Sunteți pe pagina 1din 52

Universitatea Ștefan cel Mare din Suceava

Departamentul de Sănătate și Dezvoltare Umană


Specializarea Nutriție și Dietetică

BIOCHIMIE
LUCRĂRI PRACTICE

Semestrul I, An I
îndrumător lucrări practice
(uz intern pentru studenți)
2017/2018

ș.l. Lungu Maria Magdalena


BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Structura

1. PROTECȚIA MUNCII ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE pag. 2


2. TIPURI DE PROBE BIOLOGICE PENTRU DETERMINĂRI BIOCHIMICE
3. METODE DETERMINĂRI GLUCIDE pag. 5
TESTUL TOLERANŢEI LA FRUCTOZĂ
TESTUL TOLERANŢEI LA GALACTOZĂ
DOZAREA GLUCOZEI ÎN SÂNGE
DOZAREA GLUCOZEI
METODA CU ORTO-TOLUIDINĂ
DOZAREA GLUCOZEI - METODA CU GLUCOZOXIDAZĂ
4. PROTEINE PLASMATICE pag. 14
DOZAREA PROTEINELOR PLASMATICE PRIN REACTIA BIURETULUI
TESTUL DE TURBIDITATE CU TIMOL (TESTUL MAC LAGAN)
5. DOZAREA PROTEINELOR IN URINA pag. 14
PROTEINURIE - REACŢII CANTITATIVE
6. ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE TOTALE –
PROTEINOGRAMA pag. 16
7. ELECTROFOREZA LIPOPROTEINELOR pag. 24
8. ELECTROFOREZA HEMOGLOBINEI pag. 27
9. METODA IMUNOENZIMATICĂ ELISA ÎN MICROPLACĂ pag. 30
10. METODE DE ANALIZĂ ALE BAZELOR AZOTATE ŞI ACIZILOR
NUCLEICI pag. 43
Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi concentraţiei ADN.
11. METODE DE ANALIZĂ ALE BAZELOR AZOTATE ŞI ACIZILOR
NUCLEICI pag. 45
Verificarea integrităţii ADN prin electroforeză în gel de agaroză

1
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 1

Protecția muncii în laboratorul de Biochimie.

Probe biologice pentru determinări biochimice.


Determinarea diverșilor parametri biochimici se poate realiza din diverse materiale
biologice.
Sânge: plasmă, ser, hemolizat
Urină
Omogenatul tisular
Saliva

Sângele

Sângele + limfa + lichidul interstițial formează mediul intern al organismului.


Sângele este un țesut fluid complex alcătuit din plasmă și elementele figurate care
se găsesc suspendate. Prin intermediul acestui țesut lichid se realizează toate
schimburile nutritive și de epurare dintre organism și mediul extern. În determinările
de laborator, sângele se folosește pentru investigarea diverșilor parametri
biochimici.
Analizele biochimice se pot efectua din sânge total, plasmă și ser.
PLASMA – se obține prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe
anticoagulant (heparină sau EDTA). După centrifugare, partea lichidă superioară
(supernatantul) reprezintă plasma sanguină, iar partea sedimentată reprezintă
ELEMENTELE FIGURATE ale sangelui.
SERUL – se obține fără centrifugare, din sânge recoltat fără anticoagulant, după
decantare și coagulare la temperatura camerei 30-60 minute.
Diferența între ser și plasmă constă în absența fibrinogenului din ser, respectiv
prezența fibrinogenului în plasmă.
2
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 1.1 Reprezentare schematică pentru metoda de obținere a plasmei din


sânge integral.

Aspectul serului
- Serul normal este limpede și are culoare gălbuie
- OPALESCENT – indică prezenta particulelor de grăsime– regim alimentar
bogat în lipide
- GALBEN-BRUN
o prezența de substanțe carotenoide – regim preponderent vegetarian
o prezența bilirubinei, icter
- ROZ/ROȘU – prezența hemoglobinei datorate hemolizei serului la recoltare.

Urina
Urina ca material biologic de laborator servește pentru investigații biochimice în:
- examenul de sumar de urină (examen macroscopic și examen microscopic).
- dozarea cantitativă a unor componenți anorganici (Na, K, Ca) și organici
(proteine, glucide, acid uric).

3
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Omogenatul tisular
Pentru a obține un omogenat tisular se parcurg două faze principale de lucru
1. Se obține omogenatul prin distrugerea structurii tisulare și ruperea membranei
celulare
2. Se separă particulele biologice

Metoda dezintegrării celulare – presupune câteva etape de lucru


Tratament termic – îngheț-dezgheț
Omogenizare mecanică – prin tehnica mojarării
Tratament cu ultrasunete
Mod de lucru.
- Porțiunea de țesut sau organ prelevat se spală cu ser fiziologic, se tamponează
ușor cu hârtie de filtru.
- Se mărunțește cu un foarfece și se introduce în eprubeta unui omogenizator
coaxial.
- Omogenatul rezultat se centrifughează și se obține sedimentul celular (celule
întregi, resturi celulare) și partea lichidă (supernatant).
- Se separă partea lichidă (supernatantul) de partea solidă (sediment) prin
decantare și se păstrează la rece pentru determinarea activității diverselor
enzime.

Bibliografie
Introduction to Clinical Biochemistry: Interpreting Blood Results. Download free books
at BookBooN.com

4
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 2

DOZAREA GLUCIDELOR

Unele teste funcţionale hepatice sunt bazate pe rolul ficatului în metabolismul glucidic, protidic
şi lipidic.

Pacienţii cu boli hepatice pot avea hipoglicemie, o toleranţă diminuată la administrarea glucozei,
galactozei şi fructozei. Incidenţa hipoglicemiei în bolile hepatice este, totuşi, scăzută. Ea apare
mai mult la alcoolici, dar mai puţin ca efect al disfuncţiei hepatice, cât, mai ales ca efect al
alcoolismului.

Bolnavii cu disfuncţie hepatică pot avea, de asemenea, scăzut depozitul de glicogen


hepatic, ceea ce poate fi determinat prin măsurarea concentraţiei glucozei în sânge
după administrarea de glucagon sau adrenalină.

TESTUL TOLERANŢEI LA FRUCTOZĂ

Principiu Se administrează fructoză şi se determină evoluţia concentraţiei de glucoză/fructoză în


sânge. (Fructoza este transformată de ficat în glucoză). În mod normal, după administrarea
fructozei, glicemia nu depăşeste cu peste 30 mg% nivelul iniţial şi revine cu regularitate la
normal în decurs de 2 ore. Dacă există o creştere prea mare a glicemiei şi o scădere înceată a ei
în timp, pacienţi pot avea insuficienţă hepatică accentuată sau ciroză hepatică. În paralel se poate
face şi o curbă a evoluţiei glicozuriei şi/sau fructozuriei

TESTUL TOLERANŢEI LA GALACTOZĂ

Se efectuează după acelaşi principiu ca şi cel din cazul fructozei.

Galactoza nu poate fi transformată toată în glucoză datorită disfuncţiei hepatice şi este eliminată
în cantitate mai mare în urină. La pacienţii cu deficienţe hepatice, după administrarea de
galactoză, persistă mai mult timp o concentraţie mai mare a galactozei în sânge şi se excretă
cantităţi mai mari de galactoză în urină.

DOZAREA GLUCOZEI ÎN SÂNGE

În studiul metabolismului glucidic, metodele de dozare cantitativă a glucozei au un rol


determinant. Din punct de vedere tehnic determinarea glicemiei se poate face prin:

• metode orientative;
o pot fi folosite strips-uri specifice care sunt îmbibate cu sânge integral
(poate fi şi sânge periferic). Ele sunt astfel etalonate încât devin pozitive
dacă glicemia depăşeşte valorile normale.

5
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

o Se mai poate folosi metoda Crecelius (glucoza reacţionează cu acidul


picric în mediul alcalin şi formează acidul picramic, roşu-cărămiziu)
rezultatul se citeşte la aparatul Crecelius).
• metode cantitative titrimetrice: metoda Hagedorn - Jensen
▪ Principiu :glucoza din sânge, în mediu alcalin şi la 100o C, reduce
fericianura de potasiu la ferocianură. Ferocianura precipită cu
sulfatul de zinc, iar excesul de fericianură se titrează iodometric.
• metode cantitative colorimetrice: metoda cu orto-toluidină; metoda cu
glucozoxidază

6
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

DOZAREA GLUCOZEI
METODA CU ORTO-TOLUIDINĂ

Principiu: conjugarea aldo- şi cetohexozelor cu amine aromatice dă produşi coloraţi. Pentru


dozarea glucozei amina cea mai apropiată este o-toluidina, care, în mediu acid (acid acetic)
formează cu aldohexozele un compus colorat în albastru-verde , colorimetrabil la 635 nm.

Reactivi:

1. Acid tricloracetic soluţie …10%


2. Reactiv orto-toluidină
o Orto-toluidină……….….60ml
o Acid acetic 50% …ad.la 1000ml
o Tiouree….. ………. 1,5g

3. Standard glucoză 100mg %

• Glucoză …………….100mg
• Soluţie saturată de acid benzoic………………80ml
• Apa distilata.....................ad. la 100ml

Tehnica de lucru:

• În trei eprubete se pipetează:

Metoda cu deproteinizare Proba Standard Martor


(ml) (ml) (m
Solutie acid tricloracetic* 2 2 -
Sânge integral, ser, plasmă, LCR, urină** 0,2 - -
Soluţie standard glucoză - 0,2 -
• Se agită
• Se aşteaptă 5min,
• Se centrifughează 10 min la 3000 rot/min

Supernatant proba 0.5 0,5 -


Acid tricloracetic - - 0,5
Reactiv orto-toluidină 2,5 2,5 2,5
*serurile nehemolizate, şi neicterice, se pot lucra şi fără deproteinizare cu acid tricloracetic, după
schema care urmează:

7
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

** pentru urină aceasta se diluează se fac diluţii cu apă distilată (de la 1/5 la 1/50, în funcţie de
rezultatul reacţiei calitative preliminare)

Metoda fără deproteinizare


Proba Standard Martor
(ml) (ml) (ml)
Ser, plasmă (nehemolizate, neicterice perfect clare) 0,05 - -
Standard - 0,05 -
Apă bidistilată - - 0.05
Reactiv orto- 1,5 1,5 1,5
toluidină

• Se încălzeşte pe baia de fierbere timp de 8 min


• Se răceşte
• Se lasă în repaus 10 minute
• Se măsoară extincţia probei (Ep) şi extincţia standardului (Es) faţă de martor, la
635 nm, în cuva de 1cm.

