REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

CV
El método se basa en la aplicación de tres procesos en forma cíclica .
1.  Desnaturalización del DNA .
2.  Hibridación de la hebra sencilla del DNA con un oligonucleótido (“Templado” ó “Annealing”).
3.  Replicación de la hebra sencilla del DNA por una DNA polimerasa (“Extension” ó “Elongación”)
Necesario:
5’ 3’ DNA
3’ 5’ -Muestra de DNA a amplificar
1) Desnaturalización. -Oligonucleótidos (=cebadores/DNA))
Calentamiento>Tm,68-97°C,30-120s. de cadena sencilla (18-30 N)
complementarios a extremos 3’
5’ 3’
-dNTPs en exceso, Mg2+.
-DNA pol. Termoestable.
3’ 5’
2) Hibridación con los primers. Fragmento Klenow E. Coli
(Termolabil).
Enfriar. <Tm, 37-65 °C, 30-120s)
Thermus Aquaticus (Taq pol).
5’ 3’ (Termoresistente. No corrige)
“reverse”
“forward”
3’ 5’

3) Extensión con la DNA pol.

40-75 °C, 1-3min Volumen reacción: 20-100 µl.
5’ 3’ Repetir cíclicamente: nº Ciclos: 25-40
Óptimo tamaño del gen a amplificar: 102-
3’ 5’
2x103 N. Posible: 20-40 Kb.
 Esquema de Reacciones y Resultados de los CV

primeros ciclos de una PCR

  Rendimiento Exponencial
  Gran especificidad (dependiente de los oligos usados)
  Alta sensibilidad
  Fidelidad, dependiente del enzima usado

•  La PCR permite la AMPLIFICACIÓN DE UN DNA, presente en una mezcla no pura

(tejido, mezcla de DNAs, sangre, colonia bacteriana etc). Se necesita conocer parte
de la secuencia del DNA a amplificar.

•  Es un método sencillo, sensible y rápido (alrededor de 2 horas) para obtener

múltiples copias de un fragmento de DNA. (40 ciclos : 1012 copias)
 Enriquecimiento en fragmentos diana a medida que tienen lugar los ciclos sucesivos:
CV

2 longer length molecules 4 longer length molecules

2 target molecules
6 longer length molecules 8 target molecules
8 longer length molecules

End Cycle 30
Ver animación
correspondiente
en Campus
22 target molecules Virtual
10 longer length molecules
 CV

Termociclador
para PCR

Longitud secuencia diana, redundancia, contenido GC/AT

Características de la Polimerasa (Taq, Pfu,…)
[Mg++]
[Oligos]
Parámetros que
[dNTPs, NTPs]
determinan el éxito
Tiempo & Temperatura de Desnaturalización
de una PCR
Tiempo & Temperatura de Hibridación o Templado
Tiempo & Temperatura de Extensión
Presencia de aditivos (impurezas…)
Número de ciclos
 CV
Análisis de los resultados
Electroforesis Horizontal en Geles de Agarosa

M Bl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Bl
 Test genéticos CV

Anemia Falciforme
Enfermos = los dos alelos del gen que codifica
para la β-globina de la Hemoglobina presentan
una mutación (Valina en la posición 6 de la
cadena beta de la proteína, en lugar del Ácido
Glutámico)

cadena normal

gen normal
codon

gen mutado
cadena mutada

Sustitución de una sola base

SNP= Single Nucleotide Polymorphism
RFLP/PCR
Enzima de Restricción: Mst II CCTNAGG Restriction fragment length polymorphism
 “RT-PCR” CV

(RT=Reverse Transcriptase o Transcriptasa inversa )

PCR que se usa

para amplificar
RNA mediante la
la síntesis previa
de su cDNA
 Al finalizar una PCR se hace una Ejemplo CV
electroforesis en gel de agarosa M Bl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
para confirmar la correcta
amplificación de la(s) banda(s).

La Detección “a término” en la PCR clásica plantea

algunos inconvenientes:
•  No automatizada
•  Requiere procesamiento tras la PCR (electroforesis en geles de
agarosa, o también un Southern o un dot/slot-blot)
•  Discriminación basada en tamaño exclusivamente
•  Los resultados no se expresan en número
•  La tinción con Bromuro de Etidio (o la hibridación con una sonda en
un Southern o en un dot/slot-blot) no es muy cuantitativa
•  Baja precisión. Baja sensibilidad. Baja resolución. (Mejor en
Southern)
• PCR en tiempo real = “Real Time -PCR” o PCR cuantitativa (Q-
PCR).
CV
Detecta acumulación del producto durante la Reacción:
•  La Reacción de PCR se monitoriza en tiempo real mediante fluorescencia
→ señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto de PCR.
No se necesita procesar las muestras después de la PCR para su análisis
(electroforesis…)

Fases de una
PCR High variability

High
precision
Detección de la
Detección de la
PCR clásica
PCR en Tiempo
Real

Software de apoyo para el diseño de los oligos, sondas etc.

Instrumentación: Termociclador + Fluorimetro

La señal de fluorescencia viene dada por:

-colorantes especificos de dsDNA (SYBR Green..)-”intercalantes”
-sondas especificas de secuencia (Taqman, etc…)-Basadas en la
Transferencia de Energía por Resonancia (FRET).
 Donador= CV
Receptor=

Fig.1.Sondas de hidrólisis= Sondas TaqMan

Fig.2.Sondas molécular Fig.3.Sondas FRET

beacons
 CV

• PCR en tiempo real = “Real Time -PCR” . PCR cuantitativa.

El resultado es DIRECTO:se expresa en forma de curvas de amplificación a lo largo

del tiempo: mucho más precisa y controlable que una PCR normal (en la que solo
conoces el resultado final).
La cuantificación es RELATIVA, frente a un standard o un gen de referencia
(housekeeping gene = curya expresión se considera estable)

Muestras= Réplicas Muestras= Diluciones (1:5)

Rn

Ct

Cycle # Cycle #
 Siempre se toman valores en zonas de las curvas de ciclización en donde existe una
relación lineal entre log del nº de copias de DNA y nº de ciclos. Así se asegura que se
está en fase exponencial y por tanto de alta precisión.
CV

• También puede hacerse una transcripción inversa, tendríamos una

RT-qPCR ó qRT-PCR