Sunteți pe pagina 1din 40

2 MEMBRANA CELULARĂ

Membrana celulară (membrana plasmatică sau plasmalema) este


structura esenţială care delimitează celula, conferindu-i individualitate.
Membrana plasmatică funcţionează ca o barieră selectivă pentru transportul
substanţelor între cele două compartimente, intern şi extern. Este implicată
şi în procesele de adezivitate şi semnalizare celulară, în integrarea celulelor
în ţesuturi, etc.
La nivelul membranei plasmatice se găsesc canale şi pompe, care
reglează transportul macromoleculelor şi ionilor, constituind baza
permeabilităţii selective.
Tot la nivelul membranei plasmatice se găsesc receptorii care
recunosc moleculele semnalizatoare şi declanşează mecanismele de răspuns
celular. Elementele prezente în compoziţia membranei au rol în menţinerea
formei acesteia sau, din contră, o fac flexibilă.
De asemenea, organitele celulare sunt delimitate de membrane,
fiecare având roluri specifice:
- membrana lizozomală – separă mediul cu pH scăzut din
interiorul lizozomilor de restul citoplasmei, protejând
componentele celulare de digestia enzimatică;
- membrana mitocondrială – este dublă, una internă şi alta
externă; membrana internă este pliată sub forma unor criste, fiind
sediul sintezei de ATP;
- membrana reticulului endoplasmic rugos – delimitează o
întreagă reţea tubulară intracitoplasmatică;
- membrana nucleară – este dublă, internă şi externă şi este
străbătută de numeroşi pori, care permit schimburile dintre
nucleu şi citoplasmă (Fig. 2.1)

14
Fig. 2.1 – Tipuri de membrane celulare

2.1 Structura membranei plasmatice

Toate membranele biologice conţin proteine şi lipide, dar procentul


lor este variabil, în funcţie de tipurile de membrane, ceea ce explică
diferenţele dintre proprietăţile specifice ale acestora. De exemplu, mielina,
care delimitează fibrele nervoase, conţine numai 24% proteine şi 76%
lipide; membrana internă mitocondrială conţine 76% proteine şi numai 24%
lipide; membranele plasmatice ale eritrocitelor umane şi ale celulelor
hepatice din ficatul de şobolan conţin cantităţi aproape egale de proteine
(44,49%) şi lipide (43,52%).
În 1925, Gorter şi Grendel, bazându-se pe cantitatea şi polaritatea
fosfolipidelor membranare, au sugerat pentru prima dată existenţa unui
bistrat fosfolipidic, cu zone polare (hidrofile) şi nepolare (hidrofobe). În
1940, Danielli şi Davson au arătat că în structura membranei intră şi
proteine globulare, deoarece existau anumite proprietăţi care nu puteau fi
atribuite unei membrane exclusiv fosfolipidice. De asemenea, ei au propus
modelul sandwich, conform căruia bistratul fosfolipidic ar fi îmbrăcat pe
ambele feţe de un strat proteic, cu canale care permit deplasarea moleculelor
polare prin membrană.
15
În anii ’50, odată cu apariţia microscopului electronic şi dezvoltarea
tehnicilor de observare a membranei, Robertson a sugerat că stratul
întunecat extern conţine proteine şi extremităţile hidrofile ale fosfolipidelor,
în timp ce stratul intern luminos este reprezentat de regiunile fosfolipidice
hidrofobe. Robertson a propus modelul unităţii membranare, potrivit căruia
toate membranele celulare ar fi avut o structură similară. Însă nu toate
membranele apăreau la fel la microscopul electronic, după cum nu toate
membranele au aceleaşi funcţii.
În 1972, Singer şi Nicholson au sugerat pentru structura membranei
modelul mozaicului fluid (Fig. 2.2). Conform acestui model structural:
- membranele sunt alcătuite din lipide şi proteine;
- atunci când sunt plasate într-un mediu apos, din cauza polarităţii,
fosfolipidele se dispun sub formă de bistrat;
- cele două planuri ale bistratului pot avea compoziţii diferite în
ceea ce priveşte conţinutul de fosfolipide şi colesterol;
- fosfolipidele pot efectua mişcări în plan orizontal, conferind
fluiditate membranei;
- proteinele sunt inclavate parţial sau total în bistrat; anumite
proteine se pot deplasa lent prin membrană, în timp ce altele sunt
ancorate la citoschelet; poziţiile neregulate ocupate de proteine
în bistrat conferă modelul de mozaic;
- membrana celulară este asimetrică, deoarece resturile
oligozaharidice ale glicoproteinelor sau glicolipidelor se
proiectează la exteriorul celulei;
- membrana are o permeabilitate selectivă, controlând traficul
molecular;
- grosimea membranei este de aproximativ 8 – 9 nm, din care
fosfolipidele ocupă 3 nm.

