LUCRARE PRACTIC|

POLARIMETRIE,

8
MICROSCOPIE
POLARIZANT|
{I ULTRAMICROSCOPIE

A. Lumin\ polarizat\, birefringen]\,

activitate optic\ - date teoretice

B. Polarimetrie
B1. M\surarea polarimetric\ a
concentra]iei de glucoz\ `n urina
patologic\
B2. M\surarea concentra]iei unei
substan]e optic active `n solu]ie prin
metoda interpol\rii

C. Microscopie polarizant\: punerea `n

eviden]\ a structurilor biologice bire-
fringente:
- structuri dicroice [i birefringente

D. Ultramicroscopul sau microscopul cu

fond `ntunecat — observarea particulelor
coloidale prin efect Tyndall

E. ~ntreb\ri [i exerci]ii

~n prima parte a lucr\rii sunt prezentate no]iuni de baz\ asupra polariz\rii luminii.
O serie de substan]e, denumite optic active, au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.
O aplica]ie a acestei propriet\]i este polarimetria, care constituie prima tem\ a acestei lucr\ri
practice. Materialele sau structurile anizotrope prezint\, la rândul lor, `n lumin\ polarizat\,
dou\ fenomene: dicroismul [i birefringen]a. Ca urmare, devine posibil\ observarea unor
structuri anizotrope, pe care o ve]i efectua cu ajutorul microscopului polarizant. Tot la aceast\
lucrare practic\ ve]i lucra cu ultramicroscopul sau microscopul pe fond `ntunecat care prezint\
un sistem de iluminare particular.

1

B. Polarimetrie
☺ PARTEA PRACTIC|
c Principiul metodei polarimetrice const\
La baza metodei polarimetrice
st\ legea lui Biot:
Biot
α = [ α] 20
D ⋅l⋅c (3)
valabil\ `n aceast\ form\ numai
pentru solu]ii, `n care:
α = unghiul de rotire al planului
de polarizare al luminii;
[α]20D = puterea rotatorie specifi-
că pentru linia D a sodiului la 20°C;
l = lungimea stratului de lichid;
c = concentraŃia substan]ei
Prin intermediul puterii
rotatorii specifice, unghiul α variaz\
pu]in cu temperatura, dar depinde
foarte mult de lungimea de und\ a
luminii polarizate.
LUCRARE PRACTIC|
B1. M\surarea polarimetric\ a
concentra]iei glucozei din urin\
const\ `n
m\surarea unghiului de rota]ie rota]ie a luminii plan
polarizate de c\
c\tre o substan]
substan]\
ubstan]\ optic activ\
activ\ introdus\
introdus\
`ntre polarizor [i analizor.
Metoda folosit\ este o metod\ cantitativ\ cu
ajutorul c\reia se m\soar\ concentra]ia unei substan]e
optic active `ntr-o solu]ie prin raportarea la
concentra]ia unei solu]ii etalon (metod\ relativ\ [i
indirect\).
Scriem legea lui Biot (ecua]ia 3) pentru cele dou\
solu]ii (indicele e semnific\ solu]ia etalon, iar x
semnific\ solu]ia de cercetat, cu concentra]ie
necunoscut\):
α e = [α ]20
D ⋅ l ⋅ c e , si respectiv
α x = [α ]20
D ⋅ l ⋅ cx
Raportând valoarea unghiului determinat de solu]ia
de cercetat la valoarea unghiului provocat de solu]ia
etalon (numai `n cazul `n care ambele probe con]in
aceea[i substan]\ optic activ\) rezult\ rela]ia de
principiu a metodei:
α x cx
= (4)
α e ce
Rela]ia (4) arat\ c\ rota]ia planului de oscila]ie al
luminii liniar polarizat\ este propor]ional\ cu
concentra]ia `n cazul a dou\ solu]ii con]inând acela[i
component optic activ, dac\ determin\rile sunt
efectuate la aceea[i temperatur\ [i la aceea[i lungime
de und\, lumina str\b\tând straturi egale de solu]ii.
Din rela]ia 4 rezult\ imediat rela]ia de calcul:
α
c x = ce ⋅ x (5)
αe
2

