UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA, MANAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS
SECCIÓN DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

GUÍA DE LABORATORIO
EXTRACCIÓN DE ADN EN GUISANTES
(Pisum sativum)
TEMAS A EVALUAR

 Técnicas de extracción y purificación de ácidos nucleicos.

 Aplicaciones clínicas del ADN

OBJETIVOS

 Indicar las funciones biológicas del ADN.

 Demostrar la presencia de ADN en tejidos biológicos.
 Explicar los principios físico-químicos en que se basa la extracción y
purificación del ADN.
 Indicar los usos del ADN genómico humano en el diagnóstico molecular, en
genética forense e ingeniería genética.

METODOLOGÍA

Para alcanzar los objetivos del seminario se hará uso del ABC del aprendizaje
Cooperativo; donde Ferreiro R. (2010); plantea que el trabajo activo,
bidireccionalidad y cooperación en el proceso de enseñanza aprendizaje es una
experiencia significativa que exige trabajar juntos para lograr beneficios mutuos en
la construcción social del conocimiento.

Nota: Estos objetivos serán evaluados mediante el siguiente laboratorio

Introducción

El ácido desoxiribonucleico (ADN) es la molécula que guarda la información

genética de la inmensa mayoría de los organismos.

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La extracción de ADN es un proceso vital con muchas aplicaciones científicas. En
la investigación y la medicina, sus usos incluyen secuenciación del ADN, la
detección de los virus, las bacterias, investigación de enfermedades y trastornos
con base genética. En el campo de la ciencia forense, es utilizado para la
identificación de los muertos así como el análisis de la escena de crimen.

La extracción de ADN es la base para la aplicación de cualquier técnica en

Biología Molecular. Dado que todos los organismos vivos contienen ADN, las
opciones disponibles para la muestra son prácticamente infinitas, y la elección por
lo general se relaciona directamente con el tema del objeto de estudio.

Metodología

Previa la realización del laboratorio se les recomienda a los y las estudiantes leer y
analizar la guía, en pro de lograr un aprendizaje significativo.

En este laboratorio se hará la extracción del ADN de los guisantes. Al finalizar la

práctica se socializará los resultados y se discutirán los mismos para consolidar
los conocimientos teóricos relacionados con esta actividad.

Materiales

Guisantes
Balanza de compensación
NaCl
Agua destilada
Licuadora
Beaker de 250 ml
Colador plástico, o
Filtro para cafetera
Jabón líquido
Reloj
Tubos de ensayo 13 x 100 mm
Gradillas
Ablandador para carne
Alcohol al 70%
Reloj
Pinchos de madera para carne.

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Procedimientos:

Extracción de ADN de guisantes

Procedimientos

Pesa 100 gramos de guisantes.

Agrega 1 gramo de NaCl.

Agrega 200 ml de agua destilada

bien fría (entre 0 y 4 0C).

Licúa todo a la más alta

velocidad por 15 segundos!!

En un Beaker cuela la sopa

resultante (usa un colador de
plástico o papel filtro para
cafetera)
Elimina lo que quedó en el
colador.

Agrega 30 ml de jabón líquido al

filtrado. Mezcla suavemente.
Espera 10 minutos.

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 Toma 1-2 tubos de ensayo y
llénalos hasta un tercio de la
altura con la solución resultante.
Agrega 1 gramo de ablandador
de carne, y mézclalo suavemente
unos 5 segundos.

Inclina el tubo de ensayo y

agrega suavemente alcohol al
70-90% sobre la pared del tubo
hasta alcanzar el doble del
volumen de la solución de
arvejas.
NO MEZCLES O ECHARAS A
PERDER EL EXPERIMENTO!!!
Deja reposar 10 minutos.
Observa y veras que se produce
una partición de la solución
acuosa y el alcohol. EL ADN SE
ENCUENTRA EN EL LIMITE DE
ESA PARTICIÒN.

Toma un pincho limpio de

madera (usted lo trae!!) y con
mucho cuidado lo introduces
hasta el sitio donde se parten
ambos solventes, gíralo en
sentido horario con suavidad. El
ADN se pegará al extremo del
pincho.
Extrae el ADN.
Discute los resultados con tu
docente.

Preguntas para orientar el autoestudio

1. Describa los principios generales de extracción de ADN.

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se
basa en las características físico-químicas de la molécula. El ADN está constituido
por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los
nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una

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base nitrogenada (adenina, guanina, timina, citosina). La unión de los nucleótidos
ocurre en el grupo fosfato y el azúcar mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar
al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante
puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal.
Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere
al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son
aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a
repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero,
en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los
grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como
Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y
permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le
permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente.
En general los protocolos de extracción tradicionales de ADN consisten en 5
etapas:

 Homogeneización del tejido: La homogeneización, mecánica o química,

consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción
con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético. En la
homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en
solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y
agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso
pueden perforar la membrana celular.
 Lisis celular: Durante el proceso de lisis las interacciones entre las
moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se
modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se
utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permitan
disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las
enzimas que degradan el ADN.
 Separación de proteínas y lípidos: En esta etapa se separa el ADN de las
proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación.