Fig. 2.2 – Modelul de mozaic fluid al membranei


16
2.1.1. Lipidele membranare

În structura membranei plasmatice intră o varietate de lipide, care


formează suportul pentru inserarea proteinelor. Lipidele membranare sunt
reprezentate de fosfolipide (fosfogliceride şi sfingolipide), glicolipide
(gangliozide şi glicolipide neutre – galactocerebrozida) şi colesterol.
Lipidele membranare sunt molecule amfipatice, prezentând un capăt
polar, hidrofil şi un capăt nepolar, hidrofob. Datorită caracterului lor
amfipatic, în structura membranei lipidele sunt dispuse sub formă de bistrat
(Fig. 2.3).

Fig. 2.3 – Bistratul lipidic

În ciuda compoziţiei variabile a membranelor biologice, bistratul


fosfolipidic reprezintă unitatea structurală de bază. Bistratul este compus din
două straturi de molecule fosfolipidice, ale căror extremităţi polare sunt
orientate către mediul apos înconjurător, în timp ce lanţurile de acizi graşi
constituie interiorul hidrofob, continuu, având circa 3nm grosime. Forţa care
direcţionează formarea bistratului este interacţiunea hidrofobă dintre
lanţurile de acizi graşi ale fosfolipidelor şi glicolipidelor. Interacţiunile de
tip Van der Waals dintre lanţurile hidrocarbonate favorizează împachetarea
strânsă a acestor “cozi” hidrofobe. La stabilizarea bistratului contribuie şi
legăturile de hidrogen şi interacţiunile electrostatice dintre grupările polare
şi moleculele de apă.

Fosfolipidele sunt unele din principalele tipuri de lipide din structura


membranei. Fosfolipidele se împart în fosfogliceride şi sfingolipide.
Fosfogliceridele conţin o moleculă de glicerol, la care două grupări
hidroxil sunt esterificate cu acizi graşi de lungime variabilă. Aceştia
17
alcătuiesc extremitatea hidrofobă a moleculei. Acizii graşi nesaturaţi conţin
una sau mai multe legături duble, cu configuraţie cis, ceea ce conferă o
oarecare rigiditate lanţului flexibil. Al treilea hidroxil al glicerolului este
legat, prin intermediul unui radical fosfat, la o grupare polară, hidrofilă, care
poate fi reprezentată de colină, serină, inozitol, etanolamină, de unde
denumirea de fosfatidil-colină, fosfatidil-serină, fosfatidil-inozitol,
fosfatidil-etanolamină (Fig. 2.4).

Fig. 2.4 – Structura fosfogliceridelor

Sfingomielina, principalul reprezentant al sfingolipidelor, conţine în


locul glicerolului sfingozina, un amino-alcool cu un lanţ lung hidrocarbonat,
nesaturat. La grupul amino al sfingozinei se leagă, printr-o legătură amidică,
un acid gras. Gruparea hidroxil terminală a sfingozinei este esterificată cu
fosfocolină, astfel încât extremitatea hidrofilă a sfingomielinei este similară
cu aceea a fosfatidil-colinei (Fig. 2.5).

18
Fig. 2.5 – Structura sfingomielinei

Glicolipidele sunt prezente în structura tuturor membranelor


celulare. Glicolipidele au grupările zaharidice orientate pe faţa externă a
membranei plasmatice şi spre lumenul organitelor celulare (Fig. 2.6).