Fig. 9 Polarimetru
1- Ocular
2- Lup\
3- Roti]\ de control
4- Inel de focalizare
5- Scal\ [i vernier
6- Compartimentul pentru prob\
7- Filtru de sticl\
8- Capac pentru becul de sodiu
9- Buton pornit/oprit
L.C.
A C
B maxim\
Fig. 11
Imaginile posibile ale
c`mpului polarimetric
LUCRARE PRACTIC|
Aparatele ce permit m\surarea unghiului de
rota]ie a planului de polarizare, consecutiv trecerii
luminii polarizate printr-o substan]\ optic activ\, se
numesc polarimetre . Imaginea polarimetrului utili-
zat la lucrarea practic\ este prezentat\ `n fig. 9.
Polarimetrul este un dispozitiv alc\tuit `n
principal din dou\ prisme nicol dispuse coaxial, `ntre
cei doi nicoli fiind a[ezat tubul polarimetric (sau
cuva) ce con]ine solu]ia optic activ\\ (vezi figura 10).
Sursa de lumin\
lumin \ monocromatic \ - o lamp\ de
sodiu - produce un fascicul divergent, transformat `n
fascicul paralel de lentila colimator LC. Lumina
str\bate nicolul polarizor ob]inându-se un fascicul
de lumin\ liniar polarizat\. Nicolul analizor, analizor
montat `ntr-un tub, se afl\ la o distan]\ de circa 30 cm
[i se poate roti `n jurul axei cu 360°. Analizorul este
solidar cu un tambur gradat (0 - 180°), iar un sis tem
vernier permite citirea diviziunilor de grad.
P F C F A T
Fig. 10
Schema polarimetrului
S - sursa de lumin\ monocromatic\;
L.C. - lentil\ colimator; P - polarizor;
C - cuv\; F - ferestre; A - analizor;
T - tambur gradat
S\ consider\m acum cazul a doi nicoli a[eza]i
coaxial. Pozi]ia axelor optice ale celor doi nicoli, una
`n raport cu cealalt\, genereaz\ urm\toarele situa]ii:
1° Dac\ axele optice ale celor doi nicoli sunt paralele
`ntre ele, lumina polarizat\ care iese din polarizor
trece prin analizor [i iese aproape `n totalitate,
producând o raz\ emergent\ de intensitate maxim\.
C â mpul polarimetrului are luminozitate
maxim \ (cazul A din figura 11).
2° Dac\ axele optice ale nicolilor sunt perpendiculare
`ntre ele, lumina polarizat\ care iese din polarizor se
3