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 Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para
separarlos en medios acuosos, mientras que los lípidos y proteínas se
separan en solventes orgánicos. Los reactivos que se usan en esta fase
deben evitarse usar en la etapa de purificación ya que son altamente
contaminantes.
 Precipitación: Después que son eliminados los lípidos y proteínas, se
recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas
concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos
fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y
permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo, haciéndolo insoluble.
 Redisolución del ADN: Una vez eliminado el etanol, el paso siguiente es
hidratar el ADN para mantenerlo en solución.

2. Diga usted para qué utilizamos detergente en el procedimiento.

Para realizar una extracción pura ocurrirá que el detergente contiene lauril sulfato
de sodio, el cual remueve la suciedad de los utensilios de cocina domésticos
removiendo grasas y proteínas. Este actúa de la misma manera en el protocolo de
extracción del ADN, separando las grasas (lípidos) y las proteínas que constituyen
las membranas que rodean la célula y el núcleo. Una vez que estas membranas
se rompen, el ADN se libera de la célula. El detergente elimina las proteínas que
degradan el ADN.
3. Diga usted para qué utilizamos alcohol en el procedimiento.
El alcohol (etílico) sirve para precipitar el ADN. El ADN se precipita en alcohol
fuera de la solución, donde puede ser visto. Además de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en
la solución acuosa.
4. Diga usted qué tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el
jugo de piña y para qué los utilizamos en este experimento.

Tabla 1.1. Principales enzimas de los suavizadores de carnes.

Papaína Se extrae del látex del árbol de

papaya. La papaína puede reemplazar

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 la proteinasa K por ser una enzima
proteolítica, en la metodología clásica
de extracción del ADN.

Bromelina Complejo enzimático que contiene

azufre y se extrae del tallo-raíz de la
planta de piña. Destaca por su
actividad proteolítica, es decir, ayuda a
digerir las proteínas
descomponiéndolas en aminoácidos.

Ficina Derivada del látex de la higuera. Tiene

actividad proteolítica.

Pancreatina Derivada del páncreas de cerdo.

Los zumos de piña y papaya contienen enzimas (papaína y bromelina), estas

contribuyen a eliminar las proteínas que puedan contaminar el ADN. La solución
ablandadora de carne actúa como una enzima.
5. Diga usted cuántos usos se le puede dar al ADN una vez extraído.
El ADN tiene muchos usos, probablemente el principal de todos es ver ¿Cómo
funcionan los seres vivos? ¿Cómo crecen? ¿Por qué se enferman? Por eso es tan
importante el conocimiento que nos brinda el ADN, ya que nos permite entender
cómo funciona el mundo y también ayuda en el campo de la medicina a curar
enfermedades.
Hoy en día, el ADN en el campo de la medicina se utiliza para curar enfermedades
mediante el reemplazo de un mal gen por uno bueno. Sin embargo, el uso de la
modificación del ADN, tan común en plantas y animales, sigue teniendo problemas
éticos importantes cuando se intenta aplicar en seres humanos.

También se puede utilizar para hacer los llamados perfiles de ADN, en los que se
utilizan los rasgos típicos y únicos de una persona. En general, esta técnica se
utiliza en:

 Test de paternidad.
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  Resolver dudas en un asesinato.
 Identificar personas (forense).
 Curar enfermedades hereditarias.
 Realizar transplantes.

Tabla 1.2. Usos del ADN

Crear cultivos más resistentes. En la agricultura el ADN se usa para

modificar algunas variedades de
cultivos para hacerlas más
resistentes a enfermedades y
aumentar su productividad.

Encontrar formas de vida. Los científicos aplican pruebas de

ADN a nuevas especies y objetos
traídos del espacio exterior con el fin
de descubrir un vínculo con las
formas de vida ya conocidas.

Resolver crímenes. Actualmente la policía puede

almacenar y compartir perfiles
genéticos, lo que ha llevado a
demostrar la inocencia de muchos
sospechosos o resolver casos que se
creían perdidos.

Pruebas de paternidad. Las pruebas de ADN también

permiten comprobar la paternidad de
un niño, algo esencial en los
procesos legales de custodia.

Detección de enfermedades en Gracias a las pruebas genéticas

bebés. prenatales, los doctores pueden
detectar si los fetos tienen
enfermedades graves.

Determinar la etnia. Ancestros.

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 Buscar a tus ancestros. Gracias a que los cromosomas se
mantienen sin cambios a través de
generaciones.

Prevención de enfermedades. El ADN puede revelar si una persona

es más propensa a padecer
enfermedades como el cáncer de
próstata o diabetes, lo que puede
hacer que el paciente acuda a
chequeos regulares para prevenir
estos cuadros.

