţi cum ar
fi substanţele chimice, căldura puternică şi leziuni mecanice. Rezultatul acestui proces
este acumularea unui mare număr de celule fagocitare la locul inflamaţiei.
Inflamaţia este un mecanism de apărare antiinfecţios rapid, care tinde să

localizeze infecţia şi să prevină diseminarea ei. Manifestările clinice sunt eritemul

(rubor), căldura (calor), edemul (tumor), durerea (dolor) şi impotenţa funcţională a

regiunii respective (functio laesa).

Inflamaţia poate evolua spre: vindecare cu restituţio ad integrum a ţesutului sau

vindecare cu sechele. Deznodământul unei reacţii inflamatorii depinde de extinderea
procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum şi de reactivitatea gazdei.

ETAPELE INFLAMAŢIEI (ASPECTE FIZIOPATOLOGICE)

VASODILATAŢIE CAPILARĂ LOCALĂ

Înroşirea zonei inflamate este rezultatul creşterii cantităţii de sânge la acest nivel.
Dilataţia vaselor sanguine locale determină o scădere a circulaţiei sângelui,care este
însoţită de o creştere a permeabilităţii capilarelor locale ceea ce cauzează apariţia
edemului.

ATRACŢIA LEUCOCITELOR (CHEMOTACTISM)

Chemotactismul este reprezentat, în acest caz, de atracţia între leucocite şi spaţiul
interstiţial. Primele celule care ajung în ţesutul agresat sunt PMN, datorită capacităţii
mari de migrare, apoi celulele sistemului reticuloendotelial şi limfocitele care au rol
principal în iniţierea reacţiilor imunitare.
Toate aceste celule sunt înzestrate cu o mare capacitate de recepţie a stimulilor
chemotactici, care sunt reprezentaţi în mare, de factorii chemotactici de natură
bacteriană, de factorii produşi în urma activării C′ , şi nu în ultmul rând, de cei rezultaţi
din degranularea mastocitelor. Cei mai importanţi factori care asigură producerea
inflamaţiei sunt: aminele vasoactive (de tip histaminic), serotonina, unele enzime
proteolitice (enzime lizozomale, kalicreină), unele subfracţiuni de complement (C3a,
C5a) denumite „anafilatoxine” (ce determină degranularea mastocitelor cu eliberarea
unor mediatori chimici), interleukina-1 (IL-1) şi interleukina-8 (IL-8) ce sunt monokine
secretate de macrofag. O parte din aceştia sunt preformaţi, aşa cum este histamina, cu
efect vasodilatator asupra capilarelor şi cu creşterea permeabilităţii acestora.
Sub acţiunea acestor factori, PMN vor părăsi capilarul prin diapedeză şi se vor
îndrepta către focarul inflamator.
În consecinţă se produce o exudare a plasmei cu mediatorii pe care aceasta îi
conţine, din capilare spre zona infectată (creşterea fluxului sanguin spre zona inflamată,
cu creşterea temperaturii locale).
Sub acţiunea unor mediatori chimici rezultaţi în timpul activării C′ şi secretaţi de
macrofagele stimulate de toxinele bacteriene, se modifică endoteliul capilar care
permite adeziunea PMN de acesta.

DIAPEDEZA LEUCOCITARĂ
Este procesul prin care un fagocit se strecoară printre celulele endoteliului
vascular, trecând în spaţiul interstiţial. Această trecere a celulelor în spaţiul interstiţial
se face printr-un mecanism cu mai multe etape: rostogolire, marginaţie-adeziune,
traversare prin emiterea de pseudopode (figura 8).
 C D 1 1 b
R O S T O G O L I R E

C D 1 1 a A D E Z I U N E
C D 6 2 L

C D 1 5 e

G l y C A M I L 8
C D 5 4
C D 6C 2 DP 3 1 D I A P E D E Z A
C D 6 2 E

F i b r o n e c t i n a L a m in in a
C o l a g e n

M A T R I C E E X T R A C E L U L A R Ã

Figura 8: Etapele inflamaţiei

În procesul de trecere a fagocitelor prin celulele endoteliului vascular intervin

moleculele de adeziune, ce fac parte din trei familii: selectine, integrine şi superfamilia
imunoglobulinelor. Moleculele de adeziune sunt structuri exprimate pe suprafaţa
leucocitelor şi a celulelor endoteliale care permit, prin interacţiuni reciproce, ataşarea
leucocitelor de endoteliul capilar, cu o forţă crescândă, facilitând, în final, diapedeza.
Există două categorii de molecule de adeziune (MA): L-selectine (CD 62L, LAM-1) sunt
MA exprimate pe granulocite; E-selectine (CD 62E, ELAM-1), P-selectine (CD 62P),
ICAM-1 (CD 54) ce sunt MA exprimate pe endoteliile vaselor mici.
Iniţial, prin L-selectine granulocitele se leagă de membrana celulelor endoteliale,
legare slabă, sub acţiunea curentului sanguin granulocitele „rulează” (se rostogolesc) pe
suprafaţa endoteliului vascular. Sub acţiunea unor atractanţi (IL-8) se modifică forma
celulelor ataşate, ceea ce determină oprirea rulării şi adeziunea fermă la endoteliu.
Aceeaşi IL-8 de pe suprafaţa endoteliului distruge L-selectinele, cu modificarea formei
celulelor făcându-le apte să traverseze peretele vascular.
PMN vor părăsi capilarul prin diapedeză şi se vor îndrepta către focarul
inflamator unde vor distruge microbii prin fagocităză. Formarea puroiului poate fi
asociată inflamaţiei. După ce fagocitele au distrus celulele bacteriene, sunt degradate şi
mor. În aria afectată se formează o masă de celule distruse, fagocite moarte, ceea ce
reprezintă puroiul.

CONCLUZII
În esenţă, organismul este apărat faţă de unele infecţii prin zestrea sa ereditară,
care nu permite dezvoltarea anumitor germeni. Germenilor la care este sensibil,
organismul se opune pătrunderii lor prin bariere externe anatomice şi chimice la care se
adaugă flora normală a organismului (antagonism bacterian). Dacă totuşi germenii au
reuşit să străbată aceste bariere şi ajung în zonele interne sterile ale organismului, intervin
o serie de factori umorali, dintre care unul este de o importaţă majoră: complementul.
Activarea complementului are ca urmare liza celulelor microbiene, dar şi declanşarea
răspunsului inflamator infecţios. Cascada de activare a complementului va antrena
eliberarea unor mediatori chimici care participă direct în procesul inflamator şi vor
atrage în focarul infecţios un aflux mare de celule fagocitare (PMN, macrofage).
Acestea vor distruge microorganismele prin fagocitoză.
Însă, în acelaşi timp, există germeni care dezvoltă strategii ce ocolesc
mecanismele rezistenţei naturale şi care pot da infecţii la indivizii neimunizaţi. Astfel
de strategii se referă la inhibiţia fagocitozei (secreţia de toxine faţă de fagocite;
rezistenţa faţă de lizozim; inhibiţia exploziei respiratorii a fagocitelor) sau la rezistenţa
la acţiunea complementului (inactivarea C5a la Pseudomonas aeruginosa; prezenţa la
suprafaţa bacteriilor a unor substanţe - acidul sialic - care determină degradarea C3b la E.
coli; împiedicarea inserţiei complexului de atac al membranei la Salmonella, E. coli).
Sintetizând datele privind factorii, respectiv mecanismele de apărare nespecifică
ale organismului, putem constata că prezenţa factorilor nespecifici umorali sau celulari
în diferite umori, sânge, ţesuturi şi organe, constituie un sistem de apărare dinamică şi
interdependentă, prin care organismul uman răspunde la atacul microorganismelor. Acest
sistem cuprinde sistemul fagocitar (polinucleare şi mononucleare), sistemul kininelor
declanşator al proceselor de inflamaţie, sistemul complementului şi sistemul de
coagulare şi fibrinoliză.

2.2. REZISTENŢA SPECIFICĂ (IMUNĂ).

APĂRAREA SPECIFICĂ-IMUNĂ.

IMUNOPROFILAXIE

Se poate spune că, încă din timpul vieţii fetale şi mai pronunţat după naştere şi

ulterior în tot timpul vieţii, organismul uman se găseşte în permanent conflict cu

focarul infecţios. Faţă de acesta organismul reacţionează prin funcţia de apărare

antiinfecţioasă (nespecifică şi specifică - imună), care are câteva intervenţii

importante: vindecarea dintr-o infecţie manifestă, împiedicarea reinfecţiei cu acelaşi

agent etiologic şi prevenirea primoinfecţiei. Aceste modalităţi de apărare se întâlnesc

în toate infecţiile bacteriene, micotice, parazitare şi virale, în care se găsesc trăsături

comune. Ţinând însă seama de mecanismele specifice prin care aceste categorii de

agenţi infecţioşi declanşează procesul infecţios, apar în consecinţă particularităţi

distincte şi diversificate de apărare.

Apărarea antiinfecţioasă se realizează diferenţiat în raport de:

  proprietăţile speciei patogene,
 poarta de intrare,
 localizarea în organismul uman,
 diversitatea factorilor de patogenitate şi a mecanismelor prin care aceştia
acţionează.
Trecând peste aceste diferenţe, se poate însă generaliza, că în majoritatea
infecţiilor, apărarea este rezultatul unei acţiuni sinergice şi ordonate a proceselor de
imunitate (umorală şi celulară) şi a factorilor de rezistenţă naturală.
Mai mult, există şi posibilitatea ca în aceeaşi infecţie să survină o contribuţie
diferenţiată: faţă de o categorie de factori intervin preponderent efectorii imunităţii
umorale, pe când faţă de alţi determinanţi de patogenitate efectul imunitar de apărare se
instalează prin componenţii imunităţii mediate celular.
Intervenţia fagocitelor, prima „armată” care intră în joc în apărare, are un
caracter general, vizând aproape toate bacteriile, ca şi alte microorganisme. Trebuie
subliniat că fagocitoza acţionează în tot timpul infecţiei: împiedicarea instalării agenţilor
infecţioşi la poarta de intrare (evitarea primoinfecţiei şi reinfecţiei), limitarea
multiplicării şi generalizării bacteriilor, constituind în acelaşi timp modalitatea
principală de eliminare a microorganismelor din ţesuturile gazdei, ceea ce are ca rezultat
vindecarea. Chiar dacă acţionează diferiţi factori imunitari sau chimioterapice, fagocitoza
este cea care, în final, asigură sterilizarea organismului de agenţii patogeni. În
majoritatea cazurilor funcţia fagocitară este dependentă de efectori ai imunităţii
umorale, ai imunităţii celulare şi a altor sisteme biologice.
O contribuţie majoră în apărarea antiinfecţioasă o au procesele imunitare. Se
poate aprecia că, în toate infecţiile se dezvoltă paralel o imunitate umorală şi o imunitate
celulară, cu variaţii de intensitate de la o infecţie la alta.
Astfel, dacă în infecţiile cu exotoxine ca factor principal de patogenitate
contribuţia majoră de apărare este asigurată de imunitatea umorală prin procesul de
neutralizare, în alte infecţii, în care microorganismele se multiplică facultativ intracelular,
ca şi în infecţiile virale, în micozele viscerale şi în parazitoze, rolul principal îl au
procesele de imunitate celulară (exemplu: procesul infecţios al tuberculozei). În
majoritatea infecţiilor însă, funcţia de apărare este asigurată prin participarea în
proporţii diferite şi cu intensitate variată, a sistemelor efectoare a celor două tipuri de
răspuns imun. Funcţia de apărare se realizează în primul rând, prin eliminarea cât mai
rapidă a antigenului străin pătruns în ţesuturile organismului, sau neutralizarea efectelor
nocive ale acestuia.

APĂRAREA SPECIFICĂ IMUNĂ

Imunitatea (apărarea imună) reprezintă capacitatea de apărare a organismului:

- faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, paraziţi);

- faţă de propriile molecule şi celule degradate sau modificate.

 Răspunsul de apărare specifică, ce caracterizează apărarea (rezistenţa) imună-

dobândită, este rapid, precoce, intens şi eficient. Intensitatea răspunsului de apărare

specifică depinde de natura agentului infecţios şi de numărul de contacte anterioare

pe care organismul le-a avut cu agentul respectiv.

1. DINAMICA RĂSPUNSULUI IMUN

Modul în care organismul răspunde unui stimul antigenic este variat, dinamica şi
amplitudinea răspunsului diferă în funcţie de factorii genetici, starea fiziologică şi
vârsta, felul, cantitatea şi modul de administrare a antigenului. Dincolo de aceşti factori
există o condiţie care influenţează constant dinamica răspunsului imun şi anume dacă
organismul respectiv a mai venit sau nu în contact cu acelaşi antigen. Din acest punct de
vedere putem distinge un răspuns imun primar şi un răspuns imun secundar.

1.1. RĂSPUNSUL IMUN PRIMAR

Constituie răspunsul organismului la un prim contact cu un antigen, indiferent de
natura agentului. Acest răspuns are amplitudine scăzută şi este redus ca durată şi
intensitate.

1.2. RĂSPUNSUL IMUN SECUNDAR

Un al doilea contact cu acelaşi antigen determină un răspuns imun secundar, mai
prompt, mai intens şi cu o durată mai mare decât răspunsul primar. Organismul care a
venit în contact cu un antigen „ţine minte” aceasta şi ştie să răspundă mai prompt şi mai
bine la un nou contact cu acelaşi antigen. Rezultă deci, că antigenele pot induce un
fenomen de „memorie imunologică”, care întregeşte caracteristicile fundamentale ale
sistemului imun, alături de capacitatea acestuia de a face discriminarea între „self”
(propriu organismului) şi „non-self” (străin de economia organismului), ca şi capacitatea
de discriminare între antigene diferite.

2. TIPURI DE RĂSPUNS IMUN

Există două tipuri de răspuns imun: umoral şi celular.

2.1. RĂSPUNSUL IMUN UMORAL

Imunitatea umorală intervine prioritar faţă de antigenele unor agenţi infecţioşi

(bacterieni, virali, parazitari) responsabili de infecţii acute, faţă de proteine serice de

altă specie sau alt allotip, faţă de antigenele eritrocitare de heterogrup (reacţiile de

incompatibilitate în sistemul grupelor sanguine ABO sau Rh). Secundar, imunitatea

umorală intervine în reacţia de respingere a grefei, ca şi în boala canceroasă.

Veriga efectorie este reprezentată de proteine specifice, plasmatice sau din

secreţii externe (mucoase, piele), denumite imunoglobuline (Ig) - anticorpi (de clasă:

IgM, IgG, IgA, IgD, IgE) care au capacitatea de a neutraliza antigenul care le-a indus

formarea.

Locul contactului între antigen şi anticorp este la distanţă atât de zona de

pătrundere a agentului (poarta de intrare) cât şi de locul de sinteză al

imunoglobulinelor (Ig).

Testarea răspunsului imun se face prin reacţii antigen-anticorp clasice (de

aglutinare, de precipitare, de seroneutralizare, de fixare a complementului, etc.) şi

moderne (imunofluorescenţă, ELISA, RIA).

2.2. RĂSPUNSUL IMUN CELULAR

Intervenţie prioritară faţă de antigene infecţioase care produc o evoluţie cronică a

bolii, cu tendinţa de cuibărire a germenului în ţesut, marcată de descărcări

periodice în torentul sanguin (tuberculoză, bruceloză, sifilis, lepră), faţă de ţesuturi

străine speciei receptorului (respingerea grefelor), ca şi faţă de celulele tumorale (boli

maligne).
 Veriga efectorie este reprezentată de celule specifice - limfocite sensibilizate -

subseturi de limfocite T (limfocitele CD4+Th1 de hipersensibilitate tardivă, limfocite

CD8+ T-citolitice). Aceste celule în contact cu antigenul secretă limfokine (substanţe

solubile secretate de unele celule ale sistemului imun).

Locul contactului între antigen şi anticorp este aproape de poarta de intrare sau în

anumite zone de cantonare preferenţială a antigenului, unde se produce

“granulomul” cu aspect lezional-reactiv (aglomerare de limfocite T şi macrofage).

Testarea răspunsului imun se face prin teste in vivo (intradermoreacţii - IDR - de

tip întârziat) şi teste in vitro (transformarea blastică a limfocitelor T, inhibiţia

migrării macrofagelor, testul de citotoxicitate imună, citometrie în flux).

IMUNOPROFILAXIA INFECŢIILOR

Utilizarea serurilor şi vaccinurilor, alături de chimioterapice, reprezintă o

armă esenţială în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase.

Profilaxia specifică (imunoprofilaxia) infecţiilor bacteriene poate fi de două

categorii: pasivă (transfer de anticorpi specifici) şi activă (administrare de

vaccinuri).

1. IMUNOPROFILAXIA PASIVĂ (SERURI TERAPEUTICE)

Serurile sunt produse biologice cu un conţinut bogat în anticorpi specifici faţă de

unul sau mai mulţi agenţi patogeni şi se folosesc pentru blocarea procesului infecţios

la subiecţii infectaţi cu agentul patogen respectiv.

 Aceste seruri conferă imunitate pasivă (fără participarea sistemului celular

imunocompetent). Imunitatea prin transfer de anticorpi este rapidă (conţine

anticorpi gata formaţi), dar de scurtă durată (10-15 zile pentru serurile heterologe şi

20-30 de zile pentru serurile homologe), timp necesar proteinei străine să se elimine

din organism.

După provenienţă, serurile sunt de două categorii: seruri heterologe şi seruri

omologe.

1.1. ADMINISTRAREA DE ANTICORPI SPECIFICI HETEROLOGI

(SEROPROFILAXIE, SEROTERAPIE)

Serurile heterologe se obţin pe animale (cal, iepure, oaie) hiperimunizate activ cu

diferite vaccinuri şi antitoxine.

Se utilizează în prevenirea unor boli bacteriene care recunosc în mecanismul

patogenic intervenţia prioritară sau exclusivă a exotoxinelor bacteriilor infectante:

tetanos, difterie, gangrenă gazoasă, botulism.

După compoziţie, serurile se clasifică în:

- seruri antibacteriene (ser antimeningococic);

- seruri antitoxice (ser antidifteric, antitetanic, antigangrenos, antibotulinic);
- seruri mixte: antibacterian + antitoxic (ser anticărbunos).

După scop, serurile se clasifică în seruri administrate profilactic (seroprofilaxie)

şi seruri administrate curativ. De exemplu, la copii contacţi cu un bolnav de difterie

se administrează preventiv ser imun antidifteric. Dar pentru a obţine o imunizare

mai puternică şi durabilă, seroprofilaxia se continuă cu vaccinarea (anatoxină

difterică).

Imunizarea pasivă are caracter de urgenţă în următoarele cazuri:

- protecţia pacienţilor cu a-gamaglobulinemie faţă de infecţiile cu bacterii piogene

în condiţii de risc crescut pentru infecţiile respiratorii;
- protecţia persoanelor nevaccinate în condiţii de risc ctrescut pentru tetanos sau
pacienţi cu plăgi traumatice, arsuri, avort septic;
- gangrenă gazoasă la pacienţii cu plăgi traumatice;
- terapia unor toxiinfecţii şi intoxicaţii: difterie, tetanos, botulism, muşcătură de
şerpi veninoşi.

1.2. ADMINISTRAREA DE GAMAGLOBULINE SPECIFICE HOMOLOGE

Se obţin de la om, fie de la convalescenţi de boli infecţioase (seruri de

convalescent), fie de la persoane imunizate activ, în mod special, şi se numesc seruri

hiperimune. Serurile omologe se folosesc astăzi sub formă de imunoglobuline

(gamaglobuline) specifice, extrase din aceste seruri.

- Imunoglobulinele extrase din amestecuri diferite de plasmă (de la mai mulţi

donatori adulţi normali) se numesc imunoglobuline normale sau gamaglobuline
normale standard (conţin IgG faţă de microorganismele care infectează majoritatea
populaţiei);
- Gamaglobulinele obţinute din seruri de convalescent sau din serul unor voluntari
umani hiperimunizaţi cu un anume antigen (prin vaccinare sau administrare de
anatoxină) se numesc imunoglobuline umane specifice anti-(ex.: tetanos) sau
gamaglobuline umane hiperimune.
 Avantajul administrării gamaglobulinelor specifice: număr redus de injecţii; aport

mare de anticorpi care se menţin în organism un timp mai îndelungat (10-14

săptămâni); fără riscul sensibilizării la o eventuală repetare.

Administrarea gamaglobulinelor se face prin injecţii intramusculare şi nu

intravenoase. Introducerea directă în sânge poate determina forme grave de

hipersensibilitate imediată (agregarea trombocitelor, activarea complementului).

2. IMUNOPROFILAXIA ACTIVĂ (VACCINURILE)

Vaccinurile sunt eşantioane de germeni microbieni sau toxine bacteriene,

preparate astfel încât şi-au pierdut capacitatea de a produce boală (patogenitatea), dar

şi-au păstrat capacitatea de a induce răspuns imun (imunogenitatea), deci de a proteja

activ, specific organismul împotriva unei reinfecţii homologe cu germeni patogeni.

Un individ vaccinat, venind în contact cu germenul patogen sau cu toxinele

acestuia, va dezvolta nu un răspuns primar (de mică intensitate, de durată scurtă),

ci un răspuns secundar (intens şi persistent).

2.1. CATEGORII

În funcţie de starea agenţilor patogeni (modul de preparare) şi natura

componentelor antigenice, vaccinurile se pot clasifica în:

· vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni vii atenuaţi (microbieni,

virali);
· vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni omorâţi sau inactivaţi
(microbieni, virali);
· vaccinuri preparate din:
- componente microbiene purificate (produse ale metabolismului bacterian);
- fracţiuni sau subunităţi structurale ale microorganismelor (polizaharide
capsulare, componente ale peretelui bacterian, subunităţi antigenice virale);
· vaccinuri sintetice;
· vaccinuri clonate sau biosintetice obţinute cu ADN-recombinant.

2.1.1. Vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni vii atenuaţi

Majoritatea vaccinurilor vii atenuate sunt vaccinuri virale, cele bacteriene

fiind mai puţine. Aceste vaccinuri complete conţin tulpini bacteriene (sau virale)

selectate pentru nivelul redus şi stabil al virulenţei.

Exemple de vaccinuri vii atenuate sunt prezentate în tabelul 1.

Virusuri Bacterii
Vaccinuri standard Vaccinuri standard
Poliomielitic Mycobacterium

tuberculosis
Rujeolic Salmonella typhi
Rubeolic
oreionului
febrei galbene
hepatitei A
Vaccinuri Vaccinuri experimentale

experimentale
Gripal Shigella
respirator sinciţial Vibrio cholerae
Rotavirus
 Citomegalovirus
Herpesvirus
Varicella

Tabelul 1: Vaccinuri vii atenuate (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

Atenuarea bacteriilor se face prin căldură, mutaganeză chimică (bacil tific),

pasaje timp îndelungat pe medii de cultură (ex.: tulpini de bacil tuberculos bovin

întreţinut timp de 13 ani prin pasaje succesive pe mediu cu cartof glicerinat şi bilă).

Administrarea la persoanele sănătoase produce o infecţie inaparentă, urmată,

după o singură inoculare, de instalarea unei imunităţi mediate umoral (prin

anticorpi) şi/sau celular (limfocite T reactive specifice).

În tabelul 2 sunt prezentate principalele avantajele şi dezavantajele

vaccinurilor preparate din agenţi vii atenuaţi.

Avantaje Dezavantaje
- asigură stimularea - reversibilitatea virulenţei

concomitentă a imunităţii iniţiale după replicarea

mediate celular şi umoral îndelungată în organismele

(inclusiv IgA secretor); vaccinate;

- în administrarea orală → - stabilitatea scăzută a

imunitatea umorală locală vaccinurilor la temperaturi

blochează accesul virusului ambiante;

“sălbatic” la celulele sensibile; - numărul relativ mare de

contraindicaţii.
- asigură protecţie de lungă

durată (ani de zile) deoarece

 vaccinarea echivalează cu o

infecţie uşoară sau

asimptomatică în cursul căreia

replicarea asigură eliberarea în

organism a unei cantităţi de

determinanţi antigenici cu

structură identică cu cea a

agentului patogen;

- răspunsul imun este divizat

faţă de toate antigenele

microorganismului

- sunt uşor de administrat;

- previn boala naturală.

Tabelul 2: Avantajele şi dezavantajele vaccinurilor preparate din agenţi vii atenuaţi

(după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

2.1.2. Vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni omorâţi sau inactivaţi

Sunt suspensii sau produse obţinute din particule bacteriene (sau virale) totale, la

care, prin diverse procedee fizice (căldură, radiaţii UV) sau chimice, s-a neutralizat

infecţiozitatea cu menţinerea proprietăţilor imunogene. Induc un răspuns imun mediat

umoral (anticorpi).

Exemple:
− vaccinul antitifoidic (TAB);
− vaccinul antiholeric;
− vaccinul antipertussis;
− vaccinul anti-E. coli (experimental);
− vaccinul anti-Yersinia pestis.
Principalele avantaje şi dezavantaje ale vaccinurilor preparate din agenţi

infecţioşi omorâţi sunt prezentate în tabelul 3.

Avantaje Dezavantaje
- stabilitatea mare care - induc imunitate de durată mai

nu permite reversia scurtă → rapeluri numeroase;

virulenţei;
- absenţa stimulării proceselor

- stabilitate antigenică; imunitare locale la nivelul

- stabilitate la mucoaselor (IgA secretor) →

temperatura uzuală. riscul ca la vaccinaţi să se producă

o colonizare a mucoaselor cu

multiplicare locală a agenţilor

imunizanţi urmată de diseminarea

şi transmiterea lor.

Tabelul 3: Avantajele şi dezavantajele vaccinurilor preparate din agenţi

infecţioşi omorâţi (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

2.1.3. Vaccinuri preparate din componente microbiene

a. Anatoxine
 Anatoxinele sunt produse microbiene purificate. Se obţin din toxine bacteriene

(tetanică, difterică, clostridiilor gangrenei gazoase, stafilococică) detoxifiate prin

învechirea la căldură cu formol 4%.

Administrarea anatoxinelor este însoţită de apariţia în organismul omului

vaccinat a anticorpilor antitoxici, protectori împotriva infecţiei cu germeni secretori

de exotoxine cu specificitate similară anatoxinei vaccinante.

Cele mai eficiente anatoxine utilizate în vaccinare sunt anatoxina difterică şi

tetanică. Formează, împreună cu Bordetella pertussis inactivat, un trivaccin Di-Te-

Per. O altă anatoxină este cea preparată din neurotoxina secretată de Clostridium

botulinum.

b. Vaccinuri preparate din fracţiuni sau subunităţi structurale ale microorganismelor

Sunt preparate vaccinale constituite din componenţi structurali care sunt

responsabili de răspunsul imun: polizaharide capsulare, componente ale peretelui

bacterian, subunităţi antigenice virale.

Avantajele constau în eliminarea reacţiilor postvaccinale iar dezavantajele în

obţinerea unei imunităţi celulare slabe, cu necesitatea asocierii de adjuvanţi.

2.1.4. Vaccinuri sintetice

Se obţin prin sinteza in vitro a fracţiunilor polipeptidice care reprezintă antigenele

vaccinante ale unor microorganisme. Pentru a deveni antigene complete, fracţiunile

sintetice trebuie cuplate cu un carrier. Aceste vaccinuri sunt încă obiect de studiu

experimental.

2.1.5. Vaccinuri obţinute cu AND-recombinant (vaccinuri clonate sau biosintetice)

Sunt preparate în scopul obţinerii de fracţiuni antigenice imunogene purificate a

căror administrare să excludă reacţiile adverse şi complicaţiile postvaccinale.

Prin tehnica ADN-recombinant, genele care codifică proteinele (antigenele)

componente ale vaccinului sunt selecţionate, izolate şi introduse în genomul unei

celule vector: bacterie (E. coli), levură (Saccharomices cerevisiae) sau celule de

mamifere capabile apoi să le sintetizeze în cantităţi industriale.

În raport cu numărul antigenelor înrudite sau diferite în acelaşi preparat,

vaccinurile pot fi:

- vaccinuri monovalente care provin de la o singură specie bacteriană sau virală

(toate vaccinurile);

- vaccinuri asociate care reprezintă o asociere a vaccinurilor împotriva mai multor

boli, asociere care trebuie să asigure eficacitatea fiecăruia dintre vaccinuri, iar

reacţiile adverse să nu fie mai frecvente şi mai grave decât cele cunoscute pentru

fiecare vaccin în parte. Exemple: vaccinul antidiftero-tetanic (vaccin bivalent),

diftero-tetano-pertussis (vaccin trivalent), antimeningococic (tetravalent).

2.2. INDICAŢII DE VACCINARE

 Aceste indicaţii pot fi: generale, selective şi elective.

Vaccinările generale vizează toată populaţia infantilă sau adultă în raport cu un

program de vaccinare stabilit în funcţie de gravitatea şi prevalenţa într-o anumită

ţară a unor infecţii. Astfel, în România, vaccinările anti-tetanică, anti-difterică, anti-

tuberculoasă, anti-pertussis şi anti-poliomielitică sunt obligatorii.

Vaccinările selective vizează grupe de populaţii cu risc crescut la o infecţie (anti-

pneumococică, anti-meningococică, anti-gripală în colectivităţi).

Vaccinările elective vizează pacienţii la care anumite infecţii sunt mai frecvente şi mai

grave decât în populaţia generală (vaccinul anti-pseudomonas la pacienţii arşi,

vaccinul anti-gripal la pacienţi cu afecţiuni respiratorii cronice, la cei cu diabet

zaharat).

2.3. CALEA DE ADMINISTRARE A VACCINURILOR

Calea de administrare este în general parenterală, deci fără producerea de

anticorpi IgA secretori. Se impune, atunci când bariera imună a mucoaselor este

esenţială pentru o protecţie bună, administrarea vaccinurilor atenuate pe cale orală,

pentru a stimula producerea de IgA secretor.

2.4. COMPLICAŢIILE VACCINURILOR

Aceste complicaţii constau din: inducerea bolii infecţioase şi diverse accidente

alergice.
- Boala infecţioasă poate fi indusă prin vaccinuri vii (tulpini bacteriene sau virusuri

atenuate) la persoanele cu deficienţe ale apărării imune.

- Accidentele alergice (reacţii anafilactice) se pot datora impurităţilor antigenice

provenite din substratul pe care se cultivă tulpina vaccinantă.

2.5. CONTRAINDICAŢIILE VACCINURILOR

Pot fi temporare şi definitive. Din categoria celor temporare fac parte:

sarcina, boli febrile acute. Cele definitive se referă la pacienţii cu imunodeficienţe şi

pacienţii hipersensibilizaţi la antigenele vaccinante.

MICROBIOLOGIE ECOLOGICĂ

1. DEFINIREA TERMENILOR
Microbiocenoza reprezintă ansamblul speciilor de microorganisme, dintr-un

anumit ecosistem (nişă ecologică).

Ecosistemul (nişa ecologică) este zona din macroorganism (cavitate naturală, piele
etc.) care asigură dezvoltarea unei microbiocenoze.
Microbiota defineşte totalitatea microbiocenozelor din organism, cu interrelaţiile
dintre ele.

Flora bacteriană dintr-o nişă bacteriană poate fi clasificată după două criterii:
adaptabilitatea la condiţiile nişei ecologice şi potenţialul de a determina boala.

După adaptabilitatea la condiţiile nişei ecologice

− Flora rezidentă: microorganisme bine adaptate la condiţiile ecosistemului, constantă
şi caracteristică sistemului;
− Flora flotantă: specii de microorganisme neadaptate, sau puţin adaptate, cu timp de
persistenţă variabil în cadrul unui ecosistem.
 După potenţialul de a determina boala
Din punct de vedere al patogenităţii, microorganismele nu se pot clasifica rigid,
deoarece în anumite condiţii acelaşi microorganism stabileşte relaţii diferite cu gazda
umană.

− Flora saprafită (“normală” sau “indigenă”): speciile nepatogene care populează în

mod normal diferitele ecosisteme ale organismului.

− Flora patogenă: este alcătuită din microorganisme patogene, care nu se găsesc în

mod normal în ecosistemele organismului. Ele pot determina tulburarea echilibrului
ecologic al nişei, cu apariţia unei boli cu manifestări clinice caracteristice, uneori cu
penetraţie mare în populaţie (Salmonella Typhi, Yersinia pestis etc.), sau pot determina
îmbolnăviri cu consecinţe grave (Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum).

− Flora condiţionat patogenă: specii şi tulpini saprofite, din flora indigenă a

ecosistemului, care, în anumite condiţii favorizante (scăderea rezistenţei antiinfecţioase a
organismului, stress, viroze, tratament imunosupresiv, SIDA, etc.), ca şi în cazul în care
colonizează zone anatomice sterile (apariţia de septicemii şi meningite), pot determina
boala. Datorită existenţei patogenităţii condiţionate, termenul de floră “normală” tinde să
fie înlocuit, cu cel de floră “indigenă”, termen care implică posibilitatea ca din această
floră să se selecteze indivizi bacterieni condiţionat patogeni.

− Flora accidental patogenă provine din flora comensală a organismului, dar

necesită condiţii deosebite de înmulţire, chiar dacă pătrunde în zone anatomice sterile.
Astfel, streptococii viridans se găsesc în mod normal în faringe şi ajung în circulaţie
după extracţii dentare. La omul sănătos, mecanismele rezistenţei naturale antiinfecţioase
înlătură streptococii în câteva ore de la pătrunderea lor în sânge, pe când la cei cu vicii
valvulare, la care există depozite de fibrină pe endocard, streptococii se vor înmulţi
producând endocardita lentă malignă. Un alt exemplu, este cel al tulpinilor de
Staphilococcus epidermidis, principalul comensal al pielii, care explică eşecurile din
chirurgia ortopedică şi cardiacă datorită pătrunderii în circulaţie, în timpul actului
operator.

Flora condiţionat patogenă şi cea accidental patogenă alcătuiesc flora oportunistă,

care profită în orice împrejurare de vulnerabilitatea gazdei umane.
Ponderea germenilor în etiologia infecţiilor s-a modificat de-a lungul timpului.
Până la descoperirea rolului microbilor în producerea acestora, patologia infecţioasă a
fost dominată de bacteriile înalt patogene. Introducerea metodelor de antisepsie şi
asepsie, a profilaxiei specifice prin vaccinare şi seroterapie a bolilor infecţioase, a scăzut
mult incidenţa infecţiilor. După descoperirea antibioticelor problema infecţiilor părea
rezolvată, însă la scurt timp după introducerea lor în tratamentul infecţiilor, s-a remarcat
apariţia tulpinilor bacteriene rezistente. În consecinţă, etiologia infecţiilor a început să fie,
şi mai este şi astăzi, dominată de flora condiţionat patogenă.
Cu timpul, microbiologia clinică a fost pusă faţă în faţă cu o nouă problemă, legată de
diagnosticul microbiologic al infecţiilor care apar la bolnavii cu SIDA. Înfecţiile, la aceşti
bolnavi cu imunitatea compromisă, sunt produse de microorganisme condiţionat
patogene, accidental patogene şi uneori chiar şi de microorganisme care până în prezent
nu au fost deloc izolate (sau foarte rar) în infecţii.

2. INTERRELAŢII ÎNTRE MICROORGANISMELE DINTR-O NIŞĂ

ECOLOGICĂ
Între microorganismele dintr-o nişă ecologică se stabilesc relaţii care pot influenţa
gazda umană. Relaţiile ce se stabilesc între microorganisme sunt: neutralism,
comensalism, simbioză, sinergism, parazitism, antagonism.

RELAŢII DE INDIFERENŢĂ (NEUTRALISM), în care speciile se tolerează

reciproc. În acest tip de relaţie, speciile trebuie să fie îndeajuns de depărtate din punct de
vedere taxonomic şi să aibe necesităţi nutritive diferite (să nu intre în competiţie pentru
acelaşi substrat nutritiv sau energetic). Acest tip de relaţie influenţează mai puţin gazda
umană.

RELAŢII DE COMENSALISM, în care un microorganism are nevoie de un altul,

fără ca fenomenul să fie valabil şi invers. De pildă, Haemophilus influenzae are nevoie
pentru creştere şi multiplicare de factor V, factor pe care îl secretă Staphylococcus
aureus. Aplicaţia practică a acestui raport dintre cele două specii se folosea în trecut
pentru izolarea Haemophilus influenzae dintr-un produs patologic în care se bănuia
prezenţa lui, prin însămânţarea în striu transversal a unei tulpini de Staphylococcus
aureus. Coloniile de Haemophilus se dezvoltă doar în jurul culturii de stafilococ. Acest
fenomen se numeşte satelitism. Alt exemplu este constituit din cultivarea împreună a
bacteriilor aerobe şi anaerobe. Bacteriile aerobe consumă oxigenul molecular cu
scăderea potenţialului de oxidoreducere din mediu, ceea ce permite dezvoltarea
populaţiei anaerobe asociate.

SIMBIOZA constă în asocierea a două specii care se favorizează reciproc. Astfel,

aciditatea produsă de bacilii lactici favorizează dezvoltarea levurilor, care consumă la
rândul lor acidul lactic. Scăderea acidităţii permite dezvoltarea bacililor lactici.

SINERGISMUL este o relaţie între microorganisme, frecvent dăunătoare

organismului. Astfel, unele bacterii fuziforme (Fusobacterium) şi spiralate (Treponema
vincenti) nu sunt patogene separat, dar atunci când se regăsesc împreună în faringe, sunt
cauza unei faringite ulceronecrotice denumită şi angina fuzospiralară a lui Plaut-
Vincent. Alt exemplu este prezenţa concomitentă, într-o plagă, a florei aerobe şi
anaerobe. Flora aerobă consumă oxigenul creând astfel condiţii optime dezvoltării florei
anaerobe.

PARAZITISMUL constă în folosirea unei specii de către o altă specie ca habitat.

Există multe forme de parazitism între microorganisme, dar din punct de vedere medical
importante sunt virusurile care parazitează bacteriile - bacteriofagii. Prin relaţiile care
se stabilesc între bacteriofagi şi celulele parazitate se pot răspândi diverse caractere,
dintre care de interes medical, sunt cele legate de patogenitatea şi rezistenţa la
antibiotice ale bacteriilor. Exemplu: în relaţiile fag-bacterie de tip simbiotic, când
„infecţia” cu un bacteriofag temperat a unei bacterii din aceeaşi nişă ecologică, conferă
acesteia proprietăţi noi (tulpinele de Corynebacterium diphteriae devin toxigene prin
lizogenizare cu fagi specifici; streptococii betahemolitici lizogeni secretă toxina
eritrogenă etc).

ANTAGONISMUL se defineşte prin efectul inhibitor pe care un microorganism îl are

asupra dezvoltării şi multiplicării altui microorganism. Este cea frecventă relaţie
întâlnită între microorganismele aceleiaşi nişe ecologice. Într-o asemenea interrelaţie,
specia care învinge se numeşte antagonistă, iar specia sau speciile stânjenite în
dezvoltare se numesc concurente. Se deosebesc trei tipuri de antagonism:
 antagonism prin diferenţă de vitalitate care se datorează vitezei de multiplicare
mai mare a unei specii decât a speciei concurate, diferenţe de echipament enzimatic etc.
 antagonism nespecific care este determinat de eliberarea în mediu a unor substanţe
toxice, neselective ca, de pildă, acizi, alcooli etc.
 antagonism specific ce se datorează elaborării unor substanţe mai puţin toxice
asupra organismului, dar nocive pentru alte specii microbiene. Aceste substanţe sunt
antibioticele, care constituie baza terapiei antiinfecţioase şi bacteriocinele (substanţe
specifice proteice, cu activitate antibacteriană cu spectru îngust, secretate de unele
bacterii - E. coli, Pseudomonas aeruginosa, care acţionează asupra indivizilor aceleiaşi
specii sau a speciilor înrudite).
Există numeroase exemple de antagonism bacterian: între bacteriile aerobe
sporulate (Bacillus anthracis, Bacillus mycoides); între Pseudomonas aeruginosa şi
Bacillus anthracis; între speciile nepatogene şi cele patogene (speciile nepatogene, mai
adaptabile, inhibă de obicei pe cele patogene). Exemple: streptococii alfa-hemolitici
(viridans) inhibă în faringe dezvoltarea Corynebacterium diphteriae; Escherichia coli
nepatogen inhibă în intestin speciile patogene de Enterobacteriaceae (E. Coli patogen,
Shigella, Salmonella etc.).
Relaţiile de antagonism pot însă să se manifeste uneori în dauna florei saprofite şi
în favoarea celei patogene. Astfel, Staphilococcus aureus patogen este antagoist
puternic faţă de E. Coli nepatogen. Aşa se explică de ce tratamentul abuziv cu antibiotice
cu spectru larg (tetracicline), pe cale orală, neasociat cu administrarea de complex
vitaminic B, prin inhibiţia parţială a florei de E. Coli din intestin, favorizează apariţia
unei enterite stafilococice foarte grave - disbacterie - (tulburarea echilibrului florei
intestinale indigene, cu diminuarea rolului fiziologic antagonist al acestei flore faţă de
flora patogenă sau condiţionat patogenă).
Antagonismul bacterian normal poate fi tulburat şi în alte cazuri de tratamentul
neraţional cu chimioterapice. De pildă, tratamentul îndelungat cu penicilină duce la
dispariţia streptococilor alfa-hemolitici (viridans) din nazofaringe, cu înlocuirea lor de
flora Gram negativă.
Există şi forme de antagonism între bacterii şi virusuri, cum este, pe de o parte,
între bacterii şi bacteriofagi, iar pe de altă parte, între bacteriile dintr-o nişă ecologică şi
virusurile care o populează ocazional sau datorită vaccinării orale (exemplu: relaţiile care
se stabilesc în intestin, între enterobacterii: nepatogene, patogene şi enterovirusuri).
3. INTERRELAŢII MICROORGANISM - MACROORGANISM
Între organismul uman şi microorganisme se stabilesc relaţii foarte variate, dintre

care unele îi sunt dăunătoare iar altele benefice. Astfel, între macroorganism şi

microorganisme (bacterii, virusuri, fungi, protozoare), se stabilesc relaţii care pot fi de

comensalism, mutualism şi parazitism.

COMENSALISMUL este o asociaţie în care un microorganism foloseşte ca mediu de

viaţă un alt organism fără să-l prejudicieze. Omul este gazda unei flore comensale
foarte bogate - flora normală, prezentă pe piele, mucoase, tract digestiv, etc.
Microorganismele trăiesc şi se nutresc în strânsă relaţie cu gazda, dar nu pe seama
ţesuturilor acesteia, ceea ce nu antrenează urmări vizibile pentru macroorganism.
Exemplu: bacteriile florei indigene a pielii care se hrănesc cu detritusuri organice de pe
suprafaţa tegumentelor.

MUTUALISMUL (TOLERANŢĂ MUTUALĂ) este o relaţie care se stabileşte în

beneficiul ambilor parteneri ai asociaţiei. De exemplu, între bacilii lactici şi gazda
umană există un beneficiu reciproc: vaginul oferă condiţii de viaţă bacililor lactici, iar
aceştia, la rândul lor, acidifică mediul împiedicând dezvoltarea altor microorganisme. Alt
exemplu, este constituit din bacteriile florei indigene intestinale, care produc fenomenele
fiziologice de fermentaţie şi putrefacţie, ca şi sinteza unor vitamine.

PARAZITISMUL este o relaţie care se stabileşte în mod cert în beneficiul

microorganismului şi în detrimentul gazdei umane. Din această categorie fac parte
microorganismele patogene.
Însă acestor tipuri de relaţii nu le corespund grupe taxonomice fixe de
microorganisme, deoarece relaţiile care se stabilesc depind în egală măsură de gazda
umană. Astfel, în anumite condiţii, relaţia de comensalism sau mutualism poate să se
transforme într-o relaţie de parazitism cu efecte nefavorabile asupra gazdei.

“OPORTUNISMUL”. Unele microorganisme nu sunt capabile să producă boala la

gazdă, în condiţii normale dar, odată cu apariţia unor schimbări în circumstanţele
ecologice ale mediului intern sau extern (surmenaj, subnutriţie, tumori comsumptive,
infecţii intercurente etc.) determină infecţii grave şi chiar mortale. De exemplu, la nou-
născuţi, pot apare infecţii grave cu E. coli (tulpini condiţionat patogene). De asemenea,
flora indigenă fusospirilară a cavităţii bucale (Borrelia vincenti, Fusobacterium
fusiformis), în anumite condiţii de scădere a rezistenţei organismului, poate provoca
stomatite, angine sau faringite ulceromembranoase. Un alt exemplu din această categorie
îl oferă fungii (în special levurile, de tipul Candida albicans), care în cazuri de diabet
zaharat, tumori ale ţesutului limfoid, leucemii, provoacă infecţii grave, locale sau
viscerale, mortale.
 Relativ la tipul de relaţie “oportunism”, trebuie avută în vedere posibilitatea
exacerbării florei bacteriene indigene, în condiţiile tratamentului intensiv (şi uneori
abuziv) cu corticosteroizi, tratament care diminuă rezistenţa nespecifică şi specifică a
macroorganismului.
Cel mai pregnant exemplu de infecţie oportunistică îl oferă infecţia cu virus HIV.

4. FLORA NORMALĂ (INDIGENĂ) A ORGANISMULUI

În timpul vieţii intrauterine, organismul este steril, fiind ferit de microorganisme
atât prin membranele fetale, cât şi prin placentă, care este impermeabilă pentru
majoritatea lor, cu excepţia unor virusuri (virusul rubeolic, citomegalic, etc.), bacterii
(Treponema pallidum) şi paraziţi (Toxoplasma gondi). Prima întâlnire a organismului
uman cu microorganismele mediului înconjurător se produce în momentul naşterii, când
fătul vine în contact cu flora vaginală şi cutanată a mamei.
După naştere, organismul este supus unei contaminări continue. Flora normală
a organismului este prezentă imediat după naştere şi este constituită din specii comensale.
Ea colonizează mucoasele şi tegumentele copilului, fiind supusă anumitor variaţii până
când se stabileşte un raport numeric echilibrat între bcterii şi fungi. Se constituie, astfel, o
,,barieră biologică” care, prin concurenţă microbiană se opune la pătrunderea altor specii
patogene în organism. Fiecare mucoasă (cavitatea bucală, mucoasa rinofaringiană,
intestinală, vaginală) prezintă o floră variată, cu anumite particularităţi.
În general, organismul uman este populat de foarte multe specii bacteriene şi de
un număr mai mic de virusuri, fungi şi protozoare.
Flora normală a organismului depinde de o serie de factori, cum sunt: vârsta,
regimul alimentar, statusul hormonal, starea de sănătate, condiţiile de igienă colectivă şi
personală. Este foarte dificilă definirea exactă a speciilor care alcătuiesc flora normală,
deoarece o serie de specii patogene pot fi şi ele prezente temporar pe tegumente şi
mucoase, fără să producă îmbolnăviri. De exemplu, pneumococul şi meningococul sunt
bacterii patogene, fiind cauza unor infecţii foarte grave. Totuşi ele se găsesc la
aproximativ 10% din populaţia sănătoasă.
Zonele organismului populate în mod normal cu microorganisme sunt: pielea,
tractul respirator superior (vestibul nazal, faringe), tubul digestiv (cavitatea bucală şi
intestinul gros), tractul urinar (partea anterioară a uretrei) şi vaginul.
În afară de aceste zone, microorganisme mai pot apărea în număr mic şi în mod
pasager în restul tractului respirator, digestiv şi în uter, fiind rapid îndepărtate de
mijloacele de apărare ale organismului. Sângele, lichidul cefalorahidian, lichidele
sinoviale, din seroase, ţesuturile profunde sunt sterile. Prezenţa microbilor în aceste
zone are întotdeauna o semnificaţie patologică.

4.1. FLORA NORMALĂ A PIELII

Pe tegumente există o floră rezidentă, situată în straturile profunde, de obicei
constantă şi una superficială, flotantă.
Pielea este populată de multe specii bacteriene, densitatea acestora fiind mai mare
în zonele umede (axila, zona perineală, zonele interdigitale). Specia cel mai des întâlnită,
care reprezintă 90% din flora cutanată aerobă este Staphilococcus epidermidis. În
regiunile umede se poate întâlni şi S. aureus. În afară de speciile menţionate, pe piele se
mai găsesc bacili difteromorfi anaerobi, ca, de pildă, Propionibacterium acnes (în
foliculii piloşi, transpiraţie, glandele sebacee) care se înmulţesc mai ales la pubertate,
producând acneea juvenilă. La 20% din populaţie se izolează de pe piele Clostridium
perfringens. În mod pasager se evidenţiază în patul periunghial şi pe scalp specii de
Candida.
O menţiune specială trebuie să facem pentru prezenţa bacteriilor patogene şi
condiţionat patogene pe tegumentele şi mucoasele farmacistului. Ele pot constitui o
importanţă sursă de contaminare a medicamentelor pe care acesta le prepară sau le
mânuieşte.

4.2. FLORA NORMALĂ A CAVITĂŢII BUCALE ŞI A VESTIBULUI NAZAL

Speciile ce colonizează aceste zone sunt, în general, streptococi, stafilococi, bacili
difteromorfi, coci Gram negativi şi mai rar ciuperci. Unele din aceste specii sunt
condiţionat patogene (Str. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Candida).
Densitatea florei microbiene în cavitatea bucală este foarte mare, mai ales la
nivelul suprafeţei dinţilor şi şanţurilor gingivale, care sunt sediul unei bogate flore
anaerobe. Dacă igiena cavităţii bucale este deficitară, sub acţiunea unor specii ca
Streptococcus mutans, se produc cariile dentare. S-a constatat că numărul de Str. mutans
creşte în timpul producerii cariilor şi scade după tratarea acestora.
Flora faringiană este reprezentată de streptococi viridans şi ocazional de
streptococi beta-hemolitici (specie patogenă), la care se adaugă difteromorfi, neisserii
hemolitice, stafilococi, etc.
Tractul respirator inferior este steril, dar s-a izolat din plămânul persoanelor
sănătoase Pneumocistis carinii. Acest parazit nu are semnificaţie patologică la aceste
persoane, dar poate da pneumonii grave la persoanele imunocompromise, cum sunt
bolnavii de SIDA.

4.3. FLORA NORMALĂ A TUBULUI DIGESTIV

Stomacul conţine doar ocazional floră bacteriană acidotolerantă (unii lactobacili şi
streptococi) dată fiind aciditatea gastrică pronunţată. Frecvent se izolează de pe mucoasa
gastrică Helicobacter pylori, care ar putea constitui cauza unor gastrite şi a ulcerului
duodenal. La persoanele la care se administrează o medicaţie ce schimbă pH-ul gastric,
flora normală suferă modificări.
Partea incipientă a intestinului subţire conţine un număr redus de microbi, care
creşte vertiginos spre ileon unde se vor găsi streptococi, lactobacili, enterobacterii,
specii de Bacteroides, etc.
Intestinul gros este cea mai populată zonă cu microbi a organismului. Aici, peste
90% din floră este anaerobă, reprezentată mai ales de bacili aparţinând genului
Bacteroides, însoţită de enterobacterii care sunt facultativ anaerobe, la care se adaugă
protozoare nepatogene, ca, de pildă Entamoeba coli. Tratamentul cu antibiotice alterează
rapid echilibrul care se stabileşte între aceste specii cu înmulţirea consecutivă a unor
specii mai rezistente la antibiotice cum sunt Clostridium difficile, specii din genul
Enterococcus şi Pseudomonas care pot produce diaree cu posibilităţi de evoluţie spre
colită pseudomembranoasă.

4.4. FLORA NORMALĂ A TRACTULUI UROGENITAL

Uretra anterioară este populată la ambele sexe cu floră asemănătoare celei de pe

piele: S. epidermidis, Enterococcus faecalis, difteromorfi etc.

Flora vaginală variază în funcţie de vârstă. Astfel, până la pubertate flora vaginală

conţine specii prezente pe piele, iar după pubertate până la menopauză, vaginul este

populat cu o varietate foarte mare de bacterii, predominante fiind speciile de

Lactobacillus (bacili Doderlein).

Bacilii Doderlein, indicatori ai ciclurilor endocrine normale, sunt bacili Gram

pozitivi care se dezvoltă numai la pH acid (pH-ul normal al vaginului). La fetiţele nou-

născute, bacilul apare repede în vagin, datorită fermentării glicogenului din mucoasa

vaginală (rămas din circulaţia maternă), cu scăderea concomitentă a pH-ului local. După

consumarea rezervei de glicogen de provenienţă maternă, pH-ul vaginal creşte şi bacilul

Doderlein, nemaigăsind condiţii prielnice, dispare, fiind înlocuit de o floră mixtă

(streptococi de grup D - enterococi, difteromorfi, stafilococi coagulazo-negativi,

Neisserii banale). La pubertate, odată cu apariţia ciclului menstrual, glicogenul reapare

în celulele epiteliului mucoasei vaginale. Se crează din nou condiţii de fermentare a

glicogenului, cu scăderea pH-ului, ceea ce duce la repopularea vaginului cu bacilul

Doderlein, reprezentând, deci, o reflectare fidelă a pH-ului normal vaginal al femei, în tot

cursul vieţii sexuale normale. În perioada climaxului, pH-ul vaginal creşte din nou, ceea

ce provoacă dispariţia bacilului Doderlein.

5. ROLUL FLOREI NORMALE A ORGANISMULUI
Flora normală joacă un rol important în menţinerea stării de sănătate, cât şi în
producerea unor infecţii. Astfel:
 este un factor important în apărarea antiinfecţioasă naturală, stimulând atât
fagocitoza, cât şi unii factori umorali (complement, betalizine);
 este, de asemenea, un important factor în apărarea specifică (imună). Flora indigenă
acţionează atât la nivelul apărării sistemice (induce sinteza de anticorpi naturali, la un
nivel coborât, dar eficient, datorită stimulării antigenice continue), cât şi la nivelul
apărării locale (anticorpi IgA secretori la suprafaţa mucoaselor, cu rol de “ecran”
împotriva infecţiilor cu germeni patogeni);
 flora normală deprimă înmulţirea florei patogene prin mecanisme competitive pentru
un anumit substrat nutritiv, pentru aceiaşi receptori celulari şi producerea de
bacteriocine.
 contribuie la nutriţia şi metabolismul organismului;
- sintetizează (specii de Bacteroides şi E. coli) şi secretă în intestin unele vitamine,
cum sunt vitamina K şi vitamine din grupul B;
- intervine în circuitul hepato-entero-hepatic al unor substanţe cum sunt
hormonii steroizi şi sărurile biliare. Aceste substanţe sunt excretate în intestin
prin bilă sub forma conjugată de glucuronide sau sulfaţi. Ele nu pot fi reabsorbite
decât după deconjugare care se petrece sub acţiunea glucuronidazelor şi
sulfatazelor secretate de flora bacteriană.
 constituie sursa majorităţii infecţiilor oportuniste.
Medicul practician întâlneşte mai frecvent infecţii produse de microorganisme ce
fac parte din “flora normală” decât infecţii produse de flora patogenă provenită din
mediul extern al organismului. Astfel, speciile de Bacteroides, de pildă, rezidente ale
intestinului gros, produc abcese dacă pătrund în zone sterile ale organismului.
Staphilococcus epidermidis, cea mai importantă specie a florei normale a pielii, are
proprietatea de a se ataşa în mod nespecific de catetere de plastic, producând septicemii.
De asemenea, E. coli, prezent în flora intestinală este cel mai frecvent agent etiologic al
infecţiilor urinare. Aceste infecţii cu germeni comensali şi condiţionat patogeni sunt
favorizate, după cum am văzut mai sus, de administrarea necontrolată a antibioticelor.

RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

RECOLTAREA PROBELOR PENTRU EXAMENUL MICROBIOLOGIC

Diagnosticul bolilor infecţioase, controlul sterilităţii diverselor produse biologice
şi farmaceutice, controlul microbiologic al aerului, apei, alimentelor, obiective de bază
ale laboratoarelor de microbiologie, necesită recoltarea de produse adecvate.
Materialele respective sunt eşantioane în care se bănuieşte prezenţa unor
microorganisme. Ele pot fi produse normale, cu unele modificări în caz de boală
(sânge, fecale, lichid cefalorahidian-LCR), sau produse care apar numai în urma
îmbolnăvirii (puroi, spută, lichid peritoneal, lichid articular).
 Probele provin de la bolnav, convalescenţi, purtători (personal medical, angajaţi
din sectorul alimentar, din farmacii şi industria farmaceutică), cadavre. Se pot analiza, de
asemenea, medicamente, probe de aer, apă, sol, alimente şi alte materiale.