Pentru lucrarea practic\
practic\ ve]i
avea nevoie de urm\
urm\toarele
materiale:
• polarimetru prev\zut cu lamp\
de sodiu;
• tub polarimetric (cuv\) `n care
se introduc solu]iile de m\surat;
• produs de cercetat: un lichid cu
propriet\]ile urinii patologice
(con]ine glucoz\);
• solu]ie etalon: solu]ie de
glucoz\ cu concentra]ia 5g %;
• ap\ distilat\;
• hârtie de filtru;
• pipete de 10 ml.
Condi]ii de lucru cerute de
metod
metod\
tod\:
- solu]ia etalon s\ con]in\ aceea[i
substan]\ optic activ\ ca [i
produsul de cercetat;
- produsul de cercetat s\ con]in\ o
singur\ substan]\ optic activ\;
- temperatura trebuie s\ fie
constant\ pe timpul m\sur\to-
rilor;
- utilizarea aceluia[i tub optic
atât pentru solu]ia de cercetat,
cât [i pentru solu]ia etalon pentru
a se asigura aceea[i lungime a
stratului de solu]ie;
- sp\larea cu ap\ distilat\ a
interiorului tubului optic `ntre
determin\rile efectuate cu pro-
dusul de cercetat [i, respectiv,
solu]ia etalon.
LUCRARE PRACTIC|
stinge `n analizor. ~n acest caz raza care p\trunde `n
analizor produce numai o raz\ ordinar\, deoarece are
numai oscila]ii perpendiculare pe planul sec]iunii
principale a analizorului [i, dup\ cum [tim, raza
ordinar\ format\ `n nicol sufer\ o reflexie total\ [i
este absorbit\ `n nicol. Câmpul polarimetrului va
fi `ntunecat (cazul C din figura 11).
3° Dac\ axele optice ale nicolilor fac `ntre ele un
unghi diferit de 0° sau de 90°, raza care iese din
analizor are o intensitate mai redus\ (cazul B din
figura 11).
S\ presupunem acum c\ `ntre cei doi nicoli,
a[eza]i ca la punctul 2°, se introduce o prob\ optic
activ\, lichid\ sau `n solu]ie, plasat\ `ntr-o cuv\
cilindric\ cu dou\ ferestre plan-paralele. Prezen]a
substan]ei optic active va determina rotirea cu un
anumit unghi al planului de polarizare al luminii astfel
`ncât acesta, deviat de la direc]ia ini]ial\, nu se va mai
stinge `n analizor [i câmpul polarimetrului se va
ilumina. Pentru refacerea situa]iei existente la
extinc]ie (axele optice ale celor doi nicoli fac un unghi
de 90°), nicolul analizor se rote[te `n jurul axei sale cu
un unghi α, pentru a compensa deplasarea determinat\
de substan]a optic activ\. ~n concluzie, unghiul α
reprezint\ de fapt unghiul cu care substan]a optic
activ\ a rotit planul luminii polarizate.
Timpii de lucru
P
Trebuiesc parcurse urm\toarele dou\ etape de
lucru:
1. verificarea exactit \ ]ii polarimetrului [i,
2. deter minarea propriu-
propriu - zis \ a unghiurilor de
rota]ie a luminii plan polarizate (pentru
solu]ia de cercetat [i, respectiv, solu]ia
etalon).
1° Verificarea exactit \ ]ii polarimetrului se
face prin urm \ toarele opera]iuni succesive:
succesive
⇒ se conecteaz\ polarimetrul la re]eaua de 220 V [i se
ac]ioneaz\ comutatorul 9 (vezi figura 9). Lampa de
sodiu necesit\ o perioad\ de 5 - 10 min. pentru
`nc\lzire;
⇒ se umple cu ap\ distilat\ tubul optic al
polarimetrului; (Datorit\ construc]iei speciale a
acestuia bulele de aer nu vor influen]a propagarea
razelor de lumin\.)
4

Fig. 12
M\surarea unghiului de rotire a
planului luminii polarizate
Exprimarea concentra]iei
substan]ei optic active din pro-
dusul cercetat va fi identic\ cu
exprimarea concentra]iei solu]iei
etalon.
LUCRARE PRACTIC|
⇒ se rote[te ocularul polarimetrului (1 din figura 9)
pân\ ce imaginea este clar\. ~n acest moment, `n
câmpul ocularului ve]i observa una din imaginile
posibile redate `n fig. 11;
⇒ pentru a stabili condi]ia ini]ial\ de extinc]ie a
nicolilor, se rote[te tamburul situat `n partea
inferioar\ a ocularului polarimetrului, modifi-
cându-se astfel pozi]ia axei optice a analizorului,
pân\ ce câmpul ocularului va fi uniform iluminat [i
cât mai `ntunecat (cazul C din fig. 11);
⇒ se cite[te unghiul de rota]ie al analizorului folosind
sistemul vernier alc\tuit dintr-o riglet\ (fix\) cu
diviziuni de la 1 la 10 [i rigla (mobil\) cu valori ale
unghiului cuprinse `ntre 0 - 180°. Acest unghi
trebuie s \ fie zero,
zero diviziunea 0 de pe riglet\
este perfect `n prelungirea diviziunii 0 de pe rigl\
(juxtapunere), deoarece substan]a introdus\ (apa
distilat\) este optic inactiv\.
2° Pentru determinarea propriu- propriu - zis \ a
unghiului de rotire a planului luminii
polarizate `n cazul solu]iei de cercetat [i a
solu]iei
so lu]iei etalon se procedeaz \ ca la punctul
precedent,
precedent introducându-se `n tubul polarimetric, pe
rând, solu]ia etalon [i cea de cercetat.
Citirea unghiului de rotire al analizorului (egal
cu unghiul de rotire al planului de oscila]ie al luminii
polarizate determinat de produsul optic activ) se face
astfel:
♦ privind prin lupa care se afl\ `n dreapta sau stânga
ocularului se noteaz\ num\rul de diviziuni de pe
rigl\ cuprins `ntre diviziunea 0 a riglei [i diviziunea
0 de pe riglet\ (s\ `l not\m cu N);
♦ dac\ diviziunea 0 a rigletei nu este perfect `n
prelungirea unei diviziuni de pe rigl\, not\m acea
diviziune de pe riglet\ care este perfect `n
prelungirea unei diviziuni de pe rigl\ (s\ o not\m
cu n). ~n acest caz valoarea m\surat\ a unghiului va
fi: α = N,n (în exemplul ilustrat în figura 12
unghiul este 9,30°).
Prezentarea datelor experimentale:
experimentale
Datele experimentale ob]inute individual de
fiecare dintre membrii subgrupei de lucru se trec `n
caietele de referate `ntr-un tabel asem\n\tor celui de
mai jos:
Nr. αe αx ce cx
crt.
1.
2.
3. 5
4.
 LUCRARE PRACTIC|

