Tinción H & E de equivalentes cutáneos

La morfología del tejido del equivalente de piel 3D en un chip se examinó mediante tinción con H y
E (Fig. 7). Se compararon tres fuentes diferentes de colágenos (cola de rata, piel porcina, patas de
pato). El tejido cutáneo nativo consta de tres capas principales; epidermis, dermis y la hipodermis
[19]. La epidermis es la capa más externa, compuesta principalmente de queratinocitos, células de
Markel, melanocitos y células de Langerhans. Cuando se diferencian adecuadamente, los
queratinocitos en la epidermis forman capas estratificadas que imitan la piel nativa. La dermis es la
capa debajo de la epidermis, compuesta principalmente de fibroblastos, macrófagos y adipocitos.
La mayoría de los equivalentes cutáneos in vitro contienen las capas de epidermis y dermis [20]. La
capa de la dermis está hecha de una matriz de colágeno sembrada de fibroblastos, y la capa de
epidermis se forma mediante la siembra de queratinocitos en la parte superior de la capa de la
dermis [19,20]. En nuestro estudio, la formación adecuada de la epidermis y la capa de la dermis
fue examinada por H & E tinción. En el caso del cultivo transwell, se observó formación de capa de
epidermis en los tres tipos de colágenos (Fig. 7 (a) - (c)). La cola de rata y el colágeno de la piel
porcina mostraron una formación de epidermis ligeramente mejor que el colágeno de los pies de
pato. En el caso del equivalente en piel 3D en una condición de chip, la capa de epidermis era más
delgada que la observada en la condición de transwell (Fig. 7 (d) - (f)). Sin embargo, en general, se
observó formación de epidermis para los tres tipos de colágenos en condición de chip. Por lo
tanto, podríamos verificar que la condición de cultivo de chip también admite la formación y
diferenciación de la capa de epidermis, así como la condición de cultivo transwell.

Se observaron algunas diferencias entre los constructos de la piel realizados en la condición del
chip y la condición del transwell. En general, la capa epidérmica era más gruesa en la construcción
de la piel fabricada en la condición de transwell que en la condición de la astilla. Dado que el
mayor número de capas en la epidermis denota un mayor grado de diferenciación, especulamos
que la condición para la diferenciación no se optimizó completamente en la condición del chip. La
optimización adicional de la condición de diferenciación, por ejemplo, la cantidad y la velocidad de
flujo de perfusión de los medios de cultivo celular, el número de células y los días de exposición al
aire, podrían mejorar la construcción de la piel en la condición del chip.

Inmunohistoquímica del equivalente en piel 3D

La expresión de las proteínas marcadoras clave en el tejido de la piel se examinó mediante

inmunohistoquímica (figura 8). Para evaluar la diferenciación de la capa de epidermis, se examinó
la expresión de queratina 10 [21]. Para evaluar la diferenciación de la capa de la dermis, se
examinó la expresión de fibronectina y colágeno IV [22]. En el caso de colágeno de piel porcina en
una condición de chip (Fig. 8 (a) - (d)), y la condición de transwell (Fig. 8 (e) - (h)), se observó la
expresión de proteínas marcadoras clave tanto en chip como en condiciones de cultivo transwell.
Sin embargo, la expresión fue más fuerte en el caso de la condición de cultivo transwell que la
condición de chip. En el caso del colágeno de la cola de rata, la expresión de proteínas marcadoras
fue más fuerte que el caso del colágeno de la piel porcina, tanto en cultivo de chips (figura 8 (i) -
(l)) como en condiciones de cultivo transwell (figura 8 (m)) (pag)). Curiosamente, en el caso de
colágeno de cola de rata en una condición de cultivo de chip, la exposición al aire de solo tres días
fue suficiente para observar una cantidad significativa de expresión de proteínas marcadoras
clave, en comparación con los cinco días de exposición al aire en otras condiciones. Las imágenes
teñidas con H & E también muestran una formación mucho más clara de las capas de epidermis y
dermis en el colágeno de la cola de rata, con una clara visualización de la membrana basal (BM),
especialmente en el estado de chip. Por lo tanto, podemos concluir que el mejor apoya la
diferenciación de la epidermis y la dermis en la condición de cultivo de chips. También
examinamos la cantidad de colágeno total usando el tricrómico (MT) de Masson y la tinción de
Sirius. MT tiñe el colágeno en color azul, mientras que Sirius tiñe el colágeno en color rojo [23,24].
La Fig. 9 muestra que hay una cantidad significativa de colágeno en la capa de la dermis, para
todos los tipos de colágeno ensayado (cola de rata y piel de cerdo), en todas las condiciones de
cultivo (astillas y transwell). Este resultado verifica que el colágeno se mantuvo bien durante el
cultivo celular y la diferenciación de la piel en todos los casos. Entre las dos fuentes de colágeno
evaluadas (cola de rata y piel porcina), el colágeno de la cola de rata mostró una tinción de
colágeno más fuerte que el caso de la piel porcina. Este resultado es consistente con el resultado
de la inmunohistoquímica, donde el colágeno de la cola de la rata apoyó una mejor diferenciación
de las capas de la epidermis y la dermis. En el caso de colágeno de piel porcina, la condición de
cultivo transwell mostró una tinción más fuerte de colágeno que la condición de cultivo de chip. En
el caso del colágeno de la cola de rata, tanto las condiciones de cultivo en microesferas como
transwell mostraron una fuerte tinción de colágeno, aunque el colágeno se tiñó ligeramente más
fuerte en la condición de cultivo transwell.

Conclusión

En este estudio, comparamos tres fuentes diferentes de colágeno, cola de rata, piel porcina y
colágeno de pies de pato, para usar como material de andamio para un modelo equivalente a la
piel. Se compararon una condición de cultivo transwell convencional y una condición de cultivo de
chip en combinación de diferentes fuentes de colágeno. El grado de contracción fue diferente
dependiendo de las fuentes de colágeno, probablemente debido a una diferencia en la propiedad
mecánica de diferentes fuentes de colágeno. Entre las tres fuentes de colágeno, el colágeno de la
cola de rata mostró el mejor resultado en términos de expresión de proteínas marcadoras y
formación de capas de dermis y epidermis. En general, la condición de cultivo transwell apoyó el
crecimiento y la diferenciación del equivalente de la piel mejor que la condición del chip, lo que
sugiere que la condición de cultivo del chip debe optimizarse aún más. Nuestro estudio
proporciona información sobre el efecto de las fuentes de colágeno de la diferencia, y también
demuestra que el chip de la piel puede soportar la formación del tejido cutáneo in vitro,
comparable al de una condición de cultivo transwell.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por la subvención National Q4 Research Foundation of Korea (NRF)
financiada por el gobierno de Corea (MSIP) (NRF-2015R1A4A1041631 y 2016R1D1A1B03934710),
República de Corea y el Fondo de Investigación de la Universidad Hongik.