Encontrar nuestro origen. -

Rastrear antepasados. -

6. Diga usted que relevancia tiene el ADN en el diagnóstico clínico.

El diagnóstico molecular es una área dinámica en constante desarrollo que ha
revolucionado el diagnóstico clínico. La detección y cuantificación específica de
material genético en una muestra biológica ha mostrado un significativo impacto
en todas las áreas de la salud, sobre todo en las áreas de las enfermedades
infecciosas y el cáncer. El desarrollo de nuevas tecnologías, más rápidas y
precisas, ha transformado al diagnóstico molecular en una herramienta clave para
el equipo clínico en directo beneficio del paciente.
El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas
de biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o
cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico
(ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de
“Biología Molecular” se aplicó a los trabajos realizados sobre el ADN. Esta
molécula, descubierta por el biólogo y médico suizo Johan Friedrich Miescher en
el año 1869, capturó la atención de la comunidad científica, luego que los
investigadores James D. Watson, Francis Crick y Rosalind Franklin descubrieran

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la estructura del ADN en el año 1953 (Watson y Crick, 1953). Este descubrimiento
abrió un nuevo horizonte para futuras generaciones en diferentes áreas de la
ciencia, incluida la investigación biomédica.

7. Diga usted cuáles son las funciones biológicas del ADN.

Tabla 1.3. Funciones biológicas del ADN

Almacenamiento de la información. Genes y genoma.

Codificación de proteínas. Transcripción y traducción.

Autoduplicación (Replicación). Para asegurar la transmisión de

información a las células hijas
durante la división celular.

Codificación. Todas las funciones de las

células son llevadas a cabo por
proteínas.

Diferenciación celular. -

Evolución y adaptación. Cambio de características

físicas/genéticas para adaptarse
un medio y sobrevivir.

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 8. Diga usted cuáles son las diferencias en cuanto a la extracción de ADN y
ARN.

9. Explique usted por qué la concentración de ADN se mide a 260 nm.

Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento
mediante espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración
de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las
moléculas disueltas. Una de las características del ADN es que absorbe la luz
ultravioleta (UV) a 260nm y permite estimar su concentración mediante
espectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN es
de 1cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO). En el caso de ADN
genómico o de doble cadena, una densidad óptica equivale a 50 ug/m. Se debe
considerar el factor de dilución para obtener la concentración en
nanogramos/microlitro (ng/ul).

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 10. Indique usted qué tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto
de ADN.

Tabla 1.4. Contaminantes del ADN

Contaminación por material biológico Depósito del material biológico

humano. humano sobre las muestras, con
posterioridad a la toma de las
mismas.

Contaminación microbiológica. Este tipo de contaminación tiene

lugar por el desarrollo de
microorganismos y suele estar
favorecida por la humedad y las
altas temperaturas.

Contaminación química. Presencia de productos químicos

que dificultan procesos del
análisis genético, como PCR y
extracción del ADN.

Transferencia de indicios biológicos. Debido al traslado de los indicios

de una localización a otra puede
dar lugar a una contaminación o
puede ocasionar la pérdida de la
prueba.

11. Explique usted por qué la medición de una muestra de ADN a 260/280 nos
da información sobre la pureza de la muestra.
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de absorbancia a
260nm y 280nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro,
proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas. Una
segunda prueba de valoración de ácidos nucleicos es la proporción 260/230, los
valores aceptado se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relación es menor
indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol.

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 13 | P á g i n a
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 12. Diga para qué fines se puede utilizar el ADN genómico humano.

Tabla 1.5. Avances de la genómica.

Reducción del coste económico de Variación Genómica humana.

secuenciar un genoma.

Genómica del cáncer. Conocer el origen de la especie

humana y de dónde vienen nuestros
ancestros.

Genómica en agricultura. Diagnóstico de enfermedades (raras).

Farmacogenómica. Interpretación del genoma.

13. Cuando realizamos una extracción de ADN, aparte de concentración y

pureza, ¿Qué otros parámetros de calidad de la extracción de ADN se
deben investigar?

Tabla 1.6. Tabla de parámetros de calidad del ADN

Peso húmedo inicial (mg). Método (TX, TG, MM, ME).

Concentración (mg/L) Pureza A260/A280

Cantidad de ADN (µg) Rendimiento (µg de ADN/mg de

masa húmeda.
“TX: Tritón X-100; TG: Tiocinato de guanidilo; MM: Método mecánico; ME: Método enzimático.

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 15 | P á g i n a
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EVALUACIÓN

Esta actividad tiene un valor de 100 puntos, sobre la base de los siguientes
criterios: 20% preparación previa, 30% ejecución de la práctica, 30% discusión de
resultados y correlación teórica y 20% entrega de reporte.

Bibliografía

 Conferencias y presentaciones de la asignatura.

 Ver documentos pertinentes referidos en la bibliografía del primer
laboratorio.
 http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com/file/view/PRACTICA_No_4_EXTR
ACCION_DNA_PLASMIDICO.pdf (Extracción de ADN plasmídico)
 http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf (Teoría
general de la extracción de ADN)
 http://www.biotools.eu/esp/documents/SpeedtoolsDNAExtractionKit.esp.ed0
7.Marzo12.pdf
 (Extracción de ADN genómico humano utilizando membranas de sílice,
explicado paso a paso.Aunque no es la misma marca del kit que usamos en
la extracción de ADN, son los mismos principios y procedimientos). En la
guía de las actividades evaluadas pueden revisar los pasos de extracción
del ADN humano.
 http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/ingen/practicos/arn/clases/Extraccion
%20ARN.pdf/view (Extracción de ARN)

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