1. REGULI GENERALE DE RECOLTARE

♦ Pentru fiecare boală infecţioasă se recoltează produsele patologice cele mai
reprezentative (cunoscând poarta de intrare, căile de răspândire şi eliminare, etc.). Se
utilizează tehnica corectă de prelevare, ţinându-se cont de momentul cel mai potrivit
(peroiada bolii, de preferinţă înainte de tratamentul cu antibiotice sau/şi antiseptice) şi
se recoltează cantitatea necesară, pentru fiecare produs în parte.
♦ Operaţiunea de recoltare trebuie efectuată steril (instrumentar, recipiente curate şi
sterilizate fără urme de antiseptice), aplicând cu rigurozitate metodele de asepsie şi
antisepsie. Trebuie asigurată menţinerea sterilităţii din momentul recoltării până la
identificarea agentului patogen.
♦ Produsul se etichetează corespunzător şi este însoţit de un bilet care cuprinde
următoarele date: numele şi prenumele, vârsta, domiciliul, data şi locul recoltării, natura
produsului, examinările cerute, diagnosticul prezumtiv, specificarea dacă a fost tratat cu
chimioterapice, numele persoanei care a recoltat.
♦ Materialele trebuie ferite de contaminare sau denaturare în timpul transportului şi
manipulării, printr-o ambalare corespunzătoare, în sticle bine închise, cu dop de
cauciuc sau plută, protejate de cutii de lemn sau metal. Dacă se expediază la distanţă se
menţionează “material infecţios”, uneori prin curier special.
♦ Transportul trebuie realizat cât mai rapid, pentru că orice întârziere scade
posibilitatea evidenţierii microorganismelor iniţial prezente şi permite înmulţirea celor
contaminante. Trebuie respectate şi condiţiile de temperatură: uneori este indicată
temperatura corpului uman (meningococ, gonococ), alteori temperaturi scăzute, realizate
în recipiente de gheaţă (mai ales virusuri). Pentru transportul la distanţă se utilizează
medii lichide conservante sau medii speciale de transport.
♦ Însămânţarea se face pe medii adecvate, cât mai repede după recoltare, dacă este
posibil chiar la patul bolnavului.

2. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE: BOLNAVI SAU

PURTĂTORI
2.1. Recoltarea produselor normal contaminate
a. Secreţia faringiană
Se recoltează cu tamponul de exudat faringian steril.
Indicaţii: pentru diagnosticul faringitelor şi anginelor streptococice, pentru
confirmarea diagnosticului de difterie, pentru diagnosticul bacteriologic al altor angine
bacteriene, fungice, virale, pentru depistarea stării de purtător de Steptococcus pyogenes
şi de Corynebacterium diphteriae.
Materiale necesare: tampoane de uz general (figura 1), apăsător de limbă, sursă
de lumină, mască (pentru protecţia celui ce recoltează).
Tehnica de recoltare: Se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre lumină, gâtul în
uşoară extensie şi ceafa sprijinită de perete. În condiţii de iluminare adecvată, după
deschiderea largă a gurii, se deprimă baza limbii cu apăsătorul steril şi, în timp ce
pacientul pronunţă litera A, se şterg cu tamponul ferm, dar nu brutal, amigdalele şi
perele posterior al faringelui, vizând în special orice zonă inflamată, ulcerată, cu
depozite purulente sau cu false membrane. Când există false mambrane, acestea se
detaşează de la periferie, iar mucoasa subjacentă trebuie tamponată.
Atât la introducerea, cât şi la scoaterea tamponului din faringe nu trebuie să se
atingă baza limbii sau palatul moale.
După recoltare, taponul se rintroduce în tubul protector etichetat cu
numele şi prenumele pacientului, denumirea produsului recoltat, secţia de unde provine,
data şi ora recoltării.
Recoltarea se face dimineaţa, fiind interzise gargarismele cu antiseptice, spălarea
dinţilor sau alimentaţia sau la 3-4 ore interval de la toaleta gurii ori ingestia de alimente.
Prelucrarea probei trebuie să se facă în interval de maximum 3 ore de la
recoltare. Dacă acest interval nu poate fi respectat, se impune fie imersia şi transportul
tamponului în bulion de conservare-îmbogăţire, fie transportul probei uscate pe
dreptunghi de hârtie de filtru.

Figura 1: Tampon de uz general

b. Secreţia nazală sau nazo-faringiană

Se prelevă cu tamponul, cel mai uşor per-nazal. Analiza de laborator se numeşte:
exudat nazal, respectiv, exudat nazo-faringian.
 Exudatul nazo-faringian
Indicaţii. Efectuarea exudatului nazo-faringian se recomandă pentru:
diagnosticul tusei convulsive, diagnosticul infecţiilor cu Mycoplasma pneumoniae şi
Chlamydia, diagnosticul virozelor respiratorii, depistarea stării de purtător pentru
Streptococcus pyogenes, bacili difterici, meningococi, Bordetella pertussis.
Materiale necesare: tampoane confecţionate pe aplicator de sârmă crom-nichel de
20 cm lungime şi 1 mm diametru, cu una din extremităţi îndoită, sursă de lumină, mască
(pentru protecţia celui ce recoltează).
Tehnica de recoltare: Se aşează pacientul pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină
şi ceafa sprijinită de perete pentru imobilizarea capului. Se introduce blând tamponul
printr-o nară, în lungul planşeului nazal, până atinge peretele poterior al nazo-faringelui.
Se lasă tamponul pe loc câteva secunde , apoi se roteşte pentru a se încărca cu exudat şi
se retrage. Cantitatea de prelevat creşte dacă tamponul se retrage puţin şi se reinseră în
aceeaşi poziţie (prima tamponare stimulează secreţia de mucus nazo-faringian).
La sugari este indicat aspiratul nazo-faringian pe cale per-nazală. Acesta se
recoltează cu o sondă Nélaton introdusă printr-o nară şi adaptată la o seringă etanşă de 20
ml.
 Exudatul nazal
Indicaţii: se recomandă pentru diagnosticul unor viroze respiratorii sau pentru
depistarea stării de purtător de Staphylococcus aureus sau Streptococcus pyogenes.
Recoltarea se face cu tamponul nazal.
Tehnică: se şterge, pe rând, vestibulul foselor nazale cu tamponul de uz general,
umectat cu soluţie salină izotonă.

c. Secreţia otică
Se recomandă recoltarea acestui produs patologic în cazul unor otite medii sau
extene.
În cazul otitelor medii se recomandă examinarea acestui produs pentru diagnosticarea,
ca agent etiologic al acestor boli, a: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Haemophilus influenzae, mai rar enterobacteriacee, Moraxella catarrhalis,
Staphylococcus aureus şi/sau bacterii anaerobe.
Prelevatul de elecţie este exudatul aspirat prin timpanocenteză sau se poate
recurge la însănânşarea extenporanee cu lanţeta de puncţie.
În caz de perforare spontană a timpanului exudatul se prelevă pe un tampon fin
steril, ghidat prin speculum auricularum către fistulă.
În cazul otitelor externe, pacienţilor cu scurgere otică sero-sanguinolentă sau
purulentă din conductul auditiv extern (nu din urechea medie) li se recontează exudat din
conductul auditiv extern, pe tampon cu mediu de transport.

d. Sputa
Recoltarea corectă este dificilă, pentru că trebuie avut grijă să se obţină un produs
strict reprezentativ (microorganismele din spută, nu din salivă sau din căile respiratorii
superioare). Sputa se recoltează de preferinţă dimineaţa, când bolnavul îşi face toaleta
bronşiilor, în plăci Petri, borcane sau pahare sterile (preferabil din plastic) de cca 100 ml,
cu gura largă şi capac ermetic, după o prealabilă clătire a gurii cu soluţie salină
fiziologică sterilă sau gargară cu apă, periajul simplu al dinţilor înaintea prlevării.
Folosirea antisepticelor este interzisă.
- În infecţii acute este suficientă o cantitate de 1-2 ml de spută mucopurulentă.
- La tuşitorii cronici, pentru diagnosticul tuberculozei sau al infecţiilor fungice
bronho-pulmonare, cantitatea de spută trebuie să fie mai mare: toată sputa de la
expectoraţia matinală sau cea expectorată în interval de 1-2 ore. Nu se examinează
niciodată probele sumate din 24 ore pentru că multiplicarea microorganismelorde
contaminare falsifică rezultatele.
- La pacienţi cu tuse slab productivă, stimularea expectoraţiei se face prin inhalare
de aerosoli calzi cu soluţie salină10% şi glicerinată 15%.
- La copii mici, care înghit sputa, se efectuează recoltarea prin sondaj gastric.
 Sputa se recoltează în afecţiuni pulmonare (pneumonii, bronhopneumonii,
tuberculoză, etc.).

e. Lichidul gastric
Lichidul gastric normal, recoltat dimineaţa pe nemâncate, este puternic acid (pH
0,9-1) şi fără germeni viabili, dar deseori cu germeni din nazofaringe şi salivă. Pot
supravieţui doar unii bacili acidorezistenţi, fungi şi bacterii sporulate.
La unii bolnavi cu anaciditate, cu stază gastrică sau neoplasm gastric, cavitatea
gastrică poate fi populată de un număr mare şi variat de germeni ingeraţi, proveniţi din
alimente sau înghiţiţi o dată cu saliva.
În gastritele microbiene (gastrite flegmonoasă) se evidenţiază bacterii, fungi,
celule epiteliale şi leucocite.
La copii şi la femei cu suspiciunea de tuberculoză pulmonară care nu
expectorează, ci înghit sputa, se recomandă examenul sucului gastric pentru evidenţierea
bacilului Koch.
Tehnică de recoltare. Bolnavul, nemâncat de 12 ore, face o toaletă a cavităţii
bucale cu o soluţie sterilă, apoi se introduce în stomac o sondă sterilă - sonda Einhorn. Se
aspiră lichidul de stază, dacă există, sau se spală cavitatea gastrică cu 100-200 ml de apă
distilată sterilă, care se aspiră imediat. Acest lichid este supus determinării pH şi prelucrat
specific pentru evidenţierea agentului etiologic (efectuare de frotiuri din sedimentul
obţinut prin centrifugarea lichidului şi însămânţare pe mediile adecvate, inclusiv pentru
bacilul Koch-BK).

f. Lichidul de vărsătură
Se prelevează obligatoriu în cazul gastroenteritelor acute, toxiinfecţiilor
alimentare, în borcane sau plăci Petri sterile.

g. Materiile fecale
În cazul coproculturii, se urmăreşte evidenţierea agentului patogen din fecale.
Prelevarea se face direct din rect şi din scaunul emis spontan.

 Direct din rect cu sonda Nelaton sau cu tamponul rectal, în dizenteria cronică (în
care leziunea este localizată în partea terminală a sigmoidului) şi la purtătorii de
Shigella şi Salmonella, cu excepţia celor de Salmonella typhi.
Nu se recomandă acest mod de recoltare în infecţiile acute în care agresiunea
bacteriană este ileo-jejunală sau colică inaltă.
Prelevarea corectă prin acestă modalitate de recoltare se realizează astfel:
tamponul sau sonda Nelaton se umectează în prealabil cu soluţie salină izotonă; se
penetrează prin sfincterul anal prin rotare lentă şi se introduce intrarectal 15 cm. În cazul
sondei Nelaton se va ataşa la aceasta o seringă de 10 ml cu care se fac1-2 aspiraţii.
După recoltare, atât sondele cât şi tampoanele se introduc în tuburi sterile cu dop
sau eprubete cu mediu de conservare, preferabil lichid, care să permită o bună eluare a
prelevatului.
 Scaunul emis spontan este o a doua modalitate de recoltare a materiilor fecale. Se
recomandă în toate formele de diaree acută când emisia de materii fecale este
frecventă.
Prelevarea din masa fecaloidă se face cu tamponul sau cu „linguriţa“
coprorecoltorului vizând porţiunile reprezentative ale scaunului - mucus, puroi, sânge,
porţiuni lichide (figura 2). Volumul recoltei: 3-5 cm3.
Pentru depistarea purtătorilor se administrează în prealabil purgativ salin (sulfat
de sodiu şi magneziu în părţi egale) .
Probele trebuie însămânţate imediat, în unele cazuri, cum este dizenteria, chiar la
patul bolnavului sau în cel mult 2 ore de la recoltare. Dacă nu este posibil acest lucru, se
impune folosirea unui mediu special de conservare - mediul Cary-Blair sau mediul
Stuart care asigură o bună conservare la temperatura mediului ambiant până la 7 zile a
enterobacteriaceelor, dar şi a germenilor din genul Vibrio.
Coprocultura se recomandă în infecţiile intestinale: salmoneloze, dizenterie,
holeră, enteroviroze, parazitoze etc.

Figura 2 : Coprocultor

h. Secreţiile uretrale
Se recomandă a se recolta în cazul pacienţilor cu uretrită, care acuză disurie şi
scurgeri uretrale. Scurgerea uretrală pote fi abundentă sau discretă. Macroscopic, ea
poate fi : albă, gălbuie, verzuie, brună sau muco-purulentă sau clară, filantă.
Etilogic, uretritele pot fi :
- gonococice (peste 70%);
- negonococice (detrminate de Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum,
Mycoplasma genitalim, Trichomonas vaginalis, virusul Herpes simplex);
- post-gonococice (determinate de Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum,
Cryptococcus neoformans).
 Recoltarea se face cu tamponul steril.
Momentul recomandat pentru recoltare: la cel puţin 2 ore după micţiune, dar în
cazul suspiciunii infecţiei cu Trichomonas vaginalis, prelevarea trebuie făcută înaintea
micţiunii matinale, iar tamponul trebuie imersionat în cca 1 ml de soluţie salină izotonă
încălzită la 370C.
Dacă secreţia este abundentă, se şterge mai întâi meatul uretral cu o compresă
sterilă, apoi se recoltează secreţia uretrală cu tamponul, după expresia postero-anterioară
a uretrei şi comprimarea glandului.
Dacă secreţia este redusă cantitativ, se folosesc procedee de activare a acesteia :
instilaţii cu nitrat de argint intrauretrale, masaj de prostată sau ingestie de alcool seara,
recoltarea făcându-se a doua zi dimineaţa. În acest caz, recoltarea se va face cu tampoane
speciale, alcătuite din alginat de calciu cu un capăt acoperit de vată hidrofilă, sau cu o tijă
de lemn foarte fină (ca o scobitoare) cu vată hidrofilă la un capăt. Acest tampon se
introduce 1 cm în uretră, se roteşte şi se retrage tamponul.
Alternativ, se poate folosi o ansă din platină, perfect închisă circular, sterilizată şi
complet răcită, introdusă în uretră 1-2 cm, după care produsul recoltat se însămânţează
direct pe mediile de cultură destinate izolării germenilor.

i. Secreţia vaginală
Se recomandă recoltarea acesteia în caz de leucoree (scurgere patologică la
nivelul organelor genitale feminine sau când nu există simptomatologie, dar există un
anume context epidemiologic (infecţii manifeste clinic la partenerul sexual sau la nou-
născut).
Din punct de vedere etiologic, sunt descrise :
- vulvo-vaginite specifice, determinate de Trichomonas vaginalis, gonococ sau fungi-
Candida albicans;
- vulvo-vaginite nespecifice sau vaginoze, determinate de: stafilococul auriu,
Steptococcus pyogenes, Gardnerella vaginalis, diverse specii de anaerobi.
Se recoltează secreţia acumulată în fundul de sac vaginal posterior, secreţie
detaşată cu ajutorul unei valve şi recoltată pe trei tampoane.
۰ Tamponul 1 este descărcat în soluţie izotonă sterilă, încălzită la 370C, din acest
omogenizat efectuîndu-se un preparat umed între lamă şi lamelă care se examinează la
microscop.
۰ Tamponul 2 este folosit la efectuarea unui frotiu colorat Gram, care se examinează
la microscop.
۰ Tamponul 3 serveşte pentru diagnosticul bacteriologic (pentru germenii specifici-
gonococ, şi nespecifici-mai sus menţionaţi) şi fungic, prin însămânţarea lui pe medii
pentru bacterii şi mediu pentru fungi (mediu Sabouraud cu cloramfenicol).

j. Secreţia conjunctivală
Se recomandă a se recolta în caz de: conjunctivite şi keratite, infecţii ale
pleoapelor, infecţii ale aparatului lacrimal, endolftalmite (infecţia tunicilor şi umorilor
globului ocular), panoftalmite (infecţia se extinde şi la scleră şi capsula lui Tenon),
celulite orbitare, abcese, flegmoane orbitare.
Produsul patologic poate fi:
- exudatul acumulat în sacul conjunctival şi pe suprafaţa ambelor conjunctive
palpebrale, prelevat pe tampone umectate cu bulion nutritiv. Exudatul poate fi: seros,
sero-purulent, purulent, muco-purulent, fibrinos, pseudomembranos. Exudatul seros
sau sero-purulent poate fi recoltat prin capilaritate cu micropipeta, din sacul
conjunctival.
- raclatul realizat cu spatula de platină sterilă, separat de pe conjunctiva tarsală
superioară şi inferioară.
Prelevarea probelor trebuie să se facă :
۰ înainte de toaleta feţei, care îndepărtează din secreţii şi exudatul conjunctival;
۰ înainte de machiaj, care face dificil examenul citobacteriologic;
۰ înainte de aplicarea unei terapii antimicrobiene, topică sau sistemică, pentru că
reduce şansa izolării agentului infecţios; înainte de aplicarea oricărei corticoterapii,
care modifică citologia.

k. Puroiul
Este un exudat fibrinos, uneori sanghuinolent, care conţine leucocite
(predominant polimorfonucleare neutrofile-în inflamaţiile acute, sau mononucleare-în
inflamaţiile cronice specifice), resturi celulare şi microorganismul sau microorganismele
determinante ale supuraţiei.
Supuraţia înseamnă formarea sau scurgerea de puroi. Supuraţiile pot afecta
orice ţesut şi organ, cu acumulare de puroi în:
- interstiţiile cutanate: pustule, furuncule, hidrosadenită, abcese, gome;
- ţesuturile musculo-scheletice: abcese, flegmoane, osteomielită;
- ganglionii limfatici;
- viscere: abcese;
- cavităţi preformate: sinusuri paranazale, ureche medie, seroase- meninge, pleură,
pericard, peritoneu, sinovialele articulare;
- pe suprafeţe tisulare denudate: plăgi, arsuri.
Colecţiile purulente se pot deschide spontan sau cu mai multe fistule.
Prelevarea probelor din supuraţii este frecvent unică, de aceea trebuie o existe
o legătură ireproşabilă între clinician şi medicul de laborator, puroiul reprezentând un
produs patologic care trebuie recoltat corect, trebuie trimis în timp util la laborator (în
maxim 1-2 ore de la recoltare), iar laboratorul trebuie să realizeze o prelucrare imediată şi
adecvată a probei.
Tampoanele sunt contraindicate pentru prelevarea puroiului ori de câte ori putem
obţine probe prin puncţie-aspiraţie, chiuretaj sau biopsie. Izolarea bacteriilor anaerobe
de pe tampoanele uzuale este imposibilă. Cu precauţii speciale (utilizarea unui mediu de
transport) tampoanele pot fi utilizate numai pentru prelevarea puroiului din colecţii
foarte mici.
Când este necesară (în cazul colecţiilor deschise) se realizează irigarea leziunilor
cu soluţii saline non-inhibitorii, de tipul soluţiei Ringer lactozată.
Leziunile cronice sunt sărace în bacterii, de aceea se impune prelevarea unei
cantităţi mai mari de produs decât în leziunile acute.
Unele bacterii anaerobe sunt omorâte după câteva secunde de contact cu oxigenul
atmosferic; altele supravieţiuesc 30-90 minute. De aceea se recomandă recoltarea
puroiului în 2 recipiente sterile: unul pentru aerobi, altul pentru anaerobi. În lipsa
containerelor speciale pentru anaerobi puroiul se recoltează cu seringa prin aspiraţie, se
elimină bulele de aer din seringă şi se obturează cu un dop de cauciuc, procedeu numit
„seringă anaerobă“ şi care asigură supravieţiurea anaerobilor cel puţin 30 de minute.
Procedee de recoltare:
- din colecţii închise (flegmoane, abcese superficiale, colecţii din cavităţile seroase) se
recoltează prin puncţie cu o seringă sterilă şi ac gros cu bizoul scurt după aseptizarea
loului de puncţie cu alcool sau tinctură de iod. Puroiul se introduce într-un recipient
steril;
- din colecţii deschise se recoltează după curăţirea plăgii cu soluţie Ringer lactozată
sau ser fiziologic steril, îndepărtându-se prima cantitate de puroi eliminată. Recoltarea
se face cu un tampon sau ansă sau compresă sterilă sau cu pipeta Pasteur bine efilată şi
se introduce în recipiente sterile (pentru aerobi şi pentru anaerobi) (figura 3).

Figura 3 : Tipuri de pipete

B. Recoltarea produselor normal sterile

a. Sângele
Se recoltează pentru:
- examinări bacteriologice: hemocultură;
- examinări serologice: determinarea anticorpilor;
- examinări parazitologice;
- examinări hematologice;
- examinări biochimice.

a.1. Hemocultura
Înseamnă evidenţierea bacteriilor din sânge.
Indicaţii:
۰ sindroame febrile fără cauză precizată;
۰ infecţii bacteriene plurietiologice (meningite, peritonite, pielonefrite, infecţii
puerperale, infecţii ale plăgilor şi arsurilor, alveolite pulmonare);
۰ sindrom septicemic;
۰ endocardită subacută;
۰ nou-născuţi, sugari, gazde imunocompromise la orice vârstă;
۰ infecţii sistemice cu patogeni specific (febre enterice, bruceloză, leptospiroză);
۰ stări febrile postintervenţie chirurgicală.

Materiale necesare recoltării

- seringă de unică utilizare cu volum adecvat (20 ml sau mai mică pentru copii) sau un
set de transfer (tub cu ace la ambele capete pentru a permite însămânţarea direct în
mediul de cultură, ceea ce minimalizează riscul contaminării);
- garou-pentru stază,
- alcool sau tinctură de iod: pentru dezinfecţia tegmentelor;
- mănuşi: pentru protecţia mâinilor celui care recoltează;
- flacoane pentru hemocultură cu mediu adecvat pentru dezvoltarea germenilor,
preîncălzite la 370C (figura 4 şi 5).

Figura 4: Recoltarea sângelui pentru hemocultură

Sunt indicate flacoane speciale cu membrană de cauciuc sau plastic fixate cu

capac înşurubat, care permit însămânţarea fără îndepărtarea capacului. Volumul de mediu
per flacon este de 50-100 ml pentru adulţi şi de 20-50 ml pentru prelevarea de la copii.
În lipsa unor flacoane speciale se pot „confecţiona“ astfel de flacoane, folosind
flacoane pentru plasmă de 150 ml sterile în care se toarnă mediul adecvat, iar pentru
anaerobi tuburi de 25/250 mm cu mediu repartizat în coloană de 15 cm înălţime.
Există flacoane pentru hemocultură care conţin un singur mediu pe care se
dezvoltă atât germenii aerobi, cât şi anaerobi (mediu I al Institutului Cantacuzino - I
I.C). Există şi flacoane separate pentru germeni aerobi şi germeni anaerobi, conţinând
mediile adecvate, şi care sunt inoculate cu sânge imediat după recoltare.
Pentru depistarea unor microorganisme cu creştere lentă (brucele, leptospire,
fungi) se recomandă utilizarea unor medii difazice: pantă de agar-sânge şocolat cu
bulion tripticază soia pentru brucele sau pantă de agar nutritiv şi bulion infuzie cord-
creier pentru fungi.
 Momentul recoltării
Hemocultura se recoltează înaintea tratamentului antimicrobian. În caz contrar
se indică pe buletinul care însoţeşte proba antibioticele care s-au administrat, pentru a se
utiliza inhibitori specifici. Adăugarea inhibitorilor se face prin înglobarea de la început în
mediul de cultură, sau în momentul însămânţării (exemplu: acid paraaminobenzoic
pentru sulfamide, penicilinază pentru penicilină, cisteină pentru streptomicină). Se
recomandă creşterea raportului de inocul folosit/mediu nutritiv de la 1/10 la 1/30, 1/50
când sunt întrebuinţate chimioterapice pentru care nu există inhibitori specifici.
În bolile care evoluează sistematic cu fază bacteriemică (alveolite pulmonare,
febre enterice, leptospiroză, bruceloză), hemocultura trebuie recoltată cât mai aproape
de debutul bolii.
În bolile cu bacteriemii continue (endocardite subacute) prelevarea se poate
realiza în orice moment al zilei.
În bolile cu bacteriemii intermitente (supuraţii, pielonefrite) fiecare descărcare
bacteriemică se însoţeşte de frisoane şi este urmată de un croşet febril. Ca urmare,
hemocultura trebuie recoltată în momentul apariţiei croşetului febril sau/şi în momentul
când bolnavul semnalează apariţia frisoanelor.
Numărul recoltărilor
Majoritatea bacteriemiilor sunt intermitente. În aceste cazuri se recomandă 3
prelevări/24 ore. În urgenţe, ritmul prelevărilor poate fi la intervale de 30-60 de minute.
În bolile cu descărcare bacteriemică continuă (endocardite subanute) sunt
suficiente 2 prelevări/24 ore.

VOLUMUL RECOLTĂRILOR
Pentru adult: 20-30 ml/ recoltare; la nou-născuţi, sugari, copii mici: 1-3
ml/prelevare. Proporţia sânge/mediu trebuie să fie de 1/10.
Zone de prelevare
۰ electiv: venele de la plica cotului sau venele jugulare sau temporală la nou-născuţi şi
sugari;
۰ alternativ: venele antebraţului sau venele dorsale ale mâinii;
۰ puncţie arterială la nivelul pliului inghinal (în endocarditele cu focar septic pe
valvulele mitrale sau aortice).
Procedura de recoltare
În cazul în care se abordează venele de la plica cotului, se aplică garoul proximal
de zona puncţiei. Se dezinfectează tegumentul suprajacent venei cu alcool iodat 2%.
După 1 minut se badijonează zona cu eter pentru a îndepărta iodul şi a lăsa tegumentul
cât mai uscat. Se antiseptizează membrana de cauciuc a flacoanelor cu mediu de cultură.
Se puncţionează vena, recoltându-se 10-30 ml sânge care se repartizează imediat în
1-2 flacoane cu mediu de cultură (pentru incubare aerobă şi anaerobă). Flaconul se agită
pentru omogenizarea sângelui în masa mediului. Se transportă la laborator, unde unul din
flacoane trebuie aerisit prin perforarea membranei cu un ac protejat cu filtru de vată,
pentru germenii aerobi, celălat flacon fiind folosit pentru urmărirea dezvoltării
anaerobilor.
 Flacoanele se incubează la 370C şi se examinează zilnic macroscopic,
radiometric sau microscopic timp de 7 zile. Dacă la aceste examinări se semnalează
prezenţa germenilor se fac subcultivări pe medii speciale şi se trece la identificarea
acestora şi efectuarea antibiogramei. O incubare mai prelungită se impune la pacienţi
cu endocardită subacută, la cei la care recoltarea hemoculturii s-a efectuat sub
antibioticoterapie (până la 14 zile) sau în cazul unor microorganisme particulare (BK,
brucele, leprospire).

Figura 5: Recoltarea sângelui pentru hemocultură

a.2. Determinări serologice

În acest caz se recoltează 10 ml de sânge din vena plicii cotului, se lasă să se
coaguleze, iar serul separat prin centrifugare este supus examinărilor.

b. Lichidul cefalorahidian (LCR)

LCR normal este un fluid steril, incolor şi clar. Conţine :
۰ între 3-10 celule nucleate/mm3, de regulă limfocite;
۰ 15-40 mg/dl proteine (reacţia Pandy negativă);
۰ 50-70 mg/dl glucoză;
۰ 6,8-7,3 g/l cloruri.
Barierele hematomeningee şi hematoencefalică reduc accesul agenţilor infecţioşi,
al metaboliţilor toxici, dar şi al chimioterapicelor către LCR şi ţesutul nervos.
Infectarea SNC se poate face:
- pe cale hematogenă, în cursul unor bacteriemii sau viremii cu variate porţi de intrare;
- pe tecile limfatice olfactive din nazofaringe;
- prin contiguitate, din focare infecţioase juxtameningiene (otomastoidită, sinusite);
- din exterior: conduct auditiv extern, tegumente, nazofaringe, puncţii rahidiene,
intervenţii chirurgicale pe nevrax;
- de la nivelul tegumentelor infectate cu Staphylococcus epidermidis, ce reprezintă
sursă de infecţie pentru şunturile efectuate pentru controlul hidrocefaliei;
- rar, pe cale intraneurală, prin rădăcinile nervului trigemen ori ale nervilor sacraţi.

Indicaţii pentru recoltarea LCR

- meningite : bacteriene, virale, parazitare, fungice ;
- meningoencefalite ;
- sindroame meningeale apărute în cadrul altor afecţiuni, precum cele ce constituie
punct de plecare pentru infectarea SNC ;
- supuraţii cerebrale(abcese cerebrale, subdurale, epidurale).

Prelevarea probelor
Prelevarea LCR este de competenţa specialiştilor infecţionişti, neurologi,
neurochirurgi. Se face prin rahicenteză, obişnuit lombară L4-L5, sau ventriculară
(suboccipitală) în condiţii de strictă asepsie.
 Puncţia lombară
Bolnavul este aşezat în decubit lateral, în poziţia de „cocoş de puşcă“ (cu
genunchii apropiaţi de bărbie). Pielea bolnavului se dezinfectează cu alcool şi apoi cu
tinctură de iod pe o suprafaţă pătrată cu latura de 20 cm. Medicul se spală pe mâini, şi
apoi îşi pune mănuşi sterile. După aproximativ 2 minute, timp necesar acţiunii de
dezinfecţie, se face puncţia prin pătrunderea în spaţiul intervertebral L4-L5 fie cu seringa
cu acul lung (de 8-10 cm pentru adult şi 6-7 cm pentru copil), fie numai cu acul lung
steril. Se preferă ace speciale pentru puncţii rahidiene sau, în lipsa lor, ace sterile de oţel
inoxidabil, cu bizoul scurt şi bine ascuţit, prevăzute cu un mandren, care la un capăt să nu
depăşească vârful acului, iar la celălalt capăt să fie îndoit în dreptul pavilionului. Se
introduce mandrenul în ac în mod steril, se apucă acul de pavilion, prin intermediul unei
comprese sterile şi se pătrunde în spaţiul L4-L5. Pătrunderea în spaţiul subarahnoidian
este însoţită de senzaţia de a fi ajuns intr-un spaţiu gol şi de scurgerea LCR.
În meningite LCR este de obicei hipertensiv şi poate ţâşni prin ac. Dacă primele
picături sunt sanguinolente, acestea nu se vor recolta, ci se aşteaptă puţin, pentru a se
observa dacă şi restul lichidului păstrează acelaşi aspect. Se colectează 5-10 ml de LCR
în 2-3 tuburi, dintre care unul este obligatoriu steril pentru examen microbiologic.
 Puncţia suboccipitală
După raderea părului şi dezinfecţia minuţioasă a pielii din regiunea cefei, se
menţine capul bolnavului mult flectat înainte, fără să fie înclinat sau rotat într-o parte sau
alta. Se pătrunde cu acul exact pe linia mediană, pe linia care uneşte vârful celor două
mastoide, la mijlocul distanţei dintre protuberanţa occipitală externă şi apofiza spinoasă
proeminentă (a 7- vertebră cervicală). Se pătrunde cu acul perpendicular pe tegumente,
apoi îndreptat către baza nasului. După 2-3 cm se simte o rezistenţă dată de ligamentul
atlantooccipital, după care vârful acului pătrunde într-un spaţiu liber (în cisterna mare).
Este recomandabil ca acul să fie ataşat la o seringă cu care se aspiră LCR, deoarece
presiunea lui la acest nivel poate fi aproape de zero.
În laborator se face examinarea macoscopică a LCR, care poate ridica o anume
suspiciune etiologică; unul din tuburi se centrifugheză, iar din sedimentul obţinut se fac
frotiuri care se colorează diferit pentru orientare etiologică, iar cea de-a treia eprubetă
sterilă se foloseşte pentru izolarea germenilor prin însămânţare pe medii adecvate.

c. Urina
Metoda uzuală recomandată pentru recoltarea acestui produs patologic este cea a
jetului întrerupt (mijlociu): după toaleta exterioară a organelor genitale, efectuată prin
spălare cu apă caldă şi săpun, se recoltează porţiunea din mijloc a micţiunii - prima
porţiune a jetului este aruncată, şi fără a se întrerupe jetul de urină, se recoltează cca 20ml
de urină în recipient steril, închis ermetic cu capac (figura 6).
Prelevări speciale:
 Aspiraţia suprapubiană
Se recomandă la nou-născuţi şi sugari, paciente adulte, la care examinarea
repetată a probelor din jetul mijlociu a dat rezultate echivoce. Este singura metodă care
poate atesta semnificaţia clinică a bacteriilor anaerobe din urină.
Tehnică de recoltare. Pacientul, bine hidratat, se abţine de la micţiune până când
percuţia suprapubiană evidenţiază matitate vezicală, iar palparea regiunii evidenţiază
fundul vezicii urinare şi declanşează necesitatea micţiunii urgente. Se pregăteşte
tegumentul suprajacent (depilare, decontaminare cu alcool iodat). Se puncţionează vezica
urinară deasupra simfizei pubiene cu o seringă de 10 ml, aspirându-se urină. Proba se
pune într-un recipient steril cu capac, închis ermetic, care se etichetează cu numele
pacientului, ora recoltării, diagnostic, secţia de unde provine, şi se expediază
laboratorului.

Figura 6: Urocultor
 Prelevări prin catater
Are indicaţii limitate: pacienţi necooperanţi, pacienţi care nu micţionează din
cauze neurologice sau urologice, pacienţi cataterizaţi pentru explorare urologică,
pacienţi cu catater á „démeure“.
Recoltarea se face numai de specialistul urolog, cu instilarea, la sfârşitul
procedurii, de soluţie salină cu neomicină şi polimixină sau colimicină, pentru a preveni
infecţia.
 Evidenţierea microorganismelor din urină este denumită urocultură. Ea se
însoţeşte de calcularea bacteruiriei, şi de aceea se numeţte urocultură cantitativă.
Se practică în infecţiile aparatului renal, salmoneloze, leptospiroze, tuberculoză
etc.

d. Bila
Se recoltează pentru examinări bacteriologice (bilicultură), parazitologice,
biochimice, cu sonda Einhorn sterilizată, metoda recoltării purtând numele de tubaj
duodenal. Recoltarea se face dimineaţa, după clătirea cavităţii bucale cu apă sau soluţie
salină fiziologică sterilă. Se introduce sonda Einhorn până la diviziunea 45. Se culcă
pacientul pe dreapta şi se introduce sonda până la diviziunea 65. Se adaptează seringa şi
se introduc pe sondă 30-50 ml de soluţie de sulfat de magneziu steril (40%), încălzit la
30-370C. Se penseză sonda şi, după 5-10 minute, se începe recoltarea lichidului, care este
colectat în recipiente sterile.
Primul lichid care se scurge, în cantitate de 10-30 ml, este de culoare galbenă,
limpede sau uşor opalescentă şi constituie bila A (lichid duodenal sau bilă
coledociană).
După 15-25 de minute ce scurge o cantitate de 100-200 ml de lichid vâscos, brun-
castaniu, care reprezintă bila B „veziculară“.
Lichidul care se scurge în continuare, uneori îndelungat, este galben deschis şi
reprezintă bila C „hepatică“.
Aceste 3 feluri de bilă în mod normal sunt perfect limpezi; în stări patologice pot
fi opalescente, cu mucus sau chiar net tulburi sau purulente. Se considră o bilicultură
pozitivă dacă se evidenţiază un număr mai mare de 105 bacterii/ml.
Agenţii etiologici implicaţi în producerea unei infecţii a bilei şi căilor biliare pot
fi: bacterii Gram negative de origine intestinală (Escherichia coli, Salmonella,
Klebsiella, Proteus), coci Gram pozitivi (enterococi), paraziţi (Giardia, amibe, Fasciola
hepatică), levuri (Candida).

e. Exudatele seroaselor (lichid pleural, peritoneal, sinovial)

Se recoltează după asepsie locală prin puncţie în partea declivă a regiunii.
۰ Puncţia pleurală se execută în plină zonă de matitate, în spaţiul intercostal
respectiv, folosindu-se acul montat la o seringă sterilă. Se extrag 20-40 ml lichid pleural
care este repartizat în 2 tuburi sterile, unul conţinând un anticoagulant (soluţie sterilă de
citrat trisodic 3,8 g/100 ml sau soluţie sterilă de EDTA). Nu se îndepărtează cheagul de
fibrină sau nu se triturează, deoarece în reţeaua de fibrină rămân o serie de elemente,
eventual şi germeni, şi procedând ca mai sus aceştia vor fi distruşi.
Dacă lichidul extras este tulbure sau purulent, se păstrează o cantitate de 2-3 ml în
seringă, din care se fac însămânţări pentru anaerobi.
۰ Puncţia pericardică, trebuie făcută cu precauţii, iar lichidul extras este examinat
citologic, bacteriologic, virusologic, ca şi lichidul pleural.
۰ Puncţia peritoneală se face în plină zonă de matitate, bolnavul aflându-se în decubit
lateral, respectând aceleaşi reguli ca şi pentru lichidul pleural.
Prelucrarea produsului recoltat se face ţinând cont de faptul că peritonitele
bacteriene sunt rareori unietiologice; de obicei sunt plurietiologice, germenii implicaţi
fiind aerobi (coliformi, enterococi - mai ales la copii, streptococi β-hemolitici grup A,
eventual B), anaerobi (mai ales bacili Gram negativi nesporulaţi: Bacteroides şi
Fusobacterium), sau sporulaţi (clostridii).
۰ Puncţia articulară se execută folosind ac steril ataşat la o seringă sterilă, după
dezinfecţia tegumentelor articulare cu soluţii antiseptice. După pătrunderea în cavitatea
articulară, se extrage prin aspiraţie lichidul articular care se repartizează în 2 recipiente
sterile cu capac, unul fiind cu anticoagulant.
Laboratorul va prelucra produsul de puncţie articulară în funcţie de etiologia
suspicionată, dar în general se are în vedere etiologia banală cu germeni aerobi:
streptococi, stafilococi, germeni enterali, etiologia gonococică, dar şi tuberculoasă.

f. Produs de puncţie ganglionară

Se obţine prin puncţie aspiratorie ganglionară, după prealabilă dezinfecţie a
tegumentelor suprajacente. Agentul etiologic bacterian principal suspicionat a fi prezent
este bacilul Koch (tuberculoză ganglionară). Ca atare, se va recolta produsul în două
recipiente sterile, închise ermetic; unul va fi folosit pentru examen direct pe frotiu
colorat Ziehl-Nielsen, iar celălalt pentru însămânţare pe mediul Lőwenstein-Jensen.

IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO ŞI IN VIVO

Bacteriile se pot dezvolta, în afara organismului, in vitro, prin însămânţare pe
medii nutritive, şi/sau in vivo, prin inoculare la animale de laborator sensibile.

IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO

MEDII DE CULTURĂ
Mediul de cultură reprezintă substratul nutritiv folosit pentru creşterea şi
multiplicarea microorganismelor în condiţii artificiale, iar cultura microbiană,
totalitatea microorganismelor dezvoltate.
Prin utilizarea mediilor de cultură se pot izola microorganismele în cultură pură,
ceea ce permite identificarea lor, studiul unor proprietăţi caracteristice, prepararea de
antigene, vaccinuri şi alte produse biologice.

CONDIŢIILE PE CARE TREBUIE SĂ LE ÎNDEPLINEASCĂ MEDIILE DE

CULTURĂ
Corectitudinea cercetărilor microbiologice depinde şi de calitatea mediilor de
cultură, acestea trebuind să îndeplinească câteva condiţii esenţiale:
- să ofere substanţele plastice şi energetice necesare fiecărui microorganism (să
conţină o sursă de N şi C, factori de creştere, săruri minerale;
- să aibe un pH optim pentru specia respectivă, de obicei uşor alcalin 7,2-7,4;
- să asigure, după caz, cerinţele de aerobioză sau anaerobioză;
- să aibe un anumit grad de umiditate;
- să fie stabil (trebuie să-şi păstreze toate calităţile iniţiale pe toată durata incubării);
- să fie sterile, pentru a nu se dezvolta şi alte microorganisme, în afara celor
însămânţate;
- să se păstreze ferite de contaminare, atât înainte, cât şi după folosire.
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ
În prepararea mediilor de cultură trebuie respectate următoarele etape:
- stabilirea reţetei, respectarea cantităţii de ingrediente cu amestecul acestora în
proporţia şi ordinea indicată;
- verificarea pH-ului, eventual cu ajustarea acestuia;
- filtrarea mediului pentru degrosisare (îndepărtarea sărurilor alcalino-pământoase);
- repartizarea în recipiente adecvate (eprubete, baloane) şi sterilizarea în condiţii care
nu diminuează proprietăţile lor nutritive (autoclavare).
Controlul sterilizării se face prin menţinerea la termostat 24 ore, timp după care
mediile trebuie să rămână în continuare sterile.
CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ
a. după consistenţă:
· mediile lichide (apă peptonată, bulion): folosite în special pentru studiul unor
proprietăţi ale microorganismelor şi obţinerea toxinelor;
· medii solide (geloză): utilizate mai ales pentru obţinerea microorganismelor în
cultură pură.

b. după provenienţă:
· medii naturale: nu necesită o prelucrare specială (lapte, bilă, ser, cartof);
· medii artificiale: medii la care este obligatorie o prelucrare prealabilă, pornind de
la proteine animale (carne şi organe de vită, făină de peşte), sau vegetale (mazăre,
soia, drojdie);
· medii sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substanţe chimice
(aminoacizi, factori de creştere, săruri). Compoziţia mediilor sintetice variază după
dorinţa experimentatorului, cu ajutorul lor putându-se studia necesităţile nutritive ale
diverselor specii microbiene;
· medii semisintetice: sunt acele medii care pe lângă substanţe chimice mai conţin şi
proteine animale sau vegetale.
c. după compoziţie şi mod de utilizare:
Medii uzuale sau simple
Pe aceste medii se dezvoltă majoritatea microorganismelor, având în compoziţie
extract de carne, peptonă, clorură de sodiu. Pot fi:
- lichide: bulion (utilizat ca mediu de înmulţire şi menţinere a bacteriilor, serviind ca
element de bază pentru obţinerea mediilor lichide complexe), apă peptonată (utilizat ca
mediu de îmbogăţire pentru vibrioni);
- solide: geloză simplă (provine din bulion în care se introduce, la cald, fibrele unei
alge marine din familia Florideea, cunoscute în comerţ sub numele de agar-agar, care-i
conferă acestuia suportul solid). Este utilizată pentru obţinerea fie de colonii izolate, fie
de culturi masive, în funcţie de scopul urmărit (figura 1).
 Figura 1: Geloză simplă
Medii complexe
Sunt mediile cu adaus de lichide organice (sânge, ser) sau zaharuri (glucoză,
lactoză etc.) la mediile simple, pentru cultivarea speciilor mai pretenţioase (gonococi,
meningococi, hemofili), sau evidenţierea unor proprietăţi. Prin adăugarea acestor
ingrediente se obţin medii cu bulion-sânge, bulion-ser, bulion-ascită, bulion glucozat sau
geloză ser (sânge, ascită)
- mediul geloză sânge (evidenţiază fenomenul de hemoliză caracteristic unor specii
bacteriene (stafilococi, streptococi, pneumococi). Pentru izolarea gonococilor,
meningococilor se foloseşte un mediu derivat al amestecului geloză-sânge, şi anume,
geloză chocolat.Acest mediu constă din sânge defibrinat de berbec 5% peste care se
toarnă geloză încălzită la 70°C. Sub influenţa căldurii se produce denaturarea mediului şi
punerea în libertate de aminoacizi necesari dezvoltării unor specii bacteriene (figura 2);
- medii elective: asigură cu precădere dezvoltarea unui germen în raport cu alţi
germeni
* mediul Loeffler cu ser coagulat de bou pentru izolarea bacilului difteric;
- medii selective: selectează un anumit germen, conţinând substanţe bacteriostatice
pentru flora de asociaţie:
* mediul Lowenstein Jensen, cu verde malahit pentru inhibarea florei de
asociaţie, pentru izolarea bacilului Koch. Mediul mai conţine săruri minerale,
amidon, ou, glicerină.
* mediul hiperclorurat solid Chapman (clorură de sodiu, manită, roşu fenol)
pentru izolarea stafilococilor manito-pozitivi patogeni;
 * mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric;

Figura 2 : Geloză sânge

* mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz cu telurit de potasiu pentru izolarea

bacilului difteric;
* mediul Rogose este un mediu selectiv pentru lactobacili care necesită pentru
izolare un pH foarte scăzut (amestec de geloză nutritivă topită şi răcită apoi la
50°C, amestecată extemporaneu cu părţi egale de suc de roşii centrifugat în
prealabil)
* medii pentru izolarea enterobacteriilor (geloză, bilă sau săruri biliare,
lactoză, indicator - albastru de bromtimol, roşu fenol, tinctură de turnesol):
- generale: Istrate-Meitert, Leifson, Mac-Conkey (figura 3);
- speciale: Levine (E. coli); Wilson-Blair (Salmonella typhi);

Figura 3: Agar Mac Conkey

 * mediul PPLO pentru izolarea mycoplasmelor este un mediu solid în care s-a
introdus cristal-violet şi telurit de potasiu pentru inhibarea florei de asociaţie. La
geloză se adaugă ser (cal, bou sau iepure) sau colesterină şi glucoză la un pH 7,6-
8.
* mediul Diudonne este un mediu pentru izolarea veillonellelor şi a vibrionilor
(apă peptonată hiperalcalină - pH 9-9,2 cu adaus de compuşi intermediari de
metabolism de tip piruvat, lactat sau oxalacetat);
- medii de îmbogăţire: medii lichide care favorizează înmulţirea anumitor bacterii
patogene inhibând selectiv dezvoltarea florei de asociaţie (pentru produsele care conţin
o cantitate mică de bacterii patogene în raport cu flora saprofită):
* mediul OCST (ou, cistină, ser, telurit de potasiu) pentru bacil difteric;
* mediul hiperclorurat lichid Chapman pentru stafilococi;
* mediul Picke (bulion glucozat 0,2%, cristal-violet şi azidă de sodiu) pentru
streptococ β -hemolitic grup A;
* mediul Muller-Kauffmann, mediul cu selenit acid de sodiu pentru izolarea
genului Salmonella;
- medii diferenţiale: diferenţiază diferite tipuri de bacterii:
* mediul Drigalski care diferenţiază bacteriile care fermentează lactoza de cele
care nu fermentează lactoza;
- medii pentru punerea în evidenţă a anumitor proprietăţi biochimice (de
identificare)
* medii politrope (TSI, MIU, MILF);
* mediul Hiss;
* mediul Clark-Lubs;
* mediul Simons (mediul cu citrat);
* mediul cu fenilalanină;
* mediul cu lizină;
* mediul cu esculină.
- medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe: mediul Veillon, mediul Tarozzi,
mediul Willis-Hobbs;
- medii pentru cultivarea fungilor: mediul Sabouraud (geloză cu zaharuri de tip
glucoză 4% sau maltoză 4%).

ÎNSĂMÂNŢAREA PRODUSELOR PATOLOGICE ŞI IZOLAREA ÎN CULTURĂ

PURĂ
ÎNSĂMÂNŢAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Însămânţarea produselor patologice reprezintă introducerea acestora pe medii de
cultură potrivite, pe suprafaţă sau în profunzime, cu scopul obţinerii de culturi
microbiene pure. Însămânţarea se face în mod steril, cu ansa, tamponul de exudat sau
pipeta, folosind medii de cultură sterile şi de compoziţie adecvată.
 Se recomandă însămânţarea imediată a probelor; dacă nu există posibilităţi
imediate acestea se vor păstra la 4°C.
Pentru obţinerea unor rezultate corecte trebuie să se ţină seama de anumite reguli:
- folosirea de instrumentar steril: ansa bacteriologică, pipeta Pasteur sau gradată;
- flambarea orificiilor recipientelor (baloane, eprubete) ce conţin mediile de cultură,
dopurile flacoanelor se vor ţine între degetul mic şi podul palmei drepte);
- nu se vorbeşte, nu se tuşeşte, uşile şi ferestrele trebuie închise (se preferă boxe sau
camere separate) pentru a împiedica contaminarea cu floră din aer sau cavitatea bucală a
manipulatorului.
Însămânţarea se face pe medii lichide şi solide, primele favorizând o primă
înmulţire numerică a bacteriilor. Dezavantajul lor este posibilitatea însămânţării la
început (însămânţare primară) din materialul patologic al unui amestec bacterian nedorit.
De aceea este obligatoriu în toate cazurile ca însămânţările pe mediile lichide să fie
urmate ulterior de însămânţări pe medii solide pentru a obţine colonii izolate.

ÎNSĂMÂNŢAREA ÎN MEDII LICHIDE

a. Cu ansa
Ansa se ţine în mâna dreaptă. Se sterilizează prin încălzire la incandescenţă,
utilizând becul Bunsen. Dacă produsul patologic se află într-o ebrubetă, se scoate dopul
de vată între degetul mic şi palma mîinii drepte, ţinând recipientul în mâna stângă. Se
flambează gura eprubetei, se ia din produsul patologic cu vârful ansei, se flambează din
nou gura recipientului, se pune dopul la loc. Eprubeta cu mediu se ţine în măna stângă,
uşor înclinată pentru a evita riscurile contaminării cu microorganisme din aer, se scoate
dopul, se flambează, se depune conţinutul ansei pe peretele eprubetei deasupra mediului
lichid şi se omogenizează apoi cu acesta. Urmează repunerea dopului după flambarea şi
sterilizarea ansei.

b. Cu pipeta Pasteur
Se rupe vârful pipetei şi se flambează trecând-o prin flacară. După răcirea pipetei,
se scoate dopul eprubetei cu produsul patologic, se flambează şi se aspiră 0,5-1 ml din
produs. Conţinutul pipetei se introduce în eprubeta cu mediu, după ce s-au respectat
regulile de asepsie. Urmează incubarea la termostat. Pipeta folosită este pusă în vasul cu
amestec sulfocromic.
Dacă se însămânţează în anaerobioză, mediul se fierbe în baia de apă 20-30
minute, se răceşte la 40-450C şi se introduce conţinutul pipetei în mediu, având grijă să
nu se introducă bule de aer.

ÎNSĂMÂNŢAREA PE MEDII SOLIDE

În operaţia de însămânţare pe medii solide avem două situaţii:
- însămânţarea în suprafaţă: pe medii solide în poziţie înclinată şi pe medii solide
turnate în plăci Petri;
- însămânţarea în profunzime: pe medii solide turnate în coloană dreaptă şi pe medii
solide în plăci Petri: metoda plăcii turnate şi metoda între două straturi.

a. Însămânţarea în suprafaţă
Cu ansa
- Pe geloză înclinată. Se sterilizează ansa şi după răcire se încarcă cu produsul respectiv.
Se introduce ansa aproape de fundul eprubetei cu mediu, dar deasupra lichidului de
condens şi se trece uşor pe suprafaţa mediului în zig-zag sau în linie dreaptă, fără a zgâria
suprafaţa mediului (figura 4).
- Pe geloză în plăci Petri. Se înclină placa cu mediu şi se depune produsul aproape de
margine. Se trag striuri paralele cu ansa, prin mişcări scurte şi dese pe o suprafaţă mică la
polul superior al mediului, fără a zgâria suprafaţa mediului. Apoi ansa se trece pe
suprafaţa mediului trasându-se linii paralele şi perpendiculare, în formă de pentagon
(regula pentagonului pentru obţinerea de colonii izolate) (figurile 5, 6 şi 7).

Cu pipeta Pasteur
- Pe geloză înclinată. Se însămânţează lichidul de condens al mediului cu câteva picături
din produsul patologic aflat în pipetă. Prin uşoară agitare şi înclinare a eprubetei, lichidul
se răspândeşte pe toată suprafaţa mediului.
- Pe geloză în plăci Petri. Se depune pe suprafaţa mediului aproximativ 1 ml din
produsul lichid şi se răspândeşte uniform pe toată suprafaţa prin înclinarea plăcii sau cu
pipeta Pasteur îndoită. Se ţine înclinată şi se aspiră excesul de lichid cu pipeta.
- În mediul Veillon pentru anaerobioză. Geloza Veillon se topeşte pe baia de apă, se
răceşte la 450C şi se introduce conţinutul pipetei fără bule de aer. Apoi se aşează
eprubetele în apă rece pentru solidificare rapidă.
b. Însămânţarea în profunzime
ÎNSĂMÂNŢAREA PE MEDII SOLIDE TURNATE ÎN COLOANĂ
DREAPTĂ
Se deschide eprubeta cu mediu de cultură, se răstoarnă cu gura în jos, iar
însămânţarea se face prin prin înţeparea în profunzime a mediului, utilizând ansa fir
pentru a străpunge mediul, fără a-l deplasa (exemplu însămânţarea mediului MIU).
Figura 4: Tehnica însămânţării în suprafaţă pe mediul solid înclinat
 Figura 5: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

Însămânţarea pe medii solide în profunzime:

- metoda între două straturi: produsul se însămânţează pe suprafaţa plăcii cu geloză,
după care se toarnă un alt strat subţire de geloză deasupra zonei de descărcare a
produsului;
- metoda plăcii turnate: în placa Petri se pune o cantitate de produs, se toarnă geloza,
se amestecă şi se lasă să se solidifice. Prin această metodă se crează condiţii de
semianaerobioză necesare izolării unor bacterii patogene (exemplu: însămânţarea urinii).

IZOLAREA MICROORGANISMELOR ÎN CULTURĂ PURĂ

Pentru a obţine un rezultat corect, microorganismele trebuie studiate totdeauna în
cultură pură, pornind de la colonii izolate. Colonia este o populaţie microbiană formată
din indivizi proveniţi dintr-o singură celulă (clonă). Cultura pură se obţine preluând cu
ansa o singură colonie şi însămânţând-o pe un mediu de cultură adecvat.
Izolarea este operaţia prin care se separă microorganismele dintr-un produs în
care se găsesc mai multe specii, în vederea identificării fiecăreia. Pentru obţinerea
coloniilor izolate se folosesc diverse tehnici.

TEHNICI OBIŞNUITE DE IZOLARE

a. Dispersia pe placă Petri
O cantitate mică din produsul patologic se depune într-o zonă periferică a
mediului, de unde se întinde cu ansa în striuri paralele. Se sterilizează ansa şi pornind de
la ultimile striuri, perpendicular pe acestea, se mai efectuează câteva striuri paralele.
Operaţia se repetă până la epuizarea suprafeţei mediului.
b. Metoda diluţiilor
Se folosesc mai multe tuburi cu geloză înclinată. Se însămânţează cu pipeta
Pasteur lichidul de condens al primului tub. Prin înclinare se răspândeşte lichidul pe toată
suprafaţa mediului. Se trece o picătură în lichidul de condens al celui de al doilea tub,
procedându-se la fel, până la ultimul tub. În ultimele tuburi vor apare colonii izolate.
Diluţia poate fi realizată şi în tuburi cu mediul lichid, de unde se pasează câte o picătură
în lichidul de condens al tuburilor cu geloză înclinată.

