Diseño de primers para clonación con la enzima Ligasa T4 DNA

*Verificar la temperatura de melting a partir del ATG, no se toma en cuenta la enzima de

restricción ni los primeros nucleótidos. Además, asegurarse que inicie la secuencia en open
Reading frame (ATG).

1. Agregar nucleótidos al azar.

2. Agregar Enzima de restricción
3. Elegir entre 20 -25 nucleótidos de la misma secuencia de interés, asegurarse que
tenga un porcentaje de GC de 40% - 60%, con un delta de G entre -10 – 0, y una
temperatura de melting cercana a 60°C.

AATATCTAGAATGTTCGAACGATTTACCGACCGTGCCCGCAGGGTCGTCGTCCTGGCTCAGGAAGAGG
CCAGGATGCTCAACCACAACTACATCGGCACCGAGCACATTCTTTTAGGCCTGATCCATGAAGGGGAA
GGCGTTGCCGCCAAGTCACTGGAGTCGTTGGGGATCTCGCTGGAAGGTGTGCGCAGTCAGGTCGAGG
AGATCATCGGCCAGGGCCAGCAGGCGCCGTCTGGGCACATTCCGTTTACCCCCCGCGCCAAAAAGGTC
CTCGAGCTGAGCTTGCGTGAAGCGCTGCAGCTTGGCCACAACTACATCGGGACCGAACACATTTTGCTG
GGCCTCATCCGAGAGGGTGAAGGCGTGGCCGCCCAGGTGCTGGTCAAGCTGGGCGCCGAGCTGACCC
GGGTGCGCCAGCAGGTGATCCAGCTGCTCTCCGGTTACCAAGGCAAGGAGGCCGCCGAAGCCGGCAC
CGGCGGCCGCGGGGGAGAGTCCGGCTCTCCGTCTACGTCCTTGGTGCTCGACCAGTTCGGCCGCAACC
TCACGGCGGCGGCGATGGAAGGCAAACTGGACCCGGTCATCGGCCGCGAGAAGGAAATCGAGCGGG
TCATGCAGGTGCTCTCTCGGCGCACCAAGAACAACCCGGTGCTGATCGGCGAGCCCGGCGTCGGCAAG
ACCGCGGTCGTCGAAGGACTGGCGCAGGCCATCGTGCACGGCGAGGTGCCCGAGACGCTCAAGGACA
AGCAGCTCTACACGCTGGATCTGGGATCGCTGGTGGCGGGTAGCCGCTACCGCGGTGACTTCGAGGAA
CGCCTCAAGAAGGTGCTCAAGGAGATCAACACCCGCGGTGACATCATCCTGTTTATCGACGAGCTGCA
CACCTTGGTCGGTGCTGGAGCCGCCGAGGGCGCGATCGACGCCGCCTCGATCCTGAAACCGAAGCTCG
CTCGCGGTGAACTGCAAACGATCGGCGCCACCACGCTCGACGAATACCGCAAGTACATCGAGAAGGAC
GCCGCGCTGGAGCGCCGCTTCCAGCCGGTGCAGGTGGGTGAGCCGACGGTGGAGCACACCATCGAGA
TCCTCAAGGGCCTGCGGGACCGGTACGAGGCGCACCACCGGGTGTCGATCACCGATGCGGCGATGGT
GGCCGCCGCGACCCTGGCCGACCGCTACATCAACGACCGGTTCCTGCCCGACAAGGCGATCGACCTGA
TCGACGAGGCGGGTGCTCGGATGCGGATTCGTCGCATGACCGCACCGCCAGACCTACGCGAGTTCGAT
GAGAAGATCGCCGAGGCTCGTCGGGAGAAGGAATCGGCTATCGACGCCCAGGACTTCGAGAAGGCCG
CCAGCCTGCGCGACCGGGAGAAGACACTGGTCGCACAGCGTGCTGAGCGCGAAAAGCAGTGGCGTTC
AGGCGATCTTGACGTGGTCGCGGAGGTCGACGACGAGCAGATCGCCGAGGTGCTGGGCAACTGGACC
GGTATCCCGGTGTTCAAGCTCACCGAGGCCGAGACCACCCGGCTGTTGCGGATGGAAGAAGAGCTGC
ACAAGCGGATCATCGGGCAAGAGGACGCCGTCAAGGCCGTTTCCAAGGCCATCCGGCGTACCCGGGC
CGGGCTGAAAGACCCCAAGCGCCCGTCGGGCTCGTTCATCTTCGCCGGCCCGTCCGGTGTCGGTAAGA
CCGAACTGTCCAAGGCGCTGGCCAACTTCTTGTTCGGTGACGACGACGCGCTTATTCAGATTGACATGG
GTGAATTCCACGACCGGTTCACCGCGTCGCGGCTATTCGGCGCGCCGCCCGGATACGTCGGCTACGAG
GAGGGCGGCCAACTCACCGAGAAGGTGCGGCGCAAGCCGTTCTCGGTGGTGCTGTTCGACGAGATCG
AGAAGGCGCATCAGGAGATCTACAACAGCCTGCTGCAGGTGCTCGAGGATGGCCGGCTCACCGACGG
GCAGGGCCGCACGGTGGACTTCAAGAACACCGTGCTGATCTTTACGTCCAATCTGGGCACCTCCGACAT
CTCTAAGCCGGTCGGTCTGGGCTTTTCCAAGGGCGGCGGTGAGAACGACTACGAGCGGATGAAACAG
AAGGTCAACGACGAGCTGAAGAAACACTTCCGCCCGGAGTTCCTCAACCGCATCGACGACATCATCGT
CTTCCACCAGCTGACCCGCGAGGAGATCATCCGGATGGTCGACCTGATGATCAGCCGGGTCGCCGGCC
AGCTCAAGAGCAAGGACATGGCGCTGGTGCTGACCGATGCGGCCAAGGCGCTGCTGGCCAAGCGTGG
CTTCGACCCGGTGTTGGGGGCCCGCCCGTTGCGGCGCACCATCCAGCGTGAGATCGAAGATCAGCTCT
CGGAGAAGATCCTCTTCGAGGAGGTCGGGCCGGGTCAGGTGGTCACCGTCGACGTGGACAACTGGGA
CGGTGAAGGTCCCGGCGAGGACGCGGTGTTCACCTTCACCGGTACCCGCAAGCCGCCGGCCGAGCCG
GATCTGGCCAAGGCTGGAGCGCACAGCGCGGGCGGCCCGGAGCCGGCCGCGCGGAAGCTTGCGGCC
GCAC