Fig. 2.6 – Structura membranei plasmatice

19
Cele mai bine reprezentate glicolipide sunt glicosfingolipidele
(GSL). Cu toate că densitatea GSL în membrana plasmatică este foarte
mare, circa două treimi din totalul GSL sunt localizate în membranele
intracelulare: aparatul Golgi, endozomi, lizozomi, RE, mitocondrii şi în
membrana nucleară. GLS, împreună cu alte componente membranare,
circulă între aceste organite. În aparatul Golgi, GSL sunt sintetizate prin
adiţia zaharidelor, una câte una. Procesul invers, de degradare prin
îndepărtarea treptată a zaharidelor, are loc la nivelul lizozomilor. GSL
încorporate prin endocitoză sunt transportate prin endozomi şi sortate la
nivelul aparatului Golgi şi al lizozomilor. De asemenea, GSL sintetizate în
aparatul Golgi sunt transportate prin intermediul endozomilor la membrana
plasmatică. La nivelul membranei plasmatice, circa o jumătate din GSL sunt
reciclate la un interval de 30 – 40 minute, în funcţie de tipul de celulă, astfel
încât compoziţia lor rămâne constantă. Majoritatea GSL sunt transportate
între membrane sub forma unor mici vezicule, menţinând structura unui
bistrat.
În membrana plasmatică, GSL nu sunt dispuse omogen, ci se
aglomerează în anumite microdomenii (“rafts”) (Fig. 2.7). Aceste domenii
sunt bogate în sfingolipide şi colesterol. Lanţurile de acizi graşi ale lipidelor
din microdomenii sunt strâns împachetate, astfel că aceste structuri sunt
foarte ordonate.

Fig. 2.7 – Structura microdomeniilor (raft) şi a caveolelor.


(După Hideyoshi H., 1998)
20
Asocierea la aceste domenii a unor proteine care participă la
procesele de semnalizare celulară – cum
sunt kinazele familiei Src şi subunitatea
α a proteinei G heterotrimerice –
demonstrează implicarea în transducţia
semnalului, în sortarea lipidelor şi
proteinelor, precum şi în adeziunea
celulară şi motilitate. Microdomeniile
bogate în glicolipide constituie, de
asemenea, ţinte pentru anumiţi agenţi
patogeni (Vibrionul holeric, HIV) şi
toxinele asociate acestora (Fig. 2.8).

Fig. 2.8 – Semnalizarea prin intermediul


rafts. (După Yoshio H., 2002)

Tot la nivelul membranei s-au identificat nişte micro-invaginări, cu


diametrul de aproximativ 50 nm, numite caveole (Fig. 2.7). Caveolele sunt
alcătuite din GSL, colesterol, proteine G trimerice, Ras şi o proteină
membranară specifică, numită caveolină. Caveolina este singura proteină
care se poate asocia direct cu microdomeniile rafts, fără modificări lipidice.
Ca urmare a captării microdomeniilor, densitatea moleculelor receptor
creşte foarte mult în aceste zone, fiind astfel posibilă endocitoza.
Alte glicolipide sunt galactocerebrozida, componentă majoră a
mielinei, şi gangliozidele, care conţin în molecula lor atât resturi glucidice
neutre, cât şi acid sialic (NANA = N-acetil – neuraminic acid).

Colesterolul reprezintă un alt lipid esenţial din constituţia


membranei, al cărui procent poate varia cu tipul de membrană. Membranele
plasmatice conţin proporţii aproximativ egale de colesterol şi fosfolipide.
Unele membrane, de exemplu cele bacteriene,
nu conţin colesterol. Moleculele de colesterol
se inseră în membrană cu aceeaşi orientare ca şi
moleculele fosfolipidice (capătul polar al
colesterolului este aliniat cu extremitatea polară
a fosfolipidelor) (Fig. 2.9).

Fig. 2.9 – Inserţia colesterolului în


bistratul membranar

21
Gruparea hidroxil a colesterolului formează legături de hidrogen cu
grupările polare ale fosfolipidelor. Prin încorporarea colesterolului în
bistratul fosfolipidic structura membranei devine mai ordonată, cu
împachetarea mai strânsă a lipidelor. În acelaşi timp, creşte rezistenţa
mecanică şi scade permeabilitatea pentru ionii mici. În lipsa colesterolului
(ca în cazul bacteriilor), celula ar avea nevoie de un perete celular.
Colesterolul previne cristalizarea membranei. Totuşi, interacţiunea
cu moleculele de colesterol, relativ rigide, scade mobilitatea cozilor
hidrocarbonate ale fosfolipidelor. Astfel, membranele care includ colesterol
în compoziţia lor sunt fluide, ceea ce reprezintă o stare intermediară între
cea de cristal lichid şi cea cristalină. Membranele care nu conţin colesterol,
de exemplu membrana mitocondrială internă, sunt constituite în principal
din fosfolipide ai căror acizi graşi au una sau mai multe legături duble.
Prezenţa legăturilor duble în număr mare determină scăderea punctului de
tranziţie sub valoarea temperaturii