Calcul:
Glucoza în sânge (mg%) = (Ep/Es)x100
Glucoza în urină (g %o) = (Ep/Es)x100 x diluţie
• Sângele integral se obţine prin recoltare pe fluorură de sodiu (0,25 g NaF ->5ml sânge).
Fluorura are proprietatea de a împiedica, atât coagularea cât şi glicoliza. Cu alte cuvinte,
acţionează atât ca un anticoagulant cât şi ca un conservant.
• Dacă se execută analiza în decurs de 1 - 3 ore, glicemia se poate lucra şi pe ser, sau
plasmă. Dacă se întârzie efectuarea analizei o parte din glucoză este redusă de substanţele
reducătoare din sânge, iar valoarea obţinută la determinare va fi mai mică decât valoarea
reală
Valori normale:
Glicemie: 60 - 110 mg %
Glucoză LCR: 45 - 70 mg %

Variaţii patologice:

Hiperglicemie Diabet zaharat


Infecţii, intoxicaţii
Tumori maligne ş.a.
Hipoglicemie Exces de insulină
Exces prin administrare
Exces prin producere (cancer de pancreas)
Aport scăzut de glucoză
Malnutriţie sau malabsorbţie
Insuficienţă hepatică ( necroze)

8
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Insuficienţă hipofizară sau adrenocorticală


Gluconeogeneză redusă
Alcoolism

DOZAREA GLUCOZEI - METODA CU GLUCOZOXIDAZĂ

Principiul metodi:

Glucozoxidaza (catalizează oxidarea glucozei)


Glucoză + O2 + H2O<-- glucozoxidaza-->Acid gluconic + H2O2
Peroxidul de hidrogen format reacţionează cu 4- amino-antipirina şi fenolul, în
prezenţa peroxidazei şi formează chinonimina. Intensitatea culorii produsului rezultat
este proporţională cu concentraţia de glucoză din proba de analizat
2H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina <--peroxidaza--> chinonimina +4H2O
Reactivi:
Reactiv 1 (tampon-fenol)
Tampon fosfat pH = 7,4…100 mmol/l
Fenol ……………………..24 mmol/l

Reactiv 2 (amestec enzime)


Glucoz-oxidaza…………..12.000 U/l
Peroxidaza ……….…………700 U/l
4-amino-antipirina……….0,4 mmol/l
Reactiv 3 (standard glucoză)…100mg%
Reactiv 4 -acid tricloracetic 5%

Proba:

• ser nehemolizat
• plasmă (fără hemoliză):
• recoltată cu heparină + fluorură de sodiu
• recoltată cu heparină + acetat de iod
• sânge total (se aplică metoda cu deproteinizare)

Tehnica de lucru:

• se pregăteşte reactivul enzimatic de lucru: se dizolvă reactivul 2 în reactivul 1


• se pipetează direct în trei eprubete, după schema următoare:

Metoda fără deproteinizare

PROBA STANDARD MARTOR


Reactiv enzimatic de lucru 1ml 1ml 1ml

9
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Proba 10l - -
Standard - 10l -

Sau se pipetează în tuburi de centrifugă:


Metoda cu deproteinizare

PROBA STANDARD MARTOR


Sange total, ser sau plasma 50l - -
Sol. Acid tricloracetic(R4) 500l 500l -
Standard - 50l -

• se agită
• se centrifughează 5min la 3000 derotaţii/min
• se pipetează în eprubete

PROBA STANDARD MARTOR

Supernatant proba 50 - -

Supernatant standard - 50 -

Solutie acid tricloracetic - - 50


Reactiv enzimatic de lucru 1ml 1ml 1ml

• se agită
• se incubează 15min la 37o C
• se citesc extincţia probei (Ep) şi extincţia standardului (Es) faţă de martor la
500nm (492-550 nm), în cuva de 1cm.

Calcul:
Glicemie (mg%) = (Ep/Es) x 100 (sau)
Glicemie (mmol/l = (Ep/Es) x 5,5
Valori normale:
Sânge total: 70 - 105 mg%
Ser, plasmă: 75 - 115 mg%

10
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 3

PROTEINE PLASMATICE

DOZAREA PROTEINELOR PLASMATICE PRIN REACTIA BIURETULUI

Proteinele plasmatice reprezintă un constituent principal al plasmei sanguine, alcătuind aproximativ


75% din reziduul uscat al plasmei (circa 7 g proteine din 9 g de reziduu uscat).

Principiul metodei.
Proteinele, polipeptidele, ca și biuretul, reacționează cu ionul de Cu2+, în soluție alcalină, rezultand
un complex proteic sau peptidic cupro-alcalinic, de culoare violet.
Biuretul obținut prin încălzirea ureei este cel mai simplu compus care dă această reacție.

Valori de referință
66-87 g proteine la 1000 ml ser (1L)
La copii mici valorile de referință au o zonă normală mai largă.
- nou născuți: 52 – 90 g/L
- copii pană la 1 an: 55 – 87 g/L
- copii între 1 – 3 ani: 60 – 86 g/L

Interpretare

- Proteinemia totală variază în special la copii, în funcție de modificările hidroelectrolitice plasmatice.


- Valoarea proteinemiei totale crește după o perioadă mică de efort.

Hipoproteinemii

- Afecțiuni hepatice – ciroze hepatice, intoxicații cu benzen, tetraclorură de carbon, fosfor.


Stări de șoc produse de arsuri, hemoragii.
- Afecțiuni renale – glomerulonefroze, glomerulonefrite cronice.
Inaniție, tumori maligne.

Hiperproteinemii
- Dezhidratări acute produse de vomă, diaree, diabet insipid sau zaharat cu aport hidric incorect.
- Anemie pernicioasă, infecții acute și cronice

TESTUL DE TURBIDITATE CU TIMOL (TESTUL MAC LAGAN)


Principiul metodei
O soluţie de timol cu pH-ul de 7,8, precipită proteinele serice, dacă există o labilitate a
echilibrului coloidal datorită creşterii gamma-globulinelor, a beta-lipoproteinelor sau a scăderii
albuminelor.
Se utilizează seruri proaspete, limpezi, fără hemoliză.
Testul cu timol nu este specific pentru ficat, el fiind pozitiv şi în alte afecţiuni, ca:

11
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

reumatism poliarticular acut, cancer, tuberculoză, malarie, endocardită ş.a. Este util în explorarea
funcţională a ficatului. Reacţia este pozitivă în icterul hepatic şi negativă în icterul prin obstrucţie
(icterul mecanic)

Reactivi:
1. Soluţie alcoolică (96o) de timol 10%
2. Tampon veronal pH 7,8
• Acid dietilbarbituric…….2,76 g
• Dietilbarbiturat de sodiu…2,06g
• Apă distilată ……..ad. la 1000ml
3. Soluţie clorură de bariu
4. Clorură de bariu cristalizat….1,15g
5. Apă distilată……..….ad. la 100ml
6. Acid sulfuric N/5
Înainte de începarea tehnicii de lucru propriu-zise, se prepară reactivul timol soluţie de lucru.
Soluţie de lucru

Într-un balon cotat de 100 ml se încălzesc pe o baie de apă la T= 80o C circa 90 ml soluţie tampon
(R2), timp de aproximativ 10 ml.
• Se adaugă 1ml soluţie alcoolică de timol (R1)
• Se scutură energic până la limpezire (nu se mai văd picături uleioase)
• Se răceşte în curent de apă
• Se completează la semn (la 100ml) cu tampon
(Se conservă la frigider, cel mult o săptămână)

Tehnica de lucru:
• Se pipetează 0,05 ml ser
• Se adaugă 3ml soluţie de lucru timol
• Se lasă 30 de minute în repaus, pentru a se desfăşura reacţia
• Se citesc extincţia probei (Ep) faţă de reactivul de lucru, la 660 nm, în cuva de 1cm.
• Transformare valorilor extincţiilor care au fost citite în unităţi Mac Lagan se face
utilizând curba etalon.
Curba etalon:
Într-un balon cotat de 100 ml se introduc (pentru a obţine soluţia standard de turbiditate)

• 3 ml din soluţia de clorură de bariu 1,15 %


• 97 ml de acid sulfuric N /5
(amestecul se face răcind balonul sub un jet de apă)

• opalescenţa acestei soluţii este echivalentă cu 20 unităţi Mac Lagan


• din soluţia standard de turbiditate se fac diluţii crescătoare de la 9:1 la 1:9 la (cu acidul
sulfuric N /5). Corespunzător acestor diluţii vom avea unităţi descrescătoare de unităţi

12
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Mac Lagan .
• se citesc extincţiile soluţiilor etalon şi se trasează curba etalon.