Figura 6: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

 Figura 7: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

TEHNICI SPECIALE DE IZOLARE

a. Bacteriile sporulate. Se izolează de cele nesporulate prin încălzirea produsului
patologic la 800C timp de 30 de minute, sau la 1000C timp de 2 minute, pentru distrugerea
formelor vegetative. După răcire, se însămânţează în vederea izolării fiecărei specii
sporulate prin metode obişnuite.
b. Izolarea bacteriilor anaerobe dintr-un produs care conţine şi specii aerobe, se face pe
medii lipsite de oxigen, prin metoda diluţiilor. Apoi se însămânţează în mediul Tarozzi,
pentru a obţine o cultură pură abundentă. Dacă bacteriile anaerobe din produsul patologic
sunt şi sporulate, acestea se izolează prin încălzirea prealabilă a culturii la 800C timp de
30 de minute.
Mediile de cultură utilizate pentru speciile aanaerobe trebuie să fie lipsite de aer şi
cu un potenţial redox cât mai coborât. Cultivarea în condiţii de anaerobioză se face prin
mai multe metode :
- introducerea plăcilor însămânţate în aparate metalice din care se scoate aerul cu o
pompă de vid;
- înlocuirea aerului atmosferic cu gaze inerte, cu un amestec de 90% hidrogen şi 5%
bioxid de carbon;
- însămânţarea pe medii sterile conţinând organe proaspete (fragmente de ficat,
rinichi) care să scadă potenţialul redox al mediului (mediul Tarozzi);
- cultivarea în tuburi lungi şi subţiri cu geloză semisolidă de tip Veillon;
- însămânţarea în medii lichide se face după ce acestea se fierb 15 minute şi se răcesc
brusc la un jet de apă (se regenerează). Prin această manevră se elimină aerul din
conţinutul lor.
c. Izolarea pe medii speciale. Anumite microorganisme pot fi izolate din produsul
patologic pe medii speciale: mediul Loffler pentru bacilul difteric, mediul Lowenstein
pentru bacilul tuberculozei, etc.

INCUBAREA
Constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate în condiţii necesare
dezvoltării germenilor: la majoritatea speciilor bacteriene cultura apare după 18-24 de ore
de incubare la temperatura de 37°C. La unele specii perioada de incubare este mai lungă,
de la câteva zile la câteva săptămâni (exemplu: bacilul Koch). Unele bacterii necesită
pentru dezvoltare o atmosferă de 5-10% CO2 (exemplu: pneumococul, meningococul).

IZOLAREA BACTERIILOR IN VIVO

Izolarea bacteriilor in vivo se realizează prin inocularea la animale sensibile a
produselor patologice (exemple: pneumococul sau Klebsiella pe şoarece, bacilul
tuberculozei pe cobai, etc.).
Produsul patologic se inoculează ca atare sau suspensionat în soluţie cloruro-
sodică izotonă, utilizând seringi şi ace sterile.
Calea de inoculare este diferită în funcţie de afinităţile pentru ţesut ale
germenului: calea subcutanată pentru produsele cu floră de asociaţie care rămâne
cantonată la poarta de intrare; calea intraperitoneală utilizată pentru produsele patologice
monomicrobiene; calea intravenoasă; instilare pe mucoasa nazală, calea conjunctivală,
per os, intramuscular, intracerebral etc.
Dacă operaţiunea de inoculare a animalului nu este urmată de leziuni, animalul
rămânând sănătos, se pot efectua o suită de pasaje oarbe pe animale în scopul exacerbării
virulenţei germenului.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE CU STAFILOCOC
Stafilococii sunt germeni ubicvitari, răspândiţi în natură (în apă, aer, sol),
prezenţi pe pielea şi mucoasele organismului uman. Stafilococii, în special S. aureus şi S.
epidermidis, fac parte din flora normală a unor indivizi (“purtători asimptomatici”), ca
germeni saprofiţi, localizarea predilectă fiind fosele nazale. Ei se pot afla la originea unor
procese infecţioase, fie prin auto-infecţie, fie prin transmitere la alţi indivizi.
Aproximativ 20-75% dintre indivizi sunt purtători de S. aureus, fapt deosebit de
important în urmărirea şi apariţia infecţiilor nosocomiale. Se apreciază că peste 80% din
personalul medico-sanitar este purtător de S. aureus. Transmiterea este în special
interumană directă (contact direct, mâini murdare) sau indirectă, prin alimente sau din
mediul exterior.
Infecţiile umane stafilococice sunt foarte variate. La nivelul pielii şi mucoaselor
pot genera impetigo, furuncule, foliculite, sindromul “pielii oparite” sau boala Ritter von
Rittershain prin secreţie de exfoliatine; la nivel visceral pot fi implicaţi în producerea de
osteomielite, endocardite, septicemii, infecţii urinare, toxiinfecţii alimentare, enterocolite
acute şi temutul sindrom al şocului toxic TSST-1 (Toxic Shock Syndrome Toxin 1),
consecinţa unei vaginite cu S. aureus secretor de exotoxina 1 la femeile folosind
tampoane intravaginale.
Diagnosticul de laborator în infecţiile stafilococice este bacteriologic: se
urmăreşte însămânţarea şi identificarea germenilor, precum şi testarea sensibilităţii la
antibiotice în vederea instituirii unei conduite terapeutice adecvate.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Recoltarea trebuie facută înaintea administrării de antibiotice şi cu

respectarea riguroasă a regulilor de antisepsie, atât în ceea ce priveşte
hemocultura, LCR, lichidul articular, urina, dar şi în cazul secreţiilor
purulente, aspiratul bronşic, exudatele faringiene şi nazale. Cel mai mare risc
este reprezentat de contaminarea accidentală a prelevatelor cu tulpini de S.
aureus şi S. epidermidis prezenţi la nivelul pielii.
În cazul toxiinfecţiilor alimentare se vor recolta materii fecale, lichid de vărsătură,
resturi din alimentul ingerat. În situaţiile când sunt incriminate epidemiile hidrice se
recoltează probe de apă din reţaua de aducţiune sau din piscine.
În mediul spitalicesc se recoltează probe de pe suprafeţe şi din aer conform
normelor antiepidemice în vigoare şi în colaborare cu medicul epidemiolog.
Pentru depistarea purtătorilor nazofaringieni de stafilococ patogen se recoltează
exudatul faringian şi nazal.
Transportul probelor recoltate se face cât mai repede la laborator folosind mediile
de transport gelozate sau recipiente sterile corespunzătoare (urocultoare, coprocultoare,
tampoane pentru exudat faringian sau nazal etc.).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examenul direct:
Se efectuează direct din produsele patologice, prin două tipuri de preparate:
- între lamă şi lamelă: pentru aprecierea mobilitaţii germenului, a prezenţei sau absenţei
capsulei bacteriene;
- pe frotiuri fixate şi colorate: Gram, albastru de metilen şi May-Grunwald Giemsa.
Frotiurile efectuate direct din produsele patologice, colorate Gram, evidenţiază
coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în grămezi (în ciorchine de strugure), nesporulaţi,
uneori încapsulaţi, care, în cazul produselor normal contaminate, pot fi însoţiţi de alţi coci
sau bacili (floră de asociaţie), polimorfonucleare (PMN) şi celule epiteliale, întregi sau
detritusuri (figurile 1 şi 2).
Examenul direct între lamă şi lamelă evidenţiaza germeni imobili.
Coloraţiile cu albastru de metilen şi May-Grunwald Giemsa evidenţiază aspectul
citologic şi relaţia dintre fagocite şi germeni.
 Figura 1: Frotiu colorat Gram dintr-un abces: Stafilococi. După: A Colour Atlas of
Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 2: Frotiu colorat Gram din sputa unui pacient cu pneumonie stafilococică.
După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.2. Izolare in vitro

Se însămânţează produsele pe medii de cultură simple (bulion glucozat, geloză
simplă), stafilococii fiind germeni puţin exigenţi din punct de vedere metabolic, ca şi pe
geloză cu 5% sânge defibrinat de berbec (geloză sânge). De asemenea, se pot folosi
mediile de cultură hiperclorurate, lichide şi solide, care conţin NaCl în concentraţie de
7,5 g%, deoarece permit dezvoltarea preferenţială a stafilococului inhibând flora de
asociaţie (pentru produsele patologice polimicrobiene sau alimente). Mediul hiperclorurat
lichid Chapman este un mediu de îmbogăţire pentru stafilococ. După însămânţarea
produsului pe acest mediu şi incubare 48 de ore la 37°C se fac treceri pe mediul
hiperclorurat solid Chapman, care evidenţiază fermentarea manitei, caracter de
patogenitate al stafilococului.
Stafilococii sunt aerobi, facultativ anaerobi, iar incubarea mediilor se face la 37°C
fără precauţii deosebite.

2.3. Identificare
De departe, cea mai importantă specie incriminată în patologia umană este cea a
S. aureus, dar, în cazul izolatelor repetate ce provin din hemoculturi, LCR, lichid
intraarticular, seroase, în cazul purtătorilor de valve cardiace, imunodeprimaţi, sunt de
aceeaşi gravitate şi identificarea altor specii de stafilococi, de ex. S. epidermidis, S.
schleiferi, S. lugdunensis, S. warneri sau S. haemolyticus.
În acest context, utilizarea termenului de “stafilococ patogen”, “stafilococ auriu
hemolitic” în editarea buletinelor de analiză trebuie proscris, ţinând cont de semnificaţia
clinico-epidemiologică, dar şi datorită faptului, unanim acceptat astăzi, că specificitatea
unor caractere precum hemoliza, pigmentogeneza sau fermentarea manitei este
inconstantă şi nu numai apanajul definitoriu al tulpinilor de S. aureus.
De aceea stabilirea diagnosticului bacteriologic de certitudine în infecţiile
stafilococice trebuie să reprezinte, în final, rezultatul colaborării dintre medicul clinician
şi medicul microbiolog.

2.3.1. Caractere de cultură

 Pe mediile lichide
Stafilococii tulbură uniform mediul cu depozit moderat la fundul tubului de
cultură.
 Pe mediile solide
Pe mediile cu geloză determină apariţia de colonii de tip S (“smooth” - neted),
opace, convexe, de aspect cremos, cu diametrul de 2-3 mm, dar putând atinge şi
dimensiuni de 7 mm în cazul unei incubări prelungite, de la 48 la 72 de ore. Marginile
coloniilor sunt regulate, suprafaţa lucioasă. Tulpinile de stafilococi cu alterări ale
peretelui celular provenind din probe ce conţin substanţe antimicrobiene pot da colonii de
tip G (“glossy”- lucios), pitice, sau de tip G-R (“rough”- rugos), mici, cu margini
imperfecte, granulate. Pe mediu lichid acest tip de germeni nu tulbură mediul,
depunându-se doar la baza tubului sub forma unui mic depozit granular.
În cazul stafilococilor cu capsula polizaharidică (“slime”) aceştia dezvoltă colonii
de tip M, mucoase, în special în cazul culturilor efectuate direct din prelevate.
Coloniile sunt pigmentate diferit (alb, aureu, citrin). Clasic, coloniile de S.
aureus sunt descrise ca producând un pigment de culoare galben-auriu (oranj), ca o
caracteristică relativ constantă, dar acestă producţie este descrisă şi la alte specii cum ar fi
S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus şi de aceea are o valoare mai mult
orientativă. Pigmentogeneza se intensifică dupa 1-2 zile la temperatura camerei. Mediile
cu suplimente nutritive (ou, ser, lapte etc.), cum ar fi, de exemplu, geloza P cu lapte,
favorizeaza pigmentogeneza. Mai sunt descrise şi colonii de S. aureus de culoare galben
citrin, portocalii sau albe (figurile 3, 4 şi 5).
Pe mediul cu telurit Baird-Parker coloniile de S. aureus au diametrul de 1-1,5
mm, sunt convexe, negre strălucitoare cu bordură îngustă, albă şi halou clar cu diametrul
de 2-5 mm.
 Pe geloza cu 5% sânge defibrinat de berbec (geloză sânge) tulpinile de S. aureus,
dar şi S. haemolyticus, produc o zona de hemoliză completă, clară, netă, de tip alfa (se
datorează eliberării hemolizinei alfa). Mai pot determina şi o hemoliză incompletă,
nebuloasă după 24 de ore de termostatare, dar după depunerea la frigider a plăcii cu
mediu se accentuează (hemoliza de tip “cald-rece”), datorată hemolizinei beta.

2.3.2. Caractere morfologice

Examenul microscopic al frotiurilor efectuate din culturile crescute în medii
lichide sau pe mediile solide şi colorate Gram evidenţiază coci Gram pozitivi sferici,
aşezaţi în grămezi neregulate, necapsulaţi, nesporulaţi (figurile 6 şi 7).
Pe preparatul nativ între lamă şi lamelă se observă lipsa mobilităţii.

Figura 3: Stafilococi albi - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 4: Stafilococi aurei - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 5: Stafilococi aurei - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 6: Frotiu colorat Gram din cultură - Stafilococi. După: A Colour Atlas of
Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986
Figura 7: Frotiu colorat Gram din cultură - Stafilococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology
Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979.

2.3.3. Caractere metabolice

• Fermentarea hidraţilor de carbon
Stafilococii au un metabolism oxidativ fermentativ, spre deosebire de micrococi.
Ei fermentează hidraţii de carbon, precum: glucoza, lactoza, maltoza, zaharoza,
acidificând mediul.
Stafilococii tolerează medii cu concentraţie crescută de NaCl (7,5 g%), iar
94% dintre tulpinile de S. aureus, spre deosebire de majoritatea celorlalte specii de
stafilococi fermentează manita cu producţie de acid. Aceste proprietăţi sunt exploatate
de mediul Chapman, care conţine 7,5 g% NaCl (ceea ce face mediul selectiv pentru genul
Staphylococcus) şi manită care este fermentată de către S. aureus. Acidifierea mediului se
traduce prin virajul culorii indicatorului de pH (roşu metil) în galben.(figura 8).
• Testul catalazei
Stafilococii ca şi micrococii, spre deosebire de streptococci, posedă o catalază
capabilă să transforme peroxidul de hidrogen în oxigen şi apă. Testul se efectuează pe o
lamă de sticlă port-obiect (prin descarcarea unei colonii dintr-o cultură de stafilococi într-
o picătură de peroxid de hidrogen) sau în tub. Degajarea unor bule de gaz traduce
prezenţa catalazei. Se preferă recoltarea coloniilor de pe mediul nutritiv gelozat, evitând
geloza sânge, deoarece pot apare reacţii fals positive, în cazul existenţei streptococilor,
prin antrenarea de hematii din mediu (figura 9).
 Figura 8: Testul fermentării manitei pe mediul Chapman: negativ (roşu) la stânga şi
pozitiv (viraj în galben) la dreapta (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Reacţie negativă:
Reacţie pozitivă: Streptococcus faecalis
Staphilococcus aureus

Martor

Figura 9: Testul catalazei în tub. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

• Testul oxidazei
Stafilococii sunt oxidazo-negativi, spre deosebire de micrococi care sunt
oxidazo-pozitivi. În practică se folosesc fie benzi de hârtie, fie discuri de oxidază.
Descarcarea unei colonii bacteriene poate duce la apariţia unei reacţii colorate în violet
în primele 30 de secunde pentru germenii oxidazo-pozitivi (micrococii), sau lipsa unei
reacţii de culoare în cazul tulpinilor oxidazo-negative (stafilococii, streptococii). O
reacţie de culoare ce apare într-un interval de timp mai mare de 30 secunde se va
interpreta ca reacţie fals pozitivă!
• Determinarea sensibilităţii la novobiocină
Stafilococii “coagulazo-negativi”, iniţial consideraţi germeni comensali, sunt
astăzi recunoscuţi ca bacterii potenţial patogene, responsabili de infecţii nozocomiale, în
special în serviciile de reanimare, la purtătorii de catetere sau de proteze. Cei mai des
întâlniţi sunt S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis (considerat ca fiind cel mai
patogen), S. schleiferi, S. saprophyticus, S. hominis.
Determinarea sensibilităţii la novobiocină a diferitelor specii de stafilococi izolaţi
la om, a permis să se individualizeze 2 categorii: stafilococii sensibili la novobiocină,
aici fiind cuprins şi S. aureus, dar şi 9 specii de stafilococi “coagulazo-negativi” şi
stafilococii rezistenţi la novobiocină, cuprinzând numai 3 specii de stafilococi
“coagulazo-negativi” (tabelul I).

Sensibili la Novobiocina S.aureus

S. auricularis
S. capitis subsp. capitis
S. capitis susp. ureolyticus
S. caprae (*)
S. epidermidis
S. haemolyticus
S. hominis
S. intermedius
S. lugdunensis
S. schleiferi subsp. coagulans
(*)
S. schleiferi subsp. schleiferi
S. simulans
S. warneri
Rezistenti la Novobiocina S. cohnii
S. saprophyticus
S. xylosus

(*) = caz unic de tulpină izolată la om

Tabelul I: Clasificarea stafilococilor de origine umană după sensibilitatea la Novobiocină
(dupa F. Vandenesch ., M. Bes, J.Etienne - Staphylococcus. În: Manuel de Bacteriologie
clinique, Ed. Elsevier, 1995)

Testul se realizează studiind creşterea bacteriană în jurul unui disc de novobiocina

(5 µ g/disc). Tulpinile sunt considerate rezistente dacă diametrul zonei de inhibiţie este
mai mic de 12 mm în cazul tulpinilor însămânţate pe mediu gelozat adiţionat cu 5%
sânge de berbec, sau mai mic de 16 mm în cazul tulpinilor însămânţate pe mediu gelozat
tip Mueller Hinton (figura 10).

• Stabilirea profilului biochimic (biochemotipia)

Biochemotipia conta în stabilirea profilului biochimic (reacţiile specifice în
prezenţa anumitor substraturi) al fiecarei tulpini izolate, prin utilizarea galeriilor
biochimice standardizate şi miniaturizate.
Au la bază utilizarea unui număr variabil de teste biochimice (acidifierea
diferiţilor hidraţi de carbon şi producerea de reacţii specifice în prezenţa unor substraturi
ca: ureaza, nitraza, fosfataza, ornitildecarboxilaza etc.). Rezultatele se bazează pe citirea
vizuală sau automată a reacţiilor de culoare apărute după inocularea galeriilor cu o
suspensie din tulpina de testat şi termostatate timp de 18-24 ore la 37 oC.

Figura 10: Aspectul testului la Novobiocină pentru o tulpină pozitivă (stânga) şi o

tulpina negativă (dreapta) (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Extrem de folosite la nivel mondial în cadrul laboratoarelor de analize medicale,

dar şi al laboratoarelor de cercetare, aceste galerii biochimice standardizate şi
miniaturizate încep să-şi facă loc şi în practica obişnuită a laboratoarelor de bacteriologie
din România.
Fiabilitatea rezultatelor, scurtarea timpului de investigaţie, gradul mult mai redus
de eroare faţă de tehnicile clasice (cu condiţia respectării acurateţei tehnicii preconizată
de producător), acceptarea internaţională a datelor astfel obţinute sunt tot atâtea
argumente care pledează pentru utilizare lor pe scară largă în cadrul identificărilor
bacteriologice de rutină în vederea stabilirii unui diagnostic microbiologic corect.
Studiile multicentrice internaţionale realizate în ultimii ani au demonstrat buna
reproductibilitate a acestor sisteme, ele permiţând identificarea corectă în mai mult de
95,5% din cazuri pentru majoritatea speciilor bacteriene cunoscute.
 Dintre galeriile de identificarea speciilor de stafilococi amintim :
o galeriile API STAPH (bioMerieux): folosesc 19 teste de identificare - 19 specii de
stafilococi identificate; citire vizuală şi automată.
o ID 32 STAPH (bioMerieux): folosesc 26 de teste de identificare - 24 specii
identificate; citire vizuală şi automată.
o galeriile ATB 32 STAPH (France Api System): folosesc 26 de teste de identificare -
identificarea inclusiv şi a speciilor nou descrise în ultimul deceniu; citire vizuală şi
automată.
o Micro Scan Pos Combo (Baxter Diagnostic) şi Rapid Pos Combo (Baxter
Diagnostic) - au şi avantajul deteminării sensibilităţii la antibiotice; citire automată.

2.3.4. Caractere de patogenitate

Se evidenţiază prin teste de patogenitate in vitro şi in vivo.
Teste de patogenitate in vitro
• Testul pigmentogenezei: stafilococii citrini sunt nepatogeni, cei albi sunt 20%
patogeni şi 80% nepatogeni, cei aurei sunt 80-90% patogeni şi 10-20% nepatogeni.
• Testul hemolizei: stafilococii hemolitici sunt patogeni (hemoliză de tip “cald-rece”
datorată hemolizinei beta).
• Testul fermentării manitei: pe mediul hiperclorurat solid Chapman (NaCl, manită,
roşu fenol ca indicator) (figura 8).
• Testul coagulazei (coagulaza: enzimă legată de virulenţa-patogenitatea germenului,
cu rol antifagocitar).

Identificarea coagulazei libere

Prezenţa coagulazei libere este un element major pe baza căruia se poate afirma
caracterul patogen al unei tulpini de stafilococ.
Este considerat, încă, testul principal de identificare a S. aureus, dar şi o serie de
alte specii de stafilococi, precum S. delphini, S. intermedius, S. schleiferi subsp.
coagulans, S. hyicus produc coagulaza. Aceste tulpini sunt, însă, în mod cu totul
excepţional izolate la om.
Deşi testul permite identificarea a 99% dintre tulpinile de S. aureus, s-au descris
tulpini de S. aureus care nu produc coagulaza liberă ca urmare a unui deficit
transcripţional sau post-transcripţional al genei coagulazei: identificarea speciei, în acest
caz, se realizează prin coroborarea rezultatelor altor teste.
Tehnica
- Se efectuează în tuburi de hemoliză, punând în contact 0,5 ml plasmă liofilizată de
iepure şi resuspendată extemporaneu în apa distilată cu 0,5 ml din cultura în bulion
(ex. apă peptonată, bulion cord-creier, bulion Tripcase-soia) a tulpinii de testat,
incubată în prealabil timp de 18-24 de ore la 37oC.
- Se agită amestecul astfel realizat punându-se la etuvă sau la bain-marie la 37oC.
- Se citeşte reacţia prin înclinarea uşoară a tubului, la: 30 minute, 1 oră, 3 ore, 4 ore.
Apariţia unui cheag de fibrină complet semnifică o reacţie pozitivă. După citirea
cheagului la 4 ore, cultura se lasă în continuare la termostat la 37oC timp de 18 ore.
Apariţia unui cheag incomplet în acest interval de timp defineşte tot o reacţie pozitivă.
Reacţia negativă se traduce prin lipsa apariţiei fenomenului de coagulare al plasmei în
condiţiile de mai sus (figura 11).
 Figura 11: Testul coagulării plasmei în tuburi (sursa: http://www.
microbes_med.sc.edu 85)

Identificarea coagulazei legate, sau evidenţierea factorului de afinitate pentru fibrinogen

sau clumping factorul (Clumping factor test)
Factorul de afinitate pentru fibrinogen, un receptor proteic pentru un fragment al
fibrinogenului prezent la nivelul peretelui bacterian al S. aureus, permite constituirea
unui agregat bacterian în prezenţa fibrinogenului în soluţie. In vivo el determina aderarea
germenilor de micro-cheagurile prezente la nivelul breşelor vasculare şi de materialele
străine (ex. valve cardiace).
În interpretarea rezultatelor se va ţine cont de faptul că, un procent cuprins între 1
şi 10% dintre tulpinile de S. aureus, în special cele rezistente la meticilină, nu produc
factorul de afinitate pentru fibrinogen; pe de altă parte, şi alte specii de stafilococi, cum ar
fi: S. schleiferi subsp. Schleiferi, S. lugdunensis şi S. intermedius pot da rezultate positive.

Tehnica
Metoda clasică, dar care la ora actuală este în mare parte abandonată, constă în
determinarea aglutinarii pe lamă a stafilococilor, proveniţi dintr-o cultură de 24 de ore la
37oC pe geloza înclinată, în prezenţa unei picături de plasmă umană diluată 1/5.
Metode moderne
Lipsa standardizării, riscul bio-contaminării personalului de laborator şi
posibilitatea reacţiilor neconcludente sub influenţa diferiţilor factori individuali în cazul
metodei clasice sus-amintite a făcut ca, la ora actuală, să fie comercializate şi puse la
dispoziţia laboratoarelor suspensii standardizate de hematii de berbec sensibilizate cu
fibrinogen uman purificat (ex. Staphyslide Test, Bio Merieux, Franta; Staphyloslide -
BBL, USA etc).
Ca tehnică, în paralel cu un martor negativ de control, se pune în contact o
picătură de reactiv anti-stafilococic şi o colonie de talie mijlocie din tulpina de testat
recoltată cu ansa de pe suprafaţa mediului de cultură gelozat.
Timp de 10-15 secunde se imprimă lamei o uşoară mişcare de rotaţie.
 O reacţie pozitivă se traduce prin apariţia unei aglutinări sub formă de grunji.
Reacţia este neinterpretabilă dacă reactivul de control prezintă aglutinare. O reacţie
negativă, deci lipsa factorului de afinitate pentru fibrinogen, este evidenţiată prin absenţa
aglutinării (figura 12).

Clumping factor test

Test pozitiv: Test negativ:

Staphilococcus Staphilococcus
aureus epidermidis

Figura 12: Identificarea coagulazei legate (evidenţierea factorului de afinitate pentru

fibrinogen) (sursa: http: //www.2 ac-
lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/tests_microbiologie 2.htm)

• Testul fibrinolizinei. Se efectuează pe un mediu alcătuit din 7 părţi geloză şi o parte

plasmă oxalatată care se adaugă la geloza topită şi răcită la 50°C. După însămânţarea
tulpinii izolate şi incubarea la 37°C se observă o zonă clară în jurul coloniilor prin
topirea de către fibrinolizină.

Teste de patogenitate in vivo

Există tehnici prin care se testează patogenitatea stafilococilor pe animale de

laborator (iepure, pisoi) care, însă, astăzi, nu mai sunt de actualitate:

- testul dermonecrotic (inoculare intradermică) şi testul letal (inoculare intravenoasă) la

iepure;
- testul Dolman: inoculare intraperitoneală la pisoi de 3-6 săptămâni, a filtratului de
cultură fiert 30 de minute la 100°C (evidenţiază enterotoxina ce este produsă de anumite
tipuri de stafilococi capabile să producă toxiinfecţii alimentare).
 Mai nou detectarea toxinogenezei stafilococilor este apanajul
laboratoarelor de specialitate (Institutul Ion Cantacuzino - Bucuresti, laboratoare
de igiena si supraveghere antiepidemica etc.). Se utilizeaza truse standardizate
comercializate de diferite firme pentru evidentierea productiei de enterotoxine
stafilococice (Oxoid, Ridascreen Germany etc.). Medodele utilizate au la baza fie
tehnica ELISA, fie reactii cromogenice, fie reactii de aglutinare pasiva inversata
(reversed passive latex agglutination - RPLA).

2.3.5. Sensibilitatea la bacteriofagii litici (lizotipia)

Lizotipia constă în determinarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la
acţiunea litică a unor bacteriofagi. Este metoda cea mai utilizată în epidemiile cu S.
aureus. Setul de bază de bacteriofagi folosiţi şi metodologia de lucru sunt standardizate şi
revizuite periodic sub controlul Comitetului Internaţional pentru Lizotipia Stafilococilor
cu sediul la Colindale (Anglia) încă din 1950. În 1998 acest comitet a stabilit setul de
bază internaţional al bacteriofagilor utilizaţi pentru tiparea S. aureus de provenienţă
umană, la recomandarea Subcomitetului OMS pentru Lizotipia Stafilococului. Utilizarea
acestor seturi standardizate de bacteriofagi permite exprimarea unitară la scară
internaţională a diferitelor lizotipuri. care definesc urmatoarele grupe litice :
 Grupul I (29/52//52A/79/80); Grupul II (3A/3C/55/71);
 Grupul III (6/42E/47/53/75/77/83A/84/85); Grupul V (94/96);
 Grupul Miscellaneous (81/95); Grupul experimental (88,89,90,HK2,
D11);
 Grupul aditional (69,73,78,42B, 47C,52B).
Prima citire a acţiunii fiecărui fag, tradusă prin prezenţa sau absenţa

plajelor de liză, se face dupa 24 de ore de incubare la 30oC, iar a doua citire după

menţinerea placilor timp de 24 de ore la temperatura camerei (laboratorului).

Rezultatul acţiunii fiecarui fag se traduce prin prezenţa sau absenţa plajelor

de liză.

Pe plan epidemiologic se consideră că două tulpini sunt diferite dacă ele

variază prin cel puţin două atacuri fagice puternice (lize confluente).

Tulpinile de stafilococ de origine umană fac parte în majoritatea lor din

grupurile fagice I şi III. Există de asemenea şi multe atacuri mixte.

Tulpinile de grup fagic II au tropism accentuat pentru ţesutul dermic, iar

cele enterotoxigene din grupurile III şi IV.

 Tulpinile de SARM sunt cel mai frecvent de grup fagic III sau nelizotipabile.

2.4. Antibiograma
Antibiograma (antibiotipia) reprezintă stabilirea caracterelor de sensibilitate

ale tulpinii bacteriene la acţiunea diferitelor antibiotice şi substanţe dezinfectante uzuale.

Spectrul de sensibilitate la antibiotice oferă informaţii preţioase asupra

circulaţiei unei tulpini pe arii restrânse, dar şi exprimarea unor caractere cu

specificitate regională sau chiar de tară.

Este obligatorie după identificarea unei tulpini recunoscute ca având un potenţial

patogen declarat sau care poate deveni patogenă în anumite situaţii clinico-
epidemiologice, în vederea instituirii unei terapii adecvate. Coroborarea cu datele
clinice e DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE
STREPTOCOCI
Manifestările clinice determinate de streptococi includ:
- infecţii acute supurative (angina eritematoasă, sinuzite, otite, mastoidite, endocardite,
pneumonii, bronhopneumonii etc.) şi nesupurative (scarlatina);
- complicaţii: glomerulonefrita acută difuză, reumatismul articular acut, cardita
reumatismală, eritemul nodos, coreea Hungtington.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului)
şi imunobiologic (confirmă diagnosticul etiologic, diagnostichează complicaţiile
poststreptococice, urmăreşte eficienţa tratamentului).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice recoltate pot fi: exudat faringian, exudat nazal, spută, LCR,
puroi, exudat pleural, secreţie otică, secreţie vaginală, secrceţie de col uterin, sânge,
urină, material necroptic.
Recoltarea produselor patologice trebuie să se facă înainte de începerea oricărui
tratament cu antibiotice, înainte de toaleta de dimineaţă şi înainte de masă.
Însămânţarea produselor patologice trebuie să se facă în cel mult 1-2 ore de la
recoltare.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examen direct:
Frotiul efectuat din produsul patologic, în scop orientativ, are importanţă pentru
produsele normal sterile; se efectuează 2 frotiuri: unul colorat Gram şi celălalt albastru
de metilen, ultimul important pentru studiul elementelor celulare.
Coloraţia Gram evidenţiază: coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în lanţuri,
nesporulaţi, floră de asociaţie (alţi coci sau bacili), polimorfonucleare (PMN), celule
epiteliale întregi sau detritusuri (figurile 1, 2 şi 3).
 În cazul exudatului faringian, frotiul serveşte numai pentru diagnosticul diferenţial
(pentru eliminarea altei etiologii microbiene).
De remarcat faptul că pe un astfel de frotiu nu se poate face diferenţierea între
streptococii hemolitici şi streptococul viridans, un comensal obligatoriu al căilor
respiratorii superioare.

Figura 1: Streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations

usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Figura 2: Streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations

usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993
 Figura 3: Streptococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.2. Izolare in vitro

Se utilizează următoarele medii de cultură: medii de imbogăţire - mediul Picke
(cristal violet şi azidă de sodiu), medii de izolare complexe (bulion glucozat, geloză
sânge).
Însămânţarea produsului patologic se face: fie în suprafaţa mediilor, fie în
condiţii de semianaerobioză pentru produsele patologice lichide din cavităţi închise
(puroi otic, mastoidian, sinusal, LCR). Produsul patologic se depune la fundul unei plăci
goale, peste care se toarnă sânge sau se incubează în atmosferă de CO2 5%.
Urmează incubarea la 370C 18-20 de ore şi etapa de identificare.
Tampoanele introduse în mediul de îmbogăţire se incubează 3-5 ore la 37 0C, după
care se fac treceri pe geloză-sânge, care se incubează 18-20 de ore la 370C.

2.3. Identificare
2.3.1. Caractere de cultură
Medii lichide: tulbură uşor mediul cu formarea unui depozit;
Pe medii solide: pe geloză sânge streptococul de grup A poate să determine:
• colonii mucoide: colonii rotunde, cu suprafaţa convexă, lucioase, de consistenţă
mucoasă, filantă; sunt caracteristice streptococilor încapsulaţi, virulenţi şi cu proteină
M;
• colonii „mtt“: colonii turtite, apoase, cu suprafaţa neregulată, mamelonată, cu
tendinţă de confluare (aspect de hartă geografică);
• colonii „glossy“: colonii rotunde, bine delimitate, mici, lucioase, cu suprafaţă
conică; corespund streptococilor neîncapsulaţi, cu conţinut variabil de proteină M;
• colonii „rough“: colonii turtite, uscate, cu margini dinţate şi cu suprafaţă rugoasă,
care se detaşează în totalitate de pe suprafaţa mediului, lăsând pe locul respectiv o
amprentă;
 Pe acelaşi mediu (geloză sînge) streptococii pot să determine sau nu hemoliză,
care poate fi (figurile 4, 5, 6, 7, 8 şi 9):
- β hemoliză: coloniile sunt înconjurate de o zonă completă, clară, de hemoliză, cu
diametrul variabil în raport cu grupul antigenic;
- α hemoliză: coloniile sunt înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu
înverzirea mediului şi a coloniei. După menţinerea peste noapte la +40C poate să mai
apară la exterior un alt inel de hemoliză completă.

Figura 4: Beta hemoliză. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology -

Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 5: Beta hemoliză. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986
Figura 6: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo
Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)
- α’ hemoliză: colonii înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu aspect voalat,
înceţoşat. Îi spune hemoliză incompletă pentru că în zona de hemoliză din jurul coloniei
se observă hematii intacte, nelizate.
- γ hemoliză: dată de streptococi nehemolitici.
Streptococii de grup A sunt streptococi β-hemolitici.

Figura 7: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo

Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Figura 8: Streptococi alfa-hemolitici (http //www. Lab Index,

Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

2.3.2. Caractere morfologice

 Frotiul din cultură evidenţiază coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în lanţuri,
capsulaţi, nesporulaţi (figurile 10 şi 11).

2.3.3. Caractere biochimice

• Testul sensibilităţii la bacitracină
Diferenţiază streptococii β-hemolitici de grup A de cei β-hemolitici non-grup A.
Se prelevă 3-4 colonii β-hemolitice sau o ansă din cultura în bulion. Se etalează
inoculul pe placa cu agar-sânge. Se plaseză apoi în centrul ariei însămânţate un disc cu
bacitracină. Se incubează 18-20 de ore la 370C (figurile 12 şi 13).

Figura 9: Tipuri de hemoliză (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-
5)

Figura 10: Frotiu din cultură - streptococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,
1986
 Figura 11: Frotiu din cultură - streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par
colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Test pozitiv: zonă de inhibiţie cu diametrul de minim 11 mm în jurul discului.

Test negativ: zonă de inhibiţie cu diametrul mai mic de 11 mm sau lipsa zonei de
inhibiţie în jurul microcomprimatului cu bacitracină.
Streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracină.

Test negativ la bacitracină - streptococ, dar nu beta-

hemolitic grup A

Test pozitiv la bacitracină

- streptococ beta-
hemolitic grup A

Figura 12: Testul la bacitracină. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986
 Test negativ
Test pozitiv

Figura 13: Testul la bacitracină. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,
Edward J. Bottone 1979

• Testul CAMP
Se foloseşte pentru identificarea streptococilor de grup B. Streptococii de grup B
produc un factor difuzibil, factorul CAMP, care acţionează sinergic cu β-lizina
stafilococică, determinând liza completă a hematiilor de berbec sau de bou.
Se însămânţează un striu din tulpina indicatoare de stafilococ auriu pe un
diametru al plăcii. Tulpinile de testat şi tulpinile martor se însămânţează în striuri fine,
liniare, de cca 2 cm lungime, perpendicular pe striul tulpinii indicator, dar fără a o atinge.
Se incubează plăcile la 370C peste noapte.
Test pozitiv: lărgirea cuneiformă în vârf de săgeată sau în flacără a ariei de
hemoliză produsă de cultura stafilococului (figura 14).
Test negativ: nici o modificare a hemolizei.
Testul poate fi pozitiv şi pentru alte grupuri: E, P, U, V.

Figura 14: Testul CAMP (http//www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p. 45)

• Testul PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphtylamidă)

 Diferenţiază streptococii de grup A , de cei β-hemolitici non-grup A. Este mai
specific decât testul la Bacitracină.
Streptococii β-hemolitici de grup A hidrolizează substratul PYR în L-pirolidonă şi
β-naphtylamidă, care prin reacţie cu reactivul PYR (p-dimetilamino-cinamaldehidă) dă
culoare roşie.
Se suspensionează o ansă încărcată cu cultură într-un tub cu bulion PYR. Se
incubează 4 ore la 370C, apoi se adaugă o picătură de reactiv PYR.
Test pozitiv: culoare roşie - purpurie după 2 minute de la adăugarea reactivului
PYR.
Test negativ: apariţia oricărei culori.

• Testul SXT (sulfametoxazol-trimetoprim)

Este folosit pentru diferenţierea streptococilor de grup A şi B, de ceilalţi
streptococi β-hemolitici; majoritatea streptococilor de grup A şi B sunt rezistenţi la SXT
atunci când sunt incubaţi în atmosferă normală.
Se prelevă 2-3 colonii sau o ansă din cultura pură şi se însămânţează o placă cu
agar-sânge. Se depune în mijlocul ariei însămânţate un disc cu SXT. Se incubează peste
noapte în atmosferă normală la 370C.
Test pozitiv (germeni sensibli la SXT): orice zonă de inhibiţie în jurul discului cu
SXT. Ex: streptococii de grup C ori G.
Test negativ (rezistent la SXT): creştere până la disc. Exemplu: streptococii de
grup A ori B.

• Testul bilă-esculină
Se foloseşte pentru identificarea streptococilor de grup D şi a enterococilor,
fiind probabil testul cel mai fidel.
Enterococii şi streptococii de grup D cresc pe mediul cu 40% bilă şi hidrolizează
esculina cu eliberare de glucoză şi un compus neglucidic (esculetina-dihidroxicumarina),
care reacţionează cu sărurile de fier dând naştere unui produs de culoare neagră.
Se însămânţează cu 1-3 colonii panta mediului agar-esculină sau jumătatea unei
plăci cu agar bilă-esculină. Se incubează la 370C peste noapte şi încă 24 de ore în cazul
unui rezultat negativ.
Test pozitiv: creşterea şi înegrirea mediului din placă sau a cel puţin ½ din pantă.
Test negativ: lipsa de înegrire a mediului din placă sau a pantei.

• Testul hipuratului de sodium

Diferenţiază streptococii de grup B de alţi streptococi β-hemolitici.
Hipuricaza hidrolizează hipuratul de sodiu în benzoat de sodiu şi glicină.
Ninhidrina dezaminează oxidativ glicina, rezultând aldehida corespunzătoare, CO2, NH3,
hidrindantina (forma redusă a ninhidrinei). NH3 dă cu ninhidrina şi hidrindantina un
complex colorat purpuriu.
Se suspensionează cultura de testat în 0,4 ml soluţie 1% hipurat de sodiu, până se
obţine o soluţie lăptoasă. Se incubează suspensia 2 ore la 370C. Apoi se adaugă 0,2 ml din
soluţia de ninhidrină şi se reincubează 10-150 minute la 370C. Se urmăreşte virajul
culorii.
Test pozitiv: culoare intens purpurie-hidroliza hipuratului.
Test negativ: culoare nemodificată.

• Testul sensibilităţii la vancomicină

Diferenţiază genurile Streptococcus şi Enterococcus care sunt sensibile la
vancomicină, de genurile Leuconostoc şi Pediococus care sunt rezistente.
Se prelevă cu ansa 5-10 colonii bine izolate sau un tampon bine scurs din cultura
de bulion. Se însămânţează ½ din placa de testare (plăci cu agar Mueller-Hinton). Se
plasează prin presare uşoară, în centrul ariei însămânţate, un disc cu vancomicină. Se
incubează peste noapte la 370C în atmosferă cu 5% CO2.
Test pozitiv (sensibilitate): apariţia oricărei zone de inhibiţie în jurul
microcomprimatului.
Test negativ (rezistenţă): creştere până la discul cu vancomicină.

• Testul toleranţei la sare

Este pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus, care se dezvoltă în
bulion cu 6,5% NaCl în 24-72 ore la 370C, în timp ce tulpinile de Streptococcus nu se
dezvoltă.
Tehnică: Pe un mediu cu 6,5% NaCl se însămânţează 2-3 colonii de
microorganism. Se incubează 3 zile la 370C, cu urmărire zilnică pentru turbiditate şi
virajul indicatorului (bromcrezol purpur).
Test pozitiv: turbiditate cu sau fără virajul indicatorului de la purpuriu la
galben. Ex. Enterococcus faecalis.
Test negativ: absenţa turbidităţii şi modificării de culoare. Ex: Streptococcus
viridans.

• Creşterea la 100C şi 450C

Enterococul se dezvoltă la 100C şi 450C, ceea ce-l diferenţiază de speciile de
Pediococcus care se dezvoltă numai la 450C sau de Leuconostoc care se dezvoltă numai
la 100C.

2.3.4. Caractere antigenice

– Identificarea grupului streptococic
Se face pe baza antigenului polizaharidic C, care împarte steptococii în
streptococi grupabili: notaţi cu literele A-W (cu excepţia literelor I şi J) şi streptococi
negrupabili, lipsiţi de antigenul de grup.
Antigenul specific de grup (polizaharidul C sau acidul teichoic) poate fi identificat
prin diferite reacţii antigen-anticorp.
Metode folosite:
• Reacţia de precipitare în tuburi de precipitare
În mediu lichid seruri imune de referinţă sunt puse să reacţioneze cu antigenul de
testat, aflat tot în faza lichidă. Extractul antigenic se poate obţine prin metoda
Lancefield (extracţie acidă la 1000C), sau metoda Fuller (extracţie cu formaldehidă la
1600C) sau prin autoclavare (15 min. La 1210C).
În tuburi de precipitare se pipetează extractul antigenic 0,1-0,2 ml într-un număr
de tuburi egal cu numărul antiserurilor de referinţă. Se pipetează apoi o cantitate egală
din fiecare antiser în tubul corespunzător, ci grijă, astfel încât cei doi reactivi să nu se
amestece (se ţine tubul înclinat şi se lasă serul să se prelingă pe peretele acestuia). Serul,
cu o densitate mai mare decât a extractului antigenic, se va depune la fundul tubului fără
ca cei doi reactivi să se amestece.
După 15 min de incubare la temperatura camerei, se urmăreşte apariţia inelului
de precipitare la interfaţa dintre cei doi reactivi. În caz de dubiu, se agită tuburile, se
incubează 2 ore la 370C şi se lasă apoi peste noapte la 40C. A doua zi se urmăreşte
depunerea de precipitat la fundul tubului, şi, în funcţie de cantitatea acestuia, se notează
rezultatele pozitive semicantitativ (de la ++++ la +).
Se recomandă pentru identificarea streptococilor β-hemolitici de grup A, B, C, F,
G, dar şi a celor non- β-hemolitici, de grup B şi D.
• Teste de aglutinare pe lamă
Sunt reacţii antigen-anticorp, care folosesc drept suport pentru anticorpii
specifici de grup fie stafilococi cu proteină A (reacţie de coaglutinare), fie particule de
latex (reacţie de latex-aglutinare). Astfel:
- Metoda coaglutinării: reacţia se efectuează pe lamă folosindu-se tulpina de identificat
(antigenul) sub forma unei suspensii obţinută prin cultivarea tulpinii de identificat în
bulion glucozat şi o trusă de antiseruri: A, B, C, F, G.
Principiul metodei: cuplarea stafilococului Cowan cu proteină A cu anticorpii
specifici antistreptococici de grup. Fragmentul Fc al anticorpilor se fixează de proteina
stafilococică, iar fragmentul Fab rămas liber reacţionează cu polizaharidul specific de
grup, dând o reacţie vizibilă macroscopic, sub forma unor grunji, cu clarificarea fazei
lichide.
- Metoda latex-aglutinării: particularitatea reacţiei este dată de faptul că anticorpii
specifici antigrup sunt fixaţi pe un suport reprezentat de particule de latex. Reacţia se
desfăşoară pe lamă, rezultatul pozitiv (corespondenţă imună) însemnând apariţia grunjilor
în faza lichidă clarificată.
Comparativ cu testul clasic al reacţiei de precipitare, testele de aglutinare pe lamă
sunt mai rapide, mai economice, cu o sensibilitate şi specificitate cel puţin egale.

– Identificarea tipului M streptococic

Streptococcus pyogenes se clasifică, după proteina M, în 80 de serovaruri M, care
pot fi identificate prin:
• Reacţia de precipitare în tuburi capilare
Principiul reacţiei este ca cel de mai sus, dar în locul tuburilor de precipitare se
folosesc tuburi capilare cu diametrul de 0,7-1 mm şi lungimea de 75-90 mm. Se înmoaie
extremitatea capilarului în antiserul de referinţă şi se aspiră o coloană de 25-30 mm de
ser. Se aspiră în mod similar, peste antiserul de referinţă, o coloană de extract antigenic
cu înălţime egală cu a celei de ser, fără a interpune vreo bulă de aer la interfaţa dintre cei
doi reactivi. Se obturează orificiul inferior prin inplantarea verticală a tubului în blocul de
plastilină.
Reacţia se citeşte după 5 min., urmărindu-se apariţia unui precipitat alburiu la
limita de separare a celor doi reactivi, pe fond întunecat.

– Identificarea tipului T streptococic

Pe baza proteinei T, Streptococcus pyogenes este împărţit în 28 serovaruri T, care
se identifică prin :
• Reacţia de aglutinare pe lamă
Se efectuează între serurile anti-T adsorbite şi suspensia tulpinii de identificat
cultivată în bulion (vezi tehnicile de aglutinare de mai sus).

Observaţie: Ultimele date de literatură fac diferenţiere între streptococii de grup D şi

enterococi, considerându-se că enterococii fac parte dintr-un gen separat de genul
Streptococcus, şi anume genul Enterococcus.

Alte metode de detectare rapidă a antigenului streptococic:

- detectarea directă din exudatul faringian a streptococilor de grup A: există truse
comerciale cu reactivi care pot realiza extracţia enzimatică sau chimică a polizaharidului
specific de grup A şi detectarea antigenului extras prin reacţii de aglutinare sau reacţii
ELISA;
- detectarea streptococului de grup B direct din prelevate placentare, uterine, cervicale;
- detectarea antigenelor streptococice de grup A, B, C, D, F din hemoculturi;
- detectarea directă a streptococilor de grup A din exudatul faringian sau a
streptococilor de grup B din hemoculturi prin utilizarea de sonde nucleotidice (sonde
ADN comercializate pentru aceşti germeni).

2.4. Antibiograma
Nu se efectuează pentru că, deşi infecţiile streptococice s-au tratat cu penicilină,
până acum nu s-au semnalat cazuri de rezestenţă ale acestuia la penicilină.
Antibiograma se efectuează doar la persoanele alergice la penicilină.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
Are la bază investigarea răspunsului imun umoral şi celular.

Răspunsul imun umoral

In vitro
• Determinarea anticorpilor antistreptolizină O (ASLO) prin reacţia ASLO

Reacţia ASLO

Elementele reacţiei
- ser de cercetat (anticorpi antistreptolizină O ?);
 - antigen standard - streptolizina S- (SLO);
- suspensie de hematii de iepure.
Principiul reacţiei: prezenţa anticorpilor antistreptolizină O în serul de testat
neutralizează antigenul standard (SLO), care nu-şi mai manifestă efectul hemolitic asupra
hematiilor (reacţie de seroneutralizare).
Titrul reacţiei: cea mai mare diluţie de ser cu hemoliză absentă.
Titrul ASLO normal: 250 unităţi ASLO/ml. Titrul peste 250 unităţi ASLO/ml
semnifică infecţie cu streptococ beta-hemolitic grup A, fie o infecţie recentă (în urmă cu
2-3 săptămâni), fie repetate infecţii streptococice în antecedente, netratate sau incorect
tratate.
• Determinarea anticorpilor anti-MAP
Se realizează prin reacţia de latex-aglutinare.
Se fac diluţii binare ale serului de bolnav care se pun în contact cu antigenul
latex-MAP. Se agită, se incubează acoperit la 370C 2 ore, apoi se lasă la temperatura
camerei până a doua zi. Reacţie pozitivă înseamnă aglutinare vizibilă cu ochiul liber. Se
consideră titrul pozitiv peste 40 U. Anticorpii anti-MAP au o importanţă deosebită, fiind
singurii anticorpi capabili să protejeze organismul de o nouă infecţie streptococică,
dar numai faţă de acelaşi tip, imunitatea anti-M fiind specifică de tip. Anticorpii anti-
MAP apar la 3-4 săptămâni de la debutul infecţiei acute şi se menţin luni şi chiar ani de
zile.
Anticorpii anti-MAP se găsesc la titruri foarte ridicate la cei cu RAA şi cardită
reumatismală, cât şi în perioadele de acalmie, servind la diagnosticul acestor complicaţii,
în special în aceste perioade dintre pusee.
• Determinarea anticorpilor anticarbohidrat (anti-CHO)
Se efectuează prin reacţia de hemaglutinare pasivă (HAP). În această reacţie se
pun în contact serul de bolnav diluat binar, cu antigenul standard reprezentat de antigen
streptococic grup A extras prin metoda Fuller, antigen cu care se sensibilizează hematii
de berbec. Reacţia se icubează 1 oră la 370C.
Reacţie pozitivă înseamnă apariţia unei hemaglutinări pe fundul godeului,
hamaglutinare care apare sub formă de stea, faţă de martor unde hematiile sunt dispuse
omogen pe fundul godeului. Titrul pozitiv se consuderă peste valoarea de 20 U.
Anticorpii anticarbohidrat au aceeaţi semnificaţie şi evoluţie ca a anticorpilor
anti-MAP.

In vivo
IDR Dick prin care se testează susceptibilitatea la scarlatină (prezenţa sau
absenţa anticorpilor antitoxină eritrogenă). Se injectează 0,1 ml de toxină eritrogenă pe
faţa anterioară a antebraţului. La 24-48 de ore se citeşte reacţia.
Reacţie pozitivă (prezenţa unui eritem cu diametru mai mare de 10 mm) semnifică
lipsa de anticorpi protectori anti-toxină eritrogenă, deci susceptibilitatea de a face
scarlatină.
Reacţie negativă (absenţa eritemului la locul administrării toxinei eritrogene)
semnifică prezenţa anticorpilor protectori anti-toxină eritrogenă, deci un organism
protejat faşă de o astfel de infecţie.
 Fenomenul de stingere Schultz-Charlton: diferenţiază erupţia scarlatinoasă de
alte erupţii, pe baza neutralizării in vivo a toxinei eritrogene de către serul de
convalescent injectat intradermic în zona eruptivă a bolnavului suspect de scarlatină.
Dispariţia erupţiei de la locul administrării serului semnifică erupţie scarlatiniformă;
menţinerea erupţiei semnifică o altă etiologie a erupţiei decât cea scarlatiniformă.

Răspunsul imun celular

Se evidenţiază prin teste in vivo şi in vitro, dar care vor constitui obiectul de
studiu al imunologiei.
ste d DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE
PNEUMOCOC
Streptococcus pneumonie este un germen condiţionat patogen care determină:
pneumonii sau bronhopneumonii (mai frecvent la copii şi bătrâni), meningită, otită,
sinuzită, pleurită, pericardită, infecţii oculare, cutanate, abcese etc.
Pneumococii sunt germeni frecvent întâlniţi în flora orofaringiană normală,
purtătorii sănătoşi reprezentând 30-70%.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi constă din izolarea şi identificarea
germenului, ca şi efectuarea antibiogramei.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se recoltează sputa mucopurulentă, cărămizie, cu striuri sanguinolente, aspirat
traheal, exudat faringian sau nazal, sînge, LCR, lichid pleural, sucul pulmonar extras
prin puncţie albă, fragmente tisulare prelevate prin puncţii-biopsii.
Sputa, recoltată în recipiente sterile, se spală de 2-3 ori cu ser fiziologic şi se
omogenizează prin agitare (după adăugarea a câtorva perle de sticlă sterile) în scopul
îndepărtării florei bacteriene ce provine din căile respiratorii superioare, după care este
utilizată pentru efectuarea de frotiuri, însămânţări şi inoculări în şoarece.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examen direct
Frotiul efectuat direct din produsul patologic evidenţiază: coci „in diplo”,
lanceolaţi sau „în flacără de lumânare”, Gram pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, imobili.
În funcţie de produs patologic (normal steril sau normal contaminat) se poate evidenţia:
floră de asociaţie, polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale întregi sau ratatinate
(figurile 1, 2, 3, 4 şi 5).
Frotiul efectuat direct din spută evidenţiază pe lângă coci „in diplo”, Gram
pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, imobili şi macrofage alveolare abundente, eritrocite care
au transvazat la nivelul alveolelor.
 Figura 1: Pneumococi evidenţiaţi pe frotiu colorat Gram din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.2. Izolare
In vitro pneumococii nu se dezvoltă pe medii simple. Ei necesită medii
suplimentate cu ser, ascită, sânge, incubate la 37°C în atmosferă de CO2 5% (bulion cu
infuzie proaspătă de carne de bou, bulion glucozat cu thioglicolat ca agent reducător,
geloză-sânge, -ser, -ascită, iar pentru antibiogramă Muller Hinton cu sânge).

Figura 2: Frotiu colorat Gram din produs patologic - pneumococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
 Figura 3: Frotiu colorat Gram din produs - pneumococi. După Atlas de
Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F.
Acar. 1993

Figura 4: Pneumococi capsulaţi evidenţiaţi pe frotiu colorat Gram din spută. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
Figura 5: Pneumococi capsulaţi în produs patologic. După Atlas de Bacteriologie:
Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

In vivo pentru izolarea pneumococilor se utilizează şoarecele alb. După 24-48 de

ore de la inocularea intraperitoneală, şoarecele moare de septicemie, izolându-se
pneumococi în cultură pură din cord, exudatul peritoneal şi splină.

2.3. Identificare
a. Caractere cultură
Pneumococii tulbură uniform mediile lichide; după mai mult de 3-4 ore are loc
fenomenul de „autoliză”(sinuciderea corpilor bacterieni).
Pe medii solide, de tip geloză sânge, pneumococii determină colonii asemănătoare
streptococului viridans: colonii de tip „S”, mici, punctiforme, cu zonă de hemoliză
(diametrul mai mare decât diametrul coloniei) de tip alfa (incompletă cu tentă verzuie)
(figura 6 şi 7). La pneumococi, dacă iniţial coloniile sunt în „cupolă de catedrală”, pe
parcurs iau aspect de „strachină” sau „blid”(figura 8).
Caracterele culturale mai sus menţionate sunt asemănătoare streptococului alfa-
viridans, faţă de care pneumococul trebuie diferenţiat.
Figura 6: Cultură de pneumococ pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 7: Cultură de pneumococ pe geloză sânge.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986
 Figura 8: Geloză sânge: colonii de pneumococ „în strachină”.
După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

b. Caractere morfologice
Frotiul din cultură (figura 9) evidenţiază coci „in diplo”, lanceolaţi sau „în
flacără de lumânare”, Gram pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, uneori în lanţuri scurte.
Apariţia lanţurilor şi lungimea lor este corelată cu vechimea culturii, cu condiţii
nefavorabile de mediu), cu absenţa ionilor de magneziu din mediu sau cu prezenţa
anticorpilor specifici de tip.

c. Caractere biochimice
Există trei teste biochimice care diferenţiază pneumococii de streptococii viridans:
fermentarea inulinei, biloliza, sensibilitatea la optochin. Toate aceste teste sunt pozitive la
pneumococ şi negative la streptococul viridans.