Fw: 5’ AATATCTAGAATGTTCGAACGATTTACCGACCGTGCCC 3’

Rv: 5’ GTGCGGCCGCAAGCTTCCGCGCGGCCGG 3’

Diseño de primers para clonación con la in fusión de takara

1. Agregar 10 nucleótidos del plásmido inmediatos al sitio de la enzima de restricción
elegida.
2. Agregar la enzima de restricción elegida
3. Elegir entre 20-25 o menos de nucleotidos, con los parámetros mencionados en el
primer diseño.

tcaccatcacGAATTCATGCCGTACCTGAATGGAACGCCGATCGACATTGCCGGGGCCGGCGCAGAACGG
ATACCATGCAGCCGCAGAGCCGAATGTATCGCCCCACACCTTGGTCTAGGAAAGCCATTGAGCAGCAT
CCCGCGGACAGGCAGTGCGCCGTTTAGTGTGTCAACCTTCACAGGCTCACTCTCTCTCCTCACCGCACTT
CAAAAACGGGTCCTCTCACGGCGTCTGACCCGATGCTTCGTCGACTCTGGACACTCCTGCTCCGCCCGC
CGCACCGAGGAGCGCGCACACGAACGCAGTTTGTCCTTGTCCACTGTGGCGTGTCTAGGAACAAAGCT
TGCGACGCAGAAGCCAAGAGGGCATCCGACCTCACACAGCTCACGGAAAGATGGATCACCGGCACGG
TCGCACTGGCCAAAAATATTACTCGTGCCCGACAGCTCAGTGCCGAAACTCGCCGCTCCATCGCAGCAG
GCGACTGGAACCCACGTGCGCGGACACCACCCTCACTCGTGGGGTAGAGGCCGCACTGGCCCGCCTCC
GCACCGGGGTTCTGCTCAACTACGGATGGCTGCTACGGCCCCTGCAGCCCGCCATCCCAGGCATATACC
GTCGCTGCGGCCTGGATGCCGCACAGCAGGCACGCAATGAAAGCTTggcactggcc

FW: tcaccatcacGAATTCATGCCGTACCTGAATGGAACG

RV: ggccagtgccAAGCTTTCATTGCGTGCCTGCTGTG

Uso del snap gene para corroborar los primers de clonación

1. Agregar la secuencia de interés desde el ATG.
2. Adicionar los primers, todos los nucleotidos incluyendo las enzimas de restricción y los
nucleotidos adicionales en el extremo 5’.

3. Hacer PCR, y elegir los mismos primers.

4. Abrir el plásmido de interés en snap gene
5. Simular la clonación: al elegir insertar fragmento (LIGASA) o In – fusión clonning 1
fragmento (in fusión).

6. Saldrá la siguiente ventana: donde en la pestaña vector se elige el vector pMAL cht y
en la pestañar Insert se elige amplified (muestra amplificada de PCR) y cortar tanto el
vector como el inserto con las enzimas que se usaron en los primers.

7. Ver el producto clonado:

8. Elegir la opción de traducción:

9. Y ver la secuencia al lado de la maltosa (MBP)

10. Ver en la pestaña secuencia y observar que la secuencia tenga los dos primers, uno
que inicie en ATG, que tenga la cola de histidina y la MBP.