Valori normale: 0 - 4 u Mac Lagan

Etaloane Soluţie standard (ml) Acid sulfuric Unităţi Mac


N/5 Lagan

1 10 0 20

2 9 1 18

3 8 2 16

4 7 3 14

5 6 4 12

6 5 5 10

7 4 6 8

8 3 7 6

9 2 8 4

10 1 9 2

Bibliografie
- Gh. Manole, E. M. Galețescu, M. Mateescu, Analize de laborator. Ghid privind principiile, metodele de
determinare și interpretare a rezultatelor., ediția a II-a, revizuită, 2005, Editura CNI Coresi, București.
- http://www.ilaborator.ro/BiochUr/BiochUr002.html
- http://www.ilaborator.ro/ApDig/AnFicPac017.html

13
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 4
DOZAREA PROTEINELOR IN URINA
PROTEINURIE - REACŢII CANTITATIVE

METODA ESBACH

Principiul: Albuminele precipită cu acidul picric în prezenţa acidului citric. Măsurând cantitatea
de precipita cu ajutorul unei eprubete speciale, se poate aprecia cantitatea de proteine urinare.
Reactivi:
Reactivul ESBACH:
Acid picric .......................10 g
Acid citric.........................20 g
Apă distilată........ad. la 1000 ml

(se dizolvă la cald şi se aduce la semn după răcire)


Albuminometrul Esbach este repreentat de o eprubetă gradată cu dop. Începând de jos în sus
gradaţiile sunt 1/2, 1, 2, 3, …până la 12. Deasupra gradaţiei 12 se găseşte un semn, notat cu litera
U, iar deasupra lui U seste inscripţionat un semn notat cu litera R.
Reacţia calitativă:
La 2 - 3 ml urină filtrată sau centrifugată se adaugă un volum egal de reactiv Esbach. Apariţia
unui precipitat care nu dispare la încălzire denotă prezenţa proteinelor (precipitatul dat de
pseudoalbumine dispare la încălzire).
Reacţia cantitativă:

7. Se pune urină centrifugată sau filtrată în albuminometrul Esbach până la semnul U.


8. Se adaugă reactiv picrocitric până la semnul R.
9. Se astupă eprubeta şi se agită bine.
10. Se aşază în cutia specială a albuminometrului în poziţie verticală.
11. După 24 de ore se scoate uşor, păstrând poziţia verticală şi se citeşte gradaţia la
care se află marginea superioară a precipitatului de proteine.
Exprimarea rezultatelor
Cifra reprezintă cantitatea de proteine, în grame la litrul de urină.
• Dacă valoarea concentraţiei de proteinse este mai mare de 4 g %o, se diluează urina cu apă
distilată, se determină concentraţia de proteine, iar valoarea găsită se corectează cu diluţia
folosită.
Pentru a afla cantitatea de proteine din urina de 24 de ore se înmulţeşte această cifră cu volumul

14
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

de urină din 24 de ore.

Bibliografie
Gh. Manole, E. M. Galețescu, M. Mateescu, Analize de laborator. Ghid privind principiile, metodele de
determinare și interpretare a rezultatelor., ediția a II-a, revizuită, 2005, Editura CNI Coresi, București.
Iulian NEAGU: „Ghid explicativ al principalelor ANALIZE MEDICALE” – www.primulajutor.com
A.Chiva- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare-Ed.
Universitara « Carol Davila », Bucuresti, 2008

http://www.electroforeza.ro/GhidDeInterpretare/ElectroforezaProteinelorSerice.aspx

15
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 5

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE TOTALE - PROTEINOGRAMA

Generalități

Proteinele serice îndeplinesc funcții variate în organism:


• sursă de nutriție;
• componente ale sistemelor tampon;
• agenți imunologici (imunoglobulinele);
•rol de carrier, asigurând transportul anumitor ioni și molecule (haptoglobina, prealbumina, transferina);

• rol de reglare a activității diverselor enzime proteolitice (antiproteaze: alfa1-antitripsina, alfa2-


macroglobulina);

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

Electroforeza proteinelor serice este o metoda de separare a fractiilor proteice din serul sanguin si
evaluarea concentratiei componentilor prin metoda densitometrica. Proteinele totale din ser sunt
descompuse in 5 categorii de substante numite fractiuni proteinice, in procesul electroforezei:
albumină, alfa 1, alfa 2, beta şi gamma. Grupul beta poate fi împărţit în beta 1 şi beta 2. Albumina,
care este produsa în ficat, reprezinta aproape 60% din proteinele din sange, iar globulinele
reprezintand restul de 40%. In afara imunoglobulinelor şi a catorva proteine complementare,
majoritatea globulinelor sunt produse în ficat.
Conditii de recoltare:
Recoltarea se face dimineata pe nemancate.
Se recolteaza sange venos.
Recoltarea se face in vacutainer fara anticoagulant, cu/fara clot activator, cu/fara gel separator(
vacutainer cu dop rosu sau galben), atat cat permite vacuumul. Specimenele recoltate care prezinta
hemoliza puternica sau care sunt recoltate necorespunzator, in alte tipuri de vacutainere, vor fi
respinse de la testare.

16
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Dupa recoltare, se separa serul prin centrifugare la 4000 turatii, timp de 5 minute; se lucrează in
4 ore; dacă acest lucru nu este posibil, serul se va stoca la 2-8°C sau la -20°C.
Recomandari
Electroforeza proteinelor serice este utilizata pentru a identifica prezenta sau absenta proteinelor
anormale, a proteinelor monoclonale (producerea excesiva a unei imunoglobuline specifice) si
pentru a determina cand diferite grupe de proteine au valorile crescute sau scazute in ser.
Electroforeza proteinelor ajuta la diagnosticul si monitorizarea evolutiei si tratamentului unor
afectiuni asociate cu prezenta de proteine anormale (ex.,mielom multiplu). Electroforeza proteinei
serice se poate testa cand simptomele indica o afectiune inflamatorie, o boala autoimuna, o infectie
acuta sau cronica, o dereglare a rinichilor sau a ficatului sau pierderi de proteine.

Metoda de determinare:
Metoda curenta pentru separarea proteinelor serice utilizata in laboratoarele de biochimie medicala
este electroforeza. Se utilizeaza suporturi solide si pH alcalin, la care toate componentele proteice
sunt incarcate negativ si migreaza spre polul pozitiv. Pe electroforegrama, dupa colorare,
proteinele apar sub forma de benzi carora li se masoara densitatea optica, fiecare banda avand un
maxim de absorbtie. Prin electroforeza, in conditiile amintite mai sus, se obtin sase
fractiuni: HYPERLINK “http://www.synevo.ro/albumina-serica/” \o “albumina serica” albumina
serica, a1, a2, b1, b2, g – globuline. Albumina, a1 si b apar sub forma unor benzi omogene, bine
definite. a2, si g apar ca benzi difuze, iar fractiunea g prezinta in partea sa centrala o zona mai
intens colorata.
Semnificatie clinica
• Variatii fiziologice: in sarcina scade albumina si cresc alfa2, beta- si gamaglobulinele (IgG);
valori mai scazute ale gamaglobulinelor pot fi intalnite la varstnici.
• Interferente analitice:
-o crestere usoara a largimii benzii de albumina poate fi datorata legarii unor medicamente
(penicilina) sau a bilirubinei (pacienti cu icter);
-bisalbuminemia tranzitorie (non-ereditara) poate fi intalnita ca rezultat al unui tratament
medicamentos sau unei perturbari metabolice severe (ex. pancreatita)
-benzi monoclonale false pot fi date de: hemoglobina libera, in cazul unui ser hemolizat sau a unei
hemolize intravasculare (banda in zona alfa2 – beta); proteina C reactiva in cantitate mare; lizozim
crescut, fibrinogen (la pacientii tratati cu anticoagulante; in coagulopatii, daca sangele a fost
centrifugat inainte de a coagula complet); alfa-fetoproteina in concentratii mari, seruri vechi.
-vizualizarea este dificila in cazul in care banda monoclonala se suprapune peste o banda normala
(ex. banda monoclonala in zona beta1 va migra in aceeasi pozitie ca si transferina).
Recomandari pentru efectuarea electroforezei proteinelor serice – detectarea gamapatiilor monoclonale;
evaluarea proteinelor serice si a statusului nutritional3.
Metoda – electroforetica (in gel agar) urmata de scanarea densitometrica a fractiunilor obtinute.

17
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Valori de referinta – sunt dependente de varsta

Varsta Albumina (%) a1(%) a2(%) b(%) g(%) A/G

< 1 an 40-65 2-5 6.6-13.5 8.5-14 10-21 1.16-2.23

1 – 16 ani 50-65 2-5 6-15 8.5-15 10-22 1.06-2.48

> 16 ani 52 – 68 2-5 6,6-13,5 8,5 -14 11 – 21 1.39-2.23

In cazul sistemului care separa 6 fractiuni se utilizeaza urmatoarele valori de referinta:


1. Albumina: 52-65.1%
2. alfa1 globuline: 1-3%
3. alfa2 globuline: 9.5-14.4%
4. beta1 globuline: 6-9.8%
5. beta2 globuline: 2.6-5.8%
6. gama globuline: 10.7-20.3%2.

Interpretarea rezultatelor
Pentru a facilita interpretarea rezultatelor va fi descrisa fiecare din cele 5 fractiuni cu proteinele
componente:(vezi figura 5.1)

Figura 5.1 Reprezentarea diagramei principalelor fractiuni proteice din sânge.


Albumina
Scaderea albuminei serice (hipoalbuminemie) survine in stari patologice variate si are semnificatii diferite
(malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii). Cresteri ale albuminei apar in urma deshidratarilor.