Fermentarea inulinei este testată pe mediul Hiss cu inulină 1%, în prezenţa unui
indicator (roşu fenol). Se însămânţează cultura din bulion glucozat cu thioglicolat.
Reacţia pozitivă, fermentarea inulinei, este evidenţiată de virarea în galben a
indicatorului, demonstrând prezenţa pneumococului (figura 9).
 Figura 9: Frotiu efectuat din cultură de pneumococ.
După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Reacţie pozitivă
Reacţie
negativă

Figura 10: Fermentarea inulinei.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

- Biloliza sau fenomenul Neufeld constă în liza pneumococilor în prezenţa bilei,

sărurilor biliare sau acizilor biliari, substanţe care activează enzimele lipolitice ale
pneumococului. Într-o eprubetă se pune 1 ml de cultură (în bulion glucozat cu
thioglicolat) cu 1 ml bilă de bou (eprubeta din mijloc), în prezenţa unui martor
reprezentat de o altă eprubetă care conţine 1 ml cultură cu 1 ml ser fiziologic (SF)
(prima eprubetă din figura 11). După 30 de minute, în eprubeta din mijloc cultura se
clarifică, identificând pneumococul (enzimele lipolitice ale pneumococului lizează
cultura, în timp ce în prima eprubetă conţinutul rămâne tulbure.
- Sensibilitatea la optochin. Testul este asemănător cu cel la bacitracină. Tulpina de
identificat se însămânţează, în striuri foarte dese - „în pânză” - pe geloză sânge. În
centrul zonei însămânţate se aplică o rondea împregnată în soluţie de optochin. După
termostatare, dacă în jurul comprimatului apare o zonă de inhibiţie a creşterii
germenului mai mare de 20 mm, testul este considerat pozitiv, fiind identificat
pneumococul. Rezistenţa sau zonă de inhibiţie mai mică, denotă un test negativ, fiind
cazul streptococului viridans (figurile 12 şi 13).

Cultură + bilă
Martor:
→ conţinut
Cultură + SF
tulbure ⇒
→ tulbure
streptococ
Cultură + bilă →

clarificarea

conţinutului ⇒

Figura 11: Biloliza. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology -

Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 12: Sensibilitatea la optochin - test pozitiv (pneumococ). După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
 Figura 13: Sensibilitatea la optochin - test negativ (streptococ viridans). După:
Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone
1979

d. Caractere serologice (antigenice)

Pentru identificarea serotipului se pot practica: reacţia de umflare a capsulei şi
reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri polivalente şi monovalente, ultima fiind o metodă
mai accesibilă, în condiţiile creşterii incidenţei infecţiilor pneumococice.
Reacţia de umflare a capsulei este folosită pentru identificarea polizaharidului
capsular (substanţă solubilă specifică - SSS) care împarte pneumococii în peste 83
tipuri, cel mai agresiv fiind tipul 3, posesor al celei mai mari capsule.
Tehnică: se amestecă pe o lamă curată de sticlă o picătură din cultura de
pneumococ în bulion glucozat cu tioglicolat, sau din exudatul peritoneal de la şoareci
inoculaţi intraperitoneal, cu o picătură din serurile specifice de tip (preparate pe iepuri
imunizaţi cu suspensii microbiene de pneumococ) şi cu o picătură de colorant. Se acoperă
cu o lamelă şi se examinează cu imersia. În cazul corespondenţei imune între cei doi
reactanţi, capsula îşi măreşte volumul de câteva ori (2-3 ori) comparativ cu martorul
(cultură de pneumococ + o picătură de ser fiziologic + o picătură de colorant) (figurile 14
şi 15).

Reacţia de aglutinare pe lamă se face cu serul polivalent (A+B+C) şi serurile

monovalente A (1, 2 şi 3), B (4, 5 şi 6) şi C (8, 12, 14 şi 19).
Tehnică: o cultură de 24 de ore în bulion glucozat se centrifughează, sedimentul
obţinut fiind suspensionat în 1 ml bulion. Pe o lamă de sticlă se pipetează patru picături
din cultura de pneumococ, în care se adaugă câte o picătură din serul polivalent (A+B+C)
şi serurile monovalente A, B şi C. Grunjii de aglutinare vor apărea la serul polivalent şi
de exemplu la serul monovalent B. Ca urmare, pe o a doua lamă se adaugă, separat,
serurile componente ale monovalentului B, grunjii de aglutinare identificând tipul de
pneumococ.

Figura 14: Reacţia de umflare a capsulei. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology -
Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Coaglutinarea, ELISA, RIA sunt alte tehnici de identificare serologică, care

urmăresc evidenţierea polizaharizilor capsulari ai pneumococilor direct din produsele
patologice: LCR, spută, sânge.

d. Caractere de patogenitate
Se poate efectua testul in vivo prin inoculare intraperitoneală sau subcutanată la
şoarecele alb care moare prin septicemie în 24-48 de ore.
 Figura 15: Reacţia de umflare a capsulei. După A Colour Atlas of
Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.4. Antibiograma
Prin apariţia tulpinilor rezistente la antibiotice (exemplu penicilină) este
obligatorie efectuarea antibiogramei.
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE
REPREZENTANŢII GENULUI NEISSERIA

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI PRODUSE DE

MENINGOCOC
Genul Neisseria (N) cuprinde specii care populează mucoasele. Cuprinde pe lângă
specii patogene pentru om (N. meningitidis şi N. gonorrhoeae) şi specii nepatogene ce
fac parte din flora normală (N. flavescens, N. subflava, N. sicca, N. mucosa).
Meningococii sunt paraziţi strict la om, cu localizare pe mucoasa căilor
respiratorii superioare. Determină meningita meningococică sau meningită
cerebrospinală epidemică.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului,
urmată de efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice recoltate sunt: LCR (tulbure sau net purulent), sânge,
exudat faringian, exudate ale seroaselor, lichid peteşial. Toate aceste produse se
transportă la 37°C şi se însămânţează rapid, meningococii fiind germeni foarte sensibili
la variaţii de temperatură şi uscăciune şi prezentând tendinţă de autoliză.
Sângele pentru hemocultură se însămânţează direct pe medii de cultură lichide
(bulion glucozat 2%, respectând proporţia de 5% sânge).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examen direct
Din sedimentul obţinut la centrifugarea LCR, se fac frotiuri, care, în cazul
prezenţei meningococului, spre deosebire de pneumococ (tabel 1), evidenţiază:
- coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, cu concavităţile faţă în faţă, uneori
capsulaţi (capsulă vizibilă pe preparatele proaspete sau la germenii recent izolaţi),
dispuşi frecvent intracelular, imobili, la unele specii se evidenţiază prezenţa pililor;
- polimorfonucleare (PMN) în număr foarte mare (figura 1).

LCR Pneumococ Meningococ

Aspect macroscopic - uşor opalescent - intens tulbure, sub

presiune
- coci Gram pozitivi, “in - coci Gram negativi, “in
Aspect microscopic diplo”, lanceolaţi, dispuşi diplo”, reniformi, dispuşi
frecvent extracelular frecvent intracelular
- polimorfonucleare - număr extrem de mare de
polimorfonucleare
 Tabel 1: Diagnostic diferenţial între meningita meningococică şi meningita
pneumococică

2.2. Izolare
Se folosesc medii de cultură îmbogăţite - medii complexe (geloză-sânge, -ser,
-ascită, -şocolat), mediul HYL (cu adaus de antibiotice: colimicină, lincomicină), mediul
Muller-Hinton, cu incubare în atmosferă de CO2 5-10%.
Examinarea culturilor pe medii solide se face la 24 şi 48 ore, iar hemoculturile se
examinează zilnic timp de 5-7 zile prin subculturi pe medii adecvate.

2.3. Identificare
- caractere cultură: pe mediile lichide tulbură uniform mediul; geloză sânge: colonii
de tip „S”, transparente, uşor gri, fără hemoliză (figura 2);

Figura 1: Meningococi. Frotiu colorat Gram din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

- caractere morfologice: frotiu din cultură care evidenţiază coci Gram negativi, “in
diplo”, reniformi, uneori capsulaţi, nesporulaţi;
- caractere biochimice: fermentează glucoza şi maltoza (pe medii cu geloză şi 1%
zahăr, 10% ser de cal şi indicator albastru de brom timol); nefermentarea levulozei,
lactozei şi zaharozei; produce citocrom-oxidază (pe hârtie de filtru împregnată cu
tetrametilen parafenilendiamină, apariţia unei culori albastre în 3-10 secunde indică
oxidarea enzimatică a reactivului);
 Figura 2: Cultură de meningococ pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

- caractere serologice: reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri polivalente şi apoi cu

seruri monovalente. Reacţia pozitivă, apariţia grunjilor de aglutinare, indică grupul (A,
B, C, D, X, Y, Z, Z′ şi W135).

2.4. Antibiograma
Terapia cu Rifampicină, Eritromicină, Penicilină, Sulfamide sau Cefalosporine
este în general suficientă.
Tulpinile de meningococ secretoare de penicilinază sunt rare, de aceea rezistenţa
la Penicilină a meningococilor reprezintă un marker epidemiologic cu capacitate
discriminatorie bună.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI PRODUSE DE GONOCOC

Gonococul, bacterie exclusiv umană şi întotdeauna patogenă, este agentul
etiologic al gonoreei (boală cu transmitere sexuală). Poate interesa orice fel de mucoasă a
organismului uman, cum este conjunctiva (oftalmia la nou-născuţi).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului;
efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice sunt reprezentate de secreţia uretrală şi secreţia vaginală.
Ele au un aspect purulent, sunt opace, cremoase, cu tentă gălbuie, desprinzându-se
uşor.
Recoltarea se face cu ansa sau cu tamponul. La bărbaţi, prin uşoara exprimare a
uretrei, se obţine o picătură de material ce se recoltează cu ansa sau cu tamponul. La
femeie recoltarea se face din colul uterin, la cabinetul de ginecologie, având grijă să nu se
contamineze proba cu floră vaginală. Transportul se face utilizând mediul de transport
Stuart.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examen direct
Frotiurile efectuate din probele recoltate se fixează chimic (alcool metilic) 2-10
minute şi se colorează albastru de metilen şi Gram. În coloraţia Gram se prelungeşte cu
un minut acţiunea soluţiei Lugol şi se prelungeşte decolorarea cu alcool-acetonă. Se
evidenţiază (figurile 1 şi 2 ):
- coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, cu concavităţile faţă în faţă;
- floră de asociaţie bogată (alţi coci sau bacili);
- polimorfonucleare (PMN) în număr foarte mare;
- celule epiteliale, întregi sau detritusuri.
În formele cronice apare polimorfismul dimensional şi tinctorial.

Figura 1: Frotiu colorat Gram din secreţie uretrală: gonococi. După A Colour Atlas of
Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.2. Izolare
Gonococul este un germen foarte pretenţios, necesitând medii complexe (geloză-
sânge, -ser, -ascită, -şocolat; mediul HYL; mediul Muller-Hinton), cu incubare în
atmosferă de CO2 5-10%

2.3. Identificare
- caractere cultură: examinarea culturii după 24-48 de ore pe geloză sânge evidenţiază
două tipuri de colonii: unele sunt de tip „S”, mici, transparente, uşor gri „în picătură de
rouă” (virulente), iar altele sunt mari, plate, uscate, granulate (nevirulente) (figurile 3 şi
4);
 Figura 2: Frotiu colorat Gram din secreţie uretrală: gonococi. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 3: Cultură din col uterin. Stânga: mediul geloză-şocolat: mai multe tipuri de colonii. Dreapta: mediul
Thayer-Martin: cultură pură de gonococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh
Edition, Edward J. Bottone 1979

- caractere morfologice: frotiu din cultură care evidenţiază coci Gram negativi, “in
diplo”, reniformi, nesporulaţi;
- caractere biochimice: fermentează glucoza (figura 5), produce citocrom-oxidază
(testul oxidazei pozitiv) (figura 6);
- caractere serologice: PCR (polymerase chain reaction) este o metodă de determinare
a prezenţei gonococilor în urină sau LCR.

2.4. Antibiograma
 Pentru testarea sensibilităţii se foloseşte metoda difuzimetrică. Se foloseşte
mediul HYL şi suspensie microbiană. În terapie sunt indicate Penicilina, Tetraciclina,
Kanamicina. Se pot utiliza de asemenea aminociclitolii (Spectinomicină) în doză unică.

Figura 4: Gonococ - geloză sânge. După A Colour Atlas of Microbiology,

R.J. Olds 1975, 1986

Figura 5: Fermentarea glucozei gonococ. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic

Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
Test negativ Test pozitiv

Figura 6: Testul oxidazei - gonococ. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh
Edition, Edward J. Bottone 1979
e maxim DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU
ENTEROBACTERII
Enterobacteriile reprezintă o vastă familie din grupul bacteriilor Gram negative,
cu o mare variabilitate genetică (morfologică, biochimică, antigenică, de patogenitate).
Aceste microorganisme, dezvoltate în intestinul omului şi animalelor în condiţii
ecologice complexe, cu un metabolism foarte activ, sunt supuse frecvent fenomenelor de
transfer genetic (transformare, transducţie, conjugare) cu posibilitatea apariţiei atât de
populaţii bacteriene rezistente sau multiplu rezistente la antibiotice, cât şi de populaţii
bacteriene cu patogenitate crescută. Prin aceste mecanisme de recombinare in vivo,
plasticitatea enterobacteriilor este nesfârşită, cu implicaţii pe plan terapeutic,
epidemiologic şi profilactic.
Enterobacteriile sunt bacterii de formă bacilară, majoritatea mobile (imobile:
Shigella, Klebsiella), majoritatea necapsulate (excepţie Klebsiella), aerob sau facultativ
anaerobe, nesporulate.
Unele dintre ele sunt întotdeauna patogene (Shigella şi Salmonella), altele sunt
comensale, intrând în componenţa florei intestinale normale, dar la care se evidenţiază un
potenţial de patogenitate (E. coli, Proteus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter etc.).
Acestea din urmă sunt incriminate mai ales în etiologia infecţiilor tractului digestiv,
urinar, respirator şi în infecţiile intraspitaliceşti. Patogenitatea intrinsecă a
enterobacteriilor condiţionat-patogene (determinată de un bogat echipament enzimatic, de
prezenţa antigenelor de înveliş, a endotoxinei, enterotoxinei, prezenţa plasmidelor etc.) se
exacerbează atunci când statusul biologic al macroorganismului agresionat este modificat
în sensul receptivităţii, prin deficite imune, boli medico-chirurgicale de fond, tratamente
imunosupresive etc.
Majoritatea enterobacteriozelor predominent digestive precum şi a celor
extradigestive se pot complica cu bacteriemii, septicemii, şoc endotoxinic, complicaţii
severe greu de stăpânit terapeutic.

Clasificarea enterobacteriilor, care a suferit o serie de modificări în decursul

anilor, a avut la bază mai ales proprietăţile biochimice şi antigenice. În acest
sens, se admite în momentul de faţă existenţa următoarelor triburi şi genuri
(tabelul 1):
 Tribul Genul

Escherichie Escherichia
ae Shigella

Edwarsielle Edwarsiella
ae

Salmonellea Salmonella
e Arizona
Citrobacter

Klebsielleae Klebsiella
Enterobacter

Proteus Proteus
Providencia

Yersinieae Yersinia

Erwiniene Erwinia
Pectobacterium

Tabelul 1: Încadrarea enterobacteriilor

La majoritatea enterobacteriozelor, care evoluează ca boli infecţioase

acute, investigaţiile de laborator se axează pe diagnosticul bacteriologic, în timp
ce în febrele tifoide şi febrele paratifoide, boli sistemice cu evoluţie prelungită, se
practică în plus şi diagnosticul imunologic sau serodiagnosticul.

1. RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice se vor preleva cât mai aproape de debutul bolii şi în funcţie
de diagnosticul clinic, înainte ca pacientului să i se fi administrat antibiotice. Recoltarea
se face corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie.
Se recoltează:
- materii fecale (E. coli, Shigella, Salmonella) din scaunul emis spontan sau direct din
rect (sonda Nelaton); în cazul purtătorilor de Salmonella şi Shigella (elimină intermitent
germenii) se recoltează 3 coproculturi, 3 zile succesiv, după administrarea unui purgativ
salin. Prelevatele se introduc în mediul de conservare şi transport Carry-Blair;
- sânge (Salmonella) recoltat prin puncţie venoasă: pentru hemocultură şi pentru
diagnostic serologic;
- urina (Proteus, E. coli, Klebsiella) recoltată prin metoda jetului mijlociu, după toaleta
riguroasă a organelor genitale externe;
- sputa (Klebsiella pneumoniae);
- bila (Salmonella, Klebsiella) prin tubaj duodenal cu sonda Einhorn;
- puroi (Proteus, Klebsiella) recoltat în funcţie de tipul colecţiei purulente: cu ansa,
tamponul, pipeta Pasteur sau puncţionare şi aspirare cu seringa.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (MICROBIOLOGIC)

2.1. Examenul direct
Se efectuează frotiuri direct din produsele patologice, colorate Gram, cu mare
importanţă pentru produsele patologice normal sterile. Se evidenţiază bacili Gram
negativi, necapsulaţi (excepţie Klebsiella - figura 1), mobili pe preparatele native prin
prezenţa cililor - figura 2)(excepţie Klebsiella, Shigella), monomorfi, rareori polimorfi
(forme cocoide, filamentoase în cazul genului Proteus).

Figura 1: Bacili Gram negativi, capsulaţi, in diplo - Klebsiella. După Atlas de

Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F.
Acar. 1993

2.2. Izolarea
 Se realizează prin însămânţarea pe medii de cultură şi inocularea produselor
patologice la animalele sensibile de laborator (exemplu. izolarea Klebsiellei pe şoarecii
albi).
Categorii de medii de cultură utilizate:

Figura 2: Bacterii intestinale ciliate (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

- mediu de conservare şi transport: mediul semisolid Carry-Blair (thioglicolat de

sodiu, clorură de calciu, fosfat disodic) ce permite viabilitatea germenilor patogeni
aproximativ 4-6 zile;
- medii de îmbogăţire (medii lichide care favorizează înmulţirea anumitor bacterii
patogene inhibând selectiv dezvoltarea florei de asociaţie): bulion tetrationat Muller-
Kauffmann şi bulion selenit acid de sodiu pentru Salmonella;
- medii simple: bulion, geloză simplă;
- medii complexe: geloză sânge;
- medii selective (geloză, bilă sau săruri biliare, lactoză, indicator) generale (Istrate-
Meitert, Leifson, Mac-Conkey) şi speciale (Levine pentru E. coli; Wilson-Blair pentru
Salmonella typhi);
- medii diferenţiale (diferenţiază diferite tipuri de bacterii): mediul Drigalski, geloză
lactozată cu albastru de brom timol, care diferenţiază bacteriile lactozo-pozitive de cele
lactozo-negative.
2.3. Identificarea

a. Caractere de cultură
Pe medii simple solide, după incubare 24 de ore la 37°C, enterobacteriile
formează, de regulă, colonii mari, rotunde, convexe (de tip „S”), opace,
semitransparente sau transparente; cele capsulate determină colonii mucoase, filante, ″ în
picătură de miere″ (Klebsiella) (figura 3); la genul Proteus apare fenomenul de invazie
şi căţărare (figura 4).
Pe medii simple lichide: tulbură intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la
suprafaţă (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).
Pe medii simple lichide: tulbură intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la
suprafaţă (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).

Pe mediile selective coloniile au următoarele aspecte:

- pe mediul Leifson: prin fermentarea lactozei de către bacteriile lactozo-pozitive (E.
coli, Klebsiella, unele tulpini de Citrobacter) se realizează un mediu acid care determină
virajul indicatorului, coloniile aparând de culoare roşie; bacteriile lactozo-negative
(Proteus, Salmonella, Shigella) sunt necolorate, cu centru negru pentru Salmonella şi
Proteus;

Figura 3: Colonii mucoase, filante, în picătură de miere - Klebsiella pneumoniae. După: Schneierson`s
Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 4: Proteus - fenomenul de invazie. După: A Colour Atlas of

Microbiology, R.J. Olds 1975,1986
- pe mediul Istrate-Meitert: colonii de tip „S”, galbene la germenii lactozo-pozitivi (E.
coli, Klebsiella) sau, la germenii lactozo-negativi, în culoarea mediului (Proteus,
Salmonella, Shigella), opace (E. coli, Klebsiella, Proteus), semitransparente şi albăstrui
(Salmonalla), transparente şi verzui (Shigella);
- pe mediul Mac Conkey coloniile lactozo-pozitive sunt roşii, iar cele lactozo-negative
necolorate;
- pe mediul Levine: coloniile lactozo-pozitive sunt negre cu luciu metalic, cele lactozo-
negative sunt necolorate;
- pe mediul Wilson-Blair coloniile de Salmonalla sunt negre cu luciu metalic;
Salmonella typhi produce şi colonii verzi, mici, fără halou. Celelalte bacterii din această
familie se dezvoltă greu pe acest mediu, dând colonii brune;
- pe mediile diferenţiale (geloză lactozată cu albastru de brom timol), coloniile lactozo-
pozitive sunt galbene, cele lactozo-negative sunt verzui.

b. Caractere morfologice
Pentru testarea mobilităţii se efectuează fie un preparat proaspăt între lamă şi
lamelă, fie se urmăreşte mobilitatea în urma însămânţării pe geloză semisolidă (metoda
tubului în U) sau se utilizează mediul politrop MIU (figurile 5, 6, 10 şi 11).
Frotiul colorat Gram evidenţiază bacili Gram negativi, nesporulaţi, necapsulaţi
(excepţie Klebsiella) (figura 7).
 Figura 5: Mediul MIU - testarea mobilităţii.
După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Mobilitate prezentă
Urează pozitiv
Producere de
H2S
Mobilitate absentă
Urează negativ

Figura 6: Mediul MIU - testarea mobilităţii. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic

Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
 Figura 7: Bacili Gram negativi - frotiu cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

c. Caractere metabolice (biochimice)

Dintre testele biochimice care permit încadrarea în familie, trebuie menţionate:
- degradarea oxidativă şi fermentativă a glucozei (figura 8);
- reducerea nitraţilor în nitriţi;
- lipsa citocromoxidazei.
În continuare, diferenţierea triburilor şi a unor genuri şi specii se realizează prin
alte reacţii biochimice cum ar fi:
- testul indol (figura 9);
- reacţia la roşu de metil;
- reacţia Voges-Proskauer;
- utilizarea citratului ca unică sursă de carbon şi energie (figura 12);
- producerea de hidrogen sulfurat (figurile 10 şi 11);
- producerea ureazei;
- producerea lizindecarboxilazei, fenilalanindezaminazei etc.
 Fermentarea glucozei, cu
Lipsa fermentării
producere de gaz colectat în
glucozei
tubuşor Durham

Figura 8: Degradarea oxidativă şi fermentativă a glucozei

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Producerea de indol
Triptofanul din mediul de cultură este transformat (prin dezaminare) în acid indol-
carbonic şi apoi în indol (figura 9).
Tehnică: cultura de cercetat este trecută în apă peptonată cu incubare 24 de ore la
37°C; apariţia indolului se evidenţiază cu ajutorul reactivului Ehrlich, care se adaugă
peste cultură. Apariţia unui inel roşu-rubiniu la suprafaţa mediului indică prezenţa
indolului.
Se mai poate utiliza pentru demonstrarea prezenţei indolului şi mediul MIU.
Reacţia pozitivă este apreciată pe baza colorării în roşu a hârtiei indicatoare ataşate la dop
(îmbibată în prealabil în reactiv Ehrlich).
Exemple de bacterii indol pozitive: E. coli, biotipuri de Proteus, biotipuri de
Shigella.

În tabelul 2 sunt prezentate principalele caractere de diferenţiere ale genurilor mai

importante.

Testul Escherichi Sigella Salmonell Klebsiell Proteus

a a a
Indol + variabil - variabil +
Roşu-metil + + + - +
Voges Proskauer - - - + -
Utilizarea citratului - - + + variabil
Hidrogen sulfurat - - + - variabil
Lizin decarboxilază variabil - + + -
Fenil - - - - +
alanindezaminază
 Urează - - - + +

Tabelul 2: Teste biochimice diferenţiale ale principalelor genuri

O categorie importantă de medii sunt cele politrope (testează mai multe caractere
biochimice pe acelaşi tub):
- TSI (trei zaharuri cu fier) (figurile 10 şi 11);
- MIU (mobilitate, producerea de indol, urează).

Reacţie pozitivă

Mediu

control

Reacţie negativă

Figura 9: Producerea de indol. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds

1975,1986
 Klebsiella

E. coli

Mediu

neînsmânţat Citrobacter

Figura 10: Variante ale mediului TSI. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,
Edward J. Bottone 1979

Specii Proteus,
Salmonella
Proteus-specii
Salmonalla typhi
Shigella-specii

Shigella
Salmonalla
flexneri typhi

Figura 11: Variante ale mediului TSI. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,
Edward J. Bottone 1979

Urmărind identificarea bacteriilor pe baza proprietăţilor metabolice şi încadrarea

lor în gen, specie şi biotip, se mai folosesc şi alte medii de diagnostic biochimic:
- pentru urmărirea spectrului fermentativ al zaharurilor se foloseşte apa peptonată
cu adaus de diverse zaharuri şi un indicator de culoare (roşu fenol sau albastru de brom
timol) (figura 12);
- mediul Clark-Lubs pentru evidenţierea reacţiei la roşu-metil şi pentru urmărirea
reacţiei Voges-Proskauer;
- mediul cu citrat - Simmons şi mediul malonat pentru evidenţierea surselor de carbon
şi azot folosite de enterobacterii (figura 13);

Figura 12: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

Figura 13: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)
 Figura 14: Decarboxilarea fenilalaninei. După: A Colour Atlas of Microbiology,
R.J. Olds 1975,1986

- pentru demonstrarea prezenţei unor enzime cu acţiune asupra unor aminoacizi, cum
ar fi fenilalanindezaminaza (figura 14), sau lizindecarboxilaza, se foloseşte mediul
gelozat care include pe rând aminoacidul respectiv

d. Caractere antigenice (identificarea serologică)

Proprietăţile antigenice servesc pentru caracterizarea genurilor şi, în special, a
speciilor din cadrul acestora şi serotipurilor circulante într-o anumită perioadă de timp
într-o colectivitate, ţinând cont de existanţa antigenelor somatice (O), de înveliş (K şi Vi)
şi flagelare (H).
Identificarea serologică a reprezentanţilor familiei Enterobacteriaceae se
realizează prin reacţii antigen-anticorp, în care elementul necunoscut este antigenul
(antigenele bacteriei izolate) şi elementul cunoscut este reprezentat de anticorpii specifici
dintr-un ser imun standard (obţinut prin inocularea unui animal de laborator).
În acest scop se folosesc două reacţii: reacţia de aglutinare pe lamă şi în tuburi
(pentru Salmonella, Shigella, E. coli enteropatogen) şi reacţia de umflare a capsulei
(pentru Klebsiella).

Reacţia de aglutinare pe lamă se face amestecând o picătură din serul

standard cu o suspensie de germeni provenind din cultura pură a germenului de
pe mediu neselectiv. Se urmăreşte apariţia grunjilor de aglutinare care apar
numai în cazul corespondenţei imune dintre antigen şi anticorp, identificând cu
certitudine bacteria izolată. În cazul în care nu există corespondenţă imună dintre
cei doi reactanţi imuni lichidul rămâne lactescent (figura 15).
 Figura 15: Reacţia de aglutinare pe lamă. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh
Edition, Edward J. Bottone 1979

Poate exista şi o corelaţie între diferitele serotipuri de enterobacterii şi

patogenitate. Un exemplu este întâlnit la E. coli. Astfel, în infecţiile urinare s-au izolat
serotipurile O4, O7, O75, în diareea malignă a noului-născut serotipurile O55B5, O126B6.
Dintre tulpinile enteropatogene (EPEC) s-a evidenţiat O157H7 iar dintre tulpinile
enterohemoragice (EHEC) s-a identificat O26H11, O119H2.
Pentru identificarea tulpinilor patogene infantile de E. coli se practică şi tehnica
imunofluorescenţei directe. Se efectuează frotiuri din materiile fecale, care se acoperă cu
seruri fluorescente anti E. coli polivalent şi monovalente. După incubarea necasară se
citesc în lumină ultravioletă. În cazul corespondenţei imune vor apare aglutinate
fluorescente.

e. Caractere de patogenitate
Această identificare se practică în cazul reprezentanţilor genului Klebsiella şi
Shigella prin studiul patogenităţii in vivo, în urma inoculării cu prelevat din cultura
suspectă la şoarecele alb în primul caz şi prin inoculare intraconjunctivală la iepure sau
cobai, în al doilea caz (testul Serenny).
Şoarecele alb inoculat subcutanat cu un filtrat de cultură de Klebsiella moare cu
septicemie în 18-24 ore. Se izolează Klebsiella din sângele din cordul animalului prin
tehnica hemoculturii.
Testul Serenny se recomandă pentru diagnosticul complementar al tulpinilor de
Shigella izolate recent. Tehnica constă în introducerea unei anse de cultură (obţinută pe
mediu simplu) sub pleoapa unui iepure sau cobai. După 12 ore în cazul în care germenii
sunt din genul Shigella apare o congestie conjunctivală, o secreţie mucopurulentă
abundentă urmată de opacifierea corneei şi se instalează keratoconjunctivita.

f. Sensibilitatea la bacteriofagii litici (lizotipia)

Lizotiparea tulpinilor aparţinând aceleiaşi specii se efectuează pentru a elucida
problemele legate de stabilirea sursei de infecţie, a căilor de transmitere şi filiaţiei
cazurilor în enterobacteriozele epidemice (Salmonella).
 Figura 16: Lizotipia. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds
1975, 1986

2.4. Antibiograma
Datorită comportamentului variat faţă de chimioterapice a enterobacteriilor, se
impune efectuarea obligatorie a antibiogramei.

3. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
În această etapă se evidenţiază anticorpii apăruţi în serul bolnavilor, ca urmare a
infecţiei sau eventual a vaccinării.
Are la bază reacţii antigen-anticorp de aglutinare în care elementul necunoscut
este reprezentat de anticorpii din serul de bolbav, iar elementul cunoscut de antigenele
standard (reacţia Widal în salmonelozele majore).
Evidenţierea anticorpilor şi mai ales creşterea titrului la dublu între două recoltări
de ser are valoare de diagnostic de boală, dar poate depista şi purtătorii de germeni, ca şi
trecerea prin infecţii inaparente.
ă importanţă.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACILUL

KOCH
Bacilul Koch (Mycobacterium tuberculosis) este agentul etiologic al
tuberculozei, boală cu evoluţie cronică. Agentul patogen face parte din genul
Mycobacterium, alături de bacilul leprei (Mycobacterium leprae). Bacilul tuberculos se
prezintă sub trei variante: varianta hominis şi bovis (agenţii tuberculozei mamiferelor) şi
varianta avium (agentul tuberculozei păsărilor). Forme clinice de tuberculoză sunt:
pulmonară şi extrapulmonară (renală, intestinală, osteo-articulară, genitală, a seroaselor,
meningeală).
 Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului;
efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se face în funcţie de localizarea tuberculozei: spută, urină, produs de puncţie
articulară, puroi, produs de raclaj uterin, secreţie de col, produs de puncţie ganglionară,
lichid pleural şi peritoneal, LCR.
• Sputa se recoltează prin emisie spontană, dacă bolnavul e tuşitor sau prin spălătură
bronşică.
• Pentru tuberculoza renală, urina se recoltează dimineaţa, în recipiente sterile. Cu o zi
înainte de recoltare, bolnavul va reduce pe cât posibil cantitatea de lichide ingerate,
pentru a reduce volumul de urină acumulat în cursul nopţii.
• La femei, în caz de tuberculoză genitală, se recoltează sânge menstrual, secreţii ale
colului uterin, sau produs de chiuretaj uterin. La toate aceste produse e obligatoriu
adăugarea de apă distilată pentru distugerea hematiilor şi obţinerea unui sediment fără
hematii prin centrifugare.
• Lichidul cefalorahidian, lichidul pleural, lichidul peritoneal, lichidul sinovial se
recoltează prin puncţiile acestor cavităţi, respectând regulile generale de asepsie.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examenul direct
Prezintă o etapă esenţială în diagnosticul de laborator al tuberculozei şi constă în
efectuarea de frotiuri direct din produsul patologic. Produsele patologice (în special
sputa) sunt supuse în prealabil omogenizării prin tratare cu hidroxid de sodiu şi agitare
(fluidificarea produsului şi repartizarea uniformă a bacililor) şi concentrării bacililor în
stratul superior cu xilol şi apă distilată.
Se efectuează:
- „screeningul” prin fluorescenţă cu auramină şi rodamină şi examinare în ultraviolet
(puncte strălucitoare pe fondul pal-verzui al câmpului, în caz de prezenţă a bacililor
Koch). Probele pozitive trebuie controlate prin coloraţia Ziehl-Neelsen;
- baciloscopie directă prin coloraţia Ziehl-Neelsen permite diagnosticul de certitudine:
bacili roşii, dispuşi în cordoane, celelalte elemente (floră de asociaţie, polimorfonucleare,
celule epiteliale întregi sau detritusuri) albastre (figurile 1 şi 2).

2.2. Izolare:
Se face:
• in vitro pe mediul Lowenstein-Jensen (bogat în substanţe nutritive şi conţinând
verde-malahit ca inhibitor al florei de asociaţie) (figura 3) cu incubare la 37°C timp de 2
luni;
• in vivo: se utilizează cobai masculi de 400 g, se inoculează subcutanat, pe faţa
internă a coapsei 1-2 ml produs patologic.
 Figura 1: Frotiu colorat Ziehl-Neelsen din produs patologic (sursa: http //www. Lab
Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Figura 2: Frotiu colorat Ziehl-Neelsen din produs patologic (sursa: http //www. Lab
Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

2.3. Identificare
• Caractere cultură:
Pe mediul Lowenstein: colonii „R” (margini neregulate, suprafaţa mamelonată),
„conopidiforme”, uscate, alb-gălbui; cele de tip uman cresc după 14 zile, cele de tip
bovin după 30 de zile, cele atipice cresc în primele zile şi sunt colorate (figurile 4, 5, 6 şi
7).

• Caractere morfologice:
Frotiul din cultură (colorat Ziehl-Neelsen) evidenţiază bacili acido-alcoolo-
rezistenţi, roşii, uneori dispuşi în cordoane prin bogăţia de factor „cord” (factor de
patogenitate), alături de celule epiteliale, leucocite, floră de asociaţie, colorate în albastru
(figura 8).

• Caractere biochimice:
- Testul catalazei diferenţiază mycobacteriile atipice la care reacţia este pozitivă de
bacilul Koch, unde reacţia este negativă. Se acoperă coloniile obţinute pe suprafaţa
mediilor solide cu soluţie de pirocathelor, perhidrol şi apă distilată. După 2-5 minute se
face citirea reacţiei. Reacţia este pozitivă dacă se observă apariţia bulelor de gaz.

Figura 3: Mediul Lowenstein Jensen (sursa: http //www. Lab Index, Photo Atlas
Reference: p.7 Lab Text)

Figura 4: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen. După: A Colour Atlas of Microbiology,
R.J. Olds 1975, 1986
 Figura 4: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

- Testul la niacin (Konno) este utilizat pentru punerea în evidenţă a niacinei. Este o
metodă colorimetrică şi constă în punerea în contact a unei culturi de bacili vii cu o
soluţie compusă din: anilină 4% (1ml), alcool 96% (1 ml), bromură de cianogen 10%
(1ml). În cazul în care tulpina produce niacin apare o coloraţie galbenă. Este pozitiv la M.
tuberculosis (figura 9).

Figura 6: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen

(http:// wanadoo.com/images.htm)
 Figura 7: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen
(http:// wanadoo.com/images.htm)

Figura 8: Dispunerea bacililor Koch în cordoane. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic

Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Test negativ:
M. atipice Test pozitiv:
M. tuberculosis

Figura 9: Testul la niacin. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology -

Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
 Diferenţierea între M. tuberculosis şi M. bovis se mai poate face şi după una din
condiţiile de cultivare: necesarul de oxigen (figura 10).

M. bovis - microaerofil:

creşterea până la 1,5 cm de

M. tuberculosis - strict

aerob: creşterea numai la

Figura 10: Diferenţierea între M. tuberculosis şi M. bovis după una din condiţiile de cultivare: necesarul de oxigen.
După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

• Caractere de patogenitate
Animalul de elecţie pentru reproducerea experimentală a infecţiei tuberculoase e
cobaiul, care se inoculează subcutanat pe faţa internă a coapsei, iar evoluţia bolii se face
timp de 2-6 luni, după care cobaiul slăbeşte şi moare. După 10-15 zile, de sănătate
aparent deplină, cobaiul devine apatic, pofta de mâncare scade, iar la locul inoculării apar
modificări, în sensul că regiunea se împăstează, apoi devine fluctuentă, iar la nivelul
plicii inghinale se palpează un ganglion, care creşte şi se ramoleşte, abcedând. La scurt
timp sunt prinşi ganglionii regionali. La autopsie se poate observa invadarea întregului
sistem limfatic şi a viscerelor.

2.4. Antibiograma
Se efectuează prin includerea antibioticului, în diferite concentraţii, în mediul
Lowenstein-Jensen. Se însămânţează în paralel produsul patologic pe mediu cu, şi,
respectiv, fără antibiotic şi se compară rezultatele, după 2-4 săptămâni de incubare.
Chimioterapicele la care bacilul tuberculos este sensibil sunt: rifampicina,
sterptomicina, HIN, PAS, etambutol.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
Prezenţa imunităţii celulare, principala modalitate de apărare specifică
antituberculoasă, se testează prin IDR la tuberculină. Organismele infectate cu bacili
tuberculoşi reacţionează diferit faţă de tuberculină, comparativ cu cele indemne.
Intradermoreacţia la tuberculină testează răspunsul imun celular (hipersensibilitate
întârziată), faţă de tuberculină. Se injectează pe faţa anterioară a antebraţului 0,2 ml
tuberculină, dintr-o diluţie de 1/10.000. Reacţia se citeşte după 72 de ore de la injectare,
când la locul inoculării apare un eritem şi un edem cu diametru diferit, în funcţie de
gradul de răspuns imun faţă de tuberculină.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE
GERMENI AEROBI SPORULAŢI ŞI ANAEROBI
A. GERMENI AEROBI SPORULAŢI: GENUL BACILLUS
Acest gen cuprinde bacili mari, până la 10 µ , drepţi cu capete retezate, Gram
pozitivi, capsulaţi, imobili, cu spor central, care nu deformează corpul bacterian, aerobi,
facultativ anaerobi, cu aproximativ 48 de specii, patogene pentru om fiind următoarele:
۰ B. anthracis care determină boala numită antrax sau infecţie cărbunoasă;
۰ B. cereus, B. subtilis care pot cauza uneori infecţii umane.
Restul speciilor sunt saprofite, găsindu-se în mediul extern, pe tegumente şi la
nivelul colonului.
BACILUL ANTRAXULUI (BACILLUS ANTHRACIS)
Germenii sunt răspândiţi în sol, fiind germeni foarte rezistenţi în mediul exterior;
pe sol se găsesc sub formă de spori care pot fi ingeraţi în timpul păşunatului de către
animale ierbivore (boala este astfel o zoonoză); în organismul animalului sporul se
transformă în formă vegetativă care traverseză mucoasa lezată a tubului digestiv şi trece
în torentul circulator dând o boală septicemică, cu mortalitate foarte ridicată, cu
consecinţe economice grave. Omul poate interveni în lanţul epidemiologic al germenului
prin consum de carne de animal infectată sau prin contact direct cu animalele bolnave sau
pe cale respiratorie.
La om Bacillus anthracis determină infecţia cărbunoasă ce poate fi, în funcţie de
calea de pătrundere, cutanată, respiratorie, digestivă.
 Cărbunele cutanat, manifestarea cea mai frecventă, este reprezentat de pustula
malignă, localizată mai ales pe faţă, gât sau membre. La locul de inoculare apare o
veziculă cu lichid sero-sanguinolent, care se ulcerează şi se usucă, dănd naştere unei
cruste negre (cărbune).
Regiunea subjacentă leziunii prezintă un edemul alb, nedureros, gelatinos.
Dacă tabloul clinic este dominat de un edem extins, febră, stare generală toxică se
vorbeşte despre edem malign, care reprezintă o formă gravă a cărbunelui cutanat.
 Cărbunele pulmonar se manifestă printr-o pneumonie sau bronhopneumonie
hemoragică severă, cu spută hemoptoică, însoţită de stare septicemică, ce poate duce la
deces. Prognosticul este foarte grav.
 Cărbunele digestiv se manifestă sub formă de enterocolită acută, cu scaune cu
sânge, febră, stare toxică, colaps, deces.
 Meningoencefalita cărbunoasă este o formă rară, fiind aproape totdeauna mortală.
Diagnosticul de laborator vizează izolarea germenului şi reproducerea bolii la
animal şi implică următoarele etape:

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se face în funcţie de afecţiunea clinică; pentru majoritatea produselor patologice
se face înlăturarea florei saprofite prin inactivare 60 de min la 30°C, etapă ce permite
numai supravieţuirea formelor sporulate care, în condiţii optime de mediu, vor duce la
dezvoltarea formelor vegetative. Aceste produse patologice pot fi:
- serozitatea din veziculă sau pustulă, lichidul de edem;
- sânge;
 - LCR: însămânţare direct pe medii de cultură;
- spută;
- materii fecale, produs de vărsătură, alimente;
- material necroptic pentru diagnostic retrospectiv (fragmente de splină, ficat,
piele).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1 Examenul direct
 Se fac frotiuri care se colorează cu albastru de metilen sau după metoda Gram.
Pe frotiul colorat Gram se evidenţiază bacili Gram pozitivi, cu capetele tăiate
drept, izolaţi sau în lanţuri scurte de 2-3 indivizi, cu aspect de „trestie de bambus” sau
„vagoane de tren”, imobili, capsulaţi, alături de detritusuri celulare, leucocite şi floră de
asociaţie redusă.
Frotiul efectuat din leziunile vechi evidenţiază bacili necapsulaţi cu spor central
sau subterminal, cu diametrul sporului mai mic decât diametrul formei vegetative.
 Se acoperă cu ser imun fluorescent anticapsular (reacţie de imuofluorescenţă)
pentru detectarea rapidă a bacteriei cărbunoase.
 Pentru punerea în evidenţă a capsulei se pot folosi coloraţii speciale:
- coloraţia cu tuş de China;
- coloraţia Hiss (bacilul cărbunos apare cu corpul roşu şi capsula roz);
- coloraţia cu albastru de metilen învechit sau albastru de toluidină (în care
corpul bacilului este albastru, iar capsula roz);
În coloraţiile obişnuite, deoarece capsula are o afinitate slabă faţă de coloranţi, ea
apare ca un halou incolor în jurul celulei bacteriene.
 Pentru evidenţierea sporului se pot folosi coloraţii speciale, ex. coloraţia Mőller, în
care sporul se colorează în roşu.
În coloraţiile uzuale sporii nu se colorează, ci apar sub forma unei vacuole
ovalare în corpul colorat al formei vegetative.

2.2. Izolarea germenului

Pentru izolarea germenului se pot folosi medii simple (bulion simplu, geloză-
simplă, geloză-sânge) sau mediu cu cartof sau medii sintetice cu tiamină.
Bacilul anthracis nu este exigent, crescând bine pe medii simple, în condiţii de
aerobioză, la temperatura de 350C şi pH între 7,2-7,4.
Produsele care conţin floră de asociaţie se însămânţează în bulion, se incubează
24 de ore la 370C, apoi se încălzeşte cultura la 700C timp de 20-30 de minute, pentru a
distruge germenii nesporulaţi , după care se fac treceri pe geloză simplă sau geloză-
sânge.

2.3. Identificarea
a. Caracterelor de cultură
۰ În bulion simplu: Bacillus anthracis determină un depozit floconos, mediul rămânând
limpede; tulpinile de tip S tulbură uniform mediul.
۰ Pe geloză simplă: determină colonii de tip „R”: colonii mari, de 2-4 mm, albe-
cenuşii, cu suprafaţă rugoasă, cu margini neregulate datorită prelungirilor laterale
 similare şuviţelor de păr, care conferă coloniilor un aspect caracteristic de „cap de
meduză“ (figura1).
۰ Pe geloză sânge: aspectul coloniilor este identic cu cel de pe geloză simplă; bacilul
antraxului nu produce hemoliză sau la unele tulpini, după 24 de ore poate să apară o
zonă discretă de hemoliză β (figurile 2 şi 3).
۰ Pe geloză dreaptă, însămânţat prin înţepare, se dezvoltă sub forma unui „brad
inversat“.
۰ Pe mediu cu cartof se dezvoltă repede şi abundent, formând un strat alb-cenuşiu,
mat.
۰ Pe medii sintetice cu tiamină, formează colonii mici, după 24 de ore.

b. Caracterelor morfologice
Pe frotiul din cultură colorat Gram se evidenţiază bacili Gram pozitivi, cu
capetele tăiate drept, izolaţi sau în lanţuri scurte sub formă de „ trestie de bambus“, cu
un halou incolor în jurul celulei bacteriene (capsula) şi cu o vacuolă ovalară centrală, în
corpul colorat al formei vegetative (sporul) (figurile 4 şi 5).

Figura 1: Colonii de B. anthracis la microscop, x 28.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986
 Figura 2: Colonii de tip R - Bacillus anthracis.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 3: Colonii de Bacillus anthracis nehemolitice pe geloză sânge.

După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,
Edward J. Bottone 1979
 Figura 4: Frotiu din cultură colorat Gram - Bacillus anthracis
(http://www. microbes_edu.org./diagn.antrax)

Figura 5: Frotiu din cultură colorat Gram - Bacillus anthracis

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

c. Caractere biochimice
Bacillus anthracis produce catalază, fermentează fără gaz glucoza, maltoza,
fructoza; este uree negative; nu produce indol, reduce nitraţii în nitriţi, reacţia Voges-
Proskauer este pozitivă, citrat pozitiv, lichefiază gelatina, hidrolizează cazeina, produce
lecitinază, reduce albastrul de metilen din lapte.

d. Caractere de patogenitate
Inocularea subcutanată la cobai sau şoarecii de laborator generează, după 24-72
ore, o septicemie mortală. La examenul necroptic se evidenţiază la locul inoculării un
edem gelatinos, saiguinolent, viscerele sunt congestionate, sângele este de culoare închisă
şi se coagulează tardiv, splina este mărită, foarte friabilă şi de un roşu închis. În lichidul
de edem, dar mai ales în sânge, în organele toracice şi abdominale, se găsesc numeroşi
bacili încapsulaţi.

e. Caractere antigenice
Se studiază prin reacţia de precipitare în inel (termoreacţia Ascoli) cu importanţă
în diagnosticul retrospectiv al antraxului. Antigenul este reprezentat de substanţa P
capsulară de natură polipeptidică şi fracţiunea somatică polizaharidică, preparat din
fragmente de organ ale animalului suspect (splină, ficat) sub forma unui filtrat. Serul
imun standard anticărbunos se prepară pe cal.
Principiu: serul anticărbunos formează un precipitat specific în contact cu
extractele de organe provenite de la cadavre cu infecţie cărbunoasă.
Tehnică: Într-un tub de precipitare se pun 0,5-0,6 ml filtrat, iar cu o pipetă Pasteur
se întroduce încet în fundul tubului aceeaşi cantitate de ser anticărbunos, având grijă să
nu se amestece. Dacă în decurs de 5-10 min, la linia de contact a celor două lichide se
formează un inel albicios de precipitare, reacţia este pozitivă.
2.4. Antibiograma
Bacillus anthracis este sensibil la antibiotice şi sulfamide, de tipul: penicilină,
tetraciclină, eritromicină, cloramfenicol. Aceste antibiotice se asociază terapiei cu ser
anticărbunos.

B. GERMENI ANAEROBI
Germenii anaerobi sunt microorganisme al căror metabolism este incompatibil
cu prezenţa oxigenului atmosferic.
Germenii anaerobi patogeni pentru om se împart în două categorii: floră telurică
(anaerobi sporulaţi) şi floră endogenă (anaerobi nesporulaţi).
Incidenţa reală a implicării germenilor anaerobi în patologia umană nu este pe
deplin cunoscută, deoarece, în condiţiile unei recoltări şi prelucrări incorecte a produsului
patologic în care sunt prezenţi anaerobii, aceştia nu vor fi izolaţi şi identificaţi, iar
produsul poate fi etichetat „steril“.
În patologia umană mai frecvent încriminaţi sunt anaerobii nesporulaţi, care
reprezintă flora fundamentală a cavităţilor naturale şi a învelişurilor cutanate sau
mucoase.
Aceşti germeni pot determina: abces cerebral, sinuzită cronică, infecţii ale
regiunii gâtului, infecţii în sfera buco-maxilo-facială, pneumonie de aspiraţie, abces
pulmonar, bronşiectazie, empiem nechirurgical, abces hepatic, infecţii post-chirurgicale
abdominale, diverse infecţii în obstetrică-ginecologie, abces pelvian, abces vulvo-
vaginal, abcese ale ţesuturilor moi, abcese cutanate.
Germenii anaerobi sporulaţi sunt reuniţi în genul Clostridium; sunt larg
răspândiţi în sol, dar pot fi prezenţi şi în colonul omului şi animalelor. Aceşti germeni
determină boli foarte bine individualizate clinic, şi anume:
۰ Clostridium tetani: tetanosul;
۰ Clostridium perfringens, în asociere cu Clostridium novy sau
Clostridium septicum: gangrena gazoasă;
۰ Clostridium botulinum: botulismul;
۰ Clostridium difficile: enterocolita postantibiotică.
Cel mai frecvent întâlnit în patologia umană dintre aceşti anaerobi sporulaţi este
Clostridium perfringens.
Factori favorizanţi ai unei infecţii anaerobe: infecţii aerobe, diabet zaharat,
alcoolism, boală neoplazică, operaţii, angiopatie, terapie corticosteroidă, terapie
imunosupresivă, terapie aminoglicozidică (la care anaerobii sunt rezistenţi).
Particularitatea diagnosticului de laborator în infecţiile determinate de anaerobi
este dată de faptul că, obligatoriu, produsele patologice în care se suspicionează prezenţa
acestor germeni trebuie însămânţate în condiţii de anaerobioză.

Mijloace de realizare ale anaerobiozei sunt: fizice, chimice şi biologice.

Metode fizice:
• regenerarea mediilor de cultură lichide prin fierbere 30 min şi răcire bruscă;
• realizarea unui vid cu ajutorul pompei de vid ataşată la un exicator ce conţine
recipientele cu mediile însămânţate;
• evacuarea aerului din mediu, urmată de insuflarea unui amestec de gaz dezoxigenat
(N2 sau H2 în proporţie de 90-95% şi CO2 5-105).
Metode chimice
Au la bază absorbţia oxigenului din mediu cu substanţe reducătoare:
• utilizarea unui reducător chimic care se introduce în mediul de cultură. Ex: acid
tioglicolic sau tioglicolat de sodiu, iar mediile în care sunt introduce sunt mediul I sau
mediul VF;
• utilizarea reducătorului în afara mediului de cultură, într-un spaţiu închis.
Ex.: pirogalolul, livrat de Institul Cantacuzino, care se pune într-un pliculeţ din
hârtie de filtru şi se fixează pe exteriorul capacului cutiei Petri, capac care se fixează cu
pliculeţul spre interior, spre mediu.
Pentru mediile lichide se pot introduce substanţe reducătoare: glucoza, cisteina,
acidul thioglicolic.
Metode biologice
• se însămânţează pe aceeaşi placă microorganismul anaerob în vecinătatea unuia
puternic aerob (B. prodigiosus, B. subtilis);
• introducerea în mediul de cultură lichid a fragmentelor de ţesuturi de la animale de
laborator (ficat, rinichi, creier, carne tocată şi prăjită)
Anaerobioza poate fi realizată şi prin procedee combinate din cele de mai sus.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

۰ materii fecale, eşantion din aliment conservat, produs de vărsătură: C. botulinum;
۰ produs de la nivelul plăgii înţepate, tăiate care a venit în contact cu solul în care ar
putea exista sporii de bacil tetanic;
۰ fragmente de organe de cadavru: C. tetani, C. perfringens;
۰ materii fecale, secreţii din sfera puerperală, produse de puncţie a diverselor colecţii ce
evoluează cu mionecroză, secreţii din plagi accidentale sau postoperatorii: C.
perfringens;
۰ materii fecale: C. difficile;
۰ sânge pentru hemocultură: infecţii septicemice;
۰ spută sau alte secreţii ale tractului respirator;
۰ secreţii din sfera genitală;
۰ produs de puncţie aspiratoare (abces cutanat sau ale părţilor moi, abces vulvo-
vaginal) sau recoltat întraoperator în caz de abcese (cerebral, rectal, scrotal, pelvian);
۰ lichid peritoneal;
۰ produs de puncţie sinusală;
۰ produse patologice din sfera stomatologică.
Recoltarea produselor patologice trebuie să se facă cu respectarea normelor de
asepsie şi antisepsie, cu evitarea contaminării accidentale în cursul recoltării.
Pentru produsele patologice lichide se recomandă aspirarea într-o seringă din care
se evacuează aerul şi apoi acul se înfige într-un dop de cauciuc.
Însămânţarea produselor patologice trebuie să se facă în 1-2 ore de la recoltare. În
caz contrar germenii pot muri în contact cu oxigenul atmosferic.
Pentru produsele recoltate pe tampoane se recomandă utilizarea mediului de
transport Carry-Blair, în care se cufundă tamponul după recoltare.

2.DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examenul direct
Examinarea directă, macroscopică şi microscopică, a prelevatului patologic oferă
informaţii imediate, orientative, asupra prezenţei bacteriilor anaerobe. Aceste informaţii
sunt utile pentru decizia terapeutică iniţială, în aşteptarea rezultatelor de laborator.
Macroscopic, suspiciunea infecţiei cu bacterii anaerobe este sugerată de:
- miros fetid (datorat produşilor finali de metabolism);
- fragmente de ţesut necrotic ori scurgeri de culoare neagră (determinate de bacili Gram
negativi pigmentogeni anaerobi);
- prezenţa de puroi şi sânge în plagă.
Microscopia directă a produsului patologic se realizează pe frotiu colorat Gram
care evidenţiază microorganismul sau microorganismele implicare, numărul lor, prezenţa
sau absenţa celulelor inflamatorii.
♦ Anaerobii sporulaţi
Apar ca bacili Gram pozitivi groşi, de lungimi variate, cu capete rotunjite sau
tăiate drept cu spori ovalari sau sferici, subterminali, centrali sau terminali, cu
diametrul mai mare, mai mic sau egal cu corpul bacterian.
 Bacilul tetanic: bacil alungit, cu capete nerotunjite, cu spor terminal cu un diametru
ce depăşeşte diametrul corpului bacterian de 2-4 ori; sporul are un contur net refringent,
o formă rotundă, mai rar ovalară. Aspectul germenului este de „rachetă de tenis“ (figura
6);

Figura 6: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium tetani

După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

 Clostridium perfringers: bacil gros, cu capete rotunjite, Gram pozitiv. În condiţii

obişnuite de cultură sau în organismul animal. Sporulează foarte rar, sporii fiind
subterminali, clostridieni. Germenul este încunjurat de o capsulă, vizibilă în coloraţia
Gram ca un halou subţire, necolorat în jurul corpului bacterian (figurile 7 şi 8);
 Figura 7: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium perfringens
(http://www. microbes_edu.org)
 Clostridium novy (Cl. oedematiens): bacil Gram pozitiv cu spor sobterminal
clostridian, alungit şi voluminos;
 Clostridium septicum: bacil Gram pozitiv polimorf, incluzând forme de bacil,
virgulă, filamente, cu spori mari, subterminali, dând aspect navicular germenilor;
 Clostridium botulinum: bacil lung şi gros, Gram pozitiv, cu spor subterminal (figura
9).

