UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTACIÓN

INFORME N°7
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC)
“Determinación de cafeína”

Profesor: Gerardo De Lama Castillo

Apellidos y Nombres: Anchelia Medina ,Jefferson Smith 15070151

Alarcón Ortiz, Jhonatan David 17070129

1.RESUMEN
En la presente práctica se determinó la
cantidad de cafeína en muestras de
Volt,Red Bull y Monster haciendo uso de
la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).Se usó como fase móvil al
metanol con agua en una relación de
35:65 . Se preparó primeramente el
estándar patrón stock de 1000 ppm a
partir de cafeína pura ,a partir de esta,se
elaboraron las 3 muestras estándares de
concentraciones de 20,40,60 ppm .Se
tomaron 5ml de la muestra analizar y se
diluyeron en 50 ml de agua de grado
HPLC.Finalmente se inyectó 20 ul de
cada uno de los estándares incluyendo la
muestra blanco,la cual no contiene nada
de muestra de cafeína por separado en el
cromatógrafo para luego identificar el
tiempo de retención de cada uno de los
componentes .Con el cromatograma
obtuvimos las áreas respectivas para
cada concentración de los estándares
,con estos datos y las concentraciones
conocidas se obtuvo la ecuación con la
cual se relaciona concentración vs área
,de esta manera se obtiene las
concentraciones de las muestras
analizadas.
Palabras clave :cromatografía líquida ,cafeína.
2.INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método de
separación de los componentes de una
muestra según su capacidad para
distribuirse entre una fase móvil, que
contiene la muestra, y una fase
estacionaria. Cuando la fase móvil es un
líquido hablamos de cromatografía de
líquidos.La cromatografía de líquidos
clásica fue la primera en aplicarse y se
llevaba a cabo en columnas de vidrio
rellenas de partículas granulares sólidas
en las que el flujo se producía por
gravedad. Si los gránulos eran lo
suficientemente pequeños para conseguir
una buena separación, los tiempos de
separación se hacían demasiado grandes.
Si se disminuía el tamaño de las
partículas o se forzaba el flujo mediante
una bomba o por la presión de un gas, se
aumentaba la rapidez, pero a costa de un
aumento considerable de la altura de
plato teórico y, en consecuencia, una
disminución de la eficacia de la
separación.La cromatografía HPLC es la
técnica analítica de separación más
ampliamente utilizada, debido a su
sensibilidad, su fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas, su grado
de automatización y su capacidad para
separar compuestos no volátiles o
termolábiles (que no pueden emplearse
en cromatografía de gases), muchos de
los cuales tienen una gran importancia
industrial y científica.
3.MARCO TEÓRICO
La cromatografía líquida de alta
resolución.
Es una técnica de química analítica que
se utiliza para separar, identificar y
cuantificar cada componente de una
mezcla. Se basa en bombas para pasar
un solvente líquido presurizado que
contiene la mezcla de muestra a través de
una columna llena de un material
adsorbente sólido . Cada componente de
la muestra interactúa de forma
ligeramente diferente con el material
adsorbente, provocando diferentes
velocidades de flujo para los diferentes
componentes y provocando la separación
de los componentes a medida que fluyen
fuera de la columna.
Cromatograma:
Gráfico u otra representación de la
respuesta del detector, concentración del
eluyente u otra cantidad usada como una
medida de concentración del eluyente,
versus el volumen de eluyente o tiempo
(IUPAC).