18
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

In cazuri speciale, in zona de migrare a albuminei se constata o banda suplimentara, datorata unor variatii
genetice fara relevanta clinica (aloalbuminemie si bisalbuminemie).
Zona a1 reflecta in special concentratia serica de alfa1-antitripsina, astfel ca reducerea acestei fractiuni se
intalneste in deficitul de alfa1-antitripsina asociat cu anumite boli pulmonare (emfizem cu debut precoce)
si hepatice (hepatita neonatala). Cresteri se inregistreaza in toate reactiile inflamatorii („reactant de faza
acuta”). In cazuri rare, obtinerea unei benzi suplimentare largi in aceasta zona poate sugera prezenta alfa-
fetoproteinei.
Zona a2 este constituita din 2 componente proteice: alfa2 macroglobulina si haptoglobina.
Crestere de a2 apare in infectii acute, reumatism articular acut, arterita, sindrom nefrotic, diabet zaharat,
neoplazii; scaderea acestei fractiuni se poate intalni in pancreatite acute severe, leziuni hepatocelulare,
sindroame de coagulare intravasculara diseminata, anemii hemolitice, anemii megaloblastice.
Zona b este alcatuita din 2 benzi distincte: b1 corespunzatoare transferinei si b2 care include fractiunile
complementului C3 si C4. Al treilea component al acestei zone este beta-lipoproteina, a carei banda se poate
suprapune pe cea a transferinei sau C3 sau poate fi situata in zona beta-gamma.
Nivelul seric de b globuline creste in anemia feripriva si ciroza biliara si scade in boli autoimune aflate in
puseu activ (LES), nefroza, afectiuni hepatice, neoplazii, infectii acute si cronice. In unele cazuri de mielom
multiplu de tip IgA se poate constata prezenta unui component monoclonal in aceasta zona.
Zona g Gamma-globulinele sunt globulinele cele mai importante. Din aceasta categorie fac parte
imunoglobulinele (IgG, IgA, IgM, IgD si IgE). Anomaliile suferite de acestea se traduc fie prin diverse
deficite, fie prin hipergamaglobulinemii policlonale sau monoclonale.
Procentul de g globuline scade in agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemii si sindroame nefrotice.
Hipogamaglobulinemia poate fi congenitala sau dobandita si poate fi usor detectata la electroforeza
proteinelor serice atunci cand concentratiile principalelor 3 clase de imunoglobuline sunt scazute (IgG, IgA
si IgM). Prezenta hipogamaglobulinemiei la adult impune continuarea investigatiilor in vederea depistarii
unei posibile boli limfoproliferative (mielom cu lanturi usoare, leucemie limfatica cronica, limfoame).
Cresterile policlonale de gamaglobuline indica un proces imunologic cronic asociat cu afectiuni hepatice
(hepatita cronica activa, ciroza), boli de colagen (LES, poliartrita reumatoida), neoplazii (ex. boala
Hodgkin), leucemie mielo-monocitara cronica. In aceste cazuri, hipergamaglobulinemia se datoreaza
activarii unui numar mare de clone plasmocitare care elibereaza imunoglobuline. Trebuie mentionat
aspectul caracteristic cirozei alcoolice de „punte” beta-gama, vizualizat pe gel ca o zona intens colorata
intre zonele beta si gamma.
Uneori, in zona gamma se pot observa cateva benzi mici, inguste, denumite oligoclonale, intalnite la
pacienti cu hepatita, boli ale complexelor imune, sindromul imunodeficientei dobandite, limfomul
angioimunoblastic.
Gamapatiile monoclonale includ un numar mare de conditii clinice si biologice asociate de obicei cu
afectiuni maligne (mielom multiplu, boala Waldenström, amiloidoza, limfoame) dar si cu unele afectiuni
benigne sau chiar cu absenta unei modificari patologice (gamapatii monoclonale cu semnificatie
nedeterminata). In aceste cazuri, se depisteaza la electroforeza proteinelor un component monoclonal
(banda M), rezultat ca urmare a proliferararii unei singure clone plasmocitare. Pe gel, componentele
monoclonale apar sub forma unor benzi inguste, net definite, iar dupa scanarea densitometrica, se obtin

19
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

„varfuri” (peak-uri) caracteristice, ce pot fi intalnite oriunde intre zonele alfa si gamma, datorita mobilitatii
electroforetice variabile, cel mai frecvent insa in zona gamma.
Imunoglobulinele monoclonale sunt omogene din punct de vedere structural si biochimic, fiind alcatuite
dintr-un singur tip de lant usor (kappa sau lambda). In circulatie pot fi eliberate imunoglobuline complete
sau numai subunitati ale acestora (ex. lanturi usoare monoclonale, denumite proteine Bence-Jones).
Prezenta componentului monoclonal va fi precizata pe buletinul final de analize al pacientului, cu
recomandarea de a se efectua electroforeza proteinelor serice cu imunofixare1-3.
In tabelul de mai jos sunt sintetizate informatiile prezentate:

Zone electroforetice

Descriere aspect Albumina Alfa – 1 Alfa – Beta Gamma


% 2
% % %
%

Normal N
N N N N

Enteropatie cu pierdere de
– N+ N+ N- -N+
proteine

Sindrom nefrotic
– N +++ N N-

Hipogamaglobulinemie
N- N N N –

Agamaglobulinemie
N- N N N Absenta

Gamopatie policlonala
N- N N N +

Raspuns inflamator cronic


N- N+ + N +

Raspuns inflamator acut


N- + + N N-

Raspuns inflamator subacut


N- N + N N

Ciroza hepatica
– N N- „Punte” beta-gamma

20
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Hipoalfa-1 globulinemie
N – N N N

Gamopatie monoclonala (tip γ)


N- N N N Banda M

Gamopatie monoclonala (tip β)


N- N N Banda M N-

Gamopatie biclonala
N- N N Banda M Banda M

Benzi oliglonale
N- N+ N+ N Benzi oligl.

Bisalbuminemie
Varf dublu

Hipoalbuminemie –
N N N N

Legenda

N = nivel normal + =nivel crescut – =nivel scazut

N+ =nivel normal/crescut N- =nivel -N+ =nivel scazut/normal/crescut


normal/scazut

Limite si interferente
• Variatii fiziologice: in sarcina scade albumina si cresc alfa2, beta- si gamaglobulinele (IgG); valori mai
scazute ale gamaglobulinelor pot fi intalnite la varstnici3.
• Medicamente
Albumina (scaderi): acid valproic, allopurinol, asparaginaza, azatioprina, clorpropamid, cisplatin,
contraceptive orale, dapsona, dextran, estrogeni, fenitoin, ibuprofen, izoniazida, nitrofurantoin, prednison
(doze mari), sargramostim.
Alfa1-globuline (cresteri): testosteron.
Alfa2-globuline: estrogeni, contraceptive orale, fenitoin (cresteri), asparaginaza (scaderi).
Beta-globuline: estrogeni, contraceptive orale (cresteri); asparaginaza (scaderi).
Gamma-globuline: tratament citostatic sau imunosupresor (scaderi)4.
• Interferente analitice:

21
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

-o crestere usoara a largimii benzii de albumina poate fi datorata legarii unor medicamente (penicilina)
sau a bilirubinei (pacienti cu icter);
-bisalbuminemia tranzitorie (non-ereditara) poate fi intalnita ca rezultat al unui tratament medicamentos
sau unei perturbari metabolice severe (ex. pancreatita)
-benzi monoclonale false pot fi date de: hemoglobina libera, in cazul unui ser hemolizat sau a unei
hemolize intravasculare (banda in zona alfa2 – beta); proteina C reactiva in cantitate mare; lizozim
crescut, fibrinogen (la pacientii tratati cu anticoagulante; in coagulopatii, daca sangele a fost centrifugat
inainte de a coagula complet); alfa-fetoproteina in concentratii mari, seruri vechi.
-vizualizarea este dificila in cazul in care banda monoclonala se suprapune peste o banda normala (ex.
banda monoclonala in zona beta1 va migra in aceeasi pozitie ca si transferina)2;4.

Albumina serică

Valori normale
3,4 - 5.6 g/dl
Creșteri patologice - hemoconcentrație, deshidratare
Scăderi patologice - Hiperhidratare, malnutriție, malabsorbție, boli hepatice (hepatită, ciroză, insuficiență
hepatică), Sindrom Nefrotic, glomerulonefrită cronică, enteropatii cu pierdere de proteine (Crohn, colită
ulcerativă, boala Whipple), cancer, arsuri severe, imobilizare prelungită.
Modificări fiziologice- în sarcină

Albumina urinară

Definiție
Albumina este o proteina plasmatică.
Albumina urinară- provine din albumina sanguină și în mod normal ea nu se găsește în urină. Ca
urmare a unor procese de filtrare, absorbție, a sângelui la nivelul rinichilor, proteinele pot trece din sânge
în urină.

În urina, prezența proteinelor (albuminei) este considerată patologică dar un nivel urinar al
proteinelor de circa 20-30 mg/ 24 ore este fiziologic.
- apare în bolile care afectează rinichiul precum și în bolile care dau sângerări pe traiectul cailor
urinare. Prezența albuminei în urină poartă numele de albuminurie.

22
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

- unele persoane prezintă fiziologic, normal albumine în urină dar într-o proporție foarte mică: este
vorba despre persoanele tinere înalte, slabe, care depun efort fizic intens. La aceste persoane are loc o
creștere trecătoare a cantității de albumine din urina, creștere care apoi dispare (de ex la încetarea efortului).

Creșteri ale albuminei se întâlnesc frecvent în cazul: bolilor de rinichi ai în bolile cailor urinare.
Exemple:
glomerulonefrite, nefroza, cistita, tuberculoza renala, pielonefritele cronice, calculi urinari, hipertensiumea
arteriala esențiala, bolile de inima, diabetul zaharat, diferite infecții și intoxicații cu substanțe minerale sau
organice, mielom multiplu.

Examinări de laborator în caz de hipoalbuminemii.


- VSH (viteza de sedimentare a hematiilor) crește.
- teste pozitive de disproteinemie (scade raportul albumine, globuline)
- proteinograma apare cu modificări ale raportului între diversele fracțiuni proteice
- scade concentrația de albumine și crește timpul de înjumătățire al albuminei plasmatice pană la 50 de zile.
- crește concentrația de globuline

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Immunodiagnostic Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests.