Figura 8: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium perfringens

(http://www. microbes_edu.org)
 Figura 9: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium botulinum
(http://www. microbes_edu.org)

♦ Anaerobii nesporulaţi
Microscopia directă a acestora nu este atât de importantă ca în cazul infecţiilor
clostridiale, deoarece aceste bacterii nu au aspect morfologic deosebit, putându-se
prezenta sub formă de: coci, bacili, spirili, vibrioni, Gram pozitivi sau Gram negativi,
asemănători morfologic cu cei aerobi, dar mai pleomorfi.
I. În infecţiile determinate de bacili anaerobi Gram negativi nesporulaţi, apar
frecvent aspecte morfologice particulare formelor „L“: elemente sferice de diferite
mărimi sau forme filamentoase;
۰ Diagnosticul genului Fusobacterium se poate face direct când se întrunesc două
condiţii esenţiale: lipsa creşterii în aerobioză şi prezenţa simultană pe frotiu a 3 aspecte
morfologice determinate de deficienţele peretelui bacterian: forme bacilare, forme
filamentoase (filamentele putând prezenta umflături terminale sau mediane care se
desprind şi se transformă în sferule libere), forme sferice (figura 10).
Sferulele libere şi filamentele pot avea corpusculi metacromatici, iar sferulele
numeroase granulaţii.
۰ Diagnosticul speciilor de Bacteroides: bacili Gram negativi cu coloraţie bipolară.
Toate aceste forme particulare nu sunt obligatorii a se vizualiza în produsul
patologic; frotiurile din produsul patologic pot evidenţia doar bacili Gram negativi fără
aspecte caracteristice.
 Figura 10: Frotiu colorat Gram - Fusobacterium
(http://www. microbes_edu.org)

II. Bacilii Gram pozitivi anaerobi nesporulaţi sunt bacili ramificaţi sau neramificaţi,
izolaţi, în lanţuri sau palisade ori încrucişaţi.
۰ Propionibacterium: bacili corineformi, rar ramificaţi;
۰ Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces: bacili Gram pozitivi ramificaţi.

2.2. Izolarea germenilor anaerobi

Pentru izolarea germenilor anaerobi produsele patologice se însămânţează pe
următoarele medii:

2.2.1. Pentru reprezentanţii genului Clostridium:

 mediul VF (viande-foie) sau mediul I IC cu carne tocată regenerat;
 un agar-sânge, care poate fi:
- geloză Martin 3%, glucozată 1%, cu 10% sânge de berbec;
- agar Brucella, agar Columbia, agar infuzie cord-creier suplimentat cu extract de
levură, vitamina K1 şi 5% sânge de berbec;
- agar cu alcool feniletilic şi 5% sânge pentru inhibiţia creşterii invazive a unor
specii;
 mediul Nagler cu gălbenuş de ou (se testează producerea de lecitinază, lipază,
protează); se foloseşte în cazul probelor din abcese şi plăgi (în gangrena gazoasă).
Pe aceste medii clostridiile cultivă după 12 zile de incubare la 370C.
Pentru izolarea clostridiilor din produse contaminate însămânţarea acestor
produse patologice trebuie să se facă pe mediile agarizate menţionate mai sus,
suplimentate cu Neomicină ca agent selectiv. Aceste produse patologice contaminate
trebuie prelucrate în mod special pentru izolarea clostridiilor prin tratare cu alcool sau
inactivare termică, pentru distrugerea formelor vegetative şi menţinerea în viaţă numai a
sporilor.

2.2.2. Pentru izolarea bacteriilor anaerobe nesporulate

Se folosesc aceleaşi medii ca mai sus, la care se mai adaugă medii selective, şi
anume:
 pentru bacili Gram negativi şi cocii Gram negativi:
- agar cu sânge lacat de berbec, selectiv prin Kanamicină şi Vancomicină. În lipsa
Vancomicinei se poate folosi amestecul selectiv realizat din: Kanamicină,
Streptomicină, Neomicină, Polimixină B;
- agar-sânge-bilă, suplimentat cu antibiotice, pentru Bacteroides fragilis;
- agar-sânge-esculină pentru B. fragilis şi Bilophila;
 pentru bacili Gram pozitivi şi pentru coci Gram pozitivi: nu se foloseşte
Vancomicina ca agent selectiv, ci Kanamicina, Neomicina, Polimixina sau asocierea
Colistin cu Acid nalidixic sau Biseptol-Polimixină B pentru Mobiluncus.
Culturile însămânţate cu produse în care se suspicionează prezenţa anerobilor se
incubează la 370C şi după 48 de ore se urmăresc zilnic până la 7 zile. Un rezultat negativ
nu poate fi comunicat decât după acest interval.

2.3. Identificarea bacteriilor anaerobe

2.3.1. Caractere de cultură
2.3.1.1. Germenii din genul Clostridium
a. În bulion anaerob:
۰ Cl. tetani se dezvoltă după 24-48 de ore şi determină o tulburare uniformă a mediului,
cu degajarea a câtorva bule de gaz cu miros caracteristic de corn ars sau de materie
animală arsă şi acid butiric;
۰ Cl. perfringens se dezvotă cu extrem de mare rapiditate în mediile de cultură, mai ales
la temperaturi crescute(450C-460C), la care germenul se dezvoltă în în câteva ore. În
bulion anaerob determină tulburare şi producere intensă de gaz;
۰ Cl. oedematiens: tulbură uniform mediul, cu depunere ulterioară şi cu producere
moderată de gaz;
۰ Cl. septicum se dezvoltă rapid şi bogat, dând o producţie intensă de gaz;
۰ Cl. botulinum tulbură uniform mediul, dănd un miros uşor rânced al culturii;

b. Pe geloză în suprafaţă:
۰ Cl. tetani: creştere delicată, subţire, cu margini transparente şi, dacă mediul nu are o
concentraţie sporită de geloză, în câteva zile se întinde ca un văl uniform pe toată
suprafaţa mediului;
۰ Cl. perfringens: determină colonii în varianta S, SR, R;
۰ Cl. oedematiens: determină colonii de tip R, turtite, cu margini neregulate;
۰ Cl. septicum: dă o creştere cu aspect particular, de dantelărie fină, în extensie
continuă;
۰ Cl. botulinum: colonii cu limite neregulate, translucide, cu suprafaţă granulară şi cu o
margine în extensie continuă.

c. Pe geloză sânge:
۰ Cl. tetani: nu determină hemoliză;
۰ Cl. perfringens: produce hemoliză de tip „cald-rece“ (prima zonă de hemoliză apărută
la termostat, se înconjoară de o a doua zonă, mai largă, apărută după menţinerea în
continuare la rece-+40C) (figura 11);
۰ Cl. oedematiens: determină hemoliză;
۰ Cl. septicum: intens hemolitic;
۰ Cl. botulinum: determină colonii hemolitice.

d. Pe mediul Nagler:
۰ Cl. perfringens: colonii asemănătoare unui precipitat, înconjurate de o zonă opacă;
۰ Cl. oedematiens: acelaşi aspect al coloniilor, înconjurate de un inel strălucitor în
lumină oblică, numit strat perlat, datorat acţiunii unei lipaze;
۰ Cl. septicum: nu produce lecitinază;
۰ Cl. botulinum: produce opalescenţă şi strat perlat.

Figura 11: Hemoliză pe geloză sânge - Cl. perfringens.

După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,
Edward J. Bottone 1979

2.3.1.2. Germenii anaerobi nesporulaţi:

a. În bulion anaerob:
۰ Cocii Gram pozitivi: se dezvotă sărac şi lent, obişnuit sub formă de agregate, mai rar
cu tulburarea mediului;
۰ Cocii Gram negativi: se dezvoltă redus în mediul lichid, dar produc o foarte mare
cantitate de gaz (Veillonella);
۰ Bacilii Gram pozitivi:
- Propionibacterium: se dezvoltă abundent în bulion.
۰ Bacilii Gram negativi:
- Bacteroides: B. fragilis se dezvoltă relativ abundent în 1-2 zile;
- Fusobacterium: se dezvotă pe mediile lichide, după 2-3 zile de cultivare
depunându-se la fundul eprubetei.

b. Pe geloză-sânge:
۰ Cocii Gram pozitivi: produc colonii minuscule, transparente ca picăturile de rouă;
ulterior, după 2-3 zile, coloniile se opacifică şi se extind; obişnuit sunt nehemolitice sau
ocazional β-hemolitice (Peptostreptococcus magnus) sau pigmentate în galben-citrin,
nehemolitice (P. asaccharolyticus);
۰ Cocii Gram negativi: colonii nehemolitice;
۰ Bacilii Gram pozitivi:
 - Propionibacterium: colonii înconjurate de o zonă de hemoliză, uneori pigmentate
în roz;
- Eubacterium: colonii nehemolitice;
۰ Bacilii Gram negativi:
- Bacteroides: B. fragilis determină colonii de tip S, rotunde, uşor convexe,
transparente, regulate, înconjurate frecvent de o zonă de hemoliză, după mai multe
zile;
- Fusobacterium determină 2 tipuri de colonii:
 cu diametrul 2-4 mm, contur neregulat, cu aspectul unei piramide,
de culoare roşii-verzui, intens β-hemolitice;
 cu diametrul 2-3 mm, formă rotundă, contur regulat, suprafaţă
bombată, uneori aproape semisferice, de culoare albă-gălbuie, tardiv β-
hemolitice .

c. Pe medii solide în suprafaţă:

۰ Cocii Gram-pozitivi:
- Peptosteptococii: cresc relativ lent, după 48 de ore de incubare la 370C,
determinând colonii mici, rotunde, convexe, alb-cenuşii, opace;
- Peptostreptococcus magnus: colonii cu diametrul între 0,5-2 mm după 5 zile de
incubare, obişnuit transparente, dar pot varia între alb, cenuşiu şi gălbui, rotunde,
uşor convexe, cu suprafaţa lucioasă sau lipsite de strălucire;
- Peptostreptococcus anaerobius: creşte cel mai repede dintre toate speciile (după
24 de ore): colonii între 1-4 mm după 5 zile de incubaţie, rotunde, plate, gri, cu
centrul uşor acuminat, alburiu, cu un miros dulceag, pătrunzător;
- Peptostreptococcus asaccharolyticus: colonii minuscule, care ajung la 2-3 mm
diametru, rotunde, uşor convexe, strălucitoare;
- Peptococcus niger: colonii mici, rotunde, convexe, netede, lucioase, negre sau
măslinii, dar devin gri după expunere la aer; în culturi mai vechi de o săptămână pot
fi pigmentate în galben-muştar;
۰ Cocii Gram negativi:
- Veillonella: după 48 de ore de incubare la 370C determină colonii de 1-1,5 mm,
transparente până la opac-albe la examinarea în lumină transmisă, şi transparente
până la albastre-verzui în lumină reflectată;
- Acidaminococcus: după 48 de ore de incubare: colonii minuscule (0,1-0,2 mm),
rotunde, uşor bombate, alb-cenuşii sau aproape transparente;
- Megasphaera: 0,2-2 mm, rotunde, uşor bombate, cu margini regulate, lucioase,
până la uşor rugoase, untoase;
۰ Bacilii Gram pozitivi:
- Propionibacterium: colonii de aspect alb-sidefiu;
- Eubacterium: colonii mici, semitransparente;

d. Pe agar-sânge, selectiv prin bilă:

۰ germenii din genul Bacteroides, în speţă B. fragilis, se dezvoltă chiar mai bine pe
acest mediu decât pe suprafaţa mediului solid; dau colonii înconjurate de un precipitat
maroniu, datorită descompunerii sărurilor biliare din mediu;
e. Pe mediul selectiv agar-sânge-bilă-antibiotice (Kanamicină, Streptomicină,
Neomicină, Polimixină B) pe acest mediu nu creşte nici un alt germen anaerob, decât B.
fragilis, iar dintre cele aerobe decât unele tulpini de Proteus şi coci Gram pozitivi, care
vor fi regăsiţi în cultura aerobă.

f. Pe geloză cu sânge lacat: Bacteroides melaninogenicus se dezvotă lent în 1-2

săptămâni şi produce un pigment negru caracteristic, care poate să coloreze colonia sau să
o înconjoare sau să apară sub colonie; uneori pigmentul este brun-roşcat.

g. Pe mediul Nagler:
۰ Bacilii Gram negativi:
- Fusobacterium: produce lecitinază.

2.3.2. Caractere morfologice

2.3.2.1. Germeni anaerobi nesporulaţi:
a. Cocii Gram pozitivi:
- Peptostreptococii: coci Gram pozitivi aşezaţi în perechi, tetrade, mase neregulate
sau lanţuri;
- Peptococii: coci Gram pozitivi aşezaţi în grămezi.
b. Cocii Gram negativi:
- Coci Gram negativi cu dimensiuni reduse, aşezaţi izolaţi sau în grămezi;

c. Bacilii Gram pozitivi: morfologia rămâne numai un criteriu orientativ de diferenţiere

a acestor bacterii pentru că multe specii sunt microscopic asemănătoare.
- Actinomyces: filamente Gram pozitive, ramificate, cu aspect micelial şi extremităţi
măciucate; se pot fragmenta uşor în bacili corineformi dispuşi în Y, V, T.
- Bifidobacterium: bacili Gram pozitivi scurţi, cu capete frecvent bifurcate şi
extremităţi măciucate ori spatulate, dispuşi izolat, în lanţuri scurte, în agregate stelate,
în V sau palisade.
- Eubacterium: bacili Gram pozitivi pleomorfi:
 E. alactolyticum: bacili mai lungi, uşor încurbaţi, dispuşi frecvent
în V, asemănători păsărilor în zbor, sau aglomeraţi, sub forma „literelor
chinezeşti“;
 E. lentum: forme cocobacilare dispuse izolat, în perechi sau lanţuri
scurte;
 E. imosum: bacili cu lungime intermediară, groşi, cu extremităţi
frecvent bifurcate şi umflate, singuri, în perechi sau mici aglomerări;
- Mobiluncus: bacili Gram variabil, uşor încurbaţi, cu aspect difterimorf, sau cu
aspect semilunar sau chiar de semicerc.

d. Bacili Gram negativi:

- Bacteroides, Prophyromonas, Prevotella: bacili şi cocobacili Gram negativi
polimorfi; rareori generează forme L şi sferoplaşti; de aceea filamentele şi formele bizare
sunt numai ocazional observate; la ultimele două genuri sunt frecvente formele
cocobacilare.
- Fusobacterium: bacili Gram negativi cu un polimorfism remarcabil: bacili cu
capetele rotunjite sau ascuţite, frecvent încurbaţi şi cu umflături sferice, posibile forme
cocobacilare şi filamentoase cu incluzii granulare.

2.3.2.2. Germeni anaerobi sporulaţi: identic cu aspectul morfologic descris la examenul

direct.

Figura 12: Frotiu din cultură - Cl. tetani

(http://www. microbes_edu.org)

2.3.3. Caractere biochimice

2.3.3.1. Germeni anaerobii nesporulaţi:
۰ Cocii Gram pozitivi:
- testul sensibilităţii la Vancomicină: cocii Gram pozitivi sunt sensibili; cocii Gram
negativi sunt rezistenţi;
- testul catalazei: diferenţiază Peptococcus constant, deşi slab catalază pozitiv, de genul
Peptostreptococcus catalază negativ;
- testul coagulazei: singurul pozitiv este Peptostreptococcus indolicus;
- producerea de indol: pozitiv Peptostreptococcus asaccharolyticus.
- reducerea nitratului: pozitiv Peptostreptococcus indolicus;
- testul ureazei: pozitiv pentru unele specii de Peptostreptococcus;
- fermentarea carbohidraţilor: Peptostreptococcus fermentează zaharurile, dar unele
specii sunt azaharolitice; germenii din genul Peptococcus sunt azaharolitici.
۰ Cocii Gram negativi:
- examinare sub radiaţie ultravioletă, la 360 nm: coloniile de Veillonella au
fluorescenţă roz până la roşu, care păleşte după 2 ore; ceilalţi coci Gram negativi nu dau
colonii fluorescente;
- reducerea nitraţilor: pozitiv pentru Veillonella;
- producere de catalază: variabil Veillonella;
- fermentarea glucozei: pozitiv doar pentru Megasphaera;
۰ Bacili Gram pozitivi:
- testul catalazei: pozitiv pentru Propionibacterium;
- fermentarea zaharurilor: zaharolitici;
- producere de H2S: pozitiv Propionibacterium;
- producere de indol: pozitiv Propionibacterium;
- reducerea nitraţilor la nitriţi: negativ pentru bacilii Gram pozitivi;
- acţiunea asupra laptelui turnesolat: Propionibacterium coagulează, reduce şi acidifică
laptele turnesolat;
- hidroliza gelatinei: Propionibacterium acnes lichefiază gelatina.
۰ Bacili Gram- negativi:
- creştere pe medii cu 20% bilă: toate speciile de Bacteroides şi unele specii de
Fusobacterium;
- producere de indol: variabil pentru genul Bacteroides( pentru B. fragilis negativ);
variabil pentru Fusobacterum (pozitiv pentre F. necrophorum, negativ pentru F.
mortiferum);
- hidroliza esculinei: toţi bacilii Gram negativi hidrolizează esculina;
- fermentarea zaharurilor: Bacteroides fermentează constant glucoza, lactoza,
zaharoza, iar pe celelalte zaharuri variabil, Fusobacterium este slab zaharolitic, de
regulă fermentând glucoza şu fructoza;
- fermentarea treoninei: se evidenţiază prin producerea gazului din substratul cu
treonină, prin metoda albastrului Nil sau prin cromatografie. Testul este pozitiv pentru
Fusobacterium, şi negativ pentru Bacteroides.
- hidroliza gelatinei: Bacteroides este negativ;
- acţiunea asupra laptelui turnesolat: Bacteroides coagulează, reduce şi acidifică laptele
turnesolat;
- examinare sub radiaţie ultravioletă, la 360 nm: coloniile de Bacteroides dau
fluorescenţă roşie în lumină ultravioletă.

2.3.3.2. Germeni anaerobi sporulaţi:

- sensibilitatea la Vancomicină versus Colistin: toate clostridiile sunt rezistente la
Colistin şi sensibile la Vancomicină;
- producerea de lecitinază şi lipază: pe o placă cu mediu Nagler sau Willis-Hobbs se
repică un striu longitudinal. Se incubează anaerob la 370C. După 48 de ore se urmăreşte
producerea de lecitinază: precitat opac în mediul din jurul creşterii, iar pentru
producerea de lipază se zrmăreşte cultura o săptămână: film perlat, iridiscentpe creşterea
bacteriană şi mediul imediat adjacent. Germeni lecitinază pozitivi: Cl. perfringens, Cl.
oedematiens, Cl. botulinum; germeni lecitinază negativi: Cl. septicum;
- creşterea în lapte turnesolat sau cu broncrezol purpur: Cl. perfringens formează
cheag alveolar: laptele este iniţial redus, apoi fermentat virând spre roşu, apoi coagulat,
cheagul fiind lipit de un perete şi sfâşiat de gaze; apare un zer care se limpezeşte
complet şi totul este surmontat de un alt cheag, cu aspect buretos şi virat spre roşu
(figura 13);
- fermentarea zaharurilor: Cl. perfringens fermentează majoritatea zaharurilor; Cl.
septicum fermentează ajoritatea zaharurilor cu excepţia zaharozei; Cl. botulinum
fermentează variat zaharurile;
 Cl. tetani:
cazeificare
omogenă a
mediului
Cl. perfringens: cheag
de cazeină fragmentat
de bule de gaz - aspect
de “nor de furtună”
Cl. sporogenes:
precipitarea
cazeinei

Figura 13: Acţiunea clostridiilor pe mediul cu lapte

turnesolat. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J.
- Cl. perfringens este un puternic sulfito-reducător, înegrind rapid mediile care conţin
sulfit de sodiu şi un compus feric.

2.3.4. Caractere antigenice

- Cl. perfringens: reacţia de seoneutralizare Nagler. Pe o ½ de placă cu mediu Nagler
se acoperă cu ser antiperfringens; germenul suspicionat a fi Cl. perfringens se
însămânţează în striuri perpendiculare pe linia de demarcaţie. În caz de reacţie pozitivă
germenul se dezvoltă pe ½ fără ser şi nu apare în cealaltă jumătate. Aceeaşi reacţie poate
fi evidenţiată şi în cazul Cl. tetani (figura 14).

Figura 14: Reacţia de seroneutralizare - Cl.

tetani.
- Cl. botulinum: prezintă 7 tipuri antigenic distincte de toxină, notate A, B, C, D , E, F,
G, deşi toate provoacă aceeaşi îmbolnăvire clinică, botulismul. Toxinele sunt strict
specifice de tip, fiind neutralizate numai de antitoxinele corespunzătoare.
Evidenţierea toxinei botulinice şi determinarea tipului acesteia poartă numele de
toxinotipie.
Pentru acesta se iau 4 loturi de animale de laborator (şoareci sau cobai).
La primul lot se administrează pe cale intraperitoneală (i.p) produsul patologic
filtrat ca atare (lichid de spălătură gastrică, de vărsătură, conţinut intestinal, lichid din
conserva alimentară incriminată, serul sanguin).
La al doilea lot se administrează prudusul tot i.p., dar după ce acesta a fost ţinut
15 min la 1000C.
La al treilea lot se administrează produsul patologic după ce acesta a fost pus în
contact, înainte de administrare, cu ser anti-botulinic anti-A şi lăsat 30 min la 370C.
La al patrulea lot se administrează produsul patologic după ce acesta a fost pus în
contact, înainte de administrare, cu ser anti-botulinic anti-B şi lăsat 30 min la 370C.
Rezultatul: dacă supravieţuiesc animalele lotului II şi IV, înseamnă că este
intoxicaţie botulinică, iar toxina este de tip B, pentru că a fost inactivată de temperatură şi
serul specific anti-B.
La noi în ţară toate cazurile diagnosticate cu botulism s-au datorat toxinei
botulinice de tip B, cu o excepţie - un caz dat de toxina botulinică de tip A.

2.3.5. Caractere de patogenitate

Se bazează pe reproducerea bolii experimental la animale de laborator, mai ales în
cazul germenilor anaerobi sporulaţi, mai greu sau imposibil de realizat în cazul
anaerobilor nesporulaţi. Astfel:
- Cl. tetani. Patogenitatea bacilului tetanic este dominată de toxina tetanică, o
exotoxină capabilă să determone tetanosul experimental, după o incubaţie de numai 8
ore, indiferent de doza inoculată. Acţiunea biologică a sa se exsercită prin fixarea
exclusivă şi ireversibilă pe sistemul nervos, mai ales SNC, legându-se de gangliozizii
legaţi de cerebrozizi. Injectată la animalul de laborator (şoarece, cobai, iepure), toxina
reproduce boala, determinând o paralizie spastică, care începe de partea şi cu membrul
în care s-a injectat; membrul este fixat în extensie forţată, corpul se curbează de aceeaşi
parte; urmează generalizarea contracturilor, acesta este tetanosul ascendent. La om
tetanosul începe cu contractura muşchilor masticatori (trismus) indiferent de locul de
pătrundere al toxinei sau infecţiei tetanice, realizând tetanosul descendent, care
afectează iniţial nervul cel mai scurt şi apoi continuă cu formele generalizate.
- Cl. perfringens. Factorul principal de patogenitate îl reprezintă α-toxina, care este o
enzimă pură, lecitinaza. Ea are efect: hemolitic, dermonecrotic, letal, prin acţiunea sa
asupra lecitinei din SNC. În cazul gangrenei experimentale s-a constatat că apariţia
leziunilor hemoragice în organe reprezintă momentul când animalele nu mai sunt
recuperabile prin tratament; pe când leziunile degenerative sunt compatibile cu
vindecarea.
- Cl. oedematiens este puternic toxigen. Cultura injectată i.m. la cobai, produce un
edem palid, gelatinos la locul injectării, care prinde toate ţesuturile, de la piele până la
os. Edemul accentuat este vizibil cu ochiul liber atât la animalul de laborator, cât şi la
om.
- Cl. septicum se caracterizează printr-o extrem de mare virulenţă. Injectarea a câţiva
spori i.m. în condiţii de anaerobioză la cobai, duce la moartea animalului în mai puţin
de 24 de ore, germenul producând o hemoliză intensă în toate ţesuturile şi organele.

2.4. Antibiograma
În general germenii anaerobi sunt rezistenţi la acţiunea aminoglicozidelor; sunt
sensibili la penicilină, eritromicină, tetraciclină, metronidazol, clindamicină, cefoxitină.
Asocierea penicilină-metronidazol este deosebit de eficientă.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU
PARVOBACTERII

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU GERMENI DIN

GENUL BRUCELLA
Bruceloza, antropozoonoza cea mai răspândită de pe glob, este determinată de
germeni din genul Brucella.
Brucelele infectează numeroase specii animale (caprine, ovine, bovine, porcine,
ecvine), omul contaminându-se cu produse de la animalul bolnav (sânge, lână, piei,
produse de avort, etc). Bruceloza este o boală profesională a crescătorilor de vite,
medicilor veterinari, etc.
Din punct de vedere clinic, bruceloza umană se caracterizează prin marea
varietate a simptomelor (accese febrile neregulate cu caracter recidivant, transpiraţii,
artralgii, mialgii, dureri osoase), a complicaţiilor de natură inflamatoare şi prin durata
sa nedeterminată, variind de la 4-5 luni la 2-3 ani în medie.
Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea germenului
(diagnostic bacteriologic), dar şi pe diagnosticul imunobiologic.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

De la om sau animalul bolnav se recoltează: sânge (pentru izolare şi diagnostic
serologic), produs de puncţie sternală (pentru medocultură) şi ganglionară, în caz de
adenopatie, urină (pentru urocultură), lichid articular (în caz de artrite), bilă (pentru
bilicultură), materii fecale (pentru coprocultură), de la bovidee: produs de avort spontan,
lochii, lapte.

2. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC
Se bazează pe izolarea şi identificarea germenului.

2.1. Izolarea
Se realizează prin însămânţarea pe medii de cultură şi inocularea la animalul de
laborator.

• Însămânţarea pe medii de izolare

Hemocultura
Sângele recoltat prin puncţie venoasă (2-4 ml) se însămânţează fie pe mediu
lichid, glucozat şi citratat, fie de preferinţă, pe mediu gelozat glucozat 1%, la care se
adaugă mediu lichid glucozat 1% şi citratat 2% (tehnica Castaneda). Se procedează
astfel: mediul gelozat glucozat 1%, moale (încălzit) se toarnă în baloane Erlenmayer de
100 ml, în volum de 15 ml/balon, apoi balonul se înclină lăsându-se ca mediul să se
solidifice. După solidificare, se adaugă mediu lichid glucozat 1% (10-15 ml/balon).
Se însămânţează sângele, apoi balonul se înclină, pentru a „scălda” suprafaţa
gelozei cu mediul lichid conţinând sânge. Se incubează la 370C, repetându-se la interval
de 2 zile mişcarea de clătiare a balonului, pentru umezirea cu lichid a suprafeţei gelozei.
După 4-5 zile, în cazul prezenţei brucelelor, apar coloniile caracteristice. Alteori,
dezvoltarea brucelelor necesită un timp mai îndelungat (până la 45 zile). Incubarea se
face în paralel şi în atmosferă de CO2 5% (pentru izolarea Brucellei abortus).
UROCULTURA
Sedimentul obţinut după centrifugarea urinei (300 ml) se însămânţează după
tehnica Castaneda.
Celelalte produse patologice
Se însămânţează ca atare, în condiţiile expuse pentru hemocultură.

• Inocularea la animal
Se inoculează la un cobai pe cale intraperitoneală sau subcutanată 0,5 ml
produs/inoculare şi se observă clinic timp de 45 de zile. Se urmăresc următorii parametrii:
- izolarea şi identificarea brucelelor din ganglionii limfatici, splină, ficat, măduvă
osoasă;
- diagnosticul serologic (titrara aglutinelor în ser);
- intradermoreacţia la brucelină;
- examenul histopatologic.

2.3. Identificarea
Se face pe baza următoarelor caractere:
a. Caractere de cultură
După 3-15-45 de zile pe mediul gelozat (în tehnica Cataneda), apar colonii mici
iniţial cu diametrul de 0,25 mm şi care cresc până la 3-4 mm, rotunde, bombate, cu
margini netede, cu suprafaţă regulată, nepigmentată. În cazul Brucellei abortus,
coloniile apar numai dacă incubarea s-a făcut în atmosferă de CO2 5%.
b. Caractere morfologice
Efectuarea unui frotiu bacteriologic dintr-o colonie şi colorarea cu metoda Gram,
evidenţiază prezenţa cocobacililor gram negativi, nesporulaţi cu dimesiunea de 0,5-1,5
microni/0,5-0,7 microni (figura 1).
 Frotiu 1: Brucella suis: frotiu din cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology -
Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

c. Caractere metabolice
Caracterele biochimice permit diferenţierea tipurilor de Brucella după:
- Influenţa CO2 asupra dezvoltării microbilor: dezvoltarea Br. melitensis şi a Br. suis
se face pe mediile de cultură menţinute la termostat într-o atmosferă obişnuită de aer, în
timp ce obţinerea culturilor de Br. abortus bovis este necesară o atmosferă de CO2 în
proporţie de 5-10%.
- Modul de producere a H2S: se studiază cultivând brucelele pe medii de geloză
înclinată cu pH-6,6, tuburile având ataşată lângă dop o bandă de hârtie de filtru înmuiată
în soluţie de 10% acetat de Pb. La fiecare 24 de ore hârtia este înlocuită cu alta. După
producerea de H2S se pot diferenţia biotipurile de Brucella: Br. melitensis produce H2S
numai în primele 24 ore (sau deloc), apoi nu mai produce. Br. abortus produce H2S
timp de 48 ore, apoi încetează de a mai produce. Br. suis produce H2S continuu,
abundent, timp de 96 ore.
- Acţiunea bacteriostatică a coloranţilor: testul bacteriostatic prin coloranţi
(fuxină1/25.000 şi tiamină 1/30.000). Pe mediile la care s-au adăugat aceşti coloranţi,
brucelele cresc diferit: Br. melitensis se dezvoltă pe mediile suplimentate fie cu tionină,
fie cu fuxină; Br. abortus creşte numai pe mediu cu fuxină; Br. suis creşte pe mediu de
tionină (figura 2).
 Fuxină

Pironină

Metil-violet

Tionină

Figura 2: Identificarea speciilor de Brucella după sensibilitatea la coloranţi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere antigenice
Cele trei biotipuri de Brucella aparţin aceluiaşi serotip. Identificarea serologică se
face prin reacţia de aglutinare pe lamă, punând în contact o picătură dintr-o suspensie de
cultură suspectă cu o picătură de ser standard anti-Brucella diluat conform instrucţiunilor
(uzual 1/10). Rezultatul este pozitiv, dacă apar grunji de aglutinare vizibili.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
3.1. Teste de imunitate umorală
Se folosesc: reacţii de aglutinare, reacţia de fixare a complementului, reacţia
opsono-citofagică.

a. Reacţia de aglutinare
Este larg utilizată în diagnosticul serologic, având două variante:
• Aglutinarea lentă (Wright)
Este o reacţie de aglutinare în tuburi în care se pun în contact diluţii binare din
serul de cercetat cu o concentraţie determinată dintr-un antigen standard (antigen
Wright) reprezentat de suspensia de brucelle (10 miliarde germeni/ml) în soluţie
clorurosodică izotonă, fenolată 5%. Tuburile se agită şi se lasă la 370C timp de 24 de ore.
Rezultatul se apreciază astfel:
- reacţie negativă: suspensie tulbure, omogenă;
- reacţie pozitivă: prezenţa unui sediment în formă de umbrelă, cu lichidul de
deasupra perfect limpede; prin agitare sedimentul se desface sub formă de granule.
• Aglutinarea rapidă (Huddleson)
Este o reacţie de aglutinare pe lamă. Se foloseşte un antigen standard
(Huddelson), livrat de Institutul Cantacuzino, conţinând o suspensie densă de brucelle în
apă sărată 12%, fenolată 5% şi colorată cu verde brilliant şi cristal violet (coloraţia
suspensiei este albastru-violetă).
Reacţia se efectuează astfel: pe o lamă de sticlă se depun cu o micropipetă,
cantităţi descrescânde de ser de testat. Alături de fiecare picătură se depune câte o
cantitate determinată de antigen Huddelson. Se adaugă un martor de ser (ser + soluţie
clorurosodică izotonă) şi un martor de antigen (antigen + soluţie clorurosodică izotonă).
Cu colţul unei lame, se amestecă picătura de ser cu picătura de antigen. Se incubează la
370C timp de 1-2 minute. Rezultatul se citeşte repede, în maximum 8 minute de la
expirarea timpului de incubare.
Interpretarea:
- reacţie negativă: picătură omogen colorată, fără grunji;
- reacţie pozitivă: grunji, colorati albastru-violet.

b. Reacţia de fixare a complementului

Se efectuează după tehnica Bordet-Wassermann, folosind ser de cercetat într-o
singură diluţie, antigen standard pentru RFC (suspensie de brucelle) livrat de Institutul
Cantacuzino, diluat conform instrucţiunilor, alexină şi sistem hemolitic. RFC se
pozitivează în toate formele bolii (acută, cronică, latentă). Această reacţie dă rezultate
pozitive în 97% din cazuri.

c. Reacţia opsono-citofagică
Se realizează punând în contact: sânge proaspăt recoltat pe citrat de sodiu cu
antigen brucelos (suspensie de Brucella în soluţie clorurosodică izotonă 8,5 g%0
inactivată prin căldură 45 de minute la 700C, care conţine 4 miliarde germeni/ml). După
incubare 20 de minute la 370C se fac frotiuri, se colorează cu Giemsa şi se apreciază
gradul de fagocitoză care a avut loc, numărându-se germenii fagocitaţi în citoplasma
celulei.
După Huddelson, rezultatul determinării indicelui opsonocitofagic (I.O.C.) se
exprimă astfel în raport cu intensitatea fagocitozei:
· 0-10 = indice negativ (-);
· 11-24 = indice slab pozitiv (+): susceptibil la infecţia bruceloasă;
· 25-49 = indice pozitiv (++): infecţie probabilă, dacă mai există şi alte reacţii
specifice pozitive (aglutinare, RFC);
· 50-72 = indice intens pozitiv (+++): infecţie netă; apărarea organismului
eficientă.

3.2. Teste de imunitate celulară

Se efectuează printr-o reacţie cutanată (intradermoreacţie), care testează
hipersensibilitatea de tip întârziat (imunitatea celulară în bruceloză). Se foloseşte ca
antigen brucelina (filtrat de cultură de Brucella abortus şi suis), livrat de Institutul
Cantacuzino. Se inoculează intradermic 0,1 ml brucelină pe faţa anterioară a antebraţului.
În paralel se inoculează la celălalt antebraţ 0,1 ml bulion (martor). Citirea se efectuează la
24 şi 68 de ore.
Interpretare:
· ± = reacţie dubioasă: eritem uşor (roşeaţă), fără edem;
· + = reacţie slab pozitivă: eritem şi edem net cu diametru de 1-2,5 cm;
 · ++ = reacţie pozitivă: eritem şi edem cu diametru de 3-6 cm;
· +++ = reacţie intens pozitivă: edem cu eritem, cu diametru mai mare de 6 cm, la
care se adaugă fenomene generale (febră, cefalee, etc).
La cazurile tratate: aglutinarea şi RFC se pot negativa, dar IOC şi IDR la
brucelină rămân pozitive.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU HEMOFILI

Infecţiile umane produse de reprezentanţii genului Haemophilus sunt variate ca
manifestare şi gravitate: meningita, epiglotita, pneumonia, bronşita acută, acutizarea
bronşitelor cronice şi bronşiectaziilor, pleuropneumonia, sinuzita, otita medie acută şi
cronică, mastoidita, conjunctivita, endocardita, pericardita, osteomielita, artrita,
peritonita, hepatita, colecistita, uretrita, prostatita, orhiepididimita, vaginita, salpingita,
endometrita etc.
Speciile de hemofili izolate de la om la om sunt:
- H.influenzae;
- H.aegyptus (conjunctivitidis);
- H.haemolyticus;
- H.parahaemolyticus;
- H.dycrey;
- H.vaginalis.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se recoltează: sputa, exudat faringian, exudat nazal, spălătură bronşică, LCR,
secreţie conjunctivală, otică, uretrală, vaginală, sânge, lichid pleural, pericardic,
articular, raclaje cutanate sau mucoase, materii fecale, fragmente de ţesuturi sau organe
- în caz de intervenţii chirurgicale sau deces.
Tampoanele de recoltare trebuie să fie îmbibate în bulion înainte ca proba să fie
recoltată şi transportate rapid la laborator. Probele vor fi păstrate până la însămânţare la
temperatura laboratorului, nu în frigider, iar durata să nu depăşească 2 ore, întrucât
viabilitatea hemofililor este mult mai redusă prin uscare şi răcire.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1. Examenul direct
Se foloseşte pentru: spută, exudate, aspirate, secreţii şi sedimentul obţinut prin
centrifugarea LCR şi a exudatelor lichide, numai pentru a determina prezenţa bacililor
Gram negativ.
În efectuarea coloraţiei Gram, trebuie avută mare grijă în efectuarea decolorării,
deoarece formele cocobacilare de H.influenzae pot fi confundate în morfologie cu
pneumococii. Dacă ei se colorează bipolar, iar restul organismului să fie colorat pal, se
pot confunda cu Gram pozitivii.
Se poate efectua un test direct de umflare a capsulei cu ser de tip H.influenzae.
Imunofluorescenţa cu ser capsular conjugat cu fluoresceină este un alt mijloc
excelent de identificare a tulpinilor capsulate.
 2.2. Izolarea
Se folosesc medii în care celulele sanguine au fost lizate printr-o încălzire
uşoară (agar-chocolat şi Lewinthal) sau prin digestie peptică (agar Fildes). În astfel de
medii hemina şi NAD sunt prezente în aprox. 500 micrograme şi respectiv 150
micrograme/ml. Incubarea se face la 370C în 5-10 % CO2, timp de 18-72 de ore.

2.3. Identificarea
a. Caractere de cultură
H.influenzae dă colonii mici, gri sau semiopace, netede şi plat convexe, cu
margini regulate. Tulpinile capsulate tind să se dezvolte confluent, în contrast cu
coloniile tulpinilor necapsulate, care rămân separate. Coloniile de H.parainfluenzae pot
avea un diametru până la 3 mm după incubare de 24 de ore şi apar netede sau rugoase şi
crenelate, gri-lucioase şi semiopace. Activitatea hemolitică a hemofililior hemolitici
poate fi evidenţiată pe agar Fildas sau Lewinthal, cu 5% sânge bovin sau de cal şi agar-
sânge de la aceleaşi specii (figura 1).
În jurul coloniilor de Staphilococcus aureus dezvoltă colonii mai mari (fenomen
de satelitism), datorită suplimentului de factor V furnizat de stafilococi (figurile 2 şi 3).
b. Caractere morfologice
Frotiul colorat Gram evidenţiază cocobacili Gram negativi polimorfi. Tulpinile
virulente prezintă uneori capsulă (figura 4).
c. Caractere metabolice
Reacţiile fermentative sunt foarte valoroase pentru diferenţierea speciilor de
hemofili. Carbohidraţii cu valoare de identificare sunt: glucoza, zaharoza, lactoza, xiloza,
manitolul şi riboza.
Alte teste folosite: testul indolului, testul ureazei, activitatea decarboxilazelor şi a
betagalactozidazei. Suplimentarea mediului cu factorii X, V sau X+V diferenţiază
speciile de Haemophilus: H.influenzae şi H.aegyptus necesită factor X+V; H.ducrey
necesită numai factor X.

Figura 1: H. influenzae - cultură pe agar-cholat din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979
 Figura 2: H. influenzae - satelitism în prezenţa stafilococilor pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of
Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere antigenice
Se foloseşte identificarea serologică pentru tulpinile capsulate de H.influenzae
care pot fi diferenţiate în 6 serotipuri bazate pe 6 polizaharizi capsulaţi distincţi: a, b, c, d,
e, f. Se folosesc: reacţia de umflare a capsulei, dubla difuzie în gel de agar,
imunofluorescenţa, contraimunoelectroforeza, latexaglutinarea, aglutnarea pe lamă şi
coaglutinarea.

Figura 3: H. influenzae - satelitism în prezenţa stafilococilor pe geloză sânge.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986
 Figura 4: H. influenzae - frotiu colorat Gram din cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic
Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU BORDETELLA

PERTUSIS

Bordetella pertusis este agentul etiologic al tusei convulsive, alături de alte două
specii ale aceluiaşi gen: B. parapertissis şi B. bronchiseptica..
Etapele diagnosticului de laborator sunt:

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

- exudatul faringian cu tamponul;
- sputa prin metoda plăcii tuşite;
- sângele pentru diagnosticul serologic.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
Constă în izolare şi identificare.

2.1. Izolarea
Se face pe mediul de elecţie Bordet- Gengou (macerat de cartof glicerinat şi
gelozat cu adaus de sânge).

2.2. Identificarea

a. Caractere de cultură

B. pertussis creşte sub formă de colonii de tip “S”, mici, lucioase („picătură de
mercur”), convexe, înconjurate de alfa hemoliză (figurile 1 şi 2).
 b. Caractere morfologice
Pe frotiul colorat Gram apar sub formă de cocobacili Gram negativ, nesporulaţi,
capsulaţi, cu tendinţă de colorare bipolară, dispuşi izolat, în perechi sau scurte lanţuri.

c. Caractere biochimice
Diferenţiază cele trei specii ale genului Bordetella: alcalinizarea laptelui
turnesolat (în 12-14 zile la B.pertussis, 1-4 zile la celelalte două), producerea de urează,
utilizarea citratului (reacţii negative la B.pertussis şi pozitive la celelalte două),
transformarea nitraţilor în nitriţi (reacţie pozitivă doar la B.bronchiseptica).

Figura 1: B.pertussis pe mediul Bordet-Gengou. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic

Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere de patogenitate
La cobai (testul intradermic).

e. Caractere antigenice
Identificarea serologică se efectuează prin reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri
imune standard şi reacţia de IF directă.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC
Constă în efectuarea reacţiilor de aglutinare în tuburi şi reacţia de fixare a
complementului.
 Figura 2: B. pertussis pe geloză sânge după primă izolare pe mediul Bordet-Gengou. După:
Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIA CU

TREPONEMA PALLIDUM
Genul Treponema aparţine familiei Spirochaetaceae şi cuprinde:
a. Treponeme patogene pentru om
۰ Treponema pallidum, cu trei subspecii diferenţiate numai prin caracterele clinico-
epidemiologice ale bolilor determinate: subspecia pallidum (agentul etiologic al
sifilisului venerian), subspecia endemicum (agentul etiologic al bejelului, care
determină sifilisul endemic non-venerian ce afectează copiii şi adulţii din regiunile
deşertice africane), subspecia pertenue (agentul etiologic al pianului, responsabil de
leziuni cutaneo-mucoase la copii în zonele tropicale umede).
۰ Treponema carateum, agentul etiologic al bolii numită pinta, boală cutanată ce
afectează populaţia tânără (copii şi adolescenţi) din regiunile tropicale ale Americii
Centrale şi de Sud.

b.Treponeme saprofite
۰ Treponema genitalis şi Treponema caligryrum, întâlnite pe mucoasa genitală.
۰ Treponema microdentium şi Treponema mucosum, întâlnite pe mucoasa bucală sau
în unele infecţii locale.

c. Treponeme de interes medical

۰ Treponema Reiter: tulpină de laborator, izolată de la om, cultivată pe medii
artificiale, în condiţii de anaerobioză. Este nepatogenă şi se înrudeşte antigenic cu
Treponema pallidum, de aceea este folosită pentru prepararea unor antigene de
diagnostic serologic al sifilisului.
۰ Treponema pallidum-tulpina Nichols, tulpină patogenă de laborator a Treponemei
pallidum. Se obţine prin inocularea prelevatelor de la bolnavii de sifilis, intratesticular la
iepuri, unde generează orhita experimentală. Sifilisul experimental la iepuri reprezintă
singura posibilitate de păstrare în laborator a tulpinilor de treponeme patogene folosite
 în testele serologice de diagnostic al sifilisului.
۰ Treponema cuniculi: patogenă în mod natural pentru iepure, la care produce o
infecţie genitală, care o deosebeşte de tulpina Nichols.

Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului, boală dermato-

venerică. Transmiterea se face totdeauna prin contact sexual direct (vitalitatea
treponemelor în afara organismului uman este slabă).
După o perioadă de incubaţie silenţioasă de aproximativ 3 săptămâni (cu limite
între 2 şi 10 săptămâni), treponemele se multiplică la nivelul porţii de intrare (genitală,
anală, ocazional bucală), unele diseminând şi la nivelul ganglionilor limfatici de unde
trec apoi în marea circulaţie.
Faza primară a infecţiei se caracterizează prin apariţia şancrului sifilitic, o
papulă care se ulcerează rapid, dând o leziune superficială, nedureroasă, cu baza
indurată şi acompaniată de adenopatie satelită. Şancrul şi ganglionii sateliţi sunt bogaţi
în treponeme. Netratată, leziunea se vindecă spontan în 3-6 săptămâni, iar adenopatia se
remite puţin mai târziu.
Faza secundară corespunde etapei de diseminare a treponemelor. Ea debutează
aproximativ în două luni de la contactul infectant şi se caracterizează printr-un tablou
lezional cu localizare cutaneo-mucoasă variată (rozeole, sifilidele, plăci mucoase,
condiloame, alopecie, atingeri unghiale etc.) şi care poate fi acompaniat de micro-
poliadenopatii şi de un sindrom infecţios. Toate leziunile secundare sunt bogate în
treponeme de unde rezultă şi marea lor contagiozitate. Aceste manifestări se remit
spontan, dar recăderile se pot produce în următorii 3-5 ani.
Urmează faza de latenţă, etapă în care sifilisul este clinic asimptomatic şi
necontagios.
După o perioadă de timp variabilă, de 2 până la 10 ani, boala intră în faza terţiară
caracterizată prin atingeri viscerale, cardio-vasculare (aortitită luetică, anevrism de
aortă, insuficienţă aortică) sau neurologice (tabes, paralizie generală), asociate cu
leziuni osoase sau cutaneo-mucoase granulomatoase (goma sifilitică). În toate leziunile
terţiare treponemele sunt rare.
Etapele primară, secundară şi de latenţă reprezintă fazele precoce sau
bacteriologice ale maladiei.
Sifilisul congenital. Boala se poate transmite la făt de la o mamă cu sifilis
evolutiv. Pasajul transplacentar al Treponemei pallidum va determina o atingere sistemică
a produsului de concepţie ducând fie la moarte fetală, fie, în cazul în care copilul trăieşte,
la manifestări clinice caracteristice sifilisului congenital (leziuni cutanate buloase,
ragade, sau leziuni sistemice, precum keratita, malformaţii dentare şi nazale, periostită,
anomalii ale SNC, retard intelectual).
Treponema pallidum este un germen fragil care nu supravieţuieşte în mediul
exterior fiind adaptat strict patologiei umane.
Injecţia intratesticulară a Treponemei pallidum la iepure provoacă în câteva zile o
orhită, ţesutul inflamat fiind bogat în treponeme. Tulpina Nichols este întreţinută în acest
mod în vederea testului de diagnostic Nelson.

Diagnosticul de laborator constă în diagnostic bacteriologic minor (urmăreşte

punerea în evidenţă a Treponemei pallidum prin examen direct, posibil numai în sifilisul
primar) şi diagnostic serologic major.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Sifilisul va fi luat în discuţie în faţa unei eroziuni sau ulceraţii cu localizare ano-
genitală şi bucală, la un subiect în perioadă de activitate sexuală. Diagnosticul
bacteriologic al prelevatelor se va efectua înaintea tratamentului cu antibiotice,
treponemele dispărând în câteva ore după administrarea de penicilină.
Prelevatele vor consta din serozităţi nesângerânde de la nivelul şancrului
sifilitic, plăcilor mucoase, mai rar produs de puncţie gaglionară.

2. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC
2.1. Examenul direct
Se realizează pe preparat proaspăt şi preparat colorat.
 Preparatul proaspat se examinează între lamă şi lamelă, pe fond întunecat.
Treponemele apar sub formă de filamente foarte subţiri cu 7-13 spire strânse, regulate,
cu capetele efilate, mobile. Mişcarea lor este de rotaţie axială, pendulare, translaţie şi
flexiune (figura 1).
 Preparatul colorat. Se folosesc coloraţii precum Gram prelungit, Vago, impregnaţia
argentică (figurile 2 şi 3).
Dacă în coloraţia Gram treponemele se colorează în roz palid (de aici denumirea
de Treponema pallidum - este vorba despre o coloraţie a peretelui de tip Gram -
negativă), în impregnaţia argentică (metoda Fontana-Tribondeau), treponemele apar de
culoare neagră.
Coloraţia Vago este utilizată pentru evidenţierea Treponemelor, Leptospirelor şi
Borreliilor. Reactivii pentru colorat au avantajul de a fi mai ieftini şi mai stabili decât cei
pentru impregnaţia argentică.
Tehnica:
- Se etalează un frotiu pe o lamă port-obiect de sticlă. Nu se fixează la cald.
- Se acoperă preparatul cu o soluţie filtrată de mercurocrom 2% timp de 3-5 minute.
- Se spală cu apă distilată.
- Se colorează timp de 5 minute cu o soluţie filtrată de Verde de metil 2%.
- Se spală cu apă distilată şi se lasă să se usuce.
- Se examinează cu obiectivul cu imersie.
Bacteriile apar colorate în violet clar pe un fond aproape incolor.
Prepararea reactivilor:
- Soluţia de mercurocrom 2%. 1 g mercurocrom pulbere fină dizolvat în 50 ml apă
distilată calduţă. Se agită şi se lasă în repaus câteva minute dupâ care se filtrează. Se
conservă în flacoane de sticlă închisă la culoare, filtrând din când în când.
- Soluţia de verde de metil 2% . Într-un mojar se fărâmiţează foarte fin 1 g verde de metil,
peste care se adaugă 50 ml apă distilată fierbinte. Se agită bine, după care se lasă în
repaus; se filtrează şi se păstrează în flacon de sticlă de culoare închisă, filtrând din când
în când. Aceşti reactivi se conservă timp de o lună.
Metodele de coloraţie au dezavantajul de a deforma treponemele, de unde şi
preferinţele microbiologilor pentru examenul în imunofluorescenţă.
 Figura 1: Aspectul treponemelor la examenul direct, la microscopul cu fond întunecat.
(sursa: http://www.atlas.dermato.org./images)

Figura 2: Tr. pallidum - Coloraţie Gram

(sursa: http://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

2.2. Identificarea
Se bazează pe caracterele de patogenitate prin inocularea treponemelor la iepure
intratesticular, care în 7-14 zile face o orhită.
Identificarea se poate face şi prin examen în imunofluorescenţă atât prin tehnica
directă cât şi indirectă.
- Tehnica imunofluorescenţei directe. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-Treponema
pallidum marcaţi cu o substanţă fluorescentă (izotiocianat de fluoresceină) şi diluaţi într-
un contracolorant (albastru de Evans). După spălare frotiul se examinează în lumina
ultravioletă.
- Tehnica imunofluorescenţei indirecte. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-
Treponema pallidum nemarcaţi (umani sau animali) care se fixează pe treponeme; ca
revelator se folosesc antiglobuline fluorescente de specie (antiglobulină umană sau
animală), diluate într-un contra-colorant (figura 4).
 Prezenţa treponemelor nu semnifică totdeauna o infecţie treponemică, existând la
nivelul mucoaselor şi treponeme saprofite, după cum nici un examen negativ nu exclude
o infecţie reală.

Figura 3: Treponeme - frotiu din serozitate

(sursa: http://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

Figura 4: Treponeme - aspect în imunofluorescenţă

(http://www.primer.ru/std/ gallery_std/treponema.htm)

3. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Treponemele patogene nefiind cultivabile, dianosticul de certitudine al sifilisului
este realizat în urma examenelor serologice.
Prezenţa anticorpilor apăruţi în urma contactului organismului cu Treponema
pallidum se evidenţiază prin două mari grupe de teste:
- teste cu antigene cardiolipinice;
- teste cu antigene treponemice.
Dintre numeroasele tehnici şi variante tehnice preconizate, cele mai utilizate sunt
următoarele:
Pentru bilanţul iniţial de depistare:
۰ RPR: Rapid Plasma Reading test;
۰ VDRL: Veneral Disease Reaserch Laboratory;
۰ TPHA: Treponema Pallidum Haemagglutination Assay ( mai specifică).
Ca bilanţ complementar:
۰ TIT: testul de imobilizare a treponemelor (Testul Nelson, specific).
۰ FTA-ABS: Fluorescent Treponema Assay.

3.1. Teste cu antigene cardiolipinice

Permit identificarea anticorpilor de tip reaginic. Reacţiile nu sunt specifice,
antigenul cardiolipinic fiind prezent şi în celulele animale şi vegetale, nu numai în
membrana citoplasmatică a treponemelor.
A fost utilizat în prima metodă de determinare a sifilisului de catre Wasermann,
care a folosit reacţia de fixare a complementului a lui Bordet, de unde şi denumirea
comună dată tehnicii: reactia Bordet-Wasermann, prescurtat RBW.
Reacţia are astăzi valoare istorică: deşi încă indicată de unii medici, reacţia de
fixarea a complementului Bordet-Wasermann în diagnosticul serologic al sifilisului nu
mai figurează în Nomenclatorul Internaţional al actelor biologice din octombrie 1980 !

3.1.1. Reacţia de floculare - testul V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)

Reacţie clasică, singura ce se mai practică încă. Este o reacţie de precipitare în
mediul lichid cu un antigen cardiolipinic de origine animală şi comun cu Tr. pallidum.
 Reacţia calitativă
În godeul unei plăci se pun în contact 0,05 ml ser de bolnav inactivat şi o picătură
de antigen cardiolopidic diluat 1/60 ml. După agitare timp de 4 minute cu ajutorul unui
agitator mecanic cu 100 rotaţii/minut prezenţa anticorpilor se traduce prin apariţia de
aglutinate (flocoane) mai mult sau mai puţin voluminoase exprimate astfel:
۰ 0 = rezultat negativ, fără aglutinate (flocoane).
۰ + = rezultat incert, nesigur.
۰ + + = rezultat slab pozitiv (apariţia de flocoane vizibile la aglutinoscop, lichid
tulbure).
۰ + + + sau + + + + = rezultat pozitiv (apariţia de flococoane voluminoase, vizibile,
iar lichidul devine limpede).
Citirea se face cu ajutorul unei lupe puternice sau cu ochiul liber (figura 5).
Reacţii calitative fals pozitive se întâlnesc în sarcină, dar şi în stări patologice,
ca: disproteinemii, ciroză, hepatită virală, lupus eritematos diseminat, unele parazitoze,
lepră, toxicodependentă etc.
 Figura 5 : Reacţia VDRL carbon (stânga - reacţie pozitivă; dreapta - reacţie negativă)
(http://www.lycos.fr/vdrl-carbon.htm)
 Reacţia cantitativă
În tuburi de hemoliză se realizează diluţii de ser de bolnav, în progresie
geometrică în baza 2 (nediluat, diluat 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32…), fiecare tratat cu antigen
cardiolipinic.
Titrul este dat de ultima diluţie prezentând o reacţie slab pozitivă ++. Testul
cantitativ constituie o bună metodă de depistare şi urmărire a evoluţiei bolii şi a
tratamentului, precum şi eventualele recontăminări.

3.1.2. Testul RPR carbon (rapid plasma reding test)

Este o reacţie de aglutinare care utilizează particule de carbon învelite cu antigen
cardiolipinic.
Sunt teste rapide, de aglutinare pe lamă. Reacţia pozitivă se traduce prin apariţia
de grunji de culoare gri şi limpezirea suspensiei(figura 6).

Figura 6: RPR carbon test.

(http://www.tdh.sate.tx.us./lab.serology_agg.htm)

3.1.3. Reacţia de fixare a complementului (Bordet-Wassermann)

 Dă mai puţine rezultate biologice fals pozitive, dar poate da rezultate negative la
bolnavii cu sifilis terţiar. Deşi se mai foloseşte în practica medicală, nu mai figurează în
Nomenclatorul Internaţional al actelor biologice din octombrie 1980.
Cinetica anticorpilor anticardiolipinici: aceştia apar între a 8-a şi a 20-a zi de la
debutul şancrului. Nivelul lor creşte rapid în timpul sifilisului secundar. Se negativează
printre ultimele reacţii serologice în sifilis. În lipsa unui tratament, nivelul lor se menţine
în platou, la valori variabile de la un individ la altul. În anumite forme viscerale de sifilis,
se pot negativa în mod excepţional.

