BIOLABO
www.biolabo.fr
FABRICANT :
BIOLABO SAS,
Les Hautes Rives
02160, Maizy, France
REF 4500100 : 100 tests R1 20 mL R2 7,5 mL
REF 4500200 : 200 tests R1 2 x 20 mL R2 2 x 7,5 mL
SUPPORT TECHNIQUE ET COMMANDES
Tel : (33) 03 23 25 15 50
Fax : (33) 03 23 256 256
| IVD USAGE IN VITRO
INTERET CLINIQUE (1) (2)
La Syphilis est une maladie vénérienne causée par un micro-organisme
spirochaete T. pallidum. Ce micro-organisme ne pouvant être cultivé sur
milieu artificiel, le diagnostic de la syphilis est basé sur la corrélation des
données cliniques et la détection d’anticorps spécifiques par des tests
sérologiques. Les tests de dépistage de la syphilis utilisant la cardiolipine
associée à la lécithine comme antigène sont simples d’emploi mais des
faux positifs sont fréquents en raison de la nature non-tréponémique des
antigènes.
Les tests TPI (Treponema pallidum Immobilisation) et FTA-ABS
(Fluorescent Treponema Assay) utilisent le Treponema pallidum pathogène
comme antigène mais présentent quelques désavantages pour les tests de
routine. Le test TPI nécessite d’utiliser T. pallidum pathogène vivant et le
test FTA-ABS requière l’utilisation d’un microscope à fluorescence. De
plus, ces tests nécessitent un niveau élevé de compétences.
Le test TPHA est reconnu pour sa commodité d’utilisation et sa spécificité
pour le diagnostic des infections tréponémiques, sa spécificité est
comparable à celle du test TPI et sa sensibilité proche de celle du test
FTA-ABS. Il ne nécessite qu’un minimum d’instruments de laboratoire et
est très simple à réaliser.
PRINCIPE
Le test TPHA est un test d’hémagglutination indirect (IHA) pour la
détermination d’anticorps de T. pallidum dans le sérum/plasma humain.
Des érythrocytes aviaires stabilisés sont sensibilisés par des composants
antigéniques de T. pallidum pathogène (souche de Nichol). Ces cellules
« test » agglutinent en présence d’anticorps spécifiques de T. pallidum et
forment une image (voile) caractéristique dans les puits d’une plaque de
microtitration.
Toute réaction non spécifique est détectée par l’utilisation des cellules
« Contrôle » qui sont des érythrocytes aviaires non sensibilisés.
Les anticorps de tréponème non pathogènes sont adsorbés par un extrait
de tréponèmes de Reiter, inclus dans la suspension de cellules Test.
Le résultat du test est obtenu en 45-60 minutes et le voile caractéristique
de l’agglutination cellulaire est facilement lisible et persistante.
REACTIFS
Flacon R1 Tampon de dilution
Diluant pour la prédilution des spécimens
Flacon R2 Suspension de cellules Test
Erythrocytes aviaires stabilisés sensibilisés avec l’antigène de T.
pallidum.
Flacon R3 Suspension de cellules Contrôle
Erythrocytes aviaires stabilisés.
Flacon R4 Sérum de contrôle Positif (prédilué au 1/20)
Sérum humain contenant des anticorps contre T. pallidum.
Prêt à l’emploi. Le test quantitatif donne un résultat équivalent à un titre
de 1/640 à 1/2560.
Flacon R5 Sérum de contrôle Négatif (prédilué au 1/20)
Sérum humain exempt d’anticorps contre T. pallidum.
PREPARATION DES REACTIFS
Les réactifs sont prêts à l’emploi.
IVD REF
Fabricant Date de péremption Usage “In vitro” Température de conservation Référence Produit
Made in France Dernière version : www.biolabo.fr
TPHA
Test d’hémagglutination pour la détermination qualitative et semi-quantitative
des anticorps de Treponema pallidum dans le sérum ou le plasma humain.