B2. M\surarea concentra]iei unei

☺ substan]e optic active `n solu]ie
prin metoda interpol\rii

Valoarea concentra]iei necunoscute a substan]ei

optic active ob]inut\ prin calcul la punctul precedent
Materiale
Materiale necesare: poate fi aflat\ [i prin utilizarea metodei
interpol\
interpol \ rii.
rii ~n esen]\, metoda const\ `n m\surarea
• polarimetru;
unghiurilor de rotire a planului luminii polarizate
• solu]ia stoc cu concentra]ia pentru un set de solu]ii ob]inute dintr-o solu]ie stoc, de
5%; concentra]ie cunoscut\, urmat\ de reprezentarea
• ap\ distilat\; grafic\ a valorilor unghiului de rotire `n func]ie de
• 5 pahare Berzelius; concentra]ie. Din acest grafic, prin interpolare, se
• pipet\; poate afla concentra]ia solu]iei de cercetat a c\rui
unghi de rotire αx a fost m\surat la punctul precedent.
• hârtie de filtru.

Timpii de lucru:
Comport\ dou\ etape:
P
1. prepararea setului de solu]ii diluate din
solu]ia stoc :
~n acest scop ve]i avea la dispozi]ie o solu]ie stoc cu
Nr Concentra]ia Valoarea
.cr % unghiului concentra]ia de glucoz\ de 5%, din care va trebui s\
t. prepara]i succesiv câte 30 ml de solu]ie 1%, 2%,
1. 1 2,5%, 3%, 4% `n paharele Berzelius
2. 2 corespunz\toare. (Aten]ie la calcule [i la modul `n
3. 2,5 care m\sura]i volumele de lichid!)
4. 3 2. m \ surarea unghiului de rotire a planului
5. 4
6. 5 luminii polarizate pentru fiecare solu]ie:
Pentru m\surarea unghiurilor ve]i urma tehnica
de lucru deja descris\, ob]inând valorile unghiurilor
pentru solu]iile cu concentra]ia 1%, 2%, 2,5%, 3%,
4%, 5%.

Unghiul Prezentarea datelor

de rotire experimentale
Valorile unghiurilor `n func]ie de concentra]ie
vor fi trecute `n caietele voastre de referate `ntr-un
tabel asem\n\tor celui al\turat.
Cu datele din tabel se va alc\tui un grafic (pe
hârtie milimetric\ sau la calculator!) reprezentând
Concentra]ie valorile unghiului de rota]ie a luminii polarizate `n
func]ie de concentra]ie. Prin interpolare, din graficul
de dilu]ie se va afla valoarea concentra]iei `n glucoz\
pentru unghiul αx m\surat la punctul precedent. Ve]i
compara valoarea cu cea ob]inut\ prin calcul.