Fi
gura 1. Cromatograma modelo
El cromatograma se inicia en el momento
en que la solución muestra es inyectada.
Las señales encontradas en el
cromatograma pueden ser:
Volumen de elución (Ve): es el volumen
de fase móvil eluida entre la inyección y la
detección de la concentración máxima de
cada componente de la muestra.
Volumen muerto (V0): es el volumen que
la fase móvil puede ocupar entre las
partículas de la fase estacionaria y todos
los espacios libres existentes en la
columna, en las tuberías, uniones, etc. La
solución atraviesa estos espacios, sin
participar en ningún proceso separativo.
Línea de Base: es la porción del
cromatograma donde sólo se aprecia la
elución de la fase móvil, sin señal debida
a los componentes de la muestra.
Tiempo de Retención (tn): es el tiempo
medido entre la inyección y la elución de
la concentración máxima de cada
componente de la muestra (máxima
señal). La distancia entre este máximo de
la señal y la línea de base es la altura del
pico (hn)
Tiempo muerto (t0): es el tiempo del
primer pico que aparece, no perteneciente
a ningún componente de la muestra.
Como su valor se utiliza en algunos
cálculos cromatográficos hay que
determinarlo con exactitud, no se tiene la
completa seguridad de que el primer pico,
generalmente debido al solvente de
disolución de la muestra o a alguna
impureza desconocida, sea el correcto.
Para su estimación pueden utilizarse, en
Fase Reversa, soluciones diluidas de
nitrato de sodio o de dicromato de
potasio.
Tiempo de retención neto o relativo
(t’n): también llamado tiempo de retención
ajustado o corregido, es la diferencia
entre el tiempo de retención de un pico y
el tiempo muerto.
Anchura de la base de la señal o Ancho
de Pico (w): es la porción de la línea de
base interceptada por tangentes trazadas
a ambos lados de una señal
cromatográfica. Este valor de anchura se
emplea en el cálculo de la resolución (R) y
eficiencia de los sistemas cromatográficos
(N). Se puede calcular tomando el ancho
en distintas posiciones, por ejemplo, al 50
% de la altura de pico, al 60.7 %, etc.
4.DETALLES EXPERIMENTALES
Fase móvil : metanol con agua en
relación 35:65
4.1 Preparación de la solución patrón
stock
Para este procedimiento se pesó 100 mg
de cafeína pura en 100 ml de fase móvil.
4.2 Preparación de los estándares para
la curva de calibración
Se extrajeron alícuotas del patrón stock
para preparar los estándares como se
muestra en el siguiente gráfico y se
completó con la fase móvil preparada
anteriormente.
 Estándar Alícuota Volumen Concentración 4.5 Determinación de áreas de las
de trabajo de stock final con (mg/L) muestras
(ml) FM(ml)
Para la preparación de las muestras a
BK 0 50 0 analizar ,se extraen 5ml en fiola y se
enrasa a 50 ml con agua pura de grado
St-1 1 50 20 HPLC en una fiola.Se extraen por último 5
St-2 2 50 40 ul y se introduce al
cromatógrafo,resultando sus
St-3 3 50 60 determinadas áreas.

4.3 Determinación de las áreas Muestra Área

Se extrajeron 5 ul de los estándares y el
Volt 1 525401
blanco y se introdujeron por separado en
el cromatógrafo,obteniendo las áreas para Volt 2 524252
cada concentración .
Red Bull 564034
Estándar de Concentración Área Monster 501245
trabajo (mg/L)

BK 0 0 4.6 Determinación de concentraciones

St-1 20 337042 en muestras
Con ayuda de la ecuación hallada
St-2 40 705820 anteriormente se determina las
concentraciones con las áreas halladas
St-3 60 1057491
en 4.5.

Muestra Área Concentración Concentración

4.4 Determinación de la ecuación en curva(mg/L) en
muestra(mg/L)
Esto se realiza con los datos de
concentración vs área de los estándares. Volt 1 525401 30,018 300,2