Lippincott Williams & Wilkins, USA, 7 ed. 2004, 575-578.
2. Gh. Manole, E. M. Galețescu, M. Mateescu, Analize de laborator. Ghid privind principiile, metodele de
determinare și interpretare a rezultatelor., ediția a II-a, revizuită, 2005, Editura CNI Coresi, București.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Protein
Electrophoresis, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
5. Norbert Tietz.General Clinical Tests. In Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B.SAUNDERS, USA, 3
ed. 1995, 524-526
6. https://www.synevo.ro/electroforeza-proteinelor-serice/
7. http://www.lotus-med.ro/analize/electroforeza-proteinelor-serice/

23
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 6
ELECTROFOREZA LIPOPROTEINELOR

Electroforeza lipoproteinelor (lipidograma) este un test esential si obligatoriu pentru studiul


modificarilor lipoproteice, evaluarea riscului de afectare cardiovasculara si evidentierea Lp(a), lipoproteina
cu interes clinic deosebit implicata de ateroscleroza si tromboza, prezenta la numerosi subiecti normo- sau
dislipidemici. Separarea electroforetica are loc la pH 7.5 folosind Sudanul black drept colorant.
Profilul electroforetic normal evidentiaza urmatoarele fractiuni lipoproteice, in ordinea crescatoare
a vitezei de migrare:
• chilomicronii - care raman in origine (nu migreaza in camp electric).
• betalipoproteinele corespund lipoproteinelor cu densitate mica (LDL).
• prebetalipoproteinele care corespund lipoproteinelor cu densitate foarte mica (VLDL).
• alfalipoproteinele care corespund lipoproteinelor cu densitatea mare (HDL).
Aspectul filmului electroforetic la un subiect sanatos, dupa 12-14 ore de post alimentar, releva absenta
chilomicronilor si o banda prebeta ingusta si foarte slaba.

Variatii patologice

Hiperlipoproteinemii primare
Betalipoproteinele cresc in hiperlipoproteinemia (dislipidemii) de tip IIa, IIb si scad in tipul IV.
Pre - beta lipoproteinele cresc in dislipidemiile de tip IIb, IV, V.
Alfa lipoproteinele scad in dislipidemiile de tip IIa, IIb, III, IV.
Chilomicronii absenti in serul normal, sunt prezenti in dislipidemiile de tip I, V.

Hiperlipoproteinemiile secundare (dobandite) se asociaza anumitor afectiuni.


Tip I : diabet zaharat.
Tip IIa : porfirie acuta intermitenta, hepatopatie obstructiva, hipotiroidism, insuficienta renala.
Tip IIb : hipotiroidism, sindrom Cushing, sindrom nefrotic, disgamaglobulinemie.
Tip III : hipotiroidism, lupus eritematos sistemic.
Tip IV : diabet zaharat, obezitate, uremie, lupus eritematos sistemic, tratament estrogenic.
Tip V : diabet zaharat, hipotiroidism, sindrom nefrotic, disgamaglobulinemie.

24
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

INTERPRETARE ELECTROFOREZA LIPOPROTEINELOR


SERICE

Clasificarea dislipidemiilor dupa Friedrickson

Tip dislipidemie I IIa IIb III IV V

Colesterol total 200-400 30-100 280-350 300-500 <270 <500


mg/dl

Trigliceride mg/dl 300-700 <160 200-500 200-900 20-100 <300

Aspect ser lactescent clar clar sau usor clar sau usor opalescentlactescent
opalescent opalescent

Chilomicroni prezenti absenti absenti absenti absenti prezenti

LDL --- +++ ++ ++bloc - --

VLDL normal sau -- normal ++ ++ +++ ++


-

HDL --- normal sau normal sau - - - -


-

25
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Bibliografie

A.Chiva- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare-Ed. Universitara « Carol


Davila », Bucuresti, 2008

http://www.electroforeza.ro/GhidDeInterpretare/ElectroforezaLipoproteinelor.aspx

26
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 7
ELECTROFOREZA HEMOGLOBINEI

Electroforeza hemoglobinei în mediul alcalin

Acest tip de electroforeza permite separarea si cuantificarea hemoglobinelor normale (Hb A, Hb F si


Hb A2) si identificarea principalelor hemoglobine patologice de interes medical si antropologic: HbS, HbD,
Hb C si HbE. Analiza se efectueaza pe un hemolizat de globule rosii spalate in prealabil cu ser fiziologic.
Separarea electroforetica se face pe baza sarcinii electrice si a marimii moleculare, in gel de agaroza la pH
alcalin 8.5. Fractiunile sunt evidentiate prin colorare cu amidoschwartz si cuantificate prin densitometrare
la 570 nm.
Electroforeza hemoglobinei in mediul alcalin este recomandata pentru studiul:

- Anomaliilor calitative (hemoglobinopatii) pentru identificarea hemoglobinelor patologice Hb S,


Hb C, Hb E si Hb D.
- Anomaliilor cantitative pentru diagnosticul alfa si beta talasemiilor.

Electroforeza hemoglobinei in mediul acid

Electroforeza in mediul acid serveste la identificarea variantelor de hemoglobina determinate in


prealabil pe geluri alcaline si la diferentierea hemoglobinei normal Hb A de hemoglobinele patologice Hb
S, Hb C si Hb F. Analiza se efectueaza pe un hemolizat de globule rosii spalate in prealabil cu ser fiziologic.
Hemoglobinele sunt separate in gel de agaroza la pH acid 6.0. Fractiunile sunt evidentiate prin colorare cu
amidoschwartz prin densitometrare la 570 nm.
Profilul electroforetic normal evidentiaza, de la anod la catod, urmatoarele fractiuni:

- Hb A0, fractiunea majoritara, ce corespunde Hb A0 si Hb A2 Hb A1 a+b+c (fractiunile neglicolizate


ale Hb A adulte).
- Hb A1, fractiune minoritara, ce corespunde fractiunii glicolizate a Hb A.
Variatii patologice
Profilul electroforetic evidentiaza in cazul prezentei hemoglobinelor anormale urmatoarele fractiuni, de la
anod la catod:

- Hb C - migreaza lent si se gaseste in spatele liniei de start.


- Hb S - ramane in linia de start.
- Hb D, E, A - migreaza grupat
- Hb F si A - migreaza grupat

27
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

DETERMINAREA ELECTROFORETICA A HEMOGLOBINEI GLICOZILATE

Separarea electroforetica a Hb A1c se face in gel de agaroza, la pH acid 5.9 si depinde de afinitatea
diverselor hemoglobine pentru gel si de sarcina lor. Dupa uscare, electroforegramele sunt densitometrate
fara colorare, la 420 nm, lungimea de unda la care absoarbe hemoglobina. Metoda de determinare
electroforetica prezinta unele avantaje, cum ar fi:

- valoarea Hb A1c nu depinde de concentratia totala de hemoglobină


- metodele electroforetice permit separarea Hb F si a celor cu punct izoelectric scazut, hemoglobine
ce pot interfera cu glicohemoglobinele in alte metode
Tehnica de determinare electroforetica a Hb A1c ofera informatii si asupra eventualelor hemoglobinopatii.
Rolul cuantificarii hemoglobinei glicozilate in monitorizarea tratamentului diabetului zaharat
Deoarece ea reflecta fidel concentratia medie a glucozei sanguine pe o perioada anterioara destul
de intinsa (4-8 saptamani), cuantificarea ei poate constitui un test screening, oferind chiar posibilitatea
precizarii, in anumite limite, a debutului diabetului
Deoarece revenirea la normal a Hb glicozilate necesita un interval de cateva sǎptamani,
determinarea ei constituie un test excelent de verificare a respectarii riguroase a tratamentului (in
comparatie cu glicemia care se poate normaliza in cateva zile)
Valorile normale sunt cuprinse, in general intre 4- 6 %. Valorile sub 6 % sunt considerate normale,
cele ce depasesc 6% ridicand suspiciunea de diabet. Pragul de 6% este impus de recomandarile
internationale si de sistemul de standardizare NGSP/ DCCT (National Glycohemoglobin Standardization
Program/Diabete Control and Complication Trial).
Un hemolizat normal prezinta trei fractiuni:

- cea mai catodica corespunde hemoglobinelor glicozilate intr-o proportie mai mica: HbA1a si
HbA1b
- fractia intermediara corespunde HbA1c
- cea mai anodica fractie contine HbA0 si HbA2

28
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

INTERPRETARE - ELECTROFOREZA HEMOGLOBINEI

Profil electroforetic normal

Profil electroforetic patologic

• - cresterea valorii procentuale a fractiunii Hb A2 -

29
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena


Bibliografie:
http://www.electroforeza.ro/ElectroforezaHemoglobinei.aspx

30
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 8

IDENTIFICAREA SI CUANTIFICAREA HORMONILOR GASTROINTESTINALI PRIN


METODA ELISA

GENERALITATI

Principalii hormoni gastrointestinali: Amilina, Ghrelina, Leptina, GLP-1, GLP-2, GIP, PP,
PYY, OXM.
Testele imunoenzimatice sunt teste ce utilizează marcarea cu enzime, metodă ce reprezintă
o alternativă pentru metoda cu radioizotopi. Cele mai folosite sunt testele ELISA (Enzyme-Linked
Immunoabsorbent Assay), EIA si EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique).

Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): reprezintă o metodă sensibilă deoarece


fiecare moleculă de enzimă poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al
reacției. Prin activitate enzimatică se formează produși colorați care precipită, astfel încât nu
difuzează de la locul de formare.
În laboratoarele de investigație clinică testele ELISA sunt automatizate (ex: determinarea
de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici IgG, serologie
paraziti, etc.).