6
 LUCRARE PRACTIC|

C. Microscopie polarizant\:
punerea `n eviden]\ a structurilor biologice
birefringente

☺ PARTEA PRACTIC|

c
ocular Microscopul polarizant

tubul Eviden]ierea structurilor birefringente [i/sau

microscopului dicroice se poate face utilizând microscopul
nicol analizor `n plus doi nicoli sau dou\ filtre polaroid (sub forma
lam\ sfert
de und\
obiectiv
platin\
condensor
nicol
polarizor
oglind\ surs\ de
lumin\
Fig. 14
Schema microscopului
polarizant
Lama sfert de und\ este o
lam\ sub]ire din cuar] plasat\ `ntre
polarizor [i analizor, astfel `nc`t ea
este str\b\tut\ doar de o jum\tate a
fasciculului luminos. Rolul lamei
sfert de und\ este acela de a p\stra
constant\ intensitatea luminii
transmise de analizor atunci c`nd
acesta este rotit.
O lam\ sfert de und\ pentru
lumina galben\ nu este lam\ sfert de
und\ pentru nici o alt\ culoare,
deoarece indicii de refrac]ie depind de
lungimea de und\.
polarizant prezentat `n fig. 13. A[a cum se remarc\ `n
figura 14, microscopul polarizant prezint\ toate p\r]ile
componente ale microscopului optic obi[nuit, având
unor discuri). Filtrele polaroid reprezint\ de fapt
cristale dicroice. Cei doi nicoli func]ioneaz\ unul ca
polarizor, iar cel\lalt ca analizor. Polarizorul este
situat sub lentila condensor, iar analizorul deasupra
obiectivului. Uneori, imediat sub nicolul analizor se
interpune o lam\ sfert sau jum\tate de und\.
Timpii de lucru:
P
Utilizarea microscopului polarizant se bazeaz\
pe faptul c\ la dispunerea `ncruci[at\ a nicolilor, `n
câmpul `ntunecat al ocularului va apare numai
imaginea strucrurilor birefringente ([i optic active) ale
preparatului examinat. Acest lucru este posibil ca
urmare a propriet\]ii structurilor birefringente de a
furniza lumin\ polarizat\ `n plane care nu corespund
cu planul sec]iunii principale a analizorului.
Birefringen]a granulelor de amidon din cartof, `n
sec]iune proasp\t\, poate fi pus\ `n eviden]\ prin
parcurgerea urm\toarelor etape referitoare la
preg\tirea microscopului polarizant, precum [i pentru
ob]inerea preparatului propriu-zis:
• se asigur\ o iluminare puternic\ [i uniform\ a
câmpului microscopului prin apropierea maxim\ a
tubului microscopului de condensor, urmat\ de o
reglare corespunz\toare a pozi]iei oglinzii `n raport
cu sursa de lumin\;
7
 LUCRARE PRACTIC|

• se rote[te nicolul analizor pân\ când se ob]ine

Materiale necesare:
necesare
• microscop polarizant prev\zut
cu o surs\ de lumin\ puternic\;
• lame de sticl\ pentru preparate • se observ\ c\ fiecare granul\ de amidon (când
microscopice;
• lam\ de ras sau bisturiu;
• produs de cercetat: amidon de • dispunerea benzilor este excentric\ la amidonul de
cartof.
`ntunecarea maxim\ a câmpului, pozi]ie ce
corespunde perpendicularita]ii axelor optice ale
celor doi nicoli;
• se aplic\ pe o lam\ curat\ de sticl\ materialul
rezultat prin r\zuirea suprafe]ei proaspete ob]inut\
prin sec]ionarea unui cartof, se umeze[te preparatul
cu pu]in\ ap\ [i se examineaz\ lama la microscop
`nainte de a se usca;
• se regleaz\ distan]a dintre obiectiv [i preparat
utilizându-se `ntâi viza macrometric\ [i apoi cea
micrometric\ pentru a se ob]ine o imagine clar\;
amidonul nu este alterat!) este br\zdat\ de dou\
benzi `ntunecate dispuse aproximativ `n cruce
(crucea “Cavalerilor de Malta”);
cartof [i central\ la cel de grâu;
• desena]i `n caietele de referate câteva granule de
amidon din cartof a[a cum se v\d ele `n câmpul
microscopului polarizant.