Volt 2 524252 29,953 299,5

Red Bull 564034 32,200 322,0

Monster 501245 28,654 286,5

5.ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE
RESULTADOS

Para la curva de calibración se obtuvo un

coeficiente de determinación de 0.9997
además que se observa una tendencia
lineal lo que verifica que se realizó un
Resultando la ecuación de : ajuste correcto de los puntos
Y = 17706 X - 6099,4 experimentales.
donde :
Y= área Las concentraciones de las muestras de
X= concentración las muestras de la bebida volt fueron
300.2mg/L y 299.9mg/L existiendo una
diferencia entre ellas de 0.7g/L lo que
indica que la técnica usada fue precisa.
La concentraciones hallada para el Volt
son menores a las reportadas por dicha
marca que es de 320 mg/L
La concentración hallada para el Red Bull
fue de 322 mg/L que es mayor a la que
ellos reportan de 320 mg/L.
La concentración hallada para el Monster
fue de 286.5mg/L, menor a la que es
reportada por esa marca que es de 290
mg/L.
6.CONCLUSIONES
Las concentraciones de las tres marcas
de bebidas analizadas no cumplen con las
especificaciones para bebidas gasificadas
ya que estas deben tener una
concentración de cafeína menor a 200
mg/L según la NTP 214.001 (Indecopi
2012), por lo que en el rótulo de estos
productos se debe señalar que tiene alta
cantidad de cafeína.
7.BIBLIOGRAFÍA
Perez C. Ruth. Estudio de validación de la
Metodología para la determinación de
Vitamina A en Alimentos infantiles
instantáneos por Cromatografía Líquida
de alto rendimiento (HPLC). Rev. Perú.
med. exp. salud pública, 2000, vol.17,
no.1-4, p.26-29. ISSN 1726-4634.
Serie Académicos CBS. Cromatografía de
gases y de líquidos de alta resolución
México 2000. pág. 215-231 255-305.
Sanchez Ma. Dolores. Venezuela. 2004.
Estudio sobre los ácidos grasos libres en
queso blanco, Universidad de Los Andes.
46:2.
Christian G. D. 2009. Química Analítica.
6a edición. McGRAW-HILL, México.
Harris D. C., 2001. Análisis Químico
Cuantitativo. 2a edición. Editorial Reverté,
S.A.México.
INDECOPI. (1985). NTP 214.001.
Bebidas y gaseosas
F. López, A Martínez. Aprovechamiento
energético e integrado por
fraccionamiento de biomasa
lignocelulósica forestal y agroindustrial.
2018. pág 11.
AFANASJEVA N. SINISTERRA, J. 2018.
Termólisis de los biopolímeros naturales
de los desechos agroindustriales de la
planta africana (Elaeis guinnensis). pág.
123.
GUILLERMO ARRÁZOLA G, GRANÉ N.
2. 2014. Importancia de los glucósidos
cianogénicos en el sabor de frutos de
almendros (Prunus dulcis Miller) y su
incidencia en la agroindustria. pág 4-5.
8.ANEXOS
8.1 Ventajas y desventajas de la HPLC
Ventajas:
● Con esta técnica es usual obtener
separaciones en el término de
minutos y hasta segundos.
● Otra ventaja es la alta resolución
que permite separar mezclas muy
complejas, por ejemplo muestras
de fluidos biológicos, como la
orina, plasma, etc.
● También proporciona muy buena
información de tipo cuantitativo.
● Presenta un escaso deterioro de la
columna a pesar de su repetido
uso.
 ● Quizás la ventaja más importante
sea la diversidad de sus
aplicaciones, tanto a compuestos
orgánicos como inorgánicos, a
muestras de alto y bajo PM, a
sustancias sólidas y líquidas,
iónicas o covalentes. Desde el
punto de vista práctico las únicas
muestras que no son susceptibles
de ser analizadas por HPLC son
las gaseosas.
● Por último presenta la gran ventaja
de automatizar los instrumentos de
forma tal que realicen el análisis
completo de la muestra, desde su
introducción en el cromatógrafo
hasta el cálculo e impresión de los
resultados, en forma automática.
Desventajas :
● Instrumental costoso. El personal
que utilice esta técnica tendrá que
tener experiencia como para poder
obtener el mayor provecho de la
técnica instrumental.
● La comparación de los tiempos de
retención, como método de
identificación, no es confiable, por
lo que será necesario emplear
otras técnicas, tales como
Espectroscopia de Masa, IR, o
Resonancia Magnética Nuclear
para obtener identificaciones más
precisas.
● No existe aún un detector
universal y sensible para HPLC, el
detector de índice de refracción es
de respuesta universal pero de
limitada sensibilidad y el detector
de luz UV es sensible, pero su
respuesta es selectiva y responde
solo a compuestos que absorben
radiación UV.
8.2 Aplicaciones de la cromatografía de
gases en el área agroindustrial
indicando el analito, matriz, columna
utilizada, gas portador y detector.
Estudio de validación de la
Metodología para la determinación de
Vitamina A en Alimentos infantiles
instantáneos por Cromatografía
Líquida de alto rendimiento (HPLC)
Se utilizó un equipo de cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC), marca
Shimadzu, modelo LC10A, con inyector
automático, bomba con sistema de
desgasificación, con integrador o sistema
de registro, software para el procesado de
datos cromatográficos, detector de arreglo
de diodos (longitud de onda variable). La
columna cromatográfica fue de acero
inoxidable LC-18 para fase reversa, de 25
cm x 4,6 mm de diámetro interno, 5 μm de
diámetro de partícula, y guarda columna
con cartucho C18, Supelco. Las
condiciones típicas de operación fueron:
sistema isocrático, flujo 1,2 mL/min,
volumen de inyección 20 μl, detección UV
242 nm, temperatura de horno, ambiente,
y tiempo de corrida 7 min. La fase móvil
fue metanol al 100% grado HPLC.
Aprovechamiento energético e
integrado por fraccionamiento de
biomasa lignocelulósica forestal y
agroindustrial
Se utilizó un equipo de cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC), marca
Shimadzu, modelo LC10A, con inyector
automático, bomba con sistema de
desgasificación, con integrador o sistema
de registro, software para el procesado de
datos cromatográficos, detector de arreglo
de diodos (longitud de onda variable). La
columna cromatográfica fue de acero
inoxidable LC-18 para fase reversa, de 25
cm x 4,6 mm de diámetro interno, 5 μm de
diámetro de partícula, y guarda columna
con cartucho C18, Supelco. Las
condiciones típicas de operación fueron:
sistema isocrático, flujo 1,2 mL/min,
volumen de inyección 20 μl, detección UV
242 nm, temperatura de horno, ambiente,
y tiempo de corrida 7 min. La fase móvil
fue metanol al 100% grado HPLC.
Termólisis de los biopolímeros
naturales de los desechos
agroindustriales de la planta africana
(Elaeis guinnensis)