3.2. Reactii cu antigene treponemice (TPHA, FTA-ABS, NELSON, ELISA

Sunt realizate cu germeni vii sau omorâţi, sau cu fracţiuni antigenice specifice Tr.
pallidum.
3.2.1. TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay)
Este o reacţie de hemaglutinare pasivă a hematiilor, sensibilizate cu un antigen
extras din Tr. pallidum, la contactul cu serul uman de cercetat.
Reacţia se efectuează în microplăci cu fund rotund; în paralel cu proba de testat se
face şi un test martor cu hematii nesensibilizate (figura 7).
۰ Reacţia calitativă este un test de depistare. Se foloseşte ser de bolnav diluat 1/80.
۰ Reacţia cantitativă permite stabilirea titrului de anticorpi la un bolnav depistat pozitiv
prin reacţia precedentă. Se realizează diluţii din serul de testat, în progresie geometrică
în baza 2 (1/80; 1/160; 1/320…). Titrul anticorpilor este dat de ultima diluţie care dă o
reacţie pozitivă.
Cinetica anticorpilor: testul TPHA se pozitivează către a 3-a sau a 4-a săptămână
de la debutul infecţiei (aproximativ o săptămână de la apariţia şancrului. În timpul
negativării testelor serologice, TPHA este cel care persistă cel mai mult.

Figura 7: Testul TPHA

( http://www.bmb.eeds.ac.uk/tpha.htlm)

3.2.2. Reacţia de imunofluorescenţă FTA 200 (Fluorescent Treponemal Antibody

Test)
Este o reacţie de imunofluorescenţă indirectă care se realizează punând în contact
treponeme omorâte integral cu serul de bolnav diluat 1/200. După spălare, anticorpii
fixaţi pe treponeme erau evidenţiaţi cu ser fluorescent antiglobuline umane totale.
Deoarece testul a dat destul de multe reacţii fals pozitive, el a fost înlocuit cu
testul FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody-Absorbtion test).

3.2.3. FTA-Abs (FTA-Absorbit)

Derivă din precedentul: serul de bolnav este în prealabil absorbit cu treponeme
saprofite nepatogene (tulpina Reiter) în scopul de a suprima antigenele dirijate către
antigenele de grup ale treponemelor. Etapele ulterioare sunt similare testului FTA 200.
۰ Rezultatele calitative se exprimă în trepte de pozitivitate (+ = limita pozitivităţii; + +
până la + + + + test pozitiv).
۰ Rezultatele cantitative se realizează din testarea diluţiilor geometrice în baza 2 a
serului de bolnav (1/50; 1/100; 1/200; 1/400…). Titrul este dat de ultima diluţie care
prezintă o fluorescenţă ++ (slab pozitivă).
Testul este sensibil şi specific, pozitiv în toate stadiile bolii, confirmând un
diagnostic de sifilis şi permiţind, totodată, urmărirea eficacităţii tratamentului.
Reacţii fals positive apar în boli auto-imune, boala de Lyma, herpesul genital.
Testul necesită personal calificat, experimentat şi aparatură şi reactivi de calitate.
Cinetica anticorpilor fluorescenţi arată ca sunt decelabili încă de la apariţia
şancrului. Există în toate etapele bolii, dispariţia lor spontană fiind cu totul excepţională.
Se negativează lent.

3.2.4. Determinarea IgM specifice anti-treponemice (FTA-Abs IgM)

Imunoglobulinele IgM apar încă din a doua săptămână de la contactul infectant.
Ele sunt evidenţiate printr-o reacţie de imunofluorescenţă indirectă având drept revelator
un conjugat fluorescent monospecific anti-lanţuri µ (anti IgM).
La bolnavii netrataţi ele se regăsesc încă din faza secundară; la pacienţii trataţi
corespunzator, imunoglobulinele scad rapid şi dispar în general din prima lună care
urmează tratamentului.
Testul are ca indicaţie majoră sifilisul congenital, dar este util şi în depistarea
infecţiei recente, a reinfecţiilor şi în sifilisul neurologic.
Din păcate poate da atât reacţii fals pozitive, determinate de prezenţa factorului
reumatoid, a anticorpilor nucleari, cât şi reacţii fals negative legate de competiţia cu IgG
pentru receptori.

3.2.5. Testul de imobilizare a treponemelor (TIT sau TPI) sau testul Nelson
Tehnică de referinţă, dar care nu mai este utilizată decât în laboratoare de
cercetare specializate, deoarece implică întreţinerea de animale vii infectate şi preţuri de
cost ridicate.
Principiu: tulpini de Tr. pallidum vii, virulente, deci mobile, sunt imobilizate ca
urmare a acţiunii anticorpilor bolnavului (numiţi “imobilizine”) şi a complementului
cobaiului.
Tehnica: după 18 ore de incubare la 35oC în atmosferă de azot îmbogăţită cu 5%
CO2 treponemele din tubul de testat (T) se numără şi se compară cu cele dintr-un tub
martor (M) fără complement.
Procentul de imobilizare, în care se exprimă rezultatele calitative, este dat de
raportul: M – T/ M astfel :
 ۰ 0 – 20% = test negativ;
۰ 21 – 50% = test suspect;
۰ 51 – 100% = test pozitiv.
۰ Testul este considerat “toxic”, adică neinterpretabil, atunci când în tubul martor
treponemele sunt moarte. Cauzele acestei toxicităţi nu sunt cunoscute.
Recoltarea probei de la bolnav se face a jeun şi după întreruperea oricărui
tratament cu antibiotice.
Cinetica anticorpilor. ,,Imobilizinele” sunt decelabile între a 25-a şi a 40-a zi de
la apariţia şancrului, adică la finele fazei primare şi debutul fazei secundare. În lipsa
tratamentului, aceşti anticorpi persistă în toate stadiile, dispariţia lor spontană fiind cu
totul excepţională. Tratamentul precoce determină negativarea testului Nelson; în schimb,
testul rămâne pozitiv cu atât mai frecvent cu cât tratamentul a fost instituit mai tardiv.

3.3 Alte teste

3.3.1 Tehnicile imuno-enzimatice de tip ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent
Assay) cu diferite tipuri de antigene purificate de T. pallidum, pentru IgG şi IgM.
3.3.2 Testul de inunoaderenţă-dispariţie (TPIA).
3.3.3 Testul de imunodispariţie intraperitoneală (TPID).

Alegerea reacţiilor serologice

Multitudinea de reacţii de diagnostic serologic al sifilisului se explică prin faptul
că nici una nu este perfectă pentru a confirma sau infirma cu certitudine infecţia sifilitică
pe toată durata bolii.
Ca o regulă generală, nu este recomandabil niciodată să se folosească o singură
reacţie serologică atunci când se urmăreşte depistarea şi diagnosticarea acesti boli. În
campaniile de depistare se vor executa pentru fiecare ser două reacţii dintre care
obligatoriu una cu antigen treponemic. Pentru confirmarea diagnosticului şi urmărirea
eficienţei tratamentului se va folosi un set de teste de rutină cu antigene cardiolipinice şi
treponemice. Este indicată şi efectuarea reacţiilor serologice cantitative care oferă
indicaţii privind scăderea titrului anticorpilor în cursul tratamentului specific.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE CU LEPTOSPIRE

Foarte răspândite în natură, leptospirele sunt bacterii care, emise prin urina
animalelor infectate, determină la om, în mod accidental, infecţii (zoonoze) cu un grad
variat de gravitate, dintre care cea mai severă formă este leptospiroza ictero-
hemoragică. Parte componentă a familiei Spirochetae, genul Leptospira cuprinde atât
specii saprofite (Leptospira biflexa), cât şi specii patogene pentru om şi animal
(Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona,
Leptospira canicola). În patologia umana sunt descrise peste 230 de serotipuri, grupate în
23 de serogrupe, şi 7 specii patogene asociate bolilor umane şi animale.
Leptospirele sunt bacterii fin spiralate, flexibile, mobile cu extremităţile de
forma unui cârlig (figura 8). Au diametrul de aproximativ 0,1 mm şi o lungime cuprinsă
între 6-12 mm.
 Figura 1: Imaginea unei leptospire la microscopul electronic
(http://www.ucmp.berkeley.edu/bacteries.html)

Ca urmare a polimorfismului clinic, diagnosticul este greu de stabilit în etapa de

debut a bolii. Contextul epidemiologic şi testele de laborator nespecifice (neutrofilie,
aspect de tip inflamator) sunt importante în vederea excluderii etiologiei virale.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE.

Prelevatele vor respecta o anume secvenţialitate: hemoculturile se vor recolta în
primele 10 zile de la apariţia sindromului febril (sângele fiind recoltat pe un anticoagulant
de tipul heparinei sau oxalatului; citratul determină o acidifiere nefastă dezvoltării
leptospirelor), LCR, recoltat prin puncţie rahidiană, în a 2-a săptămână de boală, iar
uroculturile, începând cu a 3-a săptămâna de boală când se recoltează şi sânge pentru
diagnosticul serologic. Prelevatele se vor recolta înaintea instituirii oricărui tratament cu
antibiotice şi nu vor fi congelate.
Prelevatele necroptice de la cadavru vor include probe de sânge, de ţesut hepatic
şi de ţesut renal, LCR şi urină.
Tinând cont de faptul că leptospirele se lizează în câteva ore de la recoltare,
transportul şi prelucrarea produselor patologice va fi cât mai rapidă.

2.DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2.1 Examenul direct
Examenul direct al preparatului proaspăt la microscopul cu fond întunecat
este de interpretat cu prudenţă, din cauza aspectelor fals pozitive determinate de resturi
celulare, fibrină etc. Examinarea preparatului proaspăt se face între lamă şi lamelă cu
obiectivul cu imersie.
Pentru examinarea directă se foloseşte: sânge (5 ml) recoltat pe un anticoagulant
fiind lăsat un timp în repaus pentru sedimentarea hematiilor; urină (50-100 ml) ca atare,
după o prealabilă alcalinizare prin administrarea bolnavului de bicarbonat de sodiu sau
sedimentul urinar, după centrifugare timp de o oră la 3000 t/minut. Se mai pot examina
prin acestă metodă şi supernatantele trituratelor de fragmente de ţesut din ficat, rinichi
recoltate de la cadavru (2 g.ţesut / 3-5 ml diluant lăsat să se sedimenteze timp de 30-60
minute).
Preparatele fixate şi colorate se fac din sânge, sedimentul urinar, LCR şi
amprente de organe post-mortem. Ca tehnici de coloraţie se folosesc metoda Giemsa,
coloraţia Fontana-Tribondeau, cu acridină oranj şi Vago (figura 9).
Metoda Giemsa: frotiul se usucă sau este fixat cu acid osmic, după care se
colorează timp de 30 minute cu soluţie Giemsa proaspătă (2 picaturi de colorant/1 ml apă
tamponată cu pH 7). Se spală şi se recolorează cu Giemsa, după care preparatul se spală
şi se usucă. Examinarea la microscopul optic se face cu obiectivul cu imersie.
Coloraţia Fontana-Tribondeau: frotiul etalat pe o lamă port-obiect se acoperă cu
soluţie Rugge pe bază de formol, acid acetic glacial, apă distilată; procedura se repetă de
3 ori în răstimp de 1 minut, după care se acoperă lama cu acid tanic, se încălzeşte până la
emisia de vapori şi se lasă apoi să se răcească 3 minute. Se spală lama şi se acoperă cu
filtrat de soluţie amoniacală de nitrat de argint; se încălzeşte din nou lama, de 2-3 ori,
pâna la emisia de vapori. După 10 minute se spală cu apă distilată, se usucă şi se
examinează la microscopul optic cu obiectivul cu imersie.
Coloraţia cu acridină oranj este preferată de un număr important de
microbiologi. Coloraţia se practică pe preparatul etalat pe lama port-obiect şi fixat în
prealabil cu etanol. Se acoperă frotiul timp de 2 minute cu amestecul colorant (acridina
oranj 10 ml/tampon acetat pH 3,5 100 ml; se filtrează şi se păstrează la întuneric). Se
examinează la microscopul cu fluorescenţă şi cu obiectivul cu imersie.

Figura 9: Imaginea unei leptospire prin coloratia Vago

(sursa : http://www.bioltrop.org/15-techbacterio/leptospira.jpg)
2.2. Izolarea
Însămânţarea în vederea izolării leptospirelor se efectuează in vivo şi in vitro.
- In vitro, pe medii speciale semisolide şi lichide, pe bază de peptonă, îmbogăţite cu ser
de iepure şi adaos de factori care stimulează creşterea şi multiplicarea germenilor,
precum vitamina B1, vitamina B12, fier, hemoglobină, acid oleic. Mediile au pH 7,2-7,4.
La noi este folosit indeosebi mediul Kortof. Mai sunt comercializate şi utilizate mediile
specifice Tween-albumină sau mediul EMJH (Ellinghausen-McCullough modificat de
Johnson şi Harris).
Sângele total se însământează în 3 tuburi, fiecare tub conţinând câte 5 ml de
mediu de cultură, în cantitate crescătoare de la o picătură la 3 picături; urina şi LCR se
însămînţează ca atare sau sedimentul lor (0,5 ml inocul/tub cu 5 ml mediu de cultură).
Culturile sunt incubate la 30oC, la întuneric, timp de 2 luni. Agitarea periodică a
culturilor lichide stimulează creşterea (metabolism aerob).
Săptămânal se va efectua un examen direct la microscopul cu fond întunecat, cu
respectarea strictă a normelor de protecţie în vederea evitării contaminării umane
accidentale (risc biologic de clasa a 2-a şi a 3-a). Când se observă leptospire se fac
subculturi pe medii proaspete.
-In vivo se face prin inoculare la cobai sau, de preferat, la hamster care este sensibil la
mai multe serovaruri. Tehnica prezintă câteva inconveniente deoarece leptospirele îşi
pierd repede virulenţa in vitro, nu toate serovarurile produc semne clinice evidente, iar
sensibilitatea animalelor de laborator variază în funcţie de indivizi (sensibilitatea poate fi
crescută printr-un tratament prealabil cu ciclofosfamidă).

2.3. Identificarea
Caracterele morfologice, mobilitatea şi creşterea pe mediile speciale susţin
apartenenţa la genul Leptospira.
a. Caractere de cultură
Pe mediile specifice semisolide leptospirele se dezvoltă lent, în grosimea
mediului, la 2-3 mm de la suprafaţă, determinând apariţia a 5-6 tipuri de colonii
identificate prin reacţia oxidazelor. Speciile patogene au nevoie de un interval de timp
mai mare, de peste 20 de zile, pentru a se dezvolta, în timp ce leptospirele nepatogene
apar după 7 zile de la însămânţare. Creşterea leptospirelor se apreciază prin studiul
culturilor la microscopul cu fond întunecat.
Pe mediile lichide creşterea leptospirelor nepatogene determină o uşoară
opalescenţă, în timp ce tulpinile patogene nu produc modificarea clarităţii mediului.

b. Caractere morfologice.
La microscopul cu fond întunecat leptospitele apar ca microorganisme de formă
spiralară, extrem de mobile, cu mişcări de rotaţie în jurul axului longitudinal, de
flectaţie şi translaţie, subţiri şi strălucitoare pe fondul întunecat al câmpului.
Frotiurile colorate Giemsa şi examinate cu microscopul optic evidenţiază
leptospirele care au un aspect spiralat regulat, capetele îndoite ca un cârlig şi o lungime
dublă faţă de dimensiunile unei hematii.
La coloraţia specială Fontana-Tribondeau leptospirele apar colorate maron
spre negru pe fond galben-bej (figura 10).
Nu se colorează Gram.
 Figura 10: Aspectul leptospirelor la coloratia Fontana-Tribondeau
(http://www.microbisome.com)
c. Caractere metabolice
În cazul leptospirelor patogene acestea sunt caracterizate printr-o activitatea
ureazică slabă, folosesc acetatul de calciu ca sursă de carbon şi fermentează inconstant
zaharurile.
Sunt bacterii strict aerobe, catalază pozitive, oxidază negative.

d. Caractere de patogenitate
Animalele de laborator inoculate cu leptospire virulente dezvoltă un sindrom
febril, icter intens, hemoragii subcutanate şi viscerale, urmate de deces în 4-5 zile.
Probele necroptice din ficat, rinichi, sânge, plamâni evidenţiază prezenţa leptospirelor.
Cobaii inoculaţi cu tulpini cu virulenţă redusă, se vindecă spontan după un
sindrom febril ce apare la 7-12 zile de la inoculare. Animalele sunt sacrificate în a 21-a zi
de la inoculare, la examenul post mortem constatându-se în special leziuni hemoragice
pulmonare, leziunile hepatice şi renale fiind mai rare.
Fragmentele de ţesut recoltate sunt însamânţate pe mediile de cultură specifice
pentru izolarea leptospirelor.

e. Caractere antigenice
Pentru determinarea tipului serologic al leptospirei izolate se utilizează reacţia
de microaglutinare-liză pe lamă. Pe o lamă de sticlă port-obiect se pune o picătură din
cultura pozitivă cu leptospire şi o picătură ser standard. Lama se lasă în repaus timp de 15
minute după care se examinează la microscopul cu fond întunecat. În prezenţa serului
specific se produce aglutinarea leptospirelor.
Rezultatul se exprimă în grade de intensitate a pozitivării reacţiei de la – la ++++:
- la o reacţie negativă, leptospirele apar izolate pe câmpul miscroscopic, predominând
formele libere;
- la o reacţie slab pozitivă (+) apar câteva leptospire aglutinate sub formă de gheme,
predominând însă leptospirele libere;
- într-o reacţie pozitivă (++) predomină ghemele de leptospire;
- în reacţia intens pozitivă (+++) ghemele sunt rare, iar leptospirele libere lipsesc;
- în reacţia intens pozitivă (++++) lipsesc ghemele şi leptospirele.
3. DIAGNOSTIC IMUNOBIOLOGIC
Diagnosticul serologic este rezervat anumitor laboratoare de specialitate din
cadrul Centrelor Nationale de Referinţă. Testele se pozitivează din a 8-a sau a 10-a zi de
boală când apar anticorpii specifici. Titrul de anticorpi scade în următoarele 3-6 luni, un
oarecare titru rezidual putând persista mai mulţi ani. Studiul cineticii anticorpilor este
indispensabil pentru diagnosticul biologic, testele urmând a fi efectuate în dinamică, la
interval de 2 săptămâni.
♦ Testul ELISA
Foloseşte un antigen nepurificat extras dintr-o tulpină de Leptospira patoc anti-
IgM umane cuplat cu peroxidază. Titrul de graniţă este de 1/400. Anticorpii serici
detectabili apar din ziua a 8-a de boală ce urmează instalării sindromului febril.
Principalul inconvenient este legat de faptul că este destul de des negativ atunci când
infecţia este determinată de anumite serotipuri precum L. grippotyphosa sau australis. În
forma sa actuală testul ELISA este considerat un test de depistare.
♦ RFC cantitativă
Foloseşte ca antigen Leptospira biflexa Patoc I (2 unităţi antigenice), un sistem
hemolitic (eritrocite de oaie şi ser hemolitic), seruri pereche de la bolnav, inactivate,
recoltate unul în prima săptămână de boală, al doilea după 7-12 zile şi alexina titrată (vezi
tehnica RFC). Anticorpii fixatori de complement ating valoarea maximă în săptămâna a
3-a şi a 4-a de boală, scăzând către finele lunii a doua de boală. Au valoare în
diagnosticul precoce al bolii.

♦ Reacţia de micro-aglutinare
Cunoscută şi sub numele de reacţia de aglutinare-liză Martin–Lepetit, reacţia
constă în evaluarea la microscopul cu fond întunecat a gradului de aglutinare a
leptospirelor cu serul de bolnav. Reacţia rămâne tehnica de referinţă pentru determinarea
serotipului de leptospire şi are la bază un set de antigene format din tulpini vii,
reprezentative, ale principalelor serogrupe (20-23 de antigene).
Ca tehnică, pe o lamă port-obiect de sticlă se pun atâtea picături din serul de
bolnav, diluat 1/50, câte tulpini de testat sunt în setul de reacţie. Se lasă în contact 15-20
de minute după care se examinează la microscop.
Microaglutinatele din reacţia pozitivă dau o imagine caracteristica de ,,cer
înstelat’’ sau ca nişte gheme mici. Liza (L) se caracterizează prin umflarea şi
imobilizarea leptospirelor care capătă un aspect granular. Aglutinarea se notează: + dacă
sunt 4-5 gheme, ++ dacă sunt peste 6 gheme şi leptospire libere, +++ când are loc
aglutinarea tuturor leptospirelor de pe lama examinată. Un ser este considerat pozitiv, la
o diluţie dată şi pentru tulpina testată, dacă cel puţin 50% dintre leptospire sunt
aglutinate faţă de o tulpină martor.
La om titrul prag de referinţă corespunde valorii de 1/100, fiind semnificativă
pentru diagnostic şi creşterea în dinamică a titrului cu cel puţin 4 trepte binare la serul de
convalescenţă faţă de serul de debut.
Omul este sensibil la toate serotipurile de Leptospira interrogans sensu lato,
gravitatea bolii depinzând mai mult de inocul, de virulenţa tulpinii precum şi de gradul de
sensibilitate individuală, decât de serovarul propriu-zis. Toate serotipurilor pot antrena o
formă gravă, letală, cu toate acestea serovarurile grippotyphosa sau pomona, şi mai ales,
icterohaemorrhagiae au reputaţia de a fi cele mai patogene.
VIRUSOLOGIE

1. DEFINIŢIE. CARACTERE GENERALE. CLASIFICARE

Virusurile, formă de viaţă situată la limita inferioară de organizare biologică, sunt
microorganisme de dimensiuni foarte reduse (sub limita de decelare prin microscopie
optică), a căror multiplicare necesită realizarea obligatorie a parazitismului intracelular.
Această necesitate se impune datorită faptului că virusul, fiind lipsit de aparat propriu de
sinteză, foloseşte ribozomii celulei parazitate (vegetală, animală, bacteriană) în vederea
programării propriilor sinteze.

Printre caracterele generale ale unui virus pot fi enumerate:

- dimensiuni reduse de ordinul nanometrilor;
- orice virus este compus dintr-un miez de acid nucleic (fie ADN, fie ARN, niciodată
ambele), înconjurat de proteine de suprafaţă ce alcătuiesc capsida virală;
- sunt lipsite de echipament enzimatic, pentru programarea propriilor sinteze utilizează
“materiale” (aminoacizi şi energie) împrumutate de la celula gazdă;
- infecţia virală a celulelor organismului poate determina o viroză care evoluează fie
inaparent, fie prin manifestări clinice şi fiziopatologice caracteristice.

CLASIFICAREA VIRUSURILOR
 După natura celulei parazitate virusurile se împart în:
- bacteriene;
- animale (categorii importante pentru practica medicală);
- vegatale.
Virusurile bacteriene (bacteriofagi-fagi), pot fi clasificate, după acidul nucleic
conţinut, în fagi ADN şi fagi ARN, iar după tipul de relaţie bacteriofag-celulă bacteriană
gazdă, în fagi litici şi fagi simbiotici sau temperaţi.
Virusurile animale se împart, la rândul lor, după mai multe criterii: dimensiuni,
tropism, acidul nucleic conţinut etc.

 După dimensiuni:
- virusuri mici, cu diametrul de 15-30 nm: picornavirusurile (enterovirusuri);
- virusuri mijlocii, cu diametrul de 70-180 nm: mixovirusurile, virusurile grupului
Herpes, rhabdovirusurile, arbovirusurile, virusurile HIV;
- virusuri mari, cu diametrul de 200-300 nm: poxvirusurile.

 După tropism:
- virusuri enterotrope: enterovirusurile, rotavirusurile;
- virusuri neurotrope: arbovirusurile, tulpinile neuropatogene de enterovirusuri şi
de virus rujeolos, virusul rabic;
- virusuri dermotrope: virusurile grupului Herpes, poxvirusurile, virusul rujeolos,
virusul rubeolic;
 - virusuri cu tropism pentru căile respiratorii: mixovirusurile, adenovirusurile,
coronavirusurile, rinovirusurile;
- virusurile hepatotrope: virusurile hepatitelor virale, unele virusuri Coxsackie de
grup B, unele arbovirusuri;
- virusuri limfocitotrope: virusul jujeolos, virusurile HIV.
Unii agenţi virali prezintă afinităţi multiple. Astfel, unele variante de virus
rujeolos, pe lângă tropismul pentru căile respiratorii şi pentru piele, au şi neurotropism,
unele enterovirusuri manifestă pe lângă enterotropism şi neurotropism, în timp ce
virusurile Coxsackie de grup B pot fi concomitent hepatotrope, pancreatotrope,
miocardotrope şi neurotrope.

 După simetrie virusurile se împart:

- virusuri cu simetrie icosaedrică: parvovirusuri, adenovirusuri, Herpesvirusuri şi
picornavirusuri;
- virusuri cu simetrie helicoidală: orthomyxovirusuri, paramyxovirusuri.

 După acidul nucleic conţinut virusurile animale se împart în virusuri ADN şi

virusuri ARN (tabel 1).

Acid nucleic Grup virus Exemple

Picornavirus Enterovirusuri: polio, ECHO, Coxsackie
Virusul hepatitei A
Rhinovirusuri
Orthomyxovirus Virusurile gripale
uri
Paramyxovirusu Virusurile paragripale
ri Virusul rujeolos
Virusul urlian
Virusul respirator sinciţial
Rhabdovirus Virusul rabic
Arbovirus Virusurile encefalitice transmise prin
artropode
ARN Togavirus Virusul rubeolic
Retrovirus Virusurile oncogene (tip C)
Virusurile HIV

Acid nucleic Grup virus Exemple

 Adenovirus Adenovirusuri umane
Adenovirusuri simiene
Adenovirusuri murine
Herpesvirus Virus Herpes simplex
Virus varicella-zoster
Virusul citomegalic
Virusul Epstein-Barr
Poxvirus Virusul vaccinia
Virusul variolic
Oncodnavirus Virusuri ADN oncogene grup Papova
ADN (virus papiloma, virus polyoma)
Hepadnavirus Virusul hepatitei B
Parvovirus Virusuri asociate adenovirusurilor

Tabel 1: Clasificarea virusurilor după acidul nucleic conţinut

2. MORFOLOGIE VIRALĂ
Virusurile posedă o varietate de forme şi o structură diferită, uneori foarte
complexă (figura 1).

2.1. Forma virusurilor

Există virusuri cu formă cilindrică (variante morfologice de virus gripal; unele
virusuri vegetale: virusul mozaicului tutunului), sferică (virusurile gripale,
paramyxovirusurile), cristaliformă sau poliedrică (enterovirusurile: polio), formă de
prismă sau cărămidă (virusurile pox).

2.2. Structura virusurilor

Orice particulă virală (virion) conţine un miez de acid nucleic (nucleoid) şi un
strat proteic înconjurător, denumit capsidă. La unele virusuri există la exterior şi un
înveliş numit anvelopă (peplos).

· Acidul nucleic (nucleoidul)

Miezul de acid nucleic, constituit fie din ADN, fie din ARN (niciodată din
ambele tipuri), are structură polinucleotidică: polimer de radicali fosforici, pentoză şi
baze purinice sau pirimidinice (adenină, guanină, timină şi citozină în cazul ADN viral şi
adenină, guanină, uracil şi citozină în cazul ARN viral).
Majoritatea virusurilor animale conţin o moleculă de acid nucleic monocatenar,
dar există şi virusuri cu acid nucleic bicatenar (reovirusurile conţin două lanţuri de ARN
legate complementar).
Acidul nucleic poate fi dispus liniar, circular sau încolăcit în interiorul virionului
şi este constituit din mai multe segmente sau dintr-o singură moleculă.
 Acidul nucleic este genomul virusului conţinând genele, capabile să codifice
sintezele de tip viral în celula parazitată.

4
2
1 3

5
6
7

8 9
10

14
13

12
11

15

1: Bacteriofag T4; 2: Bacteriofag M13; 3: Virusul rabic; 4: Hematie; 5: Adenovirus; 6: Rinovirus; 7:

Corpuscul elementar Chlamydia; 8: Bacteriofag MS2; 9: Virusul mozaicului tutunului; 10: Viroid; 11:
Virusul polio; 12: Prion; 13: Virusul vaccinia; 14: Virusul Ebola; 15: E.coli

Figura 1: Morfologie virală (comparaţie bacterii - virusuri)(sursa:

http://www.futura_sciences.com)

· Capsida şi învelişul
Capsida este dispusă în jurul nucleotidului viral, formând, împreună cu acesta, un
complex denumit nucleocapsidă.
Capsida conţine proteine virale, grupate în unităţi denumite capsomere. Relaţiile
spaţiale acid nucleic-capsidă sunt foarte stricte, existând un raport între subunităţile
(nucleotidele) moleculei de acid nucleic şi capsomerele capsidei.
Analiza chimică a compoziţiei capsidei relevă:
- proteine simple, omogene (poliovirusuri şi alte enterovirusuri);
- proteine complexe:
° proteină suport legată de lipide: fosfolipide, colesterol, lecitină (myxovirusuri,
paramyxovirusuri, poxvirusuri);
° proteină suport legată de fracţiuni glucidice → glicoproteine (arenavirusuri,
virusurile oncogene de tip C).
La virusurile mici există un singur tip de monomer capsidal, constituit din lanţuri
polipeptidice omogene sub raportul greutăţii moleculare.
În general virusurile animale mai complexe, virusurile mari şi cele cu înveliş, au o
compoziţie capsidică mai complexă decât virusurile mici şi mijlocii fără înveliş,
monomerii fiind alcătuiţi din lanţuri polipeptidice heterogene.

Învelişul (peplos sau anvelopă) este constituit atât din proteine virale (simple
sau complexe), cât şi din material lipoproteic “împrumutat” de la celula gazdă, în
cursul multiplicării intracelulare a virusului.
Exemple de virusuri cu înveliş: virusurile gripale, paramyxvirusurile (virusurile
paragripale, virusul rujeolos, virusul urlian), virusurile HIV, arbovirusurile, virusul rabic.
Elementele învelişului pot fi asamblate sub forma unei “mantii”, de la care
pornesc prelungiri (virusul gripal, virusul HIV).
La nivelul învelişului se pot exprima antigene de mare însemnătate prin
imunogenitatea lor, care servesc uneori şi la ataşarea virionului de receptorii celulei-
gazdă (antigenele hemaglutininice şi neuraminidaza la virusul gripal, antigenele
glicoproteice gp 120 şi gp 41, la virusurile HIV).

2.3. TIPURI DE SIMETRIE VIRALĂ

În cazul structurii unui virus, aşezarea spaţială a capsomerelor capsidei, ca şi
poziţia acestora faţă de unităţile de bază ale acidului nucleic viral (nucleotide) prezintă
caracteristici, ceea ce a dus la încadrarea virusurilor în categoria formelor anizotrope de
organizare a materiei, asigurând componentelor structurii un maximum de energie legată
(respectiv, un minimum de energie liberă).
Există două tipuri de simetrie: helicoidală şi icosaedrică.

· Simetria helicoidală
Complexul nucleocapsidei este dispus sub forma unei spirale (elice), constituit din
nucleoid (ex. virusul mozaicului tutunului) sau întreaga nucleocapsidă (ex. virusurile
gripale).
Elicea (helixul) prezintă un singur ax rotaţional care coincide cu axul cilindrului
nucleocapsidei sau a nucleoidului. Monomerii capsidei formează capsomere identice şi
sunt ei înşişi identici, stabilind cu monomerii vecini acelaşi tip de legături.
Monomerii capsidei formează o figură în formă de panglică (figurile 2 şi 3).
 Spiculi

Spiculi

Simetrie helicoidală cu înveliş Particule virale gripale

Figura 2: Virusuri cu simetrie helicoidală cu înveliş )(sursa:
http://www.futura_sciences.com)

· Simetria icosaedrică
Există la virusuri cu dimensiuni mici (enterovirusuri) şi mijlocii (virusurile
grupului Herpes).
Acidul nucleic, de regulă monocatenar, este dispus central, ca un ghem lax. În
jurul lui sunt aşezate capsomerele, după planuri de simetrie riguroase, astfel încât
conturul nucleocapsidei, privit în plan, apare ca un hexagon şi privit în spaţiu apare ca o
figură poliedrică, cu feţe şi muchii egale între ele “icosaedru” (20 de feţe, 30 de muchii,
12 vârfuri).

Simetrie helicoidală cu înveliş Virusul Ebola

Figura 3: Virusuri cu simetrie helicoidală cu înveliş )(sursa:

http://www.futura_sciences.com)
 Monomerii proteici ai capsomerului 6 sau 5 pentru fiecare capsomer (6 -
capsomer hexagonal şi 5 - capsomer pentagonal).
Numărul de capsomere în icosaedru este de 42, din care 12 pentagonale şi 30
hexagonale.
Aşezarea capsomerelor se face după anumite axe: axele ideale trec prin centrul
edificiului şi prin colţurile capsidei. Axele ce trec prin colţuri împart icosaedrul în 5
sectoare. Dacă icosaedrul se învârteşte în jurul axului central cu 1/5 la fiecare rotaţie, se
obţine aceeaşi figură. Deci prin rotaţie completă figura se reproduce pe ea însăşi de 5 ori.
Există şi axe de simetrie care împart icosaedrul în 3 sectoare egale (axe ce trec
prin centrul feţelor triunghiulare). Dacă icosaedrul se roteşte cu 1/3, la fiecare rotaţie se
va reproduce aceeaşi figură.
Dacă se roteşte cu ½ axul ce uneşte centrele a 2 capsomere hexagonale opuse,
icosaedrul poate fi reprodus.
Deci, icosaedrul viral are o simetrie rotaţională de tip 5: 3: 2, cu unele excepţii
(adenovirusuri, reovirusuri).

3. RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ

Între virusul animal şi celula gazdă pe care o parazitează se pot stabili două feluri
de relaţii: de tip litic (citocid) şi de tip simbiotic.

3.1. Relaţii virus-celulă gazdă de tip litic (citocid)

În acest tip de relaţie (figurile 4 şi 5), infecţia cu virus a unei celule animale se
soldează cu moartea celulei şi cu eliberarea de particule de virus neoformate (progeni)
în mediul extracelular.
Etapele acestei relaţii sunt: adsorbţia, penetrarea, decapsidarea, sinteza
particulelor virale neoformate, eliberarea particulelor virale neoformate.

· Adsorbţia
Procesul implică doi timpi: colizinea şi ataşarea.
Coliziunea reprezintă alipirea particulei (prin situsurile virale de ataşare) de
suprafaţa celulei sensibile (tabel 2). Ea depinde, pe de o parte, de proporţia între
numărul de virioni şi numărul de celule (raportul de infectivitate), iar pe de altă parte, de
unele condiţii ale mediului de reacţie (temperatură, pH, concentraţie ionică).
Ataşarea semnifică unirea strânsă între virion şi unele zone de pe suprafaţa
celulei, numite receptori.
Receptorii celulari pot fi specifici anumitor agenţi virali, explicând tropismul
unor virusuri faţă de anumite substrate celulare (myxovirusuri, picornavirusuri) sau pot fi
nespecifici (neselectivi în raport cu mai multe categorii de virusuri - arbovirusuri,
poxvirusuri).
- Ataşarea specifică a myxovirusurilor (v. gripale) şi paramyxovirusurilor (v. urlian, v.
bolii Newcastle) se datoreşte intervenţiei unei enzime virale (neuraminidaza) care
prezintă proprietatea de a ataca substanţa receptor constituită din situsuri de
mucoproteină (bogate în acid neuraminic sau sialic).
 Agent viral Situs viral de ataşare Receptori celulari
Virus gripal hemaglutinină, mucoproteine (acid sialic)
neuraminidază
(înveliş)
Virus HIV gp 120 (înveliş) receptor limfocitar CD4
Virus poliomielitic situs capsidal receptor specific (cu exprimare
diferită in vivo sau in vitro pe
celula renală de maimuţă)
Virus rabic hemaglutinină Receptor acetilcolinic (muşchi
(înveliş) striat)
Virus Herpes gβ (înveliş) Receptor pe celula fibroblastică de
simplex hamster, şoarece, om

Tabel 2: Exemple de situsuri virale de ataşare şi receptori celulari

- Ataşarea specifică a picornavirusurilor a fost cercetată îndeosebi la poliovirusuri.

Astfel, extrăgându-se un material proteic din membranele celulelor susceptibile la
infecţia cu poliovirusuri, s-a demonstrat capacitatea acestui material de a inactiva
virusul. În prima etapă a ataşării, receptorii specifici poliovirusurilor realizează un
complex reversibil, pentru ca, în timp, legătura receptor-virus să devină stabilă
(capacitatea infectivă a virusului nu mai poate fi recuperată prin diverse tentative de
desfacere a complexului). Tot referitor la receptorii pentru poliovirusuri este de remarcat
că, uneori, celulele aparţinând unei anumite specii sau unui anumit allotip, rezistente in
vivo la infecţia poliovirotică, devin deosebit de sensibile la acelaşi virus, odată cu
scoaterea lor din organism şi cultivarea in vitro (exemplu: celulele renale de maimuţă).
Acest fenomen poate fi explicat prin derepresarea in vitro a unei gene celulare care
codifică exprimarea activităţii receptorului de membrană pentru poliovirus. Pe de altă
parte, sunt şi situaţii în care poliovirusul se ataşează pe receptorii celulari, fără a se
declanşa etapele consecutive ale infecţiei de tip litic, ceea ce relevă complexitatea
fenomenului de ataşare, în funcţie de tipul de celulă şi de virusul infectant.

· Penetrarea
În această etapă are loc trecerea virusului din exteriorul celulei în interiorul
acesteia. Înglobarea virusului în citoplasmă (“viropexie”) a fost confirmată numai în
unele cazuri de relaţie de tip litic (poliovirusuri, myxovirusuri, reovirusuri), prin prezenţa
în citoplasma celulelor virus infectate, în primele ore de la iniţierea infecţiei virale, a unor
vacuole de fagocitare care conţin particule virale intacte.

· Desfacerea capsidei
Spre deosebire de bacteriofagi, la care numai acidul nucleic este “injectat” în
celula parazitară, la virusurile animale se impune pierderea unei părţi a capsidei virale,
prin enzimele lizozomale ale celulei. Lizozomii se aliniază de-a lungul pereţilor
vacuolelor de fagocitare, eliberând enzime litice care desfac atât peretele vacuolei, cât şi
o parte a capsidei virionilor conţinuţi în vacuolă.
Pentru virusurile ADN mari (poxvirusuri) decapsidarea este catalizată şi de
enzime virus-induse în celula gazdă.
· Sinteza particulelor virale neoformate
Este cea mai importantă etapă a relaţiei virus celulă gazdă de tip litic şi constă în
esenţă, din codificarea unui nou program, folosind aparatul ribozomal al celulei
parazitate. Această etapă cuprinde două categorii de fenomene: precoce (“early”) şi
tardive (“late”).
FENOMENE PRECOCE
În primele 6-8 ore de la pătrunderea virusului în celulă, acidul nucleic viral induce
două procese:
- Oprirea sintezelor proteice de tip celular, prin “paralizarea” funcţională a ADN
celular;
- Codificarea unor enzime numite polimeraze virus-specifice (ARN polimeraza virus-
indusă, în cazul virusurilor ARN; ADN polimeraza virus-indusă în cazul virusurilor
ADN). Aceste polimeraze catalizează formarea de copii ale acidului nucleic viral,
folosind ca matrice nucleoidul viral decapsidat după intrarea în celulă. Se iniţiază, în
acest fel, replicarea acidului nucleic viral, cu apariţia unor multiple “copii” conţinând
genele de tip viral.

Ataşare Endocitoză Penetrare Decapsidare

Figura 4: Etape ale infecţiei virale: Ataşare, penetrare, decapsidare (sursa:
http://www.futura_sciences.com)
 Pătrundere Replicare

Asamblare

Ataşare Eliberare

Figura 5: Etapele ciclului viral de tip litic (sursa: http://www.futura_sciences.com)

FENOMENE TARDIVE
- “Copiile” de acid nucleic viral programează la nivelul ribozomilor celulari sinteze
proteice noi, folosind ca “materie primă” aminoacizii celulari, prin legarea acestora într-
o ordine (secvenţă) diferită, conform modelului înscris în genomul viral.
· În cazul virusurilor ARN, moleculele de acid nucleic viral rezultate din replicarea
intracelulară reprezintă ele însele un ARN mesager nou, “citit” direct de ribozom.
· În cadrul virusurilor ADN, pe matricea acidului nucleic viral se sintetizează mai
întâi un ARN mesager virus specific, care funcţionează apoi ca un nou
“programator” la nivelul ribozomilor.
- Proteinele virale sintetizate de către ribozomi, potrivit unui nou program, se aşează în
jurul moleculelor de acid nucleic viral şi astfel se produce asamblarea şi maturarea
particulelor virale neoformate. În cadrul acestui proces, are loc şi aşezarea subunităţilor
capsidale (monomerilor) după simetria caracteristică tipului de virus infectant, fenomen
codificat şi el de către unele gene virale.

· Eliberarea particulelor virale neoformate

Virionii nou formaţi, care, cu rare excepţii (mutante) sunt identici morfologic şi
genetic cu particula care a iniţiat infecţia virală a celulei, sunt eliberaţi în mediul
extracelular. De regulă, acest fenomen se însoţeşte de dezintegrarea (moartea) celulei
gazdă.
 3.2. RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ DE TIP SIMBIOTIC
În urma acestui tip de relaţie virus-celulă gazdă, celula nu moare, ci câştigă
proprietăţi noi.
Etapele infecţiei virale de tip simbiotic sunt asemănătoare cu cele din infecţia de
tip litic în ce priveşte adsorbţia, penetrarea şi desfacerea capsidei. Deosebirile apar în
etapele următoare: programarea sintezelor de tip viral, apariţia unor proprietăţi de tip nou.
· Programarea sintezelor de tip viral
Inducerea unui nou program de către acidul nucleic viral în celula animală virus
infectată nu se soldează cu oprirea activităţii ADN celular, astfel încât ribozomii vor
sintetiza concomitent proteine celulare şi virale. Modul programării sintezelor virale
diferă la virusurile ADN şi ARN capabile să stabilească relaţie simbiotică.

Virusurile ADN
ADN viral pătruns în celulă poate urma două modele de codificare a sintezelor
proprii (figurile 6 şi 7).
Modelul 1: ADN viral se integrează (inseră) într-o zonă a ADN celular. Ulterior, se va
sintetiza un ARN mesager complementar mixt, conţinând anticodoni de tip celular şi
anticodoni de tip viral. ARN mesager va ajunge la ribozomi, care vor “citi” mesajul.
Model 2: ADN viral nu se integrează în genomul celular, ci induce sinteza unei enzime
precoce (ARN-polimeraza virus indusă) care catalizează sinteza de ARN mesager nou, pe
matricea de ADN viral. Pe de altă parte, ADN celular comandă sinteza de tip celular prin
intermediul ARN mesager normal. În acest fel, unii ribozomi vor citi mesajul de pe
molecula de ARN mesager celular, alţii de pe ARN mesager de tip viral, în aceeaşi celulă
apărând proteine celulare şi virale.

Papovavirus
Ataşarea virusului pe celula gazdă
Virion eliberat

Virion Pătrunderea
complet virusului în
celulă

Proteine capsidale

ARNm

Translaţie

Fenomene tardive Fenomene precoce

ale transcripţiei ale transcripţiei
 Figura 6: Ciclul replicativ viral (sursa: http://www.futura_sciences.com)

Astfel, un acelaşi ribozom va sintetiza proteine cu secvenţe de aminoacizi dictate

de ADN celular, precum şi proteine cu secvenţe de aminoacizi dictate de ADN viral.

Virusurile ARN
În cazul virusurilor ARN, mecanismul integrării acidului viral în ADN celular a
fost propus de Temin 1972, modelul fiind confirmat apoi experimental la virusurile
integrate de tip C (retrovirusuri). Procesul este cunoscut sub numele de “revers-
transcripţie”. ARN viral pătruns în celulă reprezintă o nouă matrice, care induce
formarea unei enzime, numită revers-transcriptază. Această enzimă catalizează sinteza
unui ADN complementar folosind ca matrice ARN viral (invers decât la celula eucariotă
normală, unde pe matricea de ADN se formează ARN complementar).
ADN complementar viral (“provirus”) se integrează în ADN celular şi apoi
urmează aceeaşi cale ca la modelul 1 de programare de la virusurile simbiotice ADN,
rezultând proteine mixte celular-virale.
“Revers-transcripţia”, caracteristică pentru virusurile oncogene tip C şi pentru
virusul HIV, implică intervenţia mai multor enzime, după cum urmează (tabel 3):

Secvenţă a revers-transcripţiei Enzime virale responsabile

Formarea primei catene de ADN Revers-transcriptaza
proviral
Depolimerizarea nucleotidelor din ARN Ribonucleaza H
viral care nu funcţionează ca “matrice”
Formarea ADN proviral dublu catenar Revers-transcriptaza
(ataşarea celei de a doua catene)
Integrarea provirusului în ADN celular Integraza
Activarea genomului viral activat Complex genic de activare
(exemplu: tat/nef la virusul HIV),
plus un complex enzimatic

Tabel 3: Etape ale revers-transcripţiei şi enzimele responsabile

 ARN viral
dublu catenar
Penetrarea retrovirusului în
Celula celula gazdă
gazdă
AND celulă gazdă
Maturarea
retrovirusului

Catene
ARN Sinteza ADN
identice proviral prin
reverstranscripţie
Transcripţia
Proteine provirusului în două
virale catene ARN identice
care codifică sinteza de
proteine virale

Integrarea ADN proviral

în ADN celulei gazdă

Figura 7: Ciclul replicativ al retrovirusurilor (sursa: http://www.futura_sciences.com)

· Apariţia unor proprietăţi noi

Consecinţa stabilirii unei relaţii de tip simbiotic virus-celulă gazdă, constă în
apariţia unor proprietăţi modificate ale celulei infectate faţă de celula normală-
neinfectată.
Printre proprietăţile modificate menţionăm:
- Transformarea celulară: implică modificări profunde morfologice, genetice,
biochimice, de suprafaţă, de potenţial oncogen, proces complex, echivalent până la un
punct malignizării;
- Exprimarea de antigene noi pe suprafaţa celulei;
- Instalarea unor modele metabolice particulare, care asigură un echilibru între
sinteza concomitentă de proteine de tip celular şi de tip viral în aceeaşi celulă.
Mecanismele care stau la baza apariţiei acestor noi proprietăţi sunt, pe de o parte,
introducerea, concomitent cu acidul nucleic viral, a unor gene noi, capabile să codifice
proprietăţile modificate (exemplu: genele “pol”, “gag”, “env”, “onc”, ale virusurilor
oncogene ARN-retrovirusuri, codifică sinteza revers-transcriptazei, proteinelor p10, p12,
p15, p30, glicoproteinei majore gp70, malignizarea celulei), iar pe de altă parte,
derepresia unor gene celulare datorită pătrunderii şi integrării acidului nucleic viral în
genomul celulei cu codificarea consecutivă a exprimării de noi proprietăţi (exemplu:
antigenul carcino-embrionar, prezent numai în celulele embrionate şi fetale şi, respectiv,
în celula cancerizată, dar absent în celula normală adultă).

3.3. ASPECTE PARTICULARE DE RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ

- Între virus şi celula-gazdă, există posibilitatea coexistenţei celor două tipuri de
relaţii: litică şi simbiotică (virusurile de tip C la multe specii de mamifere). În acest caz,
într-o populaţie celulară sau într-un ţesut cancerizat, unii virioni induc transformare
(prin integrarea acidului nucleic viral în genomul celular), alţii induc relaţie litică
(producerea de progeni virali, eliberarea de particule neoformate şi moartea celulei
gazdă).
- O alt caz deosebit este oferit de virusurile lente. Aceşti agenţi virali stabilesc o relaţie
de tip litic, cu o rată foarte joasă de infectivitate, astfel încât, în acelaşi ţesut, unele celule
prezintă leziuni, altele sunt normale. Consecinţa este evoluţia lungă (ani, decenii) a unei
afecţiuni degenerative, la care se poate adăuga apoi şi un mecanism autoimun de
întreţinere.
- Un alt aspect particular al relaţiilor virus-celulă gazdă este reprezentat de virusurile
“mascate” (virusuri din grupul Herpes, v. rubeolic, v. rabic, v. HIV). Aceste virusuri, în
anumite circumstanţe, pot produce o infecţie latentă a celulei, genomul viral fiind
integrat în genomul celular fără să-şi trădeze prezenţa. La un moment dat, la
intervenţia unui factor “demascator”, genomul viral intră în activitate, se desprinde din
inserţia cu genomul celular şi declanşează ciclul de multiplicare virală de tip litic, cu
dezintegrarea celulei gazdă.

4. IZOLAREA VIRUSURILOR ŞI EFECTELE VIRUS SPECIFICE

Virusurile se multiplică numai pe celulele vii, care le furnizează materia primă,

energia şi chiar mecanismele de sinteză, replicarea având loc conform informaţiei

genetice induse de acidul nucleic viral. Ele cultivă, în laborator, pe ouă de găină

embrionate, culturi celulare sau animale de laborator.

Modificările apărute la gazdele inoculate dau indicaţii asupra grupului de virusuri

căruia îi aparţine virusul inoculat, identificarea speciei sau a tipului făcându-se prin

reacţii antigen-anticorp.

4.1. Ouă de găină embrionate

Cultivarea virusurilor în oul embrionat de găină a constituit un progres remarcabil
în virusologie, prin utilizarea unui sistem de celule constituit din ţesuturi în dezvoltare, cu
multiplicare activă, practic steril, lipsit de mijloacele de apărare antiinfecţioasă existente
la animalele adulte. Cultivarea se face prin inoculare în anexele embrionare: cavitatea
amniotică şi alantoidiană, sacul vitelin, pe membrana corioalantoidiană.
Ouă de găină embrionate, de aproximativ 6-10 zile, sunt utilizate pentru izolarea
şi identificarea unor virusuri din produsele patologice sau pentru prepararea de antigene
şi vaccinuri virale. Inocularea în cavitatea alantoidiană şi amniotică se foloseşte pentru
cultivarea virusurilor gripale, paragripale, v. urlian, rujeolic; pe membrana
corioalantoidiană se cultivă v. herpetic şi poxvirusuri.
Efecte virus-specifice pe ou embrionat: efectul hemaglutinant prin
hemaglutininele virale (depozit cu marginile crenelate, franjurate în prezenţa hematiilor
de diverse specii); leziuni pe membrana corioalantoidiană; incluzii virale; hemoragii şi
moartea embrionului.

4.2. Culturi celulare

Sunt substrate de celule eucariote întreţinute in vitro, sub forma monostratului
celular. Ţesuturile fragmentate în piese mici sunt disociate cu tripsină în celule
individuale, diluate într-un mediu nutritiv şi introduse în recipiente de sticlă sau plastic,
unde se ataşează şi se multiplică pe suprafaţă.
Culturile de celule reprezintă astăzi metoda cea mai adecvată pentru izolarea
unor virusuri: enterovirusurilor, adenovirusurilor, v. paragripale, v. respirator sinciţial
etc. Se cunosc trei tipuri de culturi celulare (tabel 4): culturi primare (rinichi de
maimuţă); culturi diploide (din ţesuturile embrionare), linii celulare continue (din
ţesuturile tumorale).

Proprietăţi Celule Linii celulare (stabilizate)

Culturi (tulpini)
pri diploide
ma
re
Cariotip diploid diploid heterodiploid
Nr. de pasaje câteva aproximativ nelimitat
Dependenţă de ancorare da 50 nu (pot fi cultivate în
(pe suprafaţă solidă) da suspensie)
Necesitate de ser în 5-10%
mediu 5-10% 2-5%
Susceptibilitate la largă
infecţia virală ţesut normal largă restrânsă
Origine tisulară adult sau ţesut normal ţesut canceros sau ţesut
embrionar embrionar normal embrionar
Tipuri morfologice amestec al fibroblastic epitelial sau fibroblastic
celor două
tipuri

Tabel 4: Tipuri de culturi celulare

 Multiplicarea virusurilor în culturile de celule se evidenţiază prin examen
microscopic direct, care demonstrează degenerarea celulelor de cultură (apariţia unor
modificări morfologice ale celulelor sub acţiunea virusurilor): efect citopatic (distructiv,
sinciţial, în focar). Astfel enterovirusurile (virusurile poliomielitice) determină apariţia
unor celule mari, refringente cu desprinderea în întregime a monostratului celular în 2-3
zile; alte virusuri determină apariţia unor celule mari, multinucleate-sinciţii (v. respirator
sinciţial, v. rujeolos, v. herpes); adenovirusurile determină o alterare localizată, cu aspect
de mură - în focar.
Alte efecte virus specifice pe culturile celulare sunt: efectul hemaglutinant şi
efectul hemadsorbant. Unele virusuri hemaglutinante (gripal, paragripal), multiplicate în
culturi de celule, îşi manifestă proprietatea de a aglutina hematiile anumitor specii de
animal. De asemenea, celulele în care s-a multiplicat un virus hemaglutinant sunt
capabile să adsoarbă hematiile provenite de la diferite specii animale (hemadsorbţie).
Pe culturi celulare au mai fost evidenţiate şi alte efecte virus specifice: incluzii
virale; interferenţă (competitivitate); efectul transformant - modificări morfologice,
genetice, metabolice.
Incluziile virale sunt formaţiuni intracelulare cu o colorabilitate modificată,
dezvoltate progresiv în timpul multiplicării, reprezentând, în general, locul în care se
sintetizează componente virale sau se asamblează virioni. Sunt unice sau multiple, mari
sau mici, rotunde sau de formă neregulată, acidofile sau bazofile, intranucleare sau
intracitoplasmatice (tabel 5).
Interferenţă. Unele virusuri (v. rubeolic) fără a produce efect citopatic determină
un fenomen de interferenţă. Cultura inoculată pentru izolarea v. rebeolic este testată câtva
timp mai târziu prin infectare cu un v. citopatogen. Lipsa multiplicării acestuia pledează,
cu mare probabilitate, pentru prezenţa în cultură a v. rubeolic.

4.3. Animale de laborator

Inocularea animalelor de laborator a fost prima metodă folosită pentru izolarea
virusurilor şi precizarea tropismului lor pentru diferite ţesuturi, tropism însoţit de leziuni
caracteristice. Efecte virus specifice la animalele de laborator sunt: efecte clinice (v.
rabic); paralizii (flască - v. Coxsackie grup A; spastică - v. Coxsackie grup B); incluzii
virale (Babeş Negri - v. rabic); modificări histopatologice (v. polio - leziuni ale corpului
neuronului motor periferic din coarnele anterioare ale măduvei).

Localizare Colorabilit Virus

ate
Nuclear Bazofilă Adenovirusuri
Acidofilă Herpetoviridae
Papovaviridae
Citoplasmatic Acidofilă Paramyxoviridae
Reoviridae
Rhabdoviridae (corpi Babeş-
Negri)
Nuclear şi Acidofilă Poxviridae (corpi Guarnieri)
citoplasmatic V. rujeolei
 Citomegalovirus

Tabel 5: Exemple de virusuri ce determină incluzii virale

5. ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ŞI CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

Factorii fizici şi chimici pot acţiona asupra virusurilor (acid nucleic, capsidă,
înveliş) prin modificarea unor proprietăţi fizice ale virionilor (constantă de sedimentare,
încărcătură electrostatică) sau prin modificarea compoziţiei constituenţilor virali.
Rezultatul cel mai important al acţiunii convergente a factorilor fizici şi chimici
este pierderea infectivităţii (capacităţii de multiplicare în celula virus-sensibilă).