D. Ultramicroscopul sau microscopul cu fond

`ntunecat - observarea particulelor
coloidale prin efect Tyndall

Dac\ dorim s\ observ\m structuri cu

dimensiuni mai mici decât cele ce pot fi v\zute cu
microscopul optic, din punctul de vedere al
aprecierii formei, pozi]iei [i mi[c \ rii unor
particule - cum ar fi cele coloidale - se poate utiliza
ultramicroscopia. Aceast\ metod\ are la baz\
fenomenul Tyndall,
Tyndall fenomen ce va fi explicat pe
larg la curs.

☺ PARTEA PRACTIC|

Ultramicroscopul este asem\n\tor cons-

tructiv microscopului optic obi[nuit, cu deosebirea c\
se `nlocuie[te condensorul cu unul ultramicroscopic -
paraboloid Condensorul cardioid
cardioid sau paraboloid.
(prezentat ca principiu `n fig. 15) las\ s\ treac\ numai
razele de lumin\ marginale, formându-se astfel un con
de umbr\ mai mare decât apertura obiectivului [i deci
lumina de la surs\ nu poate intra direct `n obiectiv.
A[a cum se poate observa din figur\, razele marginale

Fig. 15
15
 LUCRARE PRACTIC|
se `ncruci[eaz\ `n preparat iluminându-l aproape
tangen]ial, ceea ce face posibil\ apari]ia fenome -
nului Tyndall.
Tyndall
Metoda este folosit\ `n medicin\ `ndeosebi
pentru punerea `n eviden]\ a unor spirochete ca
Leptospira, care produce boala numit\ lepto spiroz
spi roz \
[i Treponema pallidum, care produce sifilis ul.
ul

Fig. 16
Imagine a granulelor de
amidon la microscopul
polarizant
Atât condensorul cardioid
cât [i cel paraboloid sunt conden-
soare cu imersie!
Materiale necesare:
• microscop optic obi[nuit;
• surs\ puternic\ de lumin\;
• condensor cardioid;
• produsul de analizat: argint
coloidal (colargol).
Timpii de lucru: P
~n vederea observ\rii substan]elor coloidale cu
ajutorul ultramicroscopului se vor parcurge
urm\toarele etape:
• se scoate condensorul obi[nuit de la microscop [i `n
locul lui se monteaz\ condensorul cardioid, care
apoi se ridic\ pân\ la nivelul platinei (aceast\
opera]iune va fi efectuat\ `n prezen]a laborantului);
• se conecteaz\ la re]ea sursa de lumin\, dup\ care se
pune o pic\tur\ de ulei de cedru pe suprafa]a
condensorului, peste care se a[eaz\ lama cu
preparatul de cercetat;
• preparatul se ob]ine astfel:
- pe o lam\ de sticl\ se pune o pic\tur\ din
solu]ia coloidal\ de analizat;
- peste solu]ia coloidal\ se a[eaz\ o lamel\ din
sticl\ foarte sub]ire (0,8 - 1 mm).
Dup\ ce s-a a[ezat preparatul pe platina
microscopului se centreaz\ lumina. Se folose[te `n
acest scop un obiectiv uscat (X 20), reglându-se apoi
distan]a dintre preparat [i obiectiv pân\ când se ob]ine
o imagine clar\. Apoi, se pune o pic\tur\ de ulei de
cedru pe preparat [i se aduce `n axa optic\ obiectivul
cu imersie. Câmpul microscopic va fi `ntunecat, iar
particulele coloidale vor fi str\lucitoare. Dac\ lumina
nu este centrat\, atunci câmpul nu va fi complet
`ntunecat, fapt ce necesit\ rotirea oglinzii
condensatorului prin intermediul unei pârghii situate
la partea inferioar\ a acestuia, pân\ când câmpul se va
`ntuneca.

DUP| EFECTUAREA LUCR|RII PRACTICE TREBUIE S| FI}I

CAPABILI S|:

• indica]i modalit\]ile de ob]inere a luminii polarizate;

• explica]i fenomenul de birefringen]\ [i dicroism;
• da]i exemple de aplica]ii practice ale fenomenului de polarizare [i birefringen]\ `n
medicin\;
• realiza]i o curb\ de dilu]ii [i s\ folosi]i metoda interpol\rii;
• descrie]i succint tehnicile de polarimetrie, microscopie polarizant\ [i ultramicroscopie. 9
LUCRARE PRACTIC|

10