Condiciones del método HPLC. Equipo:

Prominence HPLC System. Columna:
Kinetex 2,6µm XB-C18 100A. Flujo total
de la bomba: 1,2 mL/min. Gradiente de
concentración: desde 0 % ACN: 100 %
Agua acidulada hasta 50 % ACN: 50 %
agua acidulada en 9 min, donde
permanece 2 min en esa concentración y
luego disminuye a 0 % en 1 min. Presión
máxima: 3500 psi.

Importancia de los glucósidos

cianogénicos en el sabor de frutos de
almendros (Prunus dulcis Miller) y su
incidencia en la agroindustria

Se utilizó un equipo de cromatografía

líquida de alta eficiencia marca Waters
Modelo 600 Controller, entrega de
solventes con gradiente cuaternario
modelo 600E, inyector manual Rheodine
7125, detector de arreglo de diodos
Waters modelo 996, columna Symmetry
C18, Waters, 250 x 4,6 mm, 5 µm),
además una precolumna C18 con objeto
de preservar la columna, software
Millenium 2008. Otras condiciones
cromatográficas fueron: volumen de
muestra 20 µL, flujo del eluyente 1,3 mL
min-1, composición del eluyente:
acetonitrilo: agua (20:80) isocrática,
tiempo de elución: 10 min, análisis
mediante el método patrón externos,curva
de calibrado amigdalina y prunasina.