5.1. ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ASUPRA VIRUSURILOR

Căldura
Virusurile, în preparatele proaspete (produs patologic), sunt relativ stabile la
temperatura camerei, cu pierderea în timp a infectivităţii.
O temperatură de 50-60°C inactivează virusurile, prin denaturarea proteinelor
capsidale, uneori inactivarea fiind însoţită şi de pierderea proprietăţilor antigenice
(denaturarea specificităţii antigenice).
Temperaturile joase reprezintă un mijloc eficient de conservare a virusurilor, în
condiţii speciale (în azot lichid şi în mediu cu substanţe protectoare) putând fi păstrate
timp indefinit.
Tratamentul mecanic
Prin agitare se asigură dezintegrarea suspensiei virale.
La valori înalte de presiune mecanică virusurile sunt rezistente.
Presiunea osmotică acţionează nociv numai când se produc şocuri osmotice.
Modificări mai discrete ale presiunii osmotice pot duce la schimbări în compoziţia
chimică a proteinelor capsidale.
Ultrasunetele
Acţionează asupra virusurilor cu structură simplă (simetrie helicoidală, fără
înveliş) în formă de baghetă, fiind ineficientă asupra virionilor sferici sau cărămidiformi.
Desicarea
La uscăciune şi la temperatura camerei unele virusuri sunt inactivate
(mixovirusuri şi paramixovirusuri), în timp ce alte virusuri rezistă destul de mult timp în
aceleaşi condiţii (enterovirusuri).
Radiaţiile
Indiferent de natura radiaţiilor, ionizante (X, radiaţii ale izotopilor radioactivi) sau
neionizante, (ultraviolete), efectul de iradiere depinde de doi factori: energia quantică şi
natura materialului absorbant. În plus există substanţe care protejează virionul împotriva
efectelor radiaţiilor, cum sunt proteinele sau agenţii reducători.
Radiaţiile ionizante acţionează prin două mecanisme: denaturarea proteinelor şi
acizilor nucleici (lacună în lanţul polinucleotidic, modificarea biochimică a structurii
bazelor pirimidinice) şi efectul de ionizare (formarea de radicali liberi -OH, formarea de
peroxizi). La doze mai mici de radiaţii ionizante, nu se produce inactivarea virusului, ci
apar mutaţii genice induse.
Radiaţiile ultraviolete se absorb selectiv la nivelul acizilor nucleici,
îndeosebi ADN, determinând formarea dimerilor pirimidinici toxici. Modificările induse
sunt reversibile, selectându-se indivizi rezistenţi la efectul radiaţiilor, prin procesele de
fotoreactivare şi restaurare la întuneric.
- Fotoreactivarea: radiaţiile luminoase pot activa o enzimă care clivează dimerii
pirimidinici toxici;
- Restaurarea la întuneric (“dark repair”) constă în faptul că, la întuneric, are loc
acţiunea succesivă a trei enzime: o endonuclează care desprinde dimerul pirimidinic de
pe ADN; o exonuclează care formează “lacune” de-a lungul moleculei alterate de ADN,
prin clivare secvenţială; o ADN-polimerază care umple lacunele, folosind ca matrice
porţiunea omologă din lanţul geamăn de ADN, nealterat.

5.2. ACŢIUNEA AGENŢILOR CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

Enzime
Majoritatea virusurilor manifestă rezistenţă marcată la acţiunea RN-azei, DN-azei
şi a unor proteaze. Papaina activată inactivează unele virusuri, pronaza atacă efectiv
capsida.
Agenţi care denaturează proteinele
Dintre aceşti agenţi cei mai cunoscuţi prin efectul lor asupra virusurilor sunt:
detergenţi sintetici, solvenţii lipidelor de tip eter, cloroform (ambele categorii inactivează
virusurile cu înveliş lipidic), ureea şi guanina (desprinderea capsidei fără a altera acidul
nucleuic), valorile înalte sau joase de pH ale mediului (împiedică ataşarea pe receptorii
celulari).
Agenţi oxidanţi
Sunt cunoscute acţiunile peroxizilor (procese oxidative la nivelul proteinelor
capsidale), acidul nitros (mutagen în doze mici, inactivant în doze mari), agenţii
alchilanţi (desfacerea lanţului polinucleotidic), beta-propiolactona (agent puternic
alkilant şi acylant, inactivând virusurile rapid, uneori cu conservarea imunogenităţii).
Formaldehida
Inactivează virusurile rapid dar le conservă imunogenitatea.

6. GENETICĂ VIRALĂ
6.1. Mutaţia virală
Este o greşeală în autoreplicarea acidului nucleic viral, în cursul formării de noi
progeni (indivizi rezultaţi din multiplicarea virusului în celula gazdă). Progenii deosebiţi
genetic de particulele virale parentale se numesc mutante virale. Aceste mutaţii pot fi:
spontane (mutaţii întâmplătoare, fără intervenţie umană, prin alterarea spontană a unei
baze) şi induse (apar experimental sub acţiunea unor factori mutageni fizici - radiaţiile
ionizante, sau chimici - acidul nitros, coloranţii acridinici, analogii halogenaţi ai bazelor
pirimidinice: 5-bromdeoxiuridina, 5-fluorouracil).
 Mecanisme care stau la baza mutaţiilor sunt: substituirea unor baze; adiţia unor
perechi de baze necomplementare; inserţia mutagenului între două baze vecine de pe
acelaşi lanţ de acid nucleic viral, urmată de citirea greşită a perechilor de baze; deleţia
(desprinderea) unei părţi din genomul viral în cursul ciclului biologic viral, avînd drept
consecinţă oprirea procesului de multiplicare şi apariţia de particule virale defective.

6.2. Interacţiuni genetice între virusuri

Se produc în urma infecţiei mixte a unei celule gazdă cu două sau mai multe
virusuri diferite, astfel încât progenii produşi în urma ciclului de multiplicare virală
exprimă caractere mixte, primite de la virusurile parentale.
Noţiunea de interacţiune genetică (interschimburi de segmente de acid nucleic
între genomuri aparţinând unor virusuri diferite) cuprinde fenomenele de recombinare,
reasortare etc. În cazul recombinării virale schimbul de material genetic se produce
intramolecular. Reasortarea poate avea loc la virusuri cu genomuri plurimoleculare
(fragmentate-segmentate) în care moleculele separate de acid nucleic se reasociază pentru
a forma genomuri noi.
Pentru realizarea interschimbului de material genetic între virusuri diferite există

cel puţin două condiţii care trebuie îndeplinite:

- genomurile virusurilor implicate trebuie să se afle în aceeaşi celulă, condiţie

îndeplinită de infecţia simultană (coinfecţie);
- între genomuri să existe omologii structurale ale acizilor nucleici (nu se pot produce

interacţiuni genetice între virusuri ARN şi virusuri ADN.

Procesul de interacţiune genetică între virusuri are foarte mare importanţă pentru
HIV şi virusurile gripale, la care, prin circulaţie interumană, datorită recombinărilor
genice, apar noi tulpini, variante genetice.

7. APĂRAREA ORGANISMULUI ÎMPOTRIVA VIRUSURILOR

Infecţia virală este supusă în general legilor procesului infecţios, care reprezintă

rezultanta între capacitatea patogenă a agentului infectant şi mijloacele de apărare ale

organismului. Aceste mijloace de apărare, nespecifice şi specifice (imune), acţionează de

regulă concertat.

7.1. Apărarea nespecifică antivirală

a. Bariere naturale cutanate şi mucoase
 Bariere mecanice: integritatea epiteliului (obstacol împotriva virusurilor mari:
poxvirusuri, herpesvirusuri); mucusul de la suprafaţa mucoasei respiratorii; acidul
hialuronic din cimentul intercelular al epidermului şi substanţa fundamentală a dermului
constituie o barieră eficientă faţă de agenţii virali cu tropism cutanat (mai ales că, spre
deosebire de bacterii, virusurile sunt lipsite de echipament propriu de enzime
depolimerizante);
Bariere fizice şi chimice: pH scăzut al pielii (defavorizează persistenţa
virusurilor pe piele), mucopolizaharide în salivă şi în secreţiile căilor respiratorii
superioare, HCl din stomac;
Bariere biologice: relaţia de antagonism între diverse virusuri ce coexistă
(ocuparea prin competiţie de către enterovirus a celulelor cu platou striat din epiteliul
mucoasei intestinului subţire împiedică intrarea unui agent viral omolog sau heterolog);
relaţia de antagonism între flora bacteriană normală din microbiocenozele organismului
şi virusuri.

b. Reacţia febrilă
Se produce prin eliberarea secundară a unui factor pirogen, în cursul circulaţiei
virusului în umori.
Eficienţa febrei în apărarea antivirală este tradusă atât prin accelerarea eliminării

urinare a virusului cât şi prin activarea circulaţiei centrale şi periferice, creşterea

catabolismului celular datorită eliberării de hormoni tiroidieni şi steroizi în cursul febrei.

Eliberarea acestor hormoni limitează multiplicarea virusului în celulele sensibile

(modificând susceptibilitatea receptorilor de suprafaţă ai acestora) şi potenţează unele

posibilităţi de apărare nespecifică (elaborarea de interferon, strss-ul antiviral).

În acelaşi timp, însă, nu trebuie neglijată posibilitatea ca în stări febrile

determinate de diferite cauze (virale sau nevirale) să se producă actualizarea clinică a

unei infecţii virale latente (v. herpes simplex). Astfel, putem afirma că nu întotdeauna

creşterea temperaturii reprezintă un factor propri-zis de apărare, ci, din contră, chiar

favorizează multiplicarea agentului viral în organism.

c. Stress-ul antiviral
Agentul viral poate acţiona ca declanşator al activităţii axului hipotalamus -
hipofiză anterioară (ACTH) - suprarenală cu eliberarea de hormoni steroizi, în cantităţi
inferioare dozelor imunosupresive şi interferon-inhibitorii, dar suficiente în limitarea
dispersiei virusurilor. Glucocorticoizii determină: fixarea hormonului prin competiţie pe
receptorii celulari pentru virus, împiedicând adsorbţia; solidizarea membranelor
lizozomale fiind împiedicată eliberarea enzimelor lizozomale (proces necesar
multiplicării unor virusuri); potenţarea activităţii de protecţie exercitată de interferon
asupra unor celule învecinate celulelor virus-infectate.

d. Factori interni umorali (serici)

În cadrul factorilor serici de apărare nespecifică antivirală intervine şi sistemul
complementului care determină liza celulelor “ţintă” . Importanţa acestuia în viroze este
însă mult mai puţin importantă decât în bacterioze. S-a stabilit cu certitudine rolul
inactivant al complementului, în perioada de viremie, faţă de unele virusuri (gripale,
urlian, Herpesvirusuri, poxvirusuri), ca şi rezistenţa marcată a unor virusuri la acţiunea
acestuia (polio, adenovirusuri).

e. Factori interni celulari - fagocitoza virală

Procesul activ de includere şi inactivare intraleucocitară (fagocitoza propriu-zisă)

trebuie diferenţiată de prezenţa virusului în leucocite, care reflectă tropismul leucocitar al

acestuia.

Fagocitoza virală eficientă, în care macrofagele au rol mai activ decât

granulocitele neutrofile, a fost atestată în infecţiile cu virusuri gripale, virusuri Coxackie
şi virusuri din grupul Herpes. Agentul viral inclus în fagocit poate fi inactivat (acţiune
reală de apărare antivirală), dar poate şi supravieţui cu multiplicare ulterioară (infecţie
persistentă), devenind astfel inabordabil mijloacelor de apărare imună pe linie umorală şi
celulară.
Înglobarea şi distrugerea germenilor microbieni este inhibată profund de unele
virusuri prin efectul imunosupresiv al acestora, cum este cazul v. gripale, v. rujeolos,
virusurilor Coxackie şi virusurilor din grupul Herpes. După viroze, ce au ca agenţi
etiologici virusurile enumerate mai sus, se constată scăderea rezistenţei organismului cu
posibilitatea instalării unor complicaţii bacteriene.

f. Elaborarea de interferon
Interferonul reprezintă un complex proteic, secretat de celulele infectate cu virus,
care protejează alte celule sănătoase împotriva infecţiei cu un agent viral omolog sau
heterolog. Există trei categorii de interferon: α interferon (leucocite), β interferon
(fibroblaste), γ interferon (limfocite T imune).
Sinteza de interferon are loc sub influenţa unor inductori virali (v. gripale, v.
paragripale, v. urlian, arbovirusurile, v. vaccinia, herpesvirusurile, v. polio, v. rujeolos, v.
Coxackie) şi inductori nevirali (bacterii sau endotoxine bacteriene - Salmonella, E. coli,
Bordetella pertussis, rickettsii, micoplasme, unele antibiotice etc.).
Mecanismele de acţiune ale interferonului au fost evidenţiate atât la nivel local cât

şi la distanţă.
 Mecanisme de acţiune locală ale interferonului:

- ataşarea moleculelor de interferon pe suprafaţa celulei (la nivelul unor receptori

celulari) → semnal care prin intermediul moleculelor de AMPc (aminofosfat ciclic) este
transmis către genom → derepresarea unei gene structurale → codifică producerea unui
ARN mesager nou → sinteza la ribozomi a unei proteine “PIT - proteină inhibitoare a
translaţiei” → maschează ribozomii celulari astfel încât acidul nucleic viral intrat în
celulă nu-şi mai poate codifica sintezele de proteine proprii la nivelul aparatului
ribozomal al celulei parazitate;
- stoparea procesului de decapsidare a virusului;
- inhibiţia sintezei unor enzime precoce (ARN polimeraza) şi implicit inhibiţia sintezei
copiilor de acid nucleic;
- intervenţia unei endonucleaze celulare (indusă de interferon la nivelul receptorilor

celulei protejate) care potenţează inhibiţia translaţiei mesajului genetic la nivelul

ribozomilor (alături de PIT) şi blochează sintezele de proteine virale, în fazele tardive.

Mecanisme de acţiune ale interferonului la distanţă:

- stimularea producţiei de IL-2 limfocitară;
- potenţarea unor funcţii macrofagice: prelucrarea antigenului, secreţia de monokine
activatoare, intensificarea citotoxicităţii macrofagice (naturală, prin armare,
anticorpodependentă);
- activarea celulelor natural-ucigaşe (NK).

7.2. Apărarea specifică (imună) antivirală

Apărarea specifică în viroze se realizează prin modificări pe linie umorală şi
celulară, celulele efectoare fiind anticorpii (în imunitatea umorală) şi limfocitele T
citotoxice (în imunitatea celulară).

7.2.1. Proprietăţi fundamentale

Imunitatea specifică posedă trei proprietăţi fundamentale:
· specificitatea: recunoaşterea strictă, specifică, a moleculelor străine organismului;
· diferenţierea între „ self“ şi„ non-self“: capacitatea răspunsului imun de a face
diferenţierea între structuri străine organismului, dar asemănătoare cu structuri proprii
ale organismului uman.
· memoria imunologică: capacitatea unora din celulele implicate în realizarea
răspunsului imun primar (celule de memorie) de a reţine specificitatea antigenului cu
care oganismul a venit pentru prima oară în contact, iar la al doilea sau următoarele
contacte ale organismului cu acelaşi antigen, aceste celule să îl recunoască şi să se
diferenţieze specific, inducând un răspuns imun specific secundar, mult mai prompt.

7.2.2. Caracteristicile antigenelor virale

Antigenele virale prezintă două caracteristici:
 - imunogenitatea: este capacitatea antigenelor virale de a produce răspuns imun
specific, umoral şi celular;
- antigenitatea: este capacitatea antigenelor de a reacţiona cu anticorpii specifici, in
vivo şi in vitro.

7.2.3. Localizarea antigenelor proprii virionului

Antigenele proprii virionului pot fi:
a. antigene de suprafaţă:
- antigene de înveliş (în cazul virusurilor anvelopate), de natură glicoproteică:
 hemaglutinine: v. gripale, v. paragripale, v. rujeolos;
 neuraminidaze: v. gripale, v. paragripale;
 glicoproteine: gp120, gp41 (HIV), gpG (v. rabic);
 proteine: Ag HBs (v. hepatitic B);
 factori de fuziune: v. paragripale, Ag Lydma (v. Epstein-Barr);

antigene capsidale (în cazul virusurilor neînvelite):

-
 v. polio: proteinele VP1, VP2, VP3;
 v. polyoma: Ag VP1;
 adenovirusurile: proteinele structurale ale hexonilor şi proiecţiilor fibroase;
Rolul antigenelor de suprafaţă:
- de ataşare la receptorul celular;
- de inducere de anticorpi neutralizanţi (HA - v. gripale, întreaga capsidă - v. polio);
- activitate hemaglutinantă;
- de fuziune cu membranele celulare.
b. antigene interne:
· antigene asociate nucleocapsidei: Ag HBc (v. hepatitic B); Ag NP, NC, N
(paramyxovirusuri); Ag NP (v. gripal); Ag p24, p17, p24 (HIV);
· asociate cu proteina M: v. paragripale, v. rujeolos.
Caracteristici ale antigenelor interne:
- sunt mai puţin expuse decât antigenele învelişului;
- induc apariţia de anticorpi fixatori de complement.

7.2.4. Superantigene
Reprezintă o categorie de antigene virale care se comportă diferit în relaţia cu
limfocitul, comparativ cu modalitatea clasică de interacţiune, şi anume: dacă clasic,
prezentarea antigenului de către celula prezentatoare de antigen (APC) are loc la nivelul
„situsului de legare“ al CMH II, constituit din lanţurile α şi β, iar după prezentare
antigenul este recunoscut de către regiunea variabilă a TCR (Vα şi Vβ) de pe limfocitul T
CD4, având drept consecinţă stimularea unei clone de limfocite T, în cazul
superantigenelor legarea antigenului se face numai la porţiunea variabilă a lanţului β
(Vβ) a TCR, deci la exteriorul situsului combinativ, ceea ce va determina o activare
excesivă de celule T, deci o hiperstimulare, ceea ce poate duce la deleţii şi anergie
limfocitară.
Exemplu: retrovirusurile - HIV: datorită comportamentului său ca superantigen
determină imunosupresia: subseturi de limfocite T CD4, Vβ ar fi activate specific,
subseturi în care are loc multiplicarea preferenţială a HIV, ceea ce duce la infectarea şi
distrugerea lor.

7.2.5. Răspunsul imun în viroze

Imunitatea specifică reprezintă răspunsul specific, dirijat strict faţă de un anumit
antigen, al organismului infectat cu un virus. Acest răspuns poate fi: umoral, realizat
prin imunoglobuline (anticorpi) şi celular, realizat prin intermediul limfocitelot T. Cele
două verigi acţionează complementar şi sinergic. Atât răspunsul imun umoral, cât şi
răspunsul imun celular, pot evolua ca: răspuns imun primar şi răspuns imun secundar.

a. Răspunsul imun primar

Apare la primul contact al organismului cu un antigen (virus), ponderea celor
două categorii de efectori variind în funcţie de tipul antigenului şi modul în care acesta
este prezentat celulelor imunocompetente. În general, răspunsul imun primar este
timpuriu, puţin specific, pasager.
Răspunsul imun primar evoluează în 4 faze:
- de latenţă (de lag): durată 2-5 zile; antigenul este prelucrat şi prezentat de către APC
limfocitelor B şi T, care sunt activate pentru începerea sintezei de anticorpi sau pentru
activarea altor subseturi de limfocite T;
- de creştere exponenţială sau logaritmică: durată 2-3 zile şi constă în creşterea
uşoară, constantă a răspunsului specific;
- de platou (staţionară): durată 3-5 zile, intensitatea răspunsului nu prea înaltă, dar el
se menţine la un nivel constant;
- de declin: răspunsul diminuă progresiv în intensitate, până la epuizarea sa totală,
sau până la un nivel minim, de regulă neprotector.

b. Răspunsul imun secundar

Se mai numeşte şi reacţie anamnestică, deoarece se manifestă după reexpunere la
acelaşi tip de antigen, cu care organismul a mai venit în contact. Răspunsul imun
secundar reflectă o reacţie mai precoce, mai promptă, mai rapidă, mai iniensă, mai
persistentă, mai eficace. Etape:
- faza de latenţă: apare scurtată sau absentă;
- în faza exponeţială: creşterea intensităţii răspunsului imun este rapidă;
- în faza staţionară: instalată după 4-7 zile de la contactul cu antigenul, apare un nivel
ridicat al reacţiei imune - de 4-7 ori mai mare decât nivelul maxim al reacţiei imune
primare, şi pentru o perioadă mai mare de timp;
- în faza de declin: răspunsul scade uşor, cu menţinerea de obicei a unui fond rezidual
protector.
Capacitatea organismului de a dezvolta un răspuns imun secundar se bazează pe
„memoria imunologică“.
Baza celulară a memoriei imunologice este expansiunea unei populaţii de
limfocite sensibilizate în raport cu antigenul. Există limfocite T şi B de memorie care
diferă de limfocitele nesensibilizate. Asfel, limfocitele B de memorie produc anticorpi de
tip IgG, timpuriu, cu afinitate mare şi timp îndelungat. Limfocitele T de memorie răspund
la doze minime de antigen, ceea ce semnifică existenţa unor receptori mai eficienţi, cu
afinitate mai mare.
 Intervenţia imunităţii specifice, umorale sau celulare, se realizează numai după
pătrunderea antigenului viral în organism şi recunoaşterea acestuia de către celulele
imunocompetente.
Pentru recunoaşterea lui de către limfocitele B sau limfocitele T antigen reactive,
se impune prelucrarea acestui antigen de către celule specializate (microfage sau
macrofage) care după prelucrare, îl prezintă spre recunoaştere limfocitelor T sau B
antigen reactive.
Etapa de recunoaştere, prelucrare şi prezentare a antigenului viral se realizează
prin intervenţia celulelor prezentatoare de antigen (APC), care pot fi:
· macrofage şi monocite;
· celule dendririce:
· celule Langerhans din epiderm;
· astrocitele de la nivelul sistemului nervos, cu rol în imunitatea locală, funcţionând
ca fagocite sau ca APC sub restricţie CMH, sintetizând totodată enzime,
prostaglandine, IL-6; rol de mediere între neuroni şi limfocitele T;
· limfocitele B - uneori, antigenul fixându-se pe receptorul de natură
imunoglobulinică.
Prezentarea antigenului este făcută sub restricţie CMH II.

7.2.6. Răspunsul imun umoral (RIU)

Caracteristicile RIU:
* intervenţie prioritară: în cazul infecţiilor virale cu evoluţie acută sau subacută;
* locul impactului antigen viral/verigă efectorie: la distanţă variabilă de la locul de
pătrundere al acestuia în organism;
* veriga efectorie: anticorpi sau imunoglobuline;
* modaliăţi de testare a răspunsului imun: reacţii antigen-anticorp. Exemple: reacţii de
aglutinare, reacţii de precipitare, reacţii de neutralizare, reacţii de fixare a
complementului, reacţii de aglutinare-liză, dar şi reacţii cu reagenţi marcaţi
(imunofluorescenţă, ELISA, RIA).

Clasele de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD

IgG constituie peste 75% din totalul Ig serice. Rol:
- principalii anticorpi cu rol în neutralizarea virusurilor;
- în limitarea diseminării virale;
- în scăderea încărcăturii virale şi eliminarea virusului din compartimentele
extracelulare; mecanism: activează complementul şi, prin citotoxicitate celulară
anticorpo-dependentă, elimină celulele infectate cu virus;
- rol preponderent în răspunsul imun secundar;
- rol în fagocitoza opsonică.

IgM sunt anticorpi liberi prezenţi în ser sau fixaţi pe membrana celulelor B;
reprezintă 10% din totalul Ig. Prezenţa IgM în ser este indicator de infecţie virală acută.
Funcţii:
- sunt primii anticorpi care apar după contactul cu antigenul, prezenţa lor fiind
caracteristică RI primar;
 - activează complementul, acţiune extrem de eficace, o singură moleculă de Ig M
fiind capabilă să iniţieze reacţiile în lanţ.

IgA este principala Ig de la nivelul mucoaselor. Este prezentă şi în diverse

secreţii ale organismului (salivă, lacrimi, colostru, lapte, secreţii vaginale, intestinale),
iar în ser 15%. Sunt 2 tipuri de IgA:
· Ig A serică: monomer alcătuit din lanţul L (k sau λ) şi Hα;
· IgA secretorie: dimer sau tetramer (rezultat prin legarea monomerilor între ei prin
segmentul J). La acestea se adaugă piesa secretorie, secretată de celulele epiteliale ale
mucoaselor, cu rolul de a transporta molecula de IgA la suprafaţa celulelor epiteliale şi
de a conferi rezistenţă la enzimele proteolitice.
Există 2 subclase. IgA1 şi IgA2. Funcţii:
- protejează mucoasele de agresivitatea vitală, prin legarea acestora la mucoase.
Astfel, se controleazî prin IgA intrarea virusurilor în organism la nivelul căilor de
intrare orofaringiană, respiratorie (v. gripale, v. paragripale), gastrointestinală
(enterovirusuri), urogenitală;
- limitează şi împiedică viremia în infecţiile sistemice (poliomielitei). După
imunizare antipolio se dezvoltă imunitatea locală mediată de IgA.

IgE se găseşte în ser în cantităţi foarte mici (0,04%), în colostru, în secreţiile

nazale, oculare, bronhice, iar în intestin sunt legate citofil de receptorii Fc ai
mastocitelor. Funcţii:
- declanşează reacţii de tip anafilactic, ca urmare a legării cu anumite alergene.

IgD sunt prezente în ser în cantităţi mici (0,2%) sau fixate pe suprafaţa
limfocitelor B. Principala funcţie:
- în diferenţierea limfocitelor B.

Semnalul primar în sinteza anticorpilor este recunoaşterea antigenului de către

IgM sau IgD de pe suprafaţa limfocitului B (receptorul pentru antigen de pe linfocitul
B-BCR- „B- cell receptor“).

Mecanismele efectoare ale imunităţii umorale

a. Neutralizarea virală
Neutralizarea are loc în două faze:
· reversibilă: legătura anticorp-antigen se desface dacă intervin anumiţi factori: pH -
trecerea de la pH de neutralitate la pH alcalin sau acid, mai mic de 4; factor de diluţie -
amestecuri de v. gripal şi ser îşi recapătă infectivitatea după diluare;
· ireversibilă: legătura anticorp-antigen devine stabilă, fiecare anticorp legându-se de
două situsuri antigenice situate pe monomeri diferiţi. Complexele stabile pot fi disociate
enzimatic.
Neutralizarea se realizează prin:
° alterări ale capsidei virale la virusurile neanvelopate, ceea ce împiedică
decapsidarea, eliberarea acidului nucleic viral şi iniţierea ciclului infectant;
° modificări conformaţionale ale proteinelor învelişului viral la virusurile cu
înveliş (v. paragripale), sub acţiunea concertată a IgM şi complementului;
 ° alterări ale ciclului de multiplicare virală:
- aderarea anticorpilor la antigenele suprafeţei virale previne adsorbţia şi pătrunderea
virusului în celula gazdă (rotavirusuri);
- blocarea secvenţelor peptidice terminale ale fibrelor adenovirusului tip 3 de către
anticorpi duce la blocarea adsorbţiei şi pătrunderii intracelulare a virusului;
- la virusurile învelite pătrunderea virusului în celulă se face prin fuziune între învelişul
viral şi membrana endozomului în condiţii de pH acid. Anticorpii pot produce
modificări conformaţionale ale factorului de fuziune (ex.. factorul de fuziune -
proteina E a virusului West-Nile) şi inhibă iniţierea ciclului infectant vital prin
inhibiţia fuziunii din interiorul endozomului.

b. Neutralizarea în prezenţa complementului

Neutralizarea virusului se realizează independent de complement, dar

este potenţată de prezenţa complementului, mai ales la virusurile învelite.
Legarea anticorpilor la antigenele învelişului viral activează complementul,
inducând viroliza (coronavirusuri).
Fenomenul predomină în răspunsul imun primar, când anticorpii din clasa IgM,
sunt intens activatori de complement.
· Opsonizarea
Imunoglobulinele IgG1 şi IgG2 pot favoriza distrugerea virusurilor prin fixarea
lor prin capătul Fc la receptorul celular pentru Fc al macrofagului şi cu celălalt fragment
-Fab- de suprafaţa virusului. Virusul acoperit de anticorpi va fi recunoscut de macrofag şi
va fi fagocitat (enterovirusuri).
· Citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi - antibody dependent cellular
citotoxicity
Citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC) este indusă de legarea
IgG, mai puţin a IgM şi IgE, de determinanţii antigenici prezenţi pe suprafaţa celulei
infectate (prin fragmentul Fab). Urmează ataşarea nespecifică a celulelor killer (K) şi a
monocitelor la fragmentul Fc al IgG şi declanşarea lizei celulare.
ADCC are rol important în vindecarea unor boli, precum rujeola, unde activitatea
ADCC apare târziu şi la titruri mai înalte decât cele neutralizante, corelându-se cu
scăderea viremiei.
· Complementul
Acţionează solidar cu anticorpii în reacţiile de neutralizare, intervenind activ în:
- liza celulelor infectate cu virus care expun la suprafaţa membranei complexe
antigen-anticorp. Cele mai susceptibile la acţiunea complementului sunt celulele
infectate cu virusuri învelite (orthomyxovirusuri, alphavirusuri, retrovirusuri).
Complexul C5b-C9 se încorporează în dublul strat lipidic, rezultând distorsiuni
structurale ale acestuia, orificii tubulare în membrană, care permit comunicarea
conţinutului celular cu exteriorul. Se produce creşterea de volum a celulei, apoi
dezintegrarea acesteia;
- liza virionilor şi neutralizarea virală, fiind implicate componentele: C1q, C1r, C1s,
C4. Se produce activarea pe cale alternativă, rezultând unitatea de atac membranar, care
 acţionează asupra învelişului viral şi produce viroliza. La unele virusuri (v. Newcastle,
oncovirusurile) calea alternativă acţionează în absenţa anticorpilor.
Alteori, interacţiunea virus-complement nu conduce la liză; inactivarea virusului
se realizează datorită unei reţele ce apare ca urmare a legării complementului (C3b) la
receptorii virusului.

7.2.7. Răspunsul imun celular (RIC)

Este răspunsul imun de interes major în viroze, având rolul de a elimina celulele
infectate cu virus şi a promova vindecarea.
Deficienţele congenitale sau câştigate ale imunităţii celulare sunt cauza evoluţiei
grave, cu generalizare şi sfârşit letal în unele viroze (herpes, rujeolă).
Caracteristicile RIC:
- intervenţie prioritară: în infecţii virale „lente“, subacute sau chiar acute;
- locul impactului antigen viral/verigă efectorie: aproape de poarta de intrare a
antigenului;
- veriga efectorie: celule specifice - limfocitele Tc (citolitice), celule NK (natural
killer);
- modaliăţi de testare a răspunsului imun: teste in vitro şi teste in vivo (IDR de tip
întârziat).
Răspunsul mediat celular presupune următoarele etape succesive: recunoaşterea
antigenului ca non-self; inducerea răspunsului prin activare specifică a celulelor imune;
distrugerea celulei-ţintă;
a. Recunoaşterea antigenului
Se efectuează de către limfocitele T antigen-reactive prin intermediul TCR,
antigenul fiind prelucrat de către aceleaşi celule prezentatoare de antigen ca şi în cazul
RIU şi prezentat spre recunoaştere sub formă de peptide şi în corelaţie cu moleculele
CMH (complex major de histocompatibilitate). Limfocitele T CD8+ recunosc antigenele
prezentate cu moleculele CMH clasa I, iar limfocitele T CD4+ recunosc antigenele
prezentate în legătură cu cu moleculele CMH clasa II.
b. Inducerea răspunsului prin activare specifică a celulelor imune
Celulele implicate în realizarea răspunsului imun, din punct de vedere
funcţional, pot fi împărţite în:
* limfocite T cu rol în reglarea răspunsului imun: Th (helper); Ta (amplificatoare);
Ts (supresoare); Tcs (contrasupresoare);
* limfocite T efectoare, cu acţiune distructivă asupra celulei-ţintă, cu caracter
specific (Tc-citotoxice) şi caracter nespecific (NK,K,LAK).
c. Distrugerea celulei-ţintă
Se realizează sub acţiunea limfocitelor Tc, sau a celulelor NK.
· Mecanismele citotoxicităţii limfocitelor Tc
Linfocitele Tc induc citoliza prin două tipuri de mecanisme:
* citoliză în absenţa anticorpilor şi a complementului, cu următoarele etape:
- contact stâns între limfocitul Tc şi celula-ţintă, contact favorizat de prezenţa
moleculelor de adeziune;
- sinteza în endozomii limfocitului Tc de granule citolitice care conţin: perforine
(proteine formatoare de pori), serinesteraze, înrudite cu componenta C9;
- perforinele, în prezenţa ionilor de Ca2+, produc leziuni transmembranare, formând
în dublul strat lipidic, pori, prin care este eliminat conţinutul celulei-ţintă în exterior,
ionii şi proteinele cu greutate moleculară mică. Consecutiv, în celulă intră apa, creşte
presiunea osmotică, se produce deformarea nucleului, umflarea şi dezintegrarea celulei;
- după începerea lizei celulei-ţintă, imediat se produce desprinderea limfocitului Tc.
* distrugerea celulei-ţintă prin apoptoză.
Fenomenul are loc în absenţa secreţiei perforinelor membranare şi este precedat
de fragmentarea nucleului celulei-ţintă. Factorul responsabil de acest fenomen este
interacţiunea dintre ligantul Fas, sintetizat în cursul activării limfocitului Tc, şi molecula
Fas, de pe celulele-ţintă, inductoare de apoptoză.
· Mecanismele citotoxicităţii NK
Sunt similare citotoxicităţii prin limfocite Tc, fiind admise ambele mecanisme.

7.2.8. Citokine
Sunt mediatori chimici solubili secretaţi de diverse populaţii celulare, cu funcţii
multiple şi complexe: semnale intercelulare, modulatori ai unor răspunsuri imune
nespecifice şi specifice, sau reglatori ai unor activităţi celulare (proliferare, diferenţiere).
După activităţile dominante, citokinele pot fi clasificate astfel:
- citokine cu rol în imunitatea specifică: interleukine (IL);
- citokine cu rol în procesele inflamatoare şi antitumorale: factorul de necroză
tumorală (TNF);
- citokine cu rol în activitatea nespecifică antivirală: interferonii (IFN).

7.2.9. Autoimunitatea în viroze

Infecţia virală poate declanşa procese autoimune prin mai multe mecanisme:
· modificarea antigenelor self spre non-self de către virusuri (exemple: artrita
reumatoidă - v. urlian, v. rubeolic; hepatite cronice - v. hepatitice B, C, D; PES - v.
rujeolos);
· alterarea capacităţii normale de recunoaştere a antigenelor de către limfocitele T
sau B, prin alterarea receptorilor BCR sau TCR de către virus (v. coriomeningitei
limfocitare);
· dezechilibru al limfocitelor imunomodulatoare cu hipertonus Th2, ceea ce
stimulează producţie de autoanticorpi faţă de diverse autoantigene modificate de infecţia
virală;
· răspuns în anticorpi antiidiotip generaţi de infecţia virală care reacţionează cu
selful.

7.2.10. Imuosupresie virală

Virusurile pot determina imunosupresie. Mecanismele imunosupresiei pot fi:
° efect citocid direct al virusurilor asupra limfocitelor (HIV, v. hepatitice B, C, D);
° alterarea procesului de recunoaştere a antigenului de către BCR sau TCR, prin
fixarea virusului, prin competiţie cu epitopii antigenici, la nivelul receptorului pentru
antigen (v. rujeolos, v. Coxsackie, HIV, v. citomegalic);
° interferarea virusului cu unele căi metabolice de activare a limfocitelor implicate
în recunoaştere, prin situarea lui pe căile de iniţiere a senmalului fosfotirozin-kinazei,
oprind procesul de transformare blastică specifică a acestora în prezenţa antigenului;
° alterarea cascadei citokinice prin creşterea tonusului treptelor supresoare, inclusiv
prin deprimarea limfocitelor CD8+11b+ (HIV, v. citomegalic, v. gripal, HIV+HBV).

7.2.11. Imunotoleranţa în viroze

Imunotoleranţa este starea de echilibru stabilită între organism şi virusul
infectant. Virusul circulă liber în umori, se multiplică în ţesuturi, fără a declanşa un
răspuns imun adecvat şi nici fenomene patologice evidente (v. rubeolic, v.
coriomeningitei limfocitare).
Există şi o imunotoleranţă constituţională faţă de unele virusuri, ceea ce explică
insuccesul unor vaccinări.

7.2.12. Imunopotenţare virală

Agravarea evoluţiei unei viroze se poate datora intervenţiei unor factori imuni,
um ar fi Ig G, care pot modifica suprafaţa virionului, facilitând pătrunderea acestuia
în celula pentru care prezintă tropism, producând implicit accelerarea infecţiei virale de
tip litic.
Compexele antigen viral-IgG intră mai uşor în celula gazdă, deci se accelerează
relaţia litică.
În cazul v. cu tropism leucocitar (v. rujeolos), prezenţa receptorilor pentru
fragmentul Fc al anticorpilor antivirali pe suprafaţa leucocitelor, facilitează intrarea
virionului în leucocit, deci relaţia de tip litic.

8. PATOGENITATE VIRALĂ ŞI TIPURI DE INFECŢIE VIRALĂ

Există mai multe tipuri de infecţie virală la om şi la animal, şi anume: infecţii

localizate, infecţii diseminate (generalizate), infecţii inaparente, infecţii lente.

8.1. Infecţiile virale localizate

Sunt mai rare, multiplicarea virală şi leziunea virus-specifică sunt limitate la
poarta de intrare. Au loc mici diseminări ale virusului, dar acestea se mărginesc la
interesarea ţesutului conjunctiv din apropierea porţii de intrare.

8.2. Infecţii virale diseminate

Majoritatea virusurilor determină astfel de infecţii. Pot fi enumerate mai multe
faze:
· Multiplicarea virală primară la poarta de intrare
Virusurile pot pătrunde pe diferite porţi de intrare: calea respiratorie (mixo-,
paramixo-, adenovirusuri); calea digestivă (enterovirusuri); calea conjunctivală
(adenovirusuri); calea sanguină directă (multiplicarea lipseşte) prin injecţii (HIV,
hepatitei B); muşcături de animale (v. rabic); înţepătura unor vectori (arbovirusuri).
Rezistenţa la poarta de intrare faţă de virus se datoreşte atât barierelor mecanice
cutanate sau mucoase, cât şi elaborării locale de interferon sau de IgA secretorii. Un rol
important în limitarea trecerii virusului dincolo de poarta de intrare îl are şi imunitatea
celulară locală, realizată de limfocitele timodependente din formaţiunile limfoide
limitrofe.
· Viremia primară, prezenţa virusului în torentul circulator, este o fază neobligatorie;
semnele clinice manifeste lipsesc.
· Multiplicarea virală secundară, fază ce se caracterizează prin localizarea şi
multiplicarea virusurilor în anumite organe; este neobligatorie, fiind specifică numai
anumitor virusuri.
· Viremia secundară constă în răspândirea virusurilor fie pe cale circulatorie (sânge,
limfă), fie de-a lungul nervilor (v. rabic, arbovirusuri). Este o fază obligatorie în
infecţiile virale diseminate, semnele clinice de debut sunt prezente şi este posibilă
izolarea virusurilor din sânge.
· Fixarea virusului în celule (ţesuturi) ţintă, cu localizarea şi multiplicarea virusului
în ţesuturile pentru care are tropism, este însoţită de apariţia leziunilor sau semnelor de
boală manifestă.
În cursul unei viroze diseminate se produce şi excreţia de virus, fie prin poarta de
intrare (secreţie nazofaringiană, fecale, leziune cutanată), fie la nivelul sistemelor
fiziologice de eliminare (fecale, urină).

8.3. Infecţia virală inaparentă

Prezenţa virusului fără semne clinice poate fi determinată de adenovirusuri,
enterovirusuri, virusuri din grupul Herpes (herpes simplex, varicella-zoster). Factorii care
determină infecţiile virale inaparente sunt multipli: natura virusului infectant (circulaţia
în populaţia umană a tulpinilor virale moderat virulente sau atenuate), gradul de
rezistenţă nespecifică şi specifică (imună) a organismului gazdă, incapacitatea unor
virusuri de a ajunge la ţesuturile ţintă sau fenomenul imunotoleranţei organismului gazdă
faţă de unele virusuri.

8.4. Infecţia virală latentă

În acest tip de viroze (prezenţa virusului cu reactivare periodică) se crează un
echilibru între virusul infectant şi organismul parazitat, care are drept consecinţă apariţia
unor boli cu evoluţie lungă, uneori cu pusee şi perioade de “linişte” clinică, alteori cu
alură subacută sau cronică progresivă. Exemple: infecţiile latente cu virusuri din grupul
Herpes (factori declanşatori: emoţionali, nutriţionali, infecţii intercurente, ciclu
menstrual, intoleranţă digestivă); infecţiile cu adenovirusuri, virusuri de tip C, infecţii cu
virusuri “lente” (varianta neurotropă a virusului rujeolos care poate determina
panencefalita sclerozantă subacută demielinizantă). În cazul acestei categorii de viroze
lente intervin fenomenele de autoimunitate şi imunotoleranţă.

9. VACCINURI VIRALE
Prima imunizare activă (vaccinare) antivirală a fost vaccinarea antivariolică cu
virus vaccinia, efectuată în 1798 de către Jenner. După criteriile componentelor virale din
vaccin, vaccinurile virale sunt de două categorii: inactivate şi vii.

9.1. Vaccinuri inactivate

Virusuri multiplicate pe o gazdă sensibilă, apoi inactivate (temperatură ridicată,
formol, betapropriolactonă), cu păstrarea capacităţii imunogene dar cu pierderea
capacităţii patogene. Exemple: vaccinul antirabic, antigripal, antirujeolos,
antipoliomielitic. Nu sunt nocive (incapabile de a produce boală), dar prezintă anumite
dezavantaje: induc imunitate antivirală umorală de scurtă durată (nu celulară, nu locală),
iar agentul inactivant poate determina reacţii de intoleranţă locale sau generale.

9.2. Vaccinuri vii

Conţin tulpini de virus vaccinal capabile ca, administrate receptorului uman, să se
multiplice la poarta de intrare, fără a produce boala, dar determinând un răspuns imun
eficient. Sunt de două feluri.
- vaccinuri vii cu virusuri nepatogene pentru om, înrudite antigenic cu agentul viral
cauzator al bolii pentru care se face imunizarea activă. Exemplu: vaccinul
antivariolic, care constă în aplicarea pe cale transcutană sau percutană a virusului
vaccinia (nepatogen pentru om dar identic antigenic virusului variolic). Răspunsul imun
umoral şi celular indus de către vaccinarea cu virus vaccinia asigură protecţia solidă şi
îndelungată împotriva variolei.
- vaccinuri vii atenuate - “adaptare” a unor populaţii virale pe anumite substraturi
de multiplicare, cu pierderea patogenităţii. Exemple: antipolio cu administrare orală,
antirujeolos cu administrare parenterală.
Avantajul vaccinurilor virale vii constă în realizarea unui răspuns imun umoral şi
celular solid, de lungă durată (antipolio crează şi un ecran de protecţie locală - IgA
secretor).
Dezavantajele acestor vaccinuri, deşi puţin numeroase, sunt demne de toată
atenţia. În cazul vaccinurilor vii neatenuate (virus vaccinal), unii indivizi receptori, pe
teren de imunodeficienţă, pot prezenta o boală generalizată (vaccină) sau reacţii de
hipersensibilitate imediată (alergie), uneori cu semne neurologice grave. În cazul
vaccinurilor vii atenuate nu poate fi înlăturat riscul selecţiei unor particule virale
patogene cu apariţia unor cazuri de boală.

10. CHIMIOPROFILAXIE ŞI CHIMIOTERAPIE ANTIVIRALĂ

Exită două categorii de dificultăţi care limitează introducerea chimioprofilaxiei

antivirale:
- deoarece agentul viral utilizează aparatul ribozomal al celulei parazitate în vederea

programării propriilor sinteze, este dificil de delimitat, în funcţie de natura şi doza

chimioterapicului, acţiunea inhibitorie asupra multiplicării virale de deprimarea funcţiilor

de biosinteză celulară normală (dificultatea precizării concentraţiilor virulicide şi toxice

de drog);

- acţiunea eficientă a chimioterapicelor antivirale are loc numai în fazele precoce ale
infecţiei virale, înainte de apariţia manifestărilor clinice ale bolii.
După acţiunea lor întâlnim două categorii de chimioterapice: agenţi care
împiedică adsorbţia, penetrarea şi decapsidarea virusului şi agenţi care inhibă sintezele de
tip viral în celula virus-parazitată. La aceste două categorii de chimioterapice se poate
adăuga şi interferonul, care are acţiuni terapeutice particulare.

10.1. Agenţi care împiedică adsorbţia, penetrarea şi decapsidarea

Amantadina - blochează ataşarea virusului pe celula gazdă prin inhibarea
neuraminidazei (enzimă prezentă în învelişul virusului). Acţionează selectiv asupra unor
virusuri ARN: v. gripale, paragripale, v. respirator sinciţial, v. rubeolic.

10.2. Agenţi care inhibă sintezele de tip viral în celula virus-parazitată

Chimioterapice cu acţiune asupra virusurilor ARN: hidroxibenzil-
benzimidazol (HBB), guanidina care blochează activitatea ARN-polimerazei virus-
dependente (enterovirusuri); Ribavirinul care inhibă multiplicarea virusului rujeolos prin
substituirea unor nucleozide din molecula de ARN viral.
Chimioterapice cu acţiune asupra virusurilor ADN: Rifampicina, eficientă în
fazele timpurii ale ciclului viral, premergătoare apariţiei primelor manifestări clinice;
Thiosemicarbazonele (metisazonă) care inhibă sinteza proteinelor virale (apariţia de
proteine virale tardive nefuncţionale) la unele virusuri ADN (adenovirusuri, poxvirusuri);
compuşii citozin-arabinosid (ara-C) şi adenin-arabinosid (ara-A) care inhibă sinteza de
ADN viral (herpes simplex, varicella-zoster, v. citomegalic).

PRIONII ŞI PRIONOZELE
GENERALITĂŢI
În ultimii 5 ani, preocuparea pentru bolile prionice a depăşit domeniul medical,
intrând în atenţia opiniei publice mondiale datorită problemelor majore de sănătate
publică ridicate, cu implicaţii atât în relaţiile economice, cât şi politice, statale şi
interstatale.
 Semnalul de alarmă a fost dat în anul 1994, în Anglia, de apariţia noilor variante
de boală Creutzfeldt-Jakob (CJ) anume, 20 de cazuri la tineri. Variantele de CJ s-au
dovedit a fi produse de tulpini prionice cu proprietăţi pe de o parte distincte de cele
incriminate în alte tipuri de boală CJ (sporadică, genetică) cunoscute până atunci, iar pe
de altă parte cu proprietăţi foarte apropiate de cele ale tulpinilor din ESB (encefalopatia
spongiformă bovină). Aceste aspecte au condus la conluzia că prin consumul de carne de
vită (probabil infectată cu agentul prionic ESB), aceste tulpini s-au transmis, odată cu
carnea infectată, pe cale enterală, la om, generând boala prionică, demonstrându-se în
acest fel, absenţa oricărei bariere interspecie (bovine-om) pentru agentul prionic infecţios.

PRIONII sunt agenţi infecţioşi de natură proteică, cu proprietate unică, aceea de

a se multiplica, deşi sunt lipsiţi de acid nucleic, responsabili de inducerea unor afecţiuni
ale sistemului nervos central, la om şi la animale, denumite encefalopatii spongiforme
transmisibile (EST).
Aceste encefalopatii spongiforme transmisibile (EST), sunt boli
neurodegenerative cauzate de un agent patogen a cărui natură, proprietăţi, multiplicare şi
transmisie rămân încă şi astăzi incomplet cunoscute; ele se caracterizează printr-o
perioadă foarte lungă de incubaţie (perioadă de infecţie ce durează luni până la 30 de ani),
perioada de boală propriu-zisă (odată cu apariţia primelor semne clinice şi cu evoluţia
unor tulburări grave anabolice), totdeauna cu sfârşit letal.
Până astăzi au fost descrise următoarele boli prionice:
- la animale: boala scrapie, ESB (bovină), encefalopatia transmisibilă a nurcilor, a
antilopei africane şi elanilor, a felinelor şi a struţilor;
- la om: boala kuru, boala Creutzfeldt-Jakob, sindromul Gerstman-Straussler (SGS),
insomnia fatală familială (IFF), boala Alper.
Termenul de prion, semnificând „proteine infecţioase” - „protinaceous infectious
particle“ (PrPres, PrP), a fost introdus în biologia moleculară de către Stanley Prusiner
de la Universitatea San Francisco în 1982 anterior acest agent infecţios fiind cunoscut sub
numele protovirinae, virinos, virus latent, virus conveţional. După teoria lui Prusiner,
aceşti prioni ar reprezenta agenţi infecţioşi lipsiţi de agenţi nucleici, formaţi exclusiv
din proteine, ceea ce apărea în totală contradicţie cu dogma centrală a biologiei
moleculare, prin acceptarea unei codificari şi multiplicări ale acestei proteine prionice
infecţioase, nu prin intermediul propriului agent nucleic al agentului prionic, ci prin
intermediul acidului nucleic al celului gazdă (figura 2).
 Figura 2: Structura prionilor.
(sursa: http://www.creutzfeld.univ.lyon1.fr)

Conform unei ipoteze recente (anul 2000) prionii ar fi nişte epigene care ar fi
transferate de la un organism la altul prin intermediul unui ADN cu rol de vector, dar nu
şi de genă.
Altă teorie susţine că responsbil (vector) de transmisia bolii prionice naturale
scrapie le oi şi capre ar fi un agent microbian. Proteina acestui agent microbian s-ar
asemăna cu PrPc(proteina celulară normală de la suprafaţa membranei plasmatice),
fiind capabilă a se replica în celula gazdă prin folosirea ADN gazdei mamifer. Simultan
cu această multiplicare, proteina microbiană ar putea declanşa în celula gazdă o reacţie
autoimună şi/sau degenerativă, un fenoment asemănător fiind descris faţă de antigenul
proteic al amibei Naegleria gruberii.
O altă ipoteză susţine că: expunerea bianuală în anii '80, în Anglia, a animalelor la
avicidul phosmet (folosit la tratarea păşunilor pentru îndepărtarea păsărilor) şi ingerarea
acestor substanţe toxice odată cu furajele (absorbţia enterală) - o primă concentrare în
ţesuturile animale, urmată de a 2-a concentrare cu ocazia prelucrării industriale a prafului
de oase şi organe animale pentru hrana vitelor, a dus la acţiunea nocivă, remanentă a
concentratului de avicid din praful furajer asupra PrPc din SNC al bovinelor furajate
artificial, având drept rezultat apariţia isoformei patologice PrPres responsabilă de
apariţia ESB epidemic. Comform acestei ipoteze ESB determinată de acţiunea omului ar
fi o clasă nouă de manifestări cronice neuroexcitotoxice întârziate induse de phosmet la
bovinele sensibile.
PrP este produsul de clivaj al unei proteine normale de 33-35 kDa (PrPc).
Proteina precursoare este o glicoproteină cu o structură tridimensională unică,
prezentă la suprafaţa membranei plasmatice a tuturor celulelor din organism, dar cu cea
mai mare concentraţie pe suprafaţa celulelor neuronale (figura 3). Ea are rol în:
- memorie (prin codificarea şi conservarea stabilă a informaţiei). Este foarte abundentă
în special în hipocamp (sediul memoriei), primul simptom al bolii prionice (prin
distrugerea PrPc şi acumularea PrPres) fiind pierderea memoriei;
- în transmisia sinaptică (interacţiuni cu receptorii de acetilcolină - în reglarea
numărului de chemoreceptori pentru acetilcolină);
- rol trofic pentru celulele cerebeloase Purkinje cărora le asigură longevitatea;
- rol în stabilirea conexiunilor celulă-celulă în ariile sinaptice, şi între celulele
neuronale - celule gliale;
- rol în menţinerea somnului şi reglarea intensităţii acestuia;
- rol în reglarea unor aspecte legate de metabolismul Cu++, determinând creşterea la
stressul oxidativ prin exercitatea unei acţiuni de echilibrare a nivelurilor Cu/Zn SOD
(cantitatea exagerată de PrP ducând la scăderea rezistenţei la acest tip de stres).

Lizozom

Endozom

Figura 3: Patogenia infecţiei prionice (sursa: http://www.creutzfeld.univ.lyon1.fr)

PrP este izoforma patologică de tip PrPSC, PrPESB şi PrPCJD a proteinei normale
PrPc; structura primară a ambelor proteine este asemănătoare (de 250 de aminoacizi),
dar structura secundară este diferită: PrPc are structura secundară de tip α-helix, pe când
cea a PrPs (scrapie) este de tip β-plisat, însoţită de modificări ale structurii terţiare.
Această PrP aparţine grupului de proteine denumite autofoldaze, capabile de
autoreplicare, denumite şi „chaperone“, având rolul de supraveghere posttranslaţională
în sinteza proteinelor, pentru realizarea corectă a conformaţiei structurale a acestora.
Astfel, PrPc nou sintetizată, pentru a deveni activă, are nevoie de o structură secundară de
tip α-helix. Plierea corectă se realizează în prezenţa unei proteine „chaperone“.
PrP apare într-un proces de alterare (conversie) postranslaţională a structurii
secundare (conversie din forma de împăturire alfa-helix în conformaţie beta de foi pliate)
şi terţiară (sub influenţa ionilor de Cu) a proteinei PrPc normale a gazdei, proces de
conversie prin care izoforma câştigă capacitate de a-şi codifica infecţiozitatea. Astfel,
această proteină PrP „chaperone“ anormală apărută va servi posttranslaţional ca
matriţă pentru realizarea de structuri de tip β-plisat, în loc de α-helix. Aceste proteine
PrPcanormale se comportă ca un agent infecţios, utilizând proteinele celulare pentru
propagarea exponenţială a informaţiei structurale, anormale, proprii.
PrP se izolează din plăcile amiloide cerebrale, fiind componentul principal al
acestora.
Morfologic, apar ca structuri filamentoase „SAF“(scrapie associated filaments).
PrP are greutate moleculară de 21-30kDa.
PrP purificată polimerizează sub formă de bastonaşe, cu dimensiuni de 10-20nm,
care se aseamănă cu amiloidul, ultrastructural şi biochimic.
Susceptibilitatea la EST este determinată genetic.
Expresia PrPc umană este codificată de gena PRNP, de pe braţul scurt al
cromozomului 20. Această genă are un cadru deschis de citire de 253 de codoni (ORF).
Unele EST la om sunt familiale, ereditare: boala Creuzfeld-Jacob (BCJ), boala
Gerstman-Sträussler-Scheincker (BGSS), insomnia fatală familială (IFF), sugerând o
transmitere de tip autosomal dominant.
Aspectele diferite clinice, histopatologice sunt determinate de numeroase mutaţii
punctiforme care interesează codonii din regiunea ORF ai genei PRNP. Astfel, mutaţiile
în codonii 200, 210, 232 determină tabloul clinic al BCJ, mutaţiile codonilor 117, 198,
217 se corelează cu BGSS, iar mutaţiile situate la codonii 129, 178 cu IFF sau BCJ
(secundar mutaţiilor sinteza de valină va duce la apariţia BCJ, sinteza de metionină la
IFF).
Polimorfismul codonilor poate fi factor asociat al diversităţii clinice.

CULTIVAREA PRIONILOR
Pentru cercetarea relaţiei prioni-celulă gazdă s-au folosit animale (cimpanzei) şi
substraturi celulare de creier, la care s-au administrat suspensii de creier de la bolnavi cu
boală Kuru sau BCJ.
- Animale
Cimpanzeii inoculaţi intracerebral cu suspensii de creier de la bolnavi de Kuru sau
filtrate acelulare de la pacienţi cu BCJ, au reprodus boala după o latenţă de 1 an.
S-a demonstrat de asemenea că numeroase alte specii animale pot fi infectate cu
astfel de produse: maimuţe, şoareci, hamsteri, nurci, pisici, oi, bovidee. Concluzia:
prionii pot fi transmisibili interspecii.
- Culturi celulare
 Culturi de explanturi de creier inoculate cu agenţi Kuru sau ai BCJ îşi păstrează
infectivitatea pe o perioadă de 25-70 zile de menţinere a acestora in vitro.

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI, CHIMICI ASUPRA PRIONILOR

PrP sunt rezistente la agenţii care inactivează acizii nucleici: radiaţii ionizante,
radiaţii u.v., nucleaze (DN-aze, RN-aze), proteze.
PrP sunt rezistente la agenţi chimici ca: aldehidele (formaldehide, glutaraldehide),
propiolactona, hidroxilamina, psoralen.
PrP sunt parţial inactivate de: căldură (1000C), fenol, hidroxid de Na.
Agenţii prionici sunt foarte rezistenţi la metodele obişnuite de sterilizare, iar
fixarea în formol a ţesuturilor animale determină creşterea rezistenţei agenţilor prionici
chiar şi la autoclavare ulterioară la 1340C timp de o oră. În prezent se consideră drept
sterilizare eficientă menţinerea probelor infectate 1 oră în soluţii NaOH 1M urmată de
autoclavare la 1340C timp de 30min, doar în cazul netratării anterioare în etanol sau
formol. În 1999 literatura de specialitate modernă consideră drept cel mai bun procedeu
pentru distrugerea agenţilor, tratamentul cu acid picric saturat 15 minute, urmat de
autoclavare sub presiune la 1210C, 10 minute, tratament cu acid formic la 5 minute, şi
apoi cu guanidintiocianat 4M, 2 ore la +4 grade Celsius.
Rezistenţa particulară a PrP ar fi expresia modificărilor sale conformaţionale,
care determină deficienţe de transportare la suprafaţa celulei şi de catabolizare,
consecinţa fiind tendinţa de a forma agregate fibrilare, cu acumulare anormală în
substanţa cerebrală şi dezogarnizarea acesteia.