METODA IMUNOENZIMATICĂ ELISA ÎN MICROPLACĂ


IDENTIFICAREA ȘI CUANTIFICAREA GRELINEI TOTALE PRIN METODA ELISA

Principiul metodei ELISA

Ag (antigenul) este legat la o suprafață solidă, Ac (anticorpul) primar se leagă de Ag, iar Ac
secundar marcat cu o enzimă se leagă de Ac primar; enzima convertește substratul într-un produs
colorat, care formează un precipitat, proporțional cu cantitatea de Ac din serul pacientului.
Metoda ELISA de tip “sandwich”/cu Ag capturat crește specificitatea metodei, necesitând legarea
Ac la doi epitopi diferiți (reacțiile încrucișate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este puțin
probabil să aibă loc la ambii epitopi simultan). Ac monoclonal este legat la suprafața solidă și leagă
Ag, dacă acesta este prezent în serul pacientului; materialul nelegat este spălat; un al doilea Ac
marcat, care recunoaște un epitop diferit, se leagă la Ag; o nouă spălare îndepărtează Ac nelegați,
apoi se adaugă substratul, care este convertit într-un produs colorat, proporțional cu cantitatea de
Ag prezentă în serul testat.

31
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 8.1 Reprezentare schematic a principiului metodei ELISA

Este un test ELISA basat pe:


1. Identificarea moleculelor de grelina de catre anti-human ghrelin IgG si imobilizarea
complexului rezultat in godeurile unei placi de microtitrare acoperita cu o cantitate
cunoscuta de anticorpi.
2. Legarea simultana a unui anticorp secundar la grelina
3. Inlaturarea prin spalare a materialului ramas nelegat (in exces).
4. Inlaturaea prin spalare a enzimei ramase libere
5. Cuantificarea conjugatului imobilizat anticorp-enzima prin monitorizarea activitatilor
peroxidazei in prezenta substratului 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine.
Anticorpii sunt molecule de natură proteică (globulină), produse în organitele limforeticulare
sanguine denumite limfocite. Aceste mlecule proteice sunt capabile să recunoască o particulă
străină din organism, denumită antigen, și să declanșeze o reacție imunologică, ce are ca rezultat
îndepărtarea respectivei particule. Unitatea structurală a anticorpului este o proteină tetracatenară,
denumită monomer.
Activitatea enzimatică este masurată spectrofotometric prin citirea absorbanței la 450 nm
și 590 nm.
Deoarece creșterea absorbției este direct proporțională cu cantitatea de grelină umană
totală capturată într-o proba oarecare, concentrația de grelina totala poate fi obținută prin
interpolarea unei curbe de referință generată în același test cu standardele de referință ale
concentrațiilor cunoscute de grelină umană.
• Dacă proba este pozitivă, anticorpii specifici din proba de ser diluat se ataseaza la antigenii
cuplati in faza solidă.
• În etapa a doua, anticorpii atașati sunt detectati cu anticorpi anti-umani marcați cu peroxidază.
• În a treia etapă, anticorpii legați devin vizibili folosind o soluție enzimatică de colorare numită
cromogen / substrat care este capabilă de a stimula o reacție de culoare. Intensitatea culorii
produsă este proporțională cu concentrația de anticorpi din proba de ser.

32
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Calibrarea/Evaluarea
• În cazul unei metode cantitative ELISA, calibrarea este efectuată în general cu trei seruri de
calibrare:
Serul de calibrare 1: pentru limita superioară a intervalului de măsurare
Serul de calibrare 2: pentru limita superioară a intervalului valorilor normale(valoare cut-off)
Serul de calibrare 3: pentru controlul negativ

• Pentru unele teste nu este nevoie pentru incubare de valori blank sau determinări duplicat, însă
alți parametri necesită determinări duplicat.
• Metoda semicantitativă ELISA se realizează folosind un singur calibrator. Curbele de calibrare
extinse se găsesc în unele metode ELISA pentru determinarea imunității sau diagnosticare
CSF.
• Calibrarea se realizează în unități relative (RU / ml) sau, în cazul în care există un ser de
referință internațional, în unități internaționale (UI / ml).
• Fiecare test poate fi efectuat în mod opțional folosind un ser de control pozitiv sau negativ
inclus în kit-ul de testare. Intervale de referință specifice ale kit-ului sunt prevăzute pentru
fiecare calibrator și ser de control
• Toate metodele de calibrare pot fi de obicei efectuate cu ușurință cu ajutorul unui software
ELISA

Bibliografie:
protocolul de lucru pentru determinarea Grelinei umane de la Millipore (HUMAN GHRELIN
(TOTAL) ELISA KIT, emdmillipore.com, EZGRT-89K Rev. 8-May-17 EMD Millipore)
http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/metode-automate-de-determinare-a-markerilor-
imunologici-74

33
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 9

METODA IMUNOENZIMATICĂ ELISA ÎN MICROPLACĂ

PREGATIREA MATERIALELOR NECESARE ȘI A REACTIVILOR PENTRU


IDENTIFICAREA ȘI CUANTIFICAREA GRELINEI TOTALE PRIN METODA ELISA

Materiale necesare

1. Pipete și vârfuri de pipete: 10 μL ~ 20 μL or 20 μL ~ 100 μL


2. Pipete multicanal și vârfuri de pipete: 5 ~ 50 μL and 50 ~ 300 μL, buffer (soluție tampon) și
recipiente pentru reactivi.
3. Vortex Mixer
4. Apă deionizată
5. Plăci sau stripuri (benzi) de microtitrare, din polistiren, căptușite cu anticorpi ancorați.
Stripurile microplăcii conțin godeuri detașabile. Godeurile căptușite cu antigeni purificați și
caractererizați biochimic, sunt utilizate drept faza solidă care conține antigeni legați.
6. Cititor microplaci capabil sa citeasca absorbanța la 450 nm și 590 nm.
7. Agitator orbital pentru microplaci
8. Șervețele sau hârtie absorbantă
9. Pefabloc sau AEBSF [4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoreide], 100 mg/mL soluție apoasă
stoc (stocare la -20oC, reducerea ciclurilor multiple de îngheț/dezgheț). Reactivul este recomandat
pentru utilizare in procedura de colectare și stocare a probelor.
10. Soluție 5N HCl, recomandată pentru utilizare în procedura de colectare și stocare a probelor.

REACTIVI NECESARI

Unii reactivi sunt gata de lucru, alții necesită preparare sau sunt în formă concentrată și este
necesară pregătire prealabilă. (ex. soluția tampon de spălare: este în formă concentrată)

În unele cazuri codificarea culorilor permite identificarea clară a reagenților.

1. 10X HRP buffer de spălare concentrat


10X concentrat de 50 mM Tris Buffered Saline cu Tween-20.
Cantitate: 2 sticle a câte 50 mL fiecare
Preparare: Diluție 1:10 cu apă distilată sau deionizată.

34
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

2. Standard de Grelina totala umana


Grelină umană totală standard de referință, liofilizat.
Cantitate: 1 sticlă, 2 ml/sticlă în momentul hidratării.
Preparare: Dizolvare rapidă în apă distilată sau deionizată imediat înainte de utilizare. După
dizolvare se diluează cu buffer de analiză conform procedurii de pregatire și utilizare a
standardelor de mai jos.
3. Controlul 1 și 2 de calitate pentru Grelina totala umana
Câte un flacon din fiecare, liofilizat, conținând grelina umană totală de două concentratii (nivele)
diferite.
Cantitate: 0.5 mL/flacon la hidratare
Preparare: Reconstirea fiecărui flacon cu 0.5 mL apă deionizată imediat înainte de utilizare.
Aliquotarea în cantități mici și congelarea la -20oC pentru utilizare ulterioară. Evitarea ulterioară
a inghețului și dezghețului.
4. Ser Human Ghrelin (Total) Matrix
Ser matrix conținând 0.08% Sodium Azide
Cantitate: 1 mL/flacon
Preparare: Ready to use.
5. Assay Buffer
0.05 M phosphosaline, pH 7.4, conținând 0.025 M EDTA, 0.05 % Triton X-100, 0.08% sodium
azide, și 0.1% BSA.
Cantitate: 15 mL/flacon
Pregătire: Ready to use.
6. Human Ghrelin (Total) Capture Antibody
Pre-titered capture antibody solution in buffer
Cantitate: 3 mL/flacon
Pregătire: Se amestecă bine cu Human Ghrelin (Total) Detection Antibody înainte de folosire.
7. Human Ghrelin (Total) Detection Antibody
Pre-titered detection antibody solution in buffer
Cantitate: 3 mL/flacon
Pregătire: Se amestecă bine cu Human Ghrelin (Total) Capture Antibody înainte de folosire.
8. Soluția enzimatică
Conjugat peroxidază streptavidin pre-titrat în soluție tampon
Cantitate: 12 mL/flacon
Pregătire: Ready to use
9. Substratul
3, 3’,5,5’-tetramethylbenzidine în soluția buffer.
Cantitate: 12 mL/flacon
Pregătire: Ready to use. Este recomandată reducerea timpului de expunere la lumină.
10. Soluție de stopare a rezcției enzimatice
0.3 M HCl
Cantitate: 12 mL/flacon

35
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Pregătire: Ready to use.


Precauții: Soluție Corozivă
STOCAREA ȘI STABILITATEA REACTIVILOR
Se recomandă stocarea reactivilor pentru componentele din kit la temperaturi cuprinse în
intervalul 2 - 8°C.
Standardele și controalele reconstituite pot fi congelate pentru utilizarea ulterioară dar trebuie
evitate procesele repetate de îngheț și dezgheț.

Precauții pentru reactivi

1. Sodium Azide

Sodium Azide sau Proclin, trebuie sa fie adăugate la unii reactivi, având rol de conservare.
Deși concentrațiile sunt scăzute, Azida de sodiu și Proclina pot reacționa cu instalațiile de plumb
și cupru pentru a forma azide metalice explozive. Aruncați conținutul neutilizat și deșeurile în
conformitate cu reglementările internaționale, federale, de stat și locale.

2. Acidul clorhidric

Acidul clorhidric este corosiv, poate provoca arsuri ale ochilor și pielii. Daunator daca e inghitit.
Provoacă arsuri ale tractului respirator și digestiv. Evitați contactul cu pielea și ochiul. Nu înghițiți
sau ingerați.