R3 7,5 mL R4 1 mL R5 1 mL
R3 2 x 7,5 mL R4 1 mL R5 1 mL
REACTIFS ET MATERIEL COMPLEMENTAIRES
1. Pipette de précision adéquate pour distribuer 10, 25, 75, 190 µL.
2. Plaque de microtitration à fond en U.
STABILITE ET CONSERVATION
Stocker à 2-8°C et à l’abri de la lumière
• En l’absence de contamination, stockés dans le flacon d’origine et utilisés
comme indiqué dans la notice, les réactifs sont stables jusqu’à la date de
péremption indiquée sur l’étiquette du coffret.
• Les flacons contenant les réactifs doivent être stockés à l’endroit.
• Rejeter tout réactif contaminé ou qui ne donne pas des résultats corrects
avec les sérums de contrôle.
• Ne pas utiliser les réactifs après la date de péremption.
• Les réactifs contenus dans chaque coffret ont été standardisés pour
produire la réaction attendue et ne doivent donc pas être interchangés
avec d’autres lots.
PRECAUTIONS
Les réactifs BIOLABO sont destinés à du personnel qualifié, pour un usage
in vitro.
• Utiliser des équipements de protection (blouse, gants, lunettes).
• Ne pas pipeter avec la bouche.
• Ne pas utiliser de réactifs endommagés ou contaminés.
• En cas de contact avec la peau ou les yeux, rincer abondamment à l’eau
et consulter un médecin.
• Les réactifs contiennent de l’azide de sodium (concentration < 0,1%) qui
peut réagir avec les métaux tel que le cuivre ou le plomb des
canalisations . Rincer abondamment.
• Les contrôles sont réalisés à base de sérums humains. Chaque sérum
humain utilisé dans la fabrication des contrôles a été analysé et a donné
des résultats négatifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg),
les anticorps de l’hépatite C (anti-HCV) et du VIH 1 et VIH 2. Cependant
comme aucun test ne peut garantir de façon absolue l’absence de tout
agent infectieux, traiter ce produit comme potentiellement infectieux.
• Pour plus d’informations, la fiche de données de sécurité peut être
obtenue sur simple demande.
• Elimination des déchets : respecter la législation en vigueur. Les
accessoires réutilisables doivent être stérilisés par une méthode
appropriée après utilisation. Les accessoires à usage unique doivent être
considérés comme des déchets potentiellement infectieux et incinérés ou
autoclavés. Des déversements accidentels de matériel potentiellement
infectieux doivent être absorbés et traités comme ci-dessus. La surface
potentiellement contaminée doit être désinfectée avec un désinfectant ou
de l’alcool à 70%.
Par mesure de sécurité, traiter tout spécimen comme potentiellement
infectieux, dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire. Respecter
la législation en vigueur.
PRELEVEMENT ET PREPARATION DU SPECIMEN
Sérum : Prélever un échantillon de sang de patient et laisser coaguler.
Centrifuger le sang coagulé et séparer le sérum clair. Travailler
impérativement sur sérum fraîchement prélevé.
Plasma : Prélever un échantillon de sang de patient dans un flacon de
collecte de plasma. Centrifuger le spécimen et séparer le plasma clair.
Travailler impérativement sur plasma fraîchement prélevé.
Ne pas utiliser de sérum ou plasma hémolysé, contaminé ou lipémique qui
sont susceptibles d’interférer avec le test.
Le sérum peut être conservé à 2-8°C pendant au moins 7 jours.
Pour une durée prolongée, stocker à -20°C (une fois seulement).
Homogénéiser les échantillons congelés avant utilisation.
LOT →
Consulter la notice Numéro de lot Conserver à l’abri de la lumière Suffisant pour diluer avec
Version : 18/09/2014
INTERFERENCES INTERPRETATIONS DES RESULTATS
Les anticorps développés lors d’une Syphilis peuvent persister après la Méthode qualitative:
guérison. C’est pourquoi un test TPHA positif peut indiquer une infection RESULTATS CELLULES TEST CELLULES CONTROLE
présente ou passée. Fortement Positif Voile de cellules couvrant la Pas d’agglutination,
De même que d’autres tests de sérodiagnostic le test TPHA ne permet pas de totalité du fonds du puits. bouton compact
distinguer la syphilis d’autres infections tréponémiques (ex : pian). Légèrement Voile de cellules couvrant Pas d’agglutination,
Les signes cliniques doivent être pris en considération. Positif environ 1/3 du fonds du puits. bouton compact
Bien que le test TPHA soit très spécifique, des résultats faux positifs ont été Indéterminé Voile de cellules avec un trou Pas d’agglutination,
constatés chez des patients souffrant de lèpre, mononucléose infectieuse et central bien visible bouton compact
troubles du tissu conjonctif. Négatif Cellules compactées en un Pas d’agglutination,
Le test FTA-ABS permet la différentiation entre les IgG et les IgM plus bouton central, habituellement bouton compact
précoces et peut donc être utilisé pour confirmer le test TPHA. Ce test est avec un petit centre clair.