PATOGENIE
 Intrarea în organism a agenţilor prionici se face pe:
- cale orală: este cazul bolii Kuru care a apărut datorită canibalismului practicat ca
ritual de către componenţii unor triburi din Papua (Noua Guinee) prin ingestie de
creier de la decedaţi, sau a encefalopatiei spongiforme bovine (ESB), care a apărut
consecutiv hrănirii bovinelor cu făină de carne, insuficient prelucrată termic,
provenită de la oi şi capre;
- parenteral: prin injecţii cu preparate contaminate, transfuzii, intervenţii
chirurgicale, transplanturi de organe;
- căi potenţiale de contaminare iatrogenă: creierul şi alte ţesuturi (duramater,
cornee).

 Diseminarea în organism:
- pe cale limfatică: după o primă replicare în ganglionii regionali, invadează căile
limfatice, apoi calea sanguină şi, prin intermediul trombocitelor infectate, se
localizează în ţesutul reticulo-endotelial;
- pe cale nervoasă, centripet, pe traseele nervoase prin măduvă la SNC.
Studii recente au demonstrat că după infectarea cu agent prionic infecţios a
ţesutului cerebral al animalului respectiv se declanşează o suprastimulare a sistemelor
cerebrale GABA şi glutamat-ergice pe termen lung, ceea ce corespunde perioadei de
latenţă (de infecţie) până la declanşarea bolii -emergenţa primelor semne clinice- care
duce la distrugerea sistemului inhibitor GABAergic al creierului şi la un proces
neurotoxic generalizat.
Nu se cunosc modalităţile de eliminare din organism ale prionilor, deşi prionii au
fost evidenţiaţi în sânge şi urină.

ASPECTE ANATOMO-PATOLOGICE
Din punct de vedere anatomo-patologic, toate encefalitele spongiforme se
caracterizează prin degenerarea celulelor neuronale cu vacuolizare progresivă a corpilor
neuronali, dendritelor şi axonilor, cu proliferare reactivă glială astrocitară excesivă în
zona corticală şi subcorticală, cu depunerea unor fibre formate dintr-o isoformă
patologică (PrPs ) a proteinei prionice celulare PrPc cu aspect tubulovezicular în
prelungirile postsinaptice. În final, aspect de „status spongious“ al materiei cenuşii.

ASPECTE CLINICE
EST la om sunt: boala Cteuzfeld-Jacob (BCJ), boala Gerstman-Sträussler-
Scheincker (BGSS), insomnia fatală familială (IFF), boala KURU.

Boala Creuzfeld-Jacob(BCJ)
Debutează în jurul vârstei de 65 de ani, cu oboseală, anxietate, confuzie. În
perioada de stare apar miocloniile, ataxia cerebeloasă, simptome piramidale şi
extrapiramidale, mutism akinetic, demenţă progresivă. Evoluţia este fatală în decurs de 6
luni-1 an.
Există 3 forme de BCJ:
 sporadică: corelată cu rata mutaţiilor ce pot surveni în gena PRNP;
 familială-ereditară: datorată mutaţiilor punctiforme sau de inserţie în regiunea
genei PrPc;
 iatrogenă: urmarea unor tratamente sau manevre chirurgicale
În 1997 literatura cita mai mult de 100 de cazuri de BCJ iatrogenă. Această formă
poate apărea la orice vârstă, se datorează transmiterii agentului prionic infecţios prin
instrumente infectate (electrozi pentru EEG, instrumente chirurgicale, stomatologice, de
explorări paraclinice, ORL), implantarea la om de biomaterie de origine umană (grefa de
cornee, de duramater, de timpan, grefoane cutanate de la cadavru cu boală CJ, ipotetic
grefoane de orice ţesut infectat cu agent CJ) sau de origine animală (valve cardiace de
origine bovină), produse de sânge şi plasmă provenind de la persoane infectate cu agent
CJ, administrare de hormoni pituitari de creştere din extrase de hipofiză de la cadavre
cu boală CJ, vaccinare cu vaccin antirabic preparat din ţesut cerebral de la animal
infectat cu agent prionic, preparate cosmetice sau farmaceutice din ţesut bovin,
infectarea personalului medico-sanitar (chirurgi, neurochirurgi, ortopezi, ORL-işti,
stomatologi, anatomo-patologi) prin microtraumatisme în cursul unor intervenţii pe
bolnavi sau manipulări de ţesuturi infectate cu agent CJ.
Varianta nouă a BCJ (CJnv) reprezintă o entitate distinctă clinico-patologică,
semnalată între 1994 şi 1998 în Anglia (48 de cazuri) şi Franţa (3 cazuri) care afectează
adolescenţi şi persoane tinere (26-29 de ani), homozigoţi pentru metionină la codonul
129. Clinic se caracterizează prin apariţia precoce a tulburărilor psihice, urmate de ataxie,
 mişcări involuntare, tulburări cognitive- pierdere de memorie, durata medie a bolii fiind
18 luni.

Boala Gerstman-Sträussler-Scheincker (BGSS)

Cu caracter familial, apare la vârsta de 45-50 ani, cu o simptomatologie
asemănătoare BCJ, dominată de ataxie spinocerebelosă şi demenţă.

Insomnia fatală familială (IFF)

Descrisă de Medori în 1992, este o boală cu caracter familial (într-o singură
familie au fost afectaţi 29 membri pe parcursul a 5 generaţii). Clinic se manifestă prin:
insomnie netratabilă, mioclonii, ataxie, hipertermie, tahicardie, hipertensiune, confuzie,
halucinaţii. Histologic: atrofie selectivă a nucleilor anterior ventral şi mediodorsal.
Durata bolii: 13 luni.

Boala KURU
Se caracterizează clinic prin: ataxie cerebeloasă (kuru-tremurături), rigiditate,
caşexie progresivă , cu sfârşit letal.

EST la animale:
1. Scrapie (la tremblante sau trotting desease)
Este prezentă sub formă de infecţie endemică la oi şi capre. În ultimii 4 ani au fost
semnalate epidemii de scrapie în Irlanda, Islanda, Cipru (facând referire specială la Franţa
- 21 de epidemii în 1998). S-a dovedit că susceptibilitatea animalelor la infecţie e legată
de cea a codonilor 136, 154 şi 171. În studii efectuate s-a dovedit că la 80% din oile
infectate cu scrapie, isoforma patologică PrP rezistentă la nuclează, a fost detectată în
probe de ţesut de splină, ganglioni limfatici, placentă. Cea mai frecventă cale de
transmitere ramâne însă calea orală.

2. ESB („boala vacii nebune”)

E considerată o boală creată de mâna omului. A fost semnalată pentru prima oară
în Anglia. A apărut drept consecinţă a unei practici greşite industriale de tratare termică a
prafului de carne, de creier, ce provin de la oi şi capre, probabil infectate cu PrP folosite
ca adaos alimentar pentru bovidee. Carcasele acestor animale nu au mai fost pretratate
prin extracţie cu solvenţi organici timp de 8 ore, proces urmat de expunerea la vapori
supraîncălziţi pentru îndepărtarea solvenţilor. Fără această procedură infectivitatea
prionilor se conservă, iar adaosul în hrană a determinat epidemia de encefalopatie
spongiformă bovină (ESB) prin inocularea agentului scrapiei la bovine.
Perioada de incubaţie a durat 3-8 ani, primele cazuri de boală clinică
(excitabilitate, mişcări nervoase ale urechilor şi ochilor, hipersensibilitate la atingere,
zgomot, lumină, ataxie) apărând la 70.000 de bovine; deşi în 1989 s-a renunţat la această
practică de hrănire a animalelor, între 1989 şi 1994 epidemia de ESB a cuprins 25.404 de
cirezi. În 1996 o nouă epidemie în Anglia a dus la sacrificarea (incinerarea) a 14 milioane
de bovine, culminând cu apariţia primelor noi cazuri de boală CJnv la om. Realitatea
ultimilor ani a prezentat proba cea mai convingătoare a dipariţiei barierei dintre specii în
cursul transmiterii ESB de la bovine la om. În ultimii 4 ani au fost depistate epidemii de
ESB în Anglia, Irlanda, Franţa.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
În ultimii ani a fost studiat un număr mare de teste de laborator pentru
diagnosticul ante-mortem al infecţiei prionice, dar dificultăţile întâmpinate s-au dovedit
deosebit de mari: metodele utilizate nu au dus totdeauna la detecţia PrP în eşantioanele
înalt infecţioase. S-a constatat că prezenţa PrP nu poate fi detectată (sub valoarea de 1
milion de particule infecţioase/g ţesut cerebral) în stadiile timpurii ale infecţiei
(perioada asimptomatică). PrP nu a putut fi niciodată evidenţiată în elementele figurate
albe ale sângelui şi nici în mixturile de hormoni de creştere cu agent prionic prezent care
au provocat bloala CJ.
Produsele patologice analizate: biopsii de ţesut cerebral, ganglioni spinali, nervi
periferici, sânge, LCR.

Metode de studiu:
Examenul histopatologic direct al ţesutului cerebral bioptic prezintă un risc
major (în caz de CJ) de morbiditate şi frecvent poate fi făcut fără a prinde zonele cu
leziuni caracteristice, obţinându-se astfel rezultate fals-negative.
Examenul imuno-histo-chimic este folosit pentru evidenţierea depozitelor de
PrP în ganglionii splinali, enterici şi nervi periferici în BCJ, GSS, IFF, ESB şi scrapie
prin tratarea amprentelor de ţesuturi cu anticorpi monoclonali marcaţi fluorescenţi.
Western blotting-ul (immunoassay) permite efectuare unui diagnostic
preclinic, precoce al BCJ, prin detectarea markerului PrP în material bioptic de ţesut
tonsilar şi apendicular uman, în LCR, sânge şi derivate de plasmă (albumină, Ig) până la
doza infectantă de 5-10 μg PrP şi respectiv 10 UI/ml. Markerul PrP este evidenţiat prin
cuplare cu anticorpi monoclonali.
PET-blotting-ul este o metodă mult mai sensibilă decât Western blotting-ul
convenţional. Cu această metodă devine posibilă detectarea PrPres şi în perioada de
incubaţie, cu mult înainte de aapariţia semnelor clinice, şi în cazul bolilor prionice cu
niveluri foarte scăzute de PrP. Tehnica este sensibilă la detectarea PrP în ţesuturi fixate
în formol şi incluse, în parafină. Cu această metodă poate fi investigat ţesut cerebral de
arhivă provenind din cazuri BCJ sporadice şi câştigate, ESB şi scrapie. Metoda a dat
rezultate concludente şi în cazurile în care imunchimia a fost echivocă sau chiar negativă.
Sunt în curs de standardizare metoda ELISA cantitativă, elecrtoforeza capilară,
sprectrioscopie în infraroşu.
PCR şi cromatografia au fost introduse în ultimii ani în practica medicală pentru
controlul produselor biofarmaceutice (derivate din plasmă), utilizate în tratamentul
coagulopatiilor.
PCR şi hibridizarea dot blot (cu marcare 32P) se folosesc pentru determinarea
variantelor alelice PrPc şi selectarea variantelor codonului 171 arginină care s-a dovedit
(la oi) corespunzător animalelor rezistente natural la scrapie, în vederea selecţionării, din
turmele de oi, a exemplarelor rezistente la infecţie, pentru crearea unor noi generaţii de
animale rezistente în focarele endemice.
Diagnosticul bolii prionice de certitudine rămâne evidenţierea leziunilor
histopatologice cerebrale, post-mortem.

EPIDEMIOLOGIE
 Rezervorul de boală: omul , dar şi animalele. Căile de transmitere a bolilor
prionice: orală, iatrogenă, cu caracter profesional.

1. Calea de tranmisie orală a agentului ESB

Indică rezistenţa la sucul gastric şi la proteazele intestinale, acesta ajungând la
ganglionii limfatici şi ileonul distal. Cercertări efectuate în Belgia în anul 2000 au
raportat 79 de cazuri confirmate anatomo-chimic şi imunohistichimic a fi boala CJD şi au
fost puse în legătură cu epidemia de ESB.
Noile variante CJ semnalate în Anglia şi Franţa care au afectat persoane tinere
(media vârstei 26-29 ani) în comparaţie cu cazurile clasice de CJ ce apar după 57 de ani,
au fost relaţionate cu consumul de carne de vită infectată cu agent ESB. Aceste cazuri
dovedesc că bariera de specie pentru agenţi prionici este depăşită. Dispariţia barierei de
specie s-ar datora capacităţii de adaptare prin anumite modificări genetice a
respectivului agent infecţios la noua gazdă, consecinţa acestor modificări genetice fiind
creşterea virulenţei.
Tot literatura de specialitate menţionează că fiind foarte grav faptul că
oficialităţile sanitare consideră drept absentă infecţia prionică acolo unde nu este
detectată prezenţa PrP, deşi poate exista agent infecţios foarte virulent (dar în cantitate
mică, încă nedetectabilă cu ajutorul tehnicilor de diagnostic actuale) şi care poate fi
transmis foarte uşor de la indivizi cu infecţii asimptomatice la indivizi sănătoşi. Astfel, în
cazul seviciilor veterinare carnea unor vite infectate (asimptomatice) considerate indemne
de infecţie (din cauza unor metode de laborator cu sensibilitate scăzută) poate fi dată în
consum, afectând populaţia.
Ţinând cont de aceste aspecte, cea mai urgentă datorie a specialiştilor este
analizarea cu mare atenţie a tuturor situaţiilor suspecte înainte de a se lua decizia
admiterii în consum a anumitor produse alimentare provenite din zone endemice, cât şi
aceea de implementare a metodelor celor mai eficace de diagnostic pentru depistarea
eficientă, cât mai precoce a agentului prionic infecţios.
În cazul epidemiilor de ESB carnea de la animalele (bolnave şi suspecte) se
distruge prin incinerare. În prezent nu se cunoaşte încă amplitudinea reală a contaminării
umane în Anglia unde au evoluat epidemiile din 1986-1996 de ESB, contaminarea bovină
reală actuală în câteva ţări deja menţionate în care a fost semnalată boala. Unele lucrări
de specialitate ridică ipoteza unei posibile infectări a apelor prin descărcarea agenţilor
prionici în apele deversate din zona abatoarelor şi păşunilor, ţinându-se cont de rezistenţa
foarte mare a infectivităţii lor în mediul extern.

2- Calea de transmitere iatrogenă

Transmiterea agentului prionic infecţios se pote realiza prin:
 instrumente infectate (electrozi pentru EEG, instrumente chirurgicale, stomatologice,
de explorări paraclinice, ORL);
 implantarea la om de biomaterie de origine:
- umană (grefă de cornee, de duramater, de timpan, grefoane cutanate de la
cadavru cu boală CJ, ipotetic grefoane de orice ţesut infectat cu agent CJ);
- animală (valve cardiace de origine bovină);
 administrarea de produse de sânge şi plasmă provenind de la persoane infectate cu
agent CJ;
 administrare de hormoni pituitari de creştere din extrase de hipofiză de la cadavre cu
boală CJ;
 vaccinare cu vaccin antirabic preparat din ţesut cerebral de la animal infectat cu
agent prionic;
 preparate cosmetice sau farmaceutice din ţesut bovin;
 infectarea personalului medico-sanitar (chirurgi, neurochirurgi, ortopezi, ORL-işti,
stomatologi, anatomo-patologi) prin microtraumatisme în cursul unor intervenţii pe
bolnavi sau manipulări de ţesuturi infectate cu agent CJ.
Din 1993 pe plan internaţional au fost luate măsuri de prevenire a răspândirii
agenţilor infecţioşi prionici prin excluderea donatorilor de sânge cu potenţial infectant
(donatori transfuzaţi). În prezent se discută excluderea donatorilor cu sejururi petrecute în
Marea Britanie şi în ţări cu ESB (Irlanda, Franţa, Belgia, Danemarca, Spania, Portugalia,
Italia, Germania, Luxemburg).
Având în vedere numărul mare de cazuri CJ iatrogen, cât şi rezistenţa foarte
înaltă a agenţilor prionici infecţioşi la procesele obişnuite de sterilizare, apare
recomandarea expresă pentru serviciile de chirurgie, anestezie şi reanimare etc. de
recunoaştere a pacienţilor cu risc şi de respectare, în legătură cu aceştia, a anumitor
măsuri de precauţie. Acestea se referă la faptul că instumentarul folosit pentru investigaţii
paraclinice (bronhoscop, endoscop), instrumente pentru intervenţii chirurgicale, canule
pentru intubaţie indotraheală la bolnavii cu CJ trebuie distrus (şi nu refolosit după o
sterilizare obişnuită), în ciuda tuturor pierderilor economice foarte mari pe care aceste
măsuri le provoacă serviciilor respective. Recomandările sunt valabile şi pentru serviciile
stomatologice, oftalmologice.
Perioada de incubaţie: 2 luni-2 ani.

3. Transmiterea cu caracter profesional

A fost semnalată la pesoane ce vin în contact cu ţesuturi infectate şi sânge:
măcelari, personal medical (neurochirurgi, oftalmologi, anatomopatologi, în ambulatorii
de asistenţă medicală, cabinete dentare, servicii chirurgicale neurologice, ORL,
prosecturi, bănci de ţesuturi şi organe).
Acest lucru este posibil datorită faptului că un agent infecţios prionic foarte
virulent (dar în cantitate mică, încă nedetectabilă cu ajutorul tehnicilor de diagnostic
actuale) poate fi transmis foarte uşor de la indivizi cu infecţii asimptomatice la indivizi
sănătoşi, de la produse de carne infectate la cei ce le manipulează.

PROFILAXIE
۰ excluderea de la donarea de organ a indivizilor cu antecedente familiale de boli
prionice şi a persoanelor la care li s-a administrat hormon hipofizar;
۰ manipularea cu precauţie a ţesuturilor şi organelor provenite de la pacienţi cu EST;
۰ sterilizarea corectă a instrumentarului;
۰ incinerarea produselor biologice contaminate;
۰ incinerarea carcaselor animalelor bolnave de EST.

TRATAMENT
 Până în prezent a fost testată eficenţa unui număr mare de preparate pentru
tratamentul bolilor prionice. Rezultatele nu sunt satisfăcătoare. Astfel se pot administra:
- amfotericina B (a determinat doar prelungirea perioadei de incubaţie în scrapie
experimental);
- blocante ale sistemului polianionic (polioxometalaţi şi polianioni organici);

PARAZITOLOGIE

Parazitii sunt organisme vii animale sau vegetale, care traiesc o perioada mai lunga sau
mai scurta a existentei lor in dependenta cu un alt organism viu, numit gazda.
Parazitismul nu reprezintă o formă degenerată de viaţă, ci din contră, o etapă mai mult
sau mai puţin perfectă de adaptare într-un mediu favorabil. Pentru a-şi asigura
perpetuarea propriei specii în natură, parazitul este supus unor transformări pentru
adaptarea la condiţiile organismului gazdă, derulându-se astfel ciclul biologic al
parazitului.
Parazitismul este o noţiune ecologică, motiv pentru care este necesară cunoaşterea
paraziţilor, a gazdelor lor, precum şi a corelaţiilor care rezultă ca urmare a supravieţuirii
unui organism pe seama altui organism viu.
Prezenţa paraziţilor în organismul uman determina formă nosologică, parazitoza.

CLASIFICARE

Paraziţii se pot clasifica după mai multe criterii:

1. După natura gazdei parazitate
a) paraziţi umani;
b) paraziţi ai animalelor(care se transmit si la om - antropozooparaziţi)
c) paraziţi strict ai animalelor
d) paraziţi ai plantelor

De stiudiul paraziţilor umani şi al antropozooparaziţilor se ocupă parazitologia

medicală, de studiul paraziţilor animalelor se ocupă medicina veterinară, iar de
studiul paraziţilor plantelor se ocupă parazitologia agricolă.
2. După natura parazitului
a) paraziţi animali: protozoare, helminţi, artropode
b) paraziţi vegetali: fungi

* PROTOZOARELE sunt organisme unicelulare încadrate după anuminte

proprietăţi commune în următoarele grupe:
- Rhizopodele. Reprezentanţii patogeni ai acestui grup sunt Entamoeba hystolitica
şi amibele libere: Naegleria fowleri, Acantamoeba polyphaga.
- Flagelatele. Au ca reprezentanţi: Giardia intestinalis şi Trichomonas vaginalis (ca
flagelate cavitare) şi Leihmania, Trypanosoma (ca flagellate sanguine).
 - Sporozoarele sunt protozoare complexe care au ca principali reprezentanţi genul
Plasmodium(agentul etiologic al malariei), Toxoplasma gondii, Criptosporidium,
Isospora belli, Sarcocystis.
- Protozoarele ciliate au un singur reprezentant semificativ: Balantidium coli.

*HELMINŢII sunt viermi paraziţi care trăiesc in organismul uman, la nivel

intestinal. Dupa morfologia lor, helminţii pot fi cilindrici(nemathelminţi) sau
plaţi(plathelminţi).

- Nemathelminţii de importanţă medicală pentru ţara noastră sunt: Ascaris

lumbricoides
Enterobius vermicularis
Trichuris trichiura
Anchylostoma duodenalis
Anchylostoma caninum
Srongyloides stercoralis
Trichinella spiralis
Toxocara canis
- Plathelminţii frecvent întâlniţi în zona noastră geografică sunt:
Fasciola hepatica
Diphylobotrium latum
Hymenolepis nana
Tenia saginata
Tenia solium
Diphilidium caninum
Echinococcus granulosum
Echinococcus multinocularis.

Helminţii au ca trăsătură comună faptul că în urma reproducerii sexuale produc ouă,

care fie direct, fie prin procese adaptative complexe, care conduc la formele larvare,
pot infecta alte persoane.

*FUNGII constituie obiectul de studiu al micologiei, fac parte din regnul Myceta şi
au ca reprezentanţi:
Candida
Aspergillus
Criptococcus neoformans
Dermatofiţi

3) după localizarea paraziţilor:

- Ectoparaziţi(care trăiesc pe suprafaţa tegumentului uman):
Pediculus
Acarieni
Heteroptere
- Endoparaziţi localizaţi în: cavităţi: intestin: Giardia, helminţi
vagin: Trichomonas, Candida
 ţesuturi: muşchi: Trichinela spiralis
ficat: Echinococcus granulosum
plămâni: Pneumocystis carini
celule: Toxoplasma gondi
Plasmodium(hematii)

4) după efectul paraziţilor asupra gazdei:

- Paraziţi incolini: folosesc organismul uman doar ca mediu de viaţă(Entamoeba
coli, Trichomonas intestinalis)
- Paraziţi comensali: trăiesc în organismul uman fară a-i produce
perturbări(Candida, Entamoeba hystolitica, Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis)
- Paraziţi condiţionat patogeni: paraziţi comensali pot deveni patogeni în prezenţa
unor factori favorizanţi. Persoanele asimptomatice parazitate cu paraziţi condiţionat
patogeni sunt considerate purtători de paraziţi şi joacă un rol important în diseminarea
parazitozei.
- Paraziţi oportunişti determină parazitoze simptomatice sau cu evoluţie clinică
uşoară la persoanele imunocompetente şi boli grave, adesea letale, la persoanele
imunocompromise, în special la pacienţii cu AIDS: Pneunocystis carinii, Toxoplasma
gondii, Criptosporidium , Criptococcus, Candida.
- Paraziţi patogeni: paraziţi a căror prezenţă în organismul uman declanşează
perturbări mai mult sau mau puţin grave.

5) după specificitatea parazitară se disting:

- Paraziţi stricţi: paraziţi adaptaţi doar la o singura gazdă definitivă, care nu pot trăi
la o altă gazdă definitivă(Tenia, PLasmodium)
- Paraziţi cu specificitate relativă: care pot trece de la o gazdă la alta mai mult sau
mai puţin uşor(insecte hematofage vectoare ale bolilor commune omului şi animalelor)

6) După evoluţia ciclului biologic există:

- Paraziţi permanenţi: întrega lor existenţă se produce în una sau mai multe
gazed(Tenia, Trichinella)
- Paraziţi temporary: o parte din viaţa lor se desfăşoară în stare parazitară,
prezentând însă şi stadii de viaţă liberă(Strongzloides stercoralis)
- Paraziţi facultative: în mod normal au o viaţă saprofită, dar uneori pot invada
organismul uman(Aspergillus)

7) După repartizarea geografică

- Paraziţii intâllniţi în zonele temperate determină parazitoze moderate ca
manifestare clinică, dar cu incidenţă crescută şi tendinţă spre evoluţie cronică(helmintoze
umane, micoze, unele protozooze)
- Paraziţii întâlniţi în zonele tropicale produc parazitoze endemice sau epidemice în
aceste zone, dar ocazional pot fi întâlniţi şi în zonele temperate, ca urmare a intensificării
migraţiei umane şi a mijloacelor rapide de transport actuale. Este important să fie
cunoscute, datorită gravităţii lor potenţiale şi necesităţii instituirii terapiei
corespunzătoare(amibiaza, tripanosomiaza), unele prezentând un character de extrema
urgenţă(accesul pernicios din malarie).
 CLASIFICAREA PARAZIŢILOR ŞI BOLILE PRODUSE

HELMINŢI

NEMATHELIMŢI
FAMILIA ASCARIDIDAE
Genul Ascaris
Ascaris lumbricoides Ascaridoza
Genul Toxocara
Toxocara cannis Larva migrans viscerală
FAMILIA OXIURIDAE
Genul Enterobius
Enterobius vermicularis Oxiuraza
FAMILIA TRICHURIDAE
Genul Trichiuris
Trichuris trichiura Tricocefaloza
FAMILIA ANCYLOSTOMIDAE
Genul Ancylostoma
Ancylostoma duodenalis Ancylostomiază
Ancylostoma cannis Larva migrans cutanată
Ancylostoma brasiliensis Larva migrans cutanată
Genul Necator
Necator Americanus
FAMILIA RHABDITIDAE(STRONGYLOIDIDAE)
Genul Strongyloides
Strongyloides stercoralis Strongyloidoză
FAMILIA TRICHINELLIDAE
Genul trichinella
Trichinella spiralis Trichineloză
FAMILIA ONCHOCERCIDAE
Genul Filaria
Wuchereria bancrofiti Filarioza Bancroft
Wuchereria pacifica Filarioza aperiodică a Pacificului
Onchocerca volvulus Oncocercoza
FAMILIA DRACUNCULIDAE
Dracunculus medinensis Dracunculoza
Dracunculus loa Loază

PLATELMINŢI
CLASA TREMATODE
FAMILIA FASCIOLIDAE
Genul Fasciola
Fasciola hepatica Fascioloză
Genul Fasciolepsis
 Fasciolopsis buski Distomatoza intestinală
Genul Fascioloides
FAMILIA DICROCELLIIDAE
Dicrocoelium dendriticum Distomatoza hepatică
FAMILIA OPISTORCHIIDAE
Opisthorchis felinaeus Distomatoya hepatică
Opisthorchis sinensis
FAMILIA TROGLOTREMATIDAE
Paragonimus westermani Distomatoza pulmonară
FAMILIA SCHISTOSOMIDAE
Genul Schistosoma
Schistosoma haematobium Schistosomoza urogenitaşă
Schistosoma mansoni Schistosomoza intestinală
Schistosoma japonicum Schistosomoza orientală

CLASA CESTODE
FAMILIA TENIIDAE
Genul Tenia
Tenia saginata Teniaza de carne de vită
Tenia solium Teniaza de carne de porc
Genul Echinococcus
Echinococcus granulosus Chist hidatic
Echinococcus multilocularis Echinococoza alveolară
Genul multiceps
Multiceps multiceps Cenuroza
Multiceps serialis Cenuroza
Multiceps crassiceps
FAMILIA HZMENOLEPIDAE
Hymenolepis nana Hymenolepiaza
Hymenolepis diminuta Hymenolepiaza murină
FAMILIA DILEPINIDAE
Genul Diphillidium
Duphillidium caninum
FAMILIA DIPHYLOBOTHRIIDAE
Genul diphylobotrium
Diphylobotrium latum Botriocefaloza

PROTOZOARE
CLASA RHIZOPODE
FAMILIA ENTAMOEBIDAE
Genul Entamoeba
Entamoeba histolytica Amibiaza intestinală, hepatică
Entamoeba hartmanni
Entamoeba coli
Genul Endolimax
 Endolimax nana
Genul Pseudolimax
Pseudolimax butschlii
FAMILIA HARTMANNELIDAE
Genul Acanthopodina
Acanthamoeba polzphaga Meningoencefalite amibiene
FAMILIA VAHLKAMPFIIDAE
Naegleria fowleri Meningoencefalite amibiene

CLASA FLAGELATE
FAMILIA HEXAMITIDAE
Genul Giardia
Giardia Intestinalis Giardioza
FAMILIA TRICHOMONADIDAE
Genul Trichomonas
Trichomonas vaginalis Trichomoniaza urogenitală
Trichomonas tenax Flageloza bucala
Trichomonas intestinalis Flageloza intestinală
Retortamonas intestinaslia Flageloza intestinală
Genul Dientamoeba
Dientamoeba fragilis
FAMILIA CHILOMASTIGIDAE
Genul Chilomastix
Chilomastix mesnili Flageloza intestinală
FAMILIA TRYPANOSOMIDAE
Genul Leishmania Lieshmanioza(viscerală, cutanată)
Genul trypanosoma

CLASA SPOROZOARE
Ordin Hemosporidia
FAMILIA PLASMOIDIDAE
Genul plasmodium Malaria
Ordin Piroplasmida
Grupul Babesia Babesioză
Subclasa Coccidia
Ordin Eucoccidiida
Subordin Eimeriina
Toxoplasma gonadii Toxoplasmoză
Isospora belli Izosporidiază
Cryptosporidium Criptosporidiază
Ordin Sarcosporidia
Genul Sarcocystis
Sarcocystis hominis Sarcocistoză
Ordiunul Microsporidia
FAMILIA MICROSPORIDIA
Genul Microspora Microsporidiază

CLASA CILIATE
Ordinul Spirotricha
FAMILIA TRICHOSTOMATINA
Genul Balantidium
Balantidium coli Balantidioză

PARAZIŢI CU TAXONOMIE INCERTĂ

Pneumocystis carinii Pneumocistoză
Blastocystis homminis Blastocistoză

ACŢIUNEA PARAZIŢILOR ASUPRA GAZDEI

Parazitismul nu este întotdeauna sinomin cu efectul pathogen. Prezenţa paraziţilor în
organismul uman induce diverse acţiuni, mai mult sau mai puţin pronunţate.
- Spolierea organisumului de substanţe nutritive
Acţiunea de spoliere este practic constantă la toţi paraziţii, care se dezvoltă deăinzând
de gazda lor. Dar, în majoritatea cazurilor, este nesemnificativă. Nu antrenează
manifestări detectabile decât în cazul unui număr mare de paraziţi sau dacă paraziţii
folosesc substanţe importante(prin spolierea vitaminei B12 rezultă anemia de tip
pernicious.
- Acţiunea traumatică şi bacteriferă
Leziunile cauzate de paraziţi constituie porţi de intrare pentru bacterii şi suprainfecţie
bacteriană: tricocefaloză, amibiază, chist hidatic.
- Acţiunea toxo-alergică
Manifestările alergice din helmintioze sunt cauzate de acţiunea produşilor lor
metabolici. Se pot produce fenomene toxo-alergice cutanate(urticarie),
pulmonare(sindrom Loffler), nervoase(cefalee, iritabilitate, insomnii, crize epileptiforme)
şi chiar şoc anafilactic(chist hidatic, trichineloză).
- Acţiune mecanică
Acţiunile mecanice sunt cele mai numeroase şi antrenează: efecte
microscopice(spargerea hematiilor parazitate de Plsmodium) sau fenomene
macroscopice: ocluzie(ocluzie intestinală prin ghem de ascarizi) şi fenomene de
compresie tisulară(chist hidatic, echinococoza alveolară).
- Acţiune iritativ reflexă
Acţiunea iritativ reflexă este mai evidentă la nivel intestinal. Creşte peristaltismul
intestinal sau apar fenomene de subocluzie în helmintioze.
- Acţiune iritativ tisulară
Acţiunea iritativ tisulară determină formarea de granuloame inflamatorii şi de focare
de fibroscleroză(colopatia postamibiană, amoebom, cisticercoză, trichineloză perichiste
în chist hidatic etc).

REACŢIA GAZDEI LA ACŢIUNEA PARAZITULUI

 În faţa acţiunii parazitare organismul uman răspunde prin reacţii celulare, tisulare,
immune. Unele dintre ele sunt doar consecinţa sau dovada parazitismului, în timp ce
altele constituie adevărate mijloace de apărare ale organismului.

REACŢII CELULARE
În diverse protozooze şi unele micoze, macrofagele fagocitează paraziţii şi constituie
primul sistem de apărare al organismului.
Eozinofilele şi mastocitele joacă un rol probabil considerabil în imunitatea faţă de
diverse helmintioze.
1. Anemia parazitară se observă într-un număr restrâns de parazitoze:
- paludism(malarie): anemie normocromă cu anizocitoză, poikilocitoză,
policromatofilie;
- leishmanioză viscerală: anemie normocromă;
- ancylostomiază: anemie hipocromă, microcitară;
- botriocefaloyă: anemie macrocitară cu megaloblastoză medulară;
Anemia apare în perioada de stare a parazitozei sau în faza sa cronică,
distingându-se:
- anemii hemolitice prin liza hematiilor prin paraziţi sau liza hematiilor prin
autoanticorpi(malarie);
- anemii prin sechestrare splenică(malaria viscerală);
- anemii posthemoragice(în tricocefaloză);
- anemii de tip megaloblastic(în botriocefaloză).
2. Hipereozinofilia parazitară
Hipereozinifilia poate fi locală sau generală.
Hipereozinofilia are cause diverse. Originea parazitară a unei hipereozinofilii se
poate preciza ţinându-se cont de următoarelşe particularităţi:
- Protozoarele şi fungi nu produc eozinofilie circulantă semnificativă;
- Hipereozinofilia este prezentă în helmintioze:
* în faza de maturare a helminţilor intestinali(Tenia, Tricocefal);
* în faza obigatorie tisulară la om, a formelor larvare(chist hidatic,
echinococoza alveolară);
*în faza tisulară de evoluţie a unor helminţi intestinali(Ascaris),
biliari(Fasciola hepatica), musculari(Trichinella). În asceste cazuri hipereozinofilia
sagvină existentă în faza de parazitism tisular dispare, prin dezvoltarea parazitului
intraluminal sau intramuscular.
Hipereozinofilia verminoasă evoluează stadial în timp, urmând curba Lavier
cu patru etape successive: latenţă, elevaţie, rapidă, platou, diminuare progresivă sau
revenire la normal pentru paraziţii cu fază primară tisulară.
După tratamentul antihelmintic se observă o creşere tranzitorie a
eozinofilelor ca urmare a lizei paraziţilor.
Hipereozinofilia verminoasă prezintă o deosebită importanţă practică,
reprezentând un element de orientare diagnostică, în special pentru parazitozele în care
atinge valori semnificativ crescute. Hipereozinofilia verminoasă apare precoce, atinge
valori maxime îninte ca verminoza să poată fi detectată prin alte mijloace.

REACŢII TISULARE
1. Splenomegalia parazitară
Constituie principala cauză de splenomegalie în ţările tropicale. Ea apare în:
malarie, leishmanioză viscerală, aibiază, hidatioză.
2. Formaţiuni iritativ tisulare
Esenţială în cadrul reacţiilor tisulare este constituirea de formaţiuni iritativ tisulare –
perichiste, care evoluează progresiv spre scleroză şi/sau calcifiere cu tendinţa de
izolare progresivă a parazitului(chist hidatic, trichineloză).

REACŢII IMUNE
Paraziţii şi produsele lor metabolice sunt antigenici şi induc apariţia de anticorpi
aniparazitari la persoanele parazitate. Anticorpii pot fi specifici faţă de o specie şi
chiar faţă de un anumit stadium evolutiv al parazitului, dar unele nematode prezintă
antigene comune de grup care induc anticorpi heterologi care interacţionează cu
paraziţii înrudiţi.
Evidenţierea anticorpilor este posibilă în parazitozele profunde intratisulare care
asigură un contact strâns între gazdă şi parazit, detectarea anticorpilor constituind
una dintre principalele metode de diagnostic ale acestor parazitoze.
Semnificaţia anticorpilor este discutabilă. Mult timp s-a negat rolul protector al
anticorpilor, aceştia fiind consideraţi de unii autori doar martori ai infecţiei.
În realitate, imunitatea dobândită este importantă în parazitoze. În unele infecţii
parazitare o primă contaminare poate antrena o imunitate definitivă,
protectoare(toxoplasmoză). În alte parazitoze profunde, imunitatea joacă un rol de
atenuare. Astfel, în malaria produsă de Plasmodium falciparum se întalnesc forme
grave, letale, doar la persoanele neimune.
Importanţa imunităţii este relevată şi de gravitatea unor parazitoze oportuniste la
imunodeprimaţi(toxoplasma cerebrală, pneumocistoză, criptococoză). Anquilluloza
intestinală, afecţiune benignă la persoanele normale, poate determina forme severe
la imunodeprimaţi.
Anticorpii antiparazitari pot exercita şi efecte imunopatologice, determinând
hemiliza autoimună în malaria, formarea de complexe immune circulante, care
declanşează glomerulonefrite în anumite forme de malarie.
În present, descoperirea antigenelor circulante constituie o modalitate diagnostică, în
special în parazitozele instalate la persoanele imunodeprimate.

EPIDEMIOLOGIE – CICLUL BIOLOGIC

Pentru perpetuarea propriei specii, parazitul este supus unor transformări pentru
adaptarea la căi evolutive, uneori complexe. Aceste transformări poată numele de
ciclu parazitar(biologic). Acesta poate fi:
- simplu: trecerea directă a parazitului de la omul infectat la omul sănătos;
- complex: parazitul necesită intervenţia gazdelor intermediare sau a vectorilor,
pentru a deveni contagios.

ELEMENTELE CICLULUI PARAZITAR

 În cursul ciclului evolutiv al paraziţilor intervin: parazitul, gazda definitivă, gazda
intermediară, vectori.
Gazda definitivă: este organismul viu care poartă forma adultă a parazitului capabil
de reproducere sexuală. În cazul helminţilor, gazda definitivă găzduieşte viermii
adulţi, care produc, în urma fecundării, ouă. Ouăle pot fi: embrionate,
infestante(contagioase) pentru alte persoane, sau neembrionate, neinfestante pentru
alte persoane.
Gazda definitivă este omul şi mai rar unele animale(pisica pentru Toxoplasma
gondii, câinele pentru Diphylidium caninum, Toxocara canis, vulpea pentru
Echinococcus multilocularis).
Gazda intermediară este organismul viu, care găzduieşte formele asexuate le
paraziţilor. Gazda intermediară este necesară în unele cazuri pentru a-I asigura
parazitului maturarea, multiplicarea sau ambele.
Gazdele intermeiare pot fi animale(bovine, porcine), poate fi ţânţarul pentru
Plasmodium sau omul pentru Toxoplasmo gondii, Echinococcus granulosus,
Toxocara canis etc.
În cazul helminţilor, în special al plathelminţilor, la gazdele intermediare rezultă
forme larvare, care suferă un process de poliembrionie şi adaptare, astfel încât sa
devină infestate pentru gazda definitivă.
Gazdele intemediare se împart în:
a) Gazde intermediare pasive: găzduiesc forma infestantă sau stadiile
anterioare formei adulte, fără a se deplasa la rezervorul de paraziţi pentru
prelucrarea lor, nici spre gazda receptivă pentru a tranzmite formele
infestante.
b) Gazde intermeiare active: găzduiesc parazitul in dezvoltare şi se
deplasează pentru prelucrarea parazitului de la gazda rezervor şi
transmiterea sau inocularea la gazda receptivă. Gazdele active sunt, în
general, vectorii biologici.
Vectorii sunt agenţi transmisibili ai parazitului. Se disting:
a) vectori biologici, indispensabili ciclului vital al parazitului, asigurându-i
maturarea şi multiplicarea. Sunt gazdele intermediare active.
b) vectorii mecanici care au rol de transport, nefiind esenţiali în ciclul
biologic al parazitului(muşte care transportă chisturi de Giardia, chisturi
de amibe).
Rezervorul de paraziţi este habitatul în care se menţine şi supravieţuieşte parazitul.
Rezervorul de paraziţi poate fi mediul extern sau o gazdă definitivă.
După natural or, se pot diferenţia trei tipuri de rezervoare de paraziţi:
a) Omul este rezervor de paraziţi în parazitozele strict umane. În
parazitozele commune omului şi animalului, omul poate fi un accident în
ciclu, fără rol epidemiologic(chist hidatic, toxoplasmoză, trichineloză).
b) Animalele constituie un rezervor esenţial pe plan epidemiologic pentru
majoritatea atropozoonozelor. Există rezervoare de paraziţi, care
funcţionează în diferite condiţii ecologice: aminale domestice sau
animale sălbatice. Rezervorul constituit de animalele sălbatice, tolerând
bine parazitismul, sub forma unei afecţiuni inaparente, reprezintă un
 rezervor de bază pentru paraziţi(rozătoarele sălbatice pentru
leishmanioza cutanată).
c) Solul reprezintă rezervorul de paraziţi pentru unii helminţi(geohelminţi)
cum ar fi Ascaris lumbricoides, Tricocefal.
d) Apa poate fi un rezervor de paraziţi pentru forma de rezistenţă a
protozoarelor(chist), declanşând epidemii hidrice(amibiază, giardioză).

CĂI DE TRANSMITERE A PARAZIŢILOR

Se disting:
Căi de pătrundere a paraziţilor în organismul uman. Cunoaşterea acestor căi este
importantă pentru proxilaxia individuală în parazitoze.
Principalele căi de pătrundere sunt:
*digestive (helmintioze, giardioză, amibiază)
* cutanate, mucoase passive (trichomoniază, micoze)
* transcutanate active (strongiloidoză, anczlostomiază, malarie – transmitere prin
vector hematofag)
* pulmonare (pneumocistoză, aspergiloză, criptococoză)
Căi de eliminare. Cunoaşterea lor prezintă un dublu interes, permiţând alegerea
modalităţilor de optime de diagnostic parazitologic şi a măsurilor de profilaxie colectivă.
Există căi digestive de eliminare prin materiile fecale, urinare, pulmonare, cutanate.
De asemenea, există paraziţi fără posibilităţi normale de ieşire; sunt paraziţi în impas
parazitar: larva migrans, chist hidatic, Trichinella spiralizată în muşchi.

PROFILAXIA PARAZITOZELOR

Cunoaşterea de ansamblu a elementelor ciclului biologic parazitar este indispensabilă

pentru cunoaşterea şi înţelegerea modului de producere a unei boli parazitare, a
modalităţilor de întrerupere a ciclului şi de evitare a contaminării umane. Profilaxia
cuprinde:
- Profilaxia individuală: încearca să evite contaminarea persoanelor sănătoase,
acţionând la un singur nivel al ciclului biologic: împiedicarea pătrunderii parazitului,
distrugerea după pătrundere sau împiedicarea dezvoltării acestuia.
Este scopul igienei alimentare, al chimioprofilaxiei şi al vaccinării.
- Profilaxia colectivă: se realizează prin intervenţia la toate nivelele vulnerabile ale
ciclului biologic. Urmăreşte:
- izolarea rezervorului de paraziţi şi sterilizarea lui prin igienă colectivă;
- lupta împotriva gazdelor intermediare şi antivectorială;
- vaccinarea şi tratamentul populaţiei receptive
În producerea bolilor parazitare intevin şi alţi factori care influienţează transmiterea
parazitozelor:
- factori umani(obiceiuri almentare, mod de viaţă, nivel de cultură, nivel terapeutic)
- factori economici(standard de viaţă)
- factori climatici(temperatură, umiditate)
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

În cele mai multe infecţii parazitare, diagnosticul etiologic se bazează pe

evidenţierea directă a parazitului în produsele biologice ale bolnavului şi pe
răspunsul gazei faţă de agresiunea parazitară(martor indirect al prezenţei al prezenţei
parazitului).
1. Examenul direct
1.1. Examenul coproparazitologic
Constituie examenul de bază pentru evidenţierea infecţiilor cu:
- protozoare: amibiaza, giardioză, coccidioze intestinale
- helminţi: ascaridioză, tricocefaloză, strongiloidoză, achilostomiază, teniaze.
Rezultatul examenului coproparazitologic trebuie să menţioneze prezenţa parazitului
precum şi abundenţa lui. Pentru protozoare(amibe), rezultatul trebuie să precizeze genul
şi specia parazitului găsit şi stadiul său evolutiv: forma vegetativă sau chistică. Controlul
după tratament este necesar după trei săptămâni de la terminarea tratamentului.
Examenul macroscopic al materiilor fecale. Determinarea consistenţei
scunului(format, semiformat, moale, lichid) poate constitui un indiciu asupra parazitului
present. Trofozoiţii protozoarelor intestinale se întâlnesc de obicei în scaunul moale sau
lichid; formele chisice se întâlnesc în scaunele formate. Ouăle de helminţi se pot găsi în
orice scaun. Proglotele mobile de tenie pot fi găsite pe sau lângă probă, iar adultul de
Ascaris poate fi găsit pe suprafaţa scaunului. Prezenţa sângelui în probă trebuie
consemnată întotdeauna. Sângele proaspăt pe suprafaţa scaunui format indică prezenţa
unor hemoroizi care sângerează; sângele găsit împreună cu mucusul format într-un scaun
lichid sau moale sugerează o infecţie amibiană.
Examenul microscopic din materiile fecale. Se efectuează următoarele preparate care
vor fi examinate:
- preparat direct în soluţie fizilogică şi soluţie Lugol. Este examenul cel mai ultil
pentru detectarea trofozoiţilor mobile ai protozoarelor intestinale şi larvelor mobile de
strongiloides stercoralis. Poate evidenţia şi chişti de protozoare şi ouă de helminţi.
- preparat în strat gros(metoda Kato – Miura). Se pot decela toate ouăle de helminţi,
mai ales cele cu coajă groasă.
- preparat după concentrarea elementelor parazitare. Metodele de concentrare permit
decelarea ouălor atunci când se găsesc în număr mic în probă şi pot scăpa neobservate
într-un examen direct. Sunt flotarea şi sedimentarea.
- preparat permanent colorat. Coloraţiile utilizate în identificarea trofozoiţilor şi
chiştilor de protozoare sunt: tricrom, hematoxilina ferică, Giemsa, Ziehl – Neelsen.
1.2. Examenul parazitologic al sângelui.
Este indicat atunci când se suspicionează: malaria, leishmanioza viscerală,
tripanosomiaza, filariozele. În cazul suspectării unei malaria, se efectuează frotiu în
picătura groasă cu prilejul acceselor febrile, când paraziţii sunt mai numeroşi. În filarioză
trebuie să se ţină seama de periodicitatea microfilaremiei: diurnă pentru Loa- loa şi
nocturnă pentru Wuchereria – Bancrofti.
1.3. Examenul parazitologic al sputei. Este indicat în suspiciunea unor infecţii cu
Pneumocystis carinii şi Paragonimus westermani.
 1.4. Examenul parazitologic al urinei. Este indicat în cazul suspectării unei
schistosomiaze urinare sau trichomoniaze urogenitale. În urina persoanelor
endemice de filorioză, se pot găsi şi microfilaria de Oncocerca volvulus.

2. Culturi de protozoare.
În scop diagnostic, unele protozoare pot fi cultivate pe medii precum: Loeffler,
TTY, TPS-1, TYM(pentru Trichomonas vaginalis), NNN(Novy, Nicole, Mc Neal
pentru Leichmania).
3. Diagnosticul immunologic al infecţiilor parazitare.
Ca răspuns la o agresiune parazitară, organismul produce anticorpi specifici şi
mobilizează diferite mecanisme celulare în scopul distrugerii parazitului sau
limitării proliferării lui.
a) investigarea imunităţii umorale. Se apelează la immunodiagnostic în
următoarele situaţii:
- când localizarea parazitului în organismul uman nu poate fi accesibilă sau
necesită manevre invasive de recoltare(toxoplasmoză, hidatidoză, cisticercoză,
larva migrans viscerală).
- când infecţiile sunt cu număr redus de paraziţi la care metodele directed au
rezultate negative(schistostomiază, filarioze, leichmanioză, malarie)
- când infecţia parazitară este recentă, iar parazitul este încî imatur, fie migrează
în ţesuturi, fie nu produce înca ouă sau larve care ar putea permite vizualizarea
sa în examenul direct.
Metodele serologice folosite în diagnosticul parazitologic sunt:
- raeacţii de precipitare: dublă imunodifuzie în gel, contraimunelectroforeză,
imunelectroforeză
- reacţii de hemaglutinare pasivă
- reacţii de fixare a complementului
- imunofloreşcenţa indirectă
- testul imunoenzimatic(ELISA)
- radioimunotestul(RIA sau RAST)
b) investigarea imunităţii celulare. Poate fi pusă în evidenţa prin următoarele reacţii:
- intradermoreacţia. Evidenţiază reacţia de hipersensibilitate întârziată care apare
pe pielea unor persoane sensibilizate după 24 de ore de la injectarea antigenului parazitar.
Este mai puţin utilizată în ultima vreme pentru că este relative nespecifică şi rămâne
pozitivă multă vreme după dispariţia parazitului din organism. Este considerată numai un
test de depistare epidemiologică în: hidatidoză, schistosomiază, leichmanioză.
- testul de inhibiţie a migrării macrofagelor
- testul de transformare blastică
- testul de degranulare a bazofilelor

FUNGI

Fungii sau micromicetii sunt bioentitati microscopice, eucariote, uni- sau pluricelulare,
heterotrofe, care contin chitina in peretele celular. Cu siguranta, aceasta definitie este
incompleta si ramane perfectibilia, deoarece particularitatile morfo-structurale, eco-
fiziologice si de inmultire, etalate de cele cca. 150.000 specii de fungi, fac imposibila
enuntarea unei caracterizari unitare si general valabile a acestor organisme.
Din multitudinea criteriilor de clasificare a fungilor, criteriul morfologic este cel mai
cunoscut si agreat in micologie medicala si permite descrierea a trei tipuri principale de
micromiceti:
• filamentosi
• levuriformi
• dimorfici
In prezent, cele patru phylum-uri acceptate in regnul FUNGI sunt Chitridiomycota,
Zygomycota, Ascomycota si Basidiomycota.
Fungii se cultiva pe mediul Saubouroud.

Diagnosticul de laborator al infectiilor oculare

Conditia anatomica – globul ocular este delimitat prin trei tunici, externa, medie si
interna si contine mai multe medii dioptrice rezistente.
Tunica externa, groasa, fibroasa si rezistenta, da forma globului ocular si ii protejeaza
structurile fragile. Este alba posterior formand sclerotica si transparenta anterior, formand
corneea.
Tunica medie, uveea, cuprinde o bogata retea vasculara care asigura nutritia tesuturilor
oculare, pigment si doua sisteme musculare. Uveea are trei parti: anterioara(irisul),
mijlocie(corpul ciliar) si posterioara(coroida).
Tunica interna sau retina, delimitata intr-o parte posterioara, unde isi au originea fibrele
nervului optic si o parte anterioara, lipsita de proprietati senzoriale.
Organele si anexele de protectie – globii oculari sunt protejati prin sprancene, pleoape
si glande lacrimale.
 Conditia microbiologica.
Microbiota indigena a pleoapelor o reflecta pe cea a tegumentului, cu particularitati
legate de dispozitia unitatilor pilosebacee si glandulare ale marginii libere la zona de
tranzitie tegument-conjunctiva. Cele mai mari densitati bacteriene sunt realizate in
unitatile pilosebacee si in orificiile glandulare. Dominanti apar stafilococii coagulazo-
negativi si organismele facultativ anaerobe, care colonizeaza orificiile pilosebacee si ale
glandelor sudoripare. Conditii prielnice de dezvoltare gaseste aici si Stafilococul aureu.
Specii de Priponibacterium, in special Priponibacterium acnes, organisme anaerobe,
colonizeaza mai profund unitatile polisebacee.
Conjunctiva si corneea, desi expuse continuu contaminarii cu microorganisme, raman
cu o incarcatura microbiana redusa, datorita spalarii prin secretia lacrimala si miscarilor
palpebrale.
Entitati nosologice
Complexitatea structurilor care compun globul ocular sau il protejeaza se reflecta in
varietatea entitatilor nosologice cauzate de cei mai diferiti agenti infectiosi prin
mecanisme patogenetice multiple:

• conjunctivite si keratite
• endoftalmite
• infectii ale pleoapelor
• infectii ale aparatului lacrimal
• celulite orbitare

Spectru etiologic
Bacterii: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,
Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis,
Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus ducreyi, Stretococcus pneumoniae,
Strectococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas
aeruginosa, Actinomyces spp., Bacillus spp., Fusobacterium spp., Lactobacillus spp.,
Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp.
Chlamidii: Chlamydia trachomatis serovar: A, B, Ba, C; D-K; L1-L3.
Virusuri: Adenoviride, serovaruri mai frecvente: 3, 4, 7, 14; Herpetoviride: v.herpes
simplex, v.varicela-zoster, v.Epstein-Barr; Orthomyxoviridae: v.gripal; Paramyxoviridae:
v.rujeolic, v.urlian; Picornaviridae: v.Coxackie; Togaviridae: v.rubeolic.
Paraziti: Toxoplasma gondii.
Fungi: Candida spp, Rhinosporidium seeberi, Sporothrix schenckii.

Complicatii oculare ale folosirii lentilelor de contact

Lentilele de contact se folosesc astazi la scara larga, uzul lor fiind de foarte multe ori
pur estetic, dar si terapeutic. Portul lentilelor de contact nu este lipsit de reactii adverse si
complicatii, de aceea, trebui intotdeauna puse in balanta beneficiile si riscurile.
Odata aleasa varianta folosirii lentilelor de contact, indiferent de scop, monitorizarea
portului lor este vitala pentru a putea diagnostica si trata la timp complicatiile ce pot
aparea in urma folosirii lor, in special cele infectioase.
Portul lentilelor de contact reprezinta un factor de risc, prin:
- efectul mecanic asupra ochiului al lentilelor
- modificari ale metabolismului corneean, variabile in functie de materialul din care
sunt confectionate lentilele, gradul de curbura al lentilelor, portul nocturn al lentilelor
- posibilitatea dezvoltarii unei alergii fata de produsele de intretinere a lentilelor si
eventual o suprainfectie bacteriana
- probleme de iginena sau de modul de intretinere al lentilelor, portul prelungit, ce pot
duce la colonizarea sub lentile a microorganismelor.
Contactul prelungit al acestor microorganisme cu epiteliul corneean, asciat cu prezenta
microleziunilor date de punerea si scoaterea lentilelor sunt la originea complicatiilor
infectioase ale ochiului la persoanele purtatoare de lentile.
Complicatiile folosirii lentilelor de contact sunt:
- neinfectioase – iritativ-alergice, legate de substantele dezinfectante sau conservantii
din substantele dezinfectante pentru lentile si sunt reprezentate de: conjunctivite
alergice, conjunctivite papilare gigante, edeme epiteliale corneene, infiltrate sterile
corneene
- infectioase – tin in special de proasta manipulare a lentilelor de contanct. Cele mai
frecvente sunt reprezentate de keratite microbiene(bacteriene, virale, parazitate,
fungice). Cele mai frecvente infectii la purtatorii de lentile de contact sunt date de coci
Gram+(streptococi, stafilococi), desi studiile florei conjunctivale la purtatorii
asimptomatici au demonstrat o modificare a florei normale prin predominenta bacililor
Gram-, in special Pseudomonas, Serratia, E.coli, Klebsiela, Proteus, Citrobacter etc.