A. Pregatirea standardelor

1. Se deschide cu precauție flaconul Standrad liofilizat. Folosind o pipetă se procedează la


reconstituirea Standardului de grelină umană (totală) cu 2 mL apă deionizată. Se consultă fișa de
analiză pentru concentrația exacta. Se inversează și se amestecă ușor pînă la dizolvarea completă.

2. Se etichetează 5 tuburi 1, 2, 3, 4, 5. Se adaugă Buffer de analiză în fiecare din cele 5 tuburi


conform volumelor din tabelul de mai jos. Se diluează soluția stock a standardului reconstituit
conform tabelului de mai jos. Se vortexează rapid fiecare tub pentru a asigura amestecarea
completă.

Notă: Se schimbă vârful de pipetă pentru fiecare diluție de standard și se sterge vârful de pipetă
înainte de distribuire. Cantitatea rămasă nefolosită din soluția stock de standard reconstituit trebuie
stocată în aliquote mici la -20°C. Evitați multiple cicluri de îngheț/dezgheț.

36
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Volumul de apă deionizată de Volumul de Standard de Concentrația de Standard


adăugat adăugat pg/mL
2 mL 0 X (pentru concentratiile
exacte din fișa de analiză)

Nr. tuburi Volumul de Buffer de adăugat Volumul de Standard de Conc. Standardelor


adăugat (pg/mL)
1 500 µL 500 µL de Standard X/2
reconstituit
2 500 µL 500 µL din tubul 1 X/4
3 500 µL 500 µL din tubul 2 X/8
4 500 µL 500 µL din tubul 3 X/16
5 500 µL 500 µL din tubul 4 X/32

B. Pregatirea controalelor de calitate


Se deschide cu precauție flaconul ce conține controlul de calitate liofilizat. Se reconstituie
fiecare control de ghrelina umană totală Quality Control 1 și Quality Control 2 cu 0,5 mL apă
distilată sau deionizată și se inversează flaconul și se amestecă ușor până la dizolvarea completă.
Cantitatea rămasă nefolosită din controalele reconstituite trebuie să fie păstrate în aliquote mici la
≤ -20oC. Evitați multiple cicluri de îngheț/dezgheț.

C. Pregătirea mixului de anticorpi de captură și detecție.


Înainte de folosire se combină întregul conținut de Anticorp Captura pentru Ghrelina
Umană (Totală) -3 mL și Anticorpul Detecție pentru Ghrelina Umană (Totală) - 3 mL în raport 1:1
și se inversează flaconul și se amestecă ușor.

Bibliografie:
protocolul de lucru pentru determinarea Grelinei umane de la Millipore (HUMAN GHRELIN
(TOTAL) ELISA KIT, emdmillipore.com, EZGRT-89K Rev. 8-May-17 EMD Millipore)

37
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 10
METODA IMUNOENZIMATICĂ ELISA ÎN MICROPLACĂ

METODA DE LUCRU PENTRU IDENTIFICAREA ȘI CUANTIFICAREA GRELINEI


TOTALE PRIN ELISA

Toți reactivii se aduc la temperatura camerei imediat înainte de folosirea lor în teste1.

1. Se diluează reactivul 10X HRP buffer de spălare concentrat de 10 ori prin amestecarea
conținuturilor ambelor sticle de buffer cu 900 mL apă distilată sau deionizată.

2. Se îndepărtează numărul necesar de benzi din placa de microtitrare. Benzile rămase nefolosite
pot fi resigilate în punga de folie și păstrate la 2-8°C. Se asamblează benzile pe un suport de placă
gol și se pipetează în fiecare godeu 300 µL din Bufferul de spalare diluat (Wash Buffer pregătit la
1). Se decantează bufferul de spălare și se îndepărtează cantitatea reziduală prin inversarea plăcii
și prin scuturarea atentă, de câteva ori, pe prosoape de hârtie absorbantă. Se spală placa ce conține
godeurile de testare, folosind această procedură descrisă anterior, de încă 2 ori. A nu se lăsa
godeurile să se usuce înainte de a trece la etapa următoare. Dacă se folosește o stație automată
de lucru, se urmează instrucțiunile instrumentului respectiv pentru a efectua toți pașii de spălare
menționați în acest protocol.

3. Se adaugă 20 μL Matrix Solution în godeurile Blank, Standarde și Quality Control.

4. Se adaugă 30 μL buffer de analiză în fiecare din godeurile Blank și probe.

5. Se adaugă 10 μL buffer de analiză în fiecare din godeurile Standard și Quality Control.

6. Se adaugă în duplicat 20 μL Ghrelin Standards în ordinea creșterii concentrațiilor în godeurile


adecvate.

7. Se adaugă în duplicat 20 μL QC1 și 20 μL QC2 concentrațiilor în godeurile adecvate.

8. Se adaugă treptat câte 20 μL din fiecare probă de testat în duplicat în godeurile rămase.

9. Se transferă Antibody Solution Mixture (1:1 amestec de anticorpi de captură și detecție) într-un
recipient buffer/reagent și se distribuie 50 μL în fiecare godeu cu ajutorul unei pipete multicanal.

10. Se acoperă placa cu dispozitivul de etanșeizare a plăcuțelor și se incubează la temperatura


camerei timp de 2 ore pe un agitator orbital pentru plăci de microtitrare setat la viteză moderată de
agitare, între 400 – 500 rpm.

11. Se îndepărtează sigiliul de pe placă și se decantează soluțiile din placă. Se acoperă placa la fel
ca înainte.

38
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

12. Se spală godeurile de 3 ori cu buffer de spălare diluat, 300 μL în fiecare godeu/fiecare spălare.
Se decantează și se șterge prin apăsare placa după fiecare spălare pentru a îndepărta soluția tampon
de spălare reziduală.

13. Se adaugă 100 μL Soluție Enzimatică în fiecare godeu. Se acoperă placa pentru etanșeizare și
se incubează pentru 30 min la temperatura camerei pe un agitator de plăci la viteză moderată.

14. Se descoperă placa, se îndepărtează soluțiile din placă, se șterge prin apăsare pentru
îndepărtarea lichidelor reziduale.

15. Se spală de 6 ori godeurile cu soluția tampon de spălare (Wash Buffer), 300 μL/godeu/spălare.
Se decantează și se șterge prin apăsare placa după fiecare spălare pentru a îndepărta soluția tampon
de spălare reziduală.

16. Se adaugă 100 μL de soluție Substrat în fiecare godeu, se acoperă placa pentru etanșeizare și
se lasă la agitat timp de aproximativ 5-20 minute pe un agitator orbital. În godeurile standardelor
cu Ghrelină ar trebui să apară culoarea albastră cu o intensitate proporțională cu creșterea
concentrației de Ghrelină.

(Notă: Culoarea se poate dezvolta mai rapid sau mai lent decât timpul de incubare
recomandat, în funcție de temperatura localizată a camerei. Monitorizați vizual apariția
culorii pentru a optimiza timpul de incubare)

17. Se îndepărtează capacul și se adaugă 100 μL soluție stop (soluție de stopare a reacției
enzimatice de culoare). [Precautii: SOLUȚIA DE STOPARE ESTE COROZIVĂ]. Se agită
plăcuța cu mîna pentru a asigura amestecarea completă a soluției de stopare în toate godeurile.
Culoarea albastră ar trebui să devină galbenă după acidifiere. The blue color should turn into
yellow after acidification. Ștergeți partea inferioară a plăcii de microtitrare pentru a îndepărta orice
reziduu înainte de citirea cu cititorul de plăci. Citiți absorbanța la 450 nm și 590nm într-un cititor
de plăci în decurs de 5 minute și asigurați-vă că nu există bule de aer în nicio fantă (godeu).

39
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 10.1 Schema procedurii de lucru pentru metoda ELISA

40
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 10.2 Shema distribuirii standardelor, controalelor si a probelor în godeurile pentru metoda
ELISA

Bibliografie:
Protocolul de lucru pentru determinarea Grelinei umane (totale) de la Millipore (HUMAN
GHRELIN (TOTAL) ELISA KIT, emdmillipore.com, EZGRT-89K Rev. 8-May-17 EMD Millipore.

41
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 11

CALCULUL ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR PENTRU METODA ELISA

Se obține un grafic pentru curba de referință prin plotarea valorii absorbanței, pe axa Y,
rezultată în urma diferenței între valorii citite la 450nm și valoarea citită la 590nm, față de
concentrațiile standardului de Ghrelină pe axa X. Curba doză-răspuns a acestei analize se
potrivește cel mai bine unei ecuații logistice sigmoidale de 4 sau 5 parametri. Rezultatele probelor
necunoscute pot fi calculate cu orice program de calculator care are o funcție logistică de 4 sau 5
parametri.

Notă: Atunci când volumele de probă analizate diferă de 20 μL, trebuie efectuată o ajustare
matematică adecvată pentru a se potrivi cu factorul de diluție (de exemplu, dacă se utilizează 10
μL de probă, datele calculate trebuie multiplicate cu 2). Când volumul de probă analizat este mai
mic de 20 μL, compensați deficitul de volum cu soluție de matrice (matrix solution).

INTERPRETAREA REZULTATELOR

1. Testul va fi considerat acceptat atunci când toate valorile de control al calității se încadrează în
intervalul QC calculat. Dacă oricare dintre QC-uri se află în afara domeniului de control, controlați
rezultatele cu un supervizor.
2. Dacă diferențele dintre rezultatele probelor în duplicat este >15% CV, se repetă testele.
3. Concentrația minimă de detecție detectată de acest test este de 50 pg/mL Ghrelină Totală (pentru
20 µL de probă).
4. Intervalul adecvat pentru acest tip de test este între 50 pg/mL - 5000 pg/mL Ghrelină totală
(pentru 20 µL de probă). Orice rezultat peste 5000 pg/mL la 20 µL probă trebuie să fie diluat
folosind soluția matrix și testul repetat până când rezultatele se regăsesc în intervalul limitelor de
detecție.