aussi très utile dans le cas de Syphilis très précoce où le test Non-spécifique * Réaction Positive Réaction Positive
d’hémagglutination peut rendre des résultats négatifs.
Méthode quantitative :

CONTRÔLE DE QUALITE - + + + + + +/- -

Contrôles positif et négatif inclus dans le coffret.
Programme externe de contrôle de la qualité.
Il est recommandé de contrôler dans les cas suivants :
• Au moins un contrôle par série.
• Au moins un contrôle par 24 heures.
• Changement de flacon de réactif.
Si les résultats du contrôle sont incorrects, appliquer les actions suivantes:
1. Répéter le test en utilisant le même contrôle.
2. Si les résultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de contrôle et
répéter le test.
3. Si les résultats sont encore incorrects, utiliser un autre flacon de réactif et
répéter le test
4. Si les résultats sont encore incorrects, contacter le service technique
BIOLABO ou le revendeur local.
PERFORMANCES
Spécificité : deux études indépendantes sur 2900 sérums de donneurs
appartenant à une population à faible risque ont montré chacune 100% de
consensus avec des méthodes préexistantes. Le taux de réactivité initiale était
de 0,1% et le taux de réactivité répété était de 0%.
Une étude indépendante sur sérum anténatal montre 100% de spécificité
(avec 95% de confiance, 98,04%-100%).
Sensibilité : Une étude interne réalisée sur 110 spécimens déterminés comme
positifs donne 100% de résultats positifs (avec 95% de confiance,
98,04-100%)
MODE OPERATOIRE (TECHNIQUE MANUELLE)
METHODE QUALITATIVE
Prévoir 3 puits de la plaque de microtitration par échantillon.
1. Ramener chacun des composants à température ambiante.
2. Ajouter 190 µL de diluant dans le puits 1.
3. Ajouter 10 µL de sérum dans le puits 1.
4. A l’aide d’une micropipette, mélanger le contenu du puits 1 et transférer 25
µL de cette dilution 1/20 dans les puits 2 et 3.
5. Remettre en suspension par retournement les cellules Test et Contrôle.
6. Ajouter 75 µL de cellules Contrôle dans le puits 2.
7. Ajouter 75 µL de cellules Test dans le puits 3.
8. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits.
9. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et de
toutes sources de vibration.
10. Incuber 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.
11. Les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les
précautions ci dessus sont respectées.
12. A la fin du test, jeter les plaques usagées (voir § Précautions).
METHODE SEMI-QUANTITATIVE
Prévoir 8 puits de plaque de microtitration par échantillon. Identifier de A à H.
1. Distribuer 25 µL de diluant (flacon R1) du puits B à H inclus.
2. Transférer 25 µL de sérum dilué 1/20 du test de dépistage dans les puits
A et B. Bien mélanger le contenu du puits B.
3. Prélever 25 µL de sérum dilué du puits B et diluer en aliquotes de 25 µL
de manière répétée du puits B à H inclus, en rejetant 25 µL de la dilution
du puits H.
4. S’assurer que les cellules test sont bien remises en suspension. Ajouter
75 µL de cellules test du puits A à H inclus. Ceci conduit a une dilution
1/80 dans le puits A jusqu’à 1/10240 dans le puits H.
5. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits.
6. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et de
toutes sources de vibration.
7. Incuber 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.
8. Les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et si les
précautions ci dessus sont respectées.
9. A la fin du test, jeter les plaques usagées (voir § Précautions).
Négatif 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120
Le titre correspond à la plus forte dilution conduisant à une agglutination.