42
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 11.1 Curba de referință pentru interpretarea testului ELISA

Bibliografie:
Protocolul de lucru pentru determinarea Grelinei umane de la Millipore (HUMAN GHRELIN
(TOTAL) ELISA KIT, emdmillipore.com, EZGRT-89K Rev. 8-May-17 EMD Millipore

43
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 12

METODE DE ANALIZĂ ALE BAZELOR AZOTATE ŞI ACIZILOR NUCLEICI

Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi concentraţiei ADN.

Principiul metodei
ADN-ul extras din diferite surse biologice trebuie verificat pentru estimarea purităţii şi
integrităţii înainte de a fi utilizat în diferite manipulări moleculare.
Aprecierea gradului de puritate al unui extract ADN se realizează prin evaluarea valorii
absorbanţei la diferite lungimi de undă (260 şi 280 nm), la un spectrofotometru UV, în cuve de
cuarţ cu drum optic cunoscut.
Folosirea acestor cuve este absolut necesară deoarece cuarţul permite trecerea radiaţiilor
luminoase din spectrul UV.
În paralel, se recomandă şi determinarea întregului spectru de absorbţie al probei în
domeniul 200 - 400 nm, pentru a evidenţia prezenţa altor maxime la lungimi de undă diferite de
cele de interes, care pot aparţine eventualilor contaminanţi.
Verificarea purităţii ADN se realizează spectrofotometric pe baza următoarelor
considerente:
i) moleculele de ADN mono- sau dublucatenar prezintă absorbanţă maximă la lungimi de
undă cuprinse între 257 şi 260 nm;
ii) proteinele care pot impurifica extractul au absorbanţa maximă la 280 nm;
iii) glucidele rămase eventual în extract au absorbanta maxima la la 230 nm;
iv) oligonucleotidele rezultate din fragmentarea ADN în timpul extracţiei prezintă
absorbanţa maximă la 220 nm.
Determinarea concentraţiei ADN dintr-un extract se bazează pe citirea absorbanţei la 260
nm şi pe folosirea următoarelor formule:
A260 = 1 corespunde la 50 µg ADN dc/ml;
A260 = 1 corespunde la 33 µg ADN mc/ml.
Reactivi şi aparatură:
i) soluţie de ADN de concentraţie necunoscută;
ii) spectrofotometru UV-VIS.
Mod de lucru
Se determină spectrul de absorbţie pentru soluţia de ADN în intervalul 200–400 nm şi se
identifică maximul de absorbţie.
Se citesc absorbanţele soluţiei de ADN la 260, 230 şi 280 nm şi se calculează valorile
rapoartelor A260/A280 şi A260/A230 pentru a determina gradul de puritate al soluţiei.
Cu ajutorul valorii de absorbanţă la 260 nm se calculează concentraţia soluţiei de ADN
folosind formulele de mai sus.
Rezultate şi discuţii
În figura de mai jos este prezentat spectrul de absorbţie al unei soluţii de ADN cu
identificarea maximului la 260nm.
Eventualele maxime de absorbtie pot fi datorate potenţialilor contaminanţi din soluţia de
ADN.

44
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 12.1 Spectrul de absorbţie al unei soluţii de acid deoxiribonucleic.

În funcţie de valorile A260 şi A280 se poate stabili gradul de contaminare proteică sau cu
ARN a extractului ADN.
Raportul optim A260/A280 este cuprins între 1,8 şi 2. Un raport mai mic de 1,8 ne indică
prezenţa proteinelor în timp ce un raport mai mare de 2 este un indiciu al contaminării cu ARN.
Raportul A260/A230 oferă informaţii asupra gradului de contaminare cu polizaharide a extractului
ADN. Valoarea normală a acestuia este 2. Un raport mai mic indică o contaminare cu polizaharide.

Bibliografie:
https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache/publication/274083742_Lucrari_practice
_de_Biochimia_acizilor_nucleici_si_biologie_moleculara/links/5515c50e0cf2b5d6a0ec590e/Luc
rari-practice-de-Biochimia-acizilor-nucleici-si-biologie-moleculara.pdf, pag. 50-51.

45
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

LP 13

METODE DE ANALIZĂ ALE BAZELOR AZOTATE ŞI ACIZILOR NUCLEICI

Verificarea integrităţii ADN prin electroforeză în gel de agaroză

Principiul metodei
Electroforeza în gel de agaroză constituie o metodă standard pentru separarea, purificarea şi
identificarea moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri de unde acestea nu pot fi separate
adecvat prin alte tehnici.
Pentru verificarea integritatii ADN genomic, precum şi pentru estimarea gradului de contaminare
cu ARN, extractul este supus unei electroforeze în gel de agaroză, în sistem submers pe placă
orizontală. La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcina electrică globală negativă. Ca
urmare, dacă sunt plasaţi într-un câmp electric, moleculele acestora vor migra către anod Figura
13.1).
Vizualizarea moleculelor de ADN se va realiza folosind bromura de etidiu. Acest fluorocrom este
un agent intercalant care se inseră între planurile formate de bazele azotate la nivelul
macromoleculei de ADN. Prin excitarea bromurii de etidiu în lumina UV (λ = 250 - 310 nm) se
obţine o emisie în domeniul vizibil, la 520 nm (culoare rozportocalie). Imaginile sunt interpretate
cu ajutorul unui sistem de vizualizare cu UV.
Material biologic: probe de ADN genomic.
Se pot folosi în scop comparativ probe păstrate în condiţii optime şi probe lăsate câteva zile
la temperatura camerei (în cazul acestora poate fi evidenţiat fenomenul de fragmentare). Reactivi
şi aparatură:
i) tampon de electroforeză: TAE 1X – TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002
M. Se prepară ca soluţie 10X care este apoi diluată înainte de folosire;
ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% în TAE 1X;
iii) soluţie de bromură de etidiu 10 mg/ml;
iv) agaroză;
v) tanc de electroforeză orizontală pentru separare de acizi nucleici;
vi) sursă de curent;
vii) transiluminator UV.
ATENŢIE: Bromura de etidiu este toxică şi are un puternic efect mutagen.

46
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 13.1 reprezentare schematică a principiului metodei de electroforeză pentru acizii nucleici.

47
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Mod de lucru
1. Într-un pahar Erlenmeyer se cântăresc 0,4 g agaroză. Peste ea se adaugă 40 ml tampon
TAE 1X (concentraţia finală a agarozei 1%). Paharul se acopera cu o folie de plastic sau cu staniol
şi se încălzeşte la fierbere până la dizolvarea totală a agarozei.
2. Soluţia obţinută este lăsată la răcit până la o temperatură de 50-60o C. În acest timp se
vor adăuga 2 µl bromură de etidium pentru a permite vizualizarea ulterioară a ADN.
3. Se izolează tăviţa aparatului de electroforeza cu bandă adezivă. Se montează pieptenul
astfel încât dinţii acestuia să nu atinga taviţa şi apoi se toarnă gelul cald (50 o C). Se lasă 30-40 de
minute la temperatura camerei pentru solidificare.
4. Se îndepărtează banda adezivă şi pieptenul cu mare atenţie, iar gelul solidificat complet
se introduce în aparat.
5. Se amestecă proba de analizat cu tamponul sau şi se încarcă cu mare atenţie în godeuri
cu o pipetă automată.
6. Se pune capacul aparatului şi se conectează la sursa de curent fixată la o tensiune
constantă (aproximativ 3V/cm). Durata migrării este de 50-60 de minute.
7. La finalizarea migrării moleculele de ADN se vor vizualiza cu ajutorul unui
transiluminator UV.

Figura 13.2 Electroforeză de ADN genomic în gel de agaroză în scopul evidenţierii


integrităţii acestuia. Liniile 1 – 6: ADN genomic nefragmentat. (din Marieta Costache, 2009, pag.
54)

48
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Rezultate şi discuţii
Moleculele de ADN genomic migrează limitat deoarece sunt extrem de voluminoase.
Înaintarea prin gelul de agaroză este foarte înceată datorită rezistenţei opusă de acesta şi
imposibilităţii moleculelor de a pătrunde în porii gelului.
În cazul unor molecule de ADN integre, nefragmentate, acestea vor putea fi observate sub
forma unei benzi compacte, în apropierea godeurilor de start (Figura 13.2). Cu cât banda este mai
groasă şi mai intensă, cu atât proba de ADN este mai concentrată şi mai nefragmentată.
În cazul unui ADN genomic degradat, fragmentat, benzile nu vor fi compacte şi vor apărea
sub forma unor dâre/”comete” (Figura 13.3). Aceste dâre/”comete” sunt cu atât mai lungi şi mai
intense, cu cât ADN este mai degradat. Ele apar datorită fragmentelor mici de ADN rezultate în
urma scindării macromoleculelor iniţiale. Degradarea probelor de ADN genomic apare în urma
păstrării acestora în condiţii neadecvate, procesul putând merge până la degradarea totală a ADN

.
Figura 13.3 Electroforeză de ADN genomic în gel de agaroză în scopul evidenţierii
integrităţii acestuia. Liniile 4, 5: ADN genomic nefragmentat; liniile 1, 2, 8: ADN genomic parţial
degradat, linia 6: ADN genomic puternic degradat, liniile 3, 7: ADN genomic degradat aproape în
totalitate. (din Marieta Costache, 2009, pag. 55).

49
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura 13.4 Reprezentare schematică a camerei de electroforeză.

50
BIOCHIMIE – îndrumător lucrări practice ș. l. Lungu Maria Magdalena

Figura.....Exemplu de imagine pentru analiza migrării electroforetice a fragmentelor de acizi


nucleici.
Bibliografie:
https://www.researchgate.net/profile/Marieta_Costache/publication/274083742_Lucrari_practice_
de_Biochimia_acizilor_nucleici_si_biologie_moleculara/links/5515c50e0cf2b5d6a0ec590e/Lucrari-
practice-de-Biochimia-acizilor-nucleici-si-biologie-moleculara.pdf. Pag. 52-55.

51