Tout spécimen donnant une agglutination inférieure à “+/-“ est négatif.
Tout spécimen donnant une agglutination supérieure à “+/-“ doit être
considéré provisoirement comme Positif. Le Test doit être répété en
duplicate, en ajoutant les cellules Contrôle dans la première série de puits et
les cellules test dans l’autre série.
Si l’agglutination est plus forte dans la série de cellules test que dans la série
de cellules Contrôle, le spécimen contient des anticorps anti-tréponémiques
et sera soumis à d’autres tests de confirmation.
Si l’agglutination dans la série de cellules Contrôle est supérieure ou égale à
celle de la série de cellules test, la procédure ci-dessous pour absorption non
spécifique doit être appliquée.
« Procédure en cas d’adsorption non spécifique » :
1. Transférer 100 µL de sérum à tester dans un petit tube puis ajouter 400 µL
de cellules Contrôle. Bien mélanger et laisser incuber une heure.
2. Centrifuger 15 minutes à 1000 tpm et tester le surnageant avec la méthode
qualitative.
Remarque: Le spécimen est ainsi dilué au 1/5, ceci doit être pris en
considération pour préparer les dilutions. Si le résultat est à nouveau non
spécifique, répéter le test avec une autre méthode : ex. Réagine ou FTA-ABS.
Interprétations des résultats :
Des réactions fortement positives peuvent conduire à des pliures en bordure
du voile cellulaire.
Quand le puits Test est positif, il faut également observer le puits Contrôle.
Les cellules Contrôle se tassent en un bouton compact. Elles ne doivent en
aucun cas servir de référence en tant qu’image de non-réactivité car les
cellules Contrôle apparaissent sous la forme d’un bouton plus compact que les
cellules Test non réactives.
Une agglutination dans le puits de contrôle indique la présence d’agglutinines
non-spécifiques dans le spécimen, un tel résultat doit être considéré comme
NON VALIDE. Un sérum donnant ce type de résultat doit être adsorbé en
utilisant les cellules Contrôle comme indiqué dans la « Procédure en cas
d’adsorption non spécifique ». Une réaction douteuse avec les cellules Test
est considérée comme INDETERMINEE. Ce résultat peut correspondre à un
début de Syphilis primaire ou à un pian. Ces spécimens doivent dans un
premier temps être testés à nouveau avec la méthode qualitative puis
ultérieurement pour vérifier si le titre augmente ou non. Il est également
recommandé de réaliser un test de confirmation Réagine et/ou un autre test
(FTA-ABS) pour compléter le tableau diagnostique.
REFERENCES
(1) Rathlev T. - Haemagglutination tests utilizing antigens from pathogenic and apathogenic
Treponema pallidum WHO/VDT/RES 1965 ; 77 : 65.
(2) Tomizawa T, Kasamatsu S. - Haemagglutination tests for diagnosis of syphilis. A preliminary
report. Japan. J. Med. Sci. Biol. 19, 305-308, 1966.
(3) Rathlev T. - Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the
serodiagnosis of syphilis. Br J Vener Dis 1967 ; 43 : 181-5
(4) Tomizawa T. Kasamatsu S. Yamaya S. - Usefulness of the haemagglutination test using
Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. Jap J Med Sci Biol 1969 ;
22 : 341-50.
(5) Sequeira P,J,L. Eldridge A,E. - Treponemal Haemagglutination test. Br J Vener Dis 1973 ; 49
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(6) Larsen S.A., Hambie E.A., et coll., Specificity, sensitivity and reproducibility among the
fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for Treponema
pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J. Clin. Microbiol.,
1981 ; 14 : 441 – 445.
(7) Paris Hamelin, A., Dreux P. et coll. – Tréponématoses : aspects cliniques et biologiques.
Feuill. Biol. 1991a ; 23 : 88-89.
(8) Houng H. - Syphilis : new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992 ; 3 : 391-413.
(9) Sluis J.J. Van Der. - Laboratory Techniques in the diagnosis of syphilis : a review. Genitourin
Med. 1992 ; 68 : 413-9.
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(11) North ML et Guntz Ph. Sérodiagnostic de la syphilis. La Revue Française des Laboratoires,
1997 ; 294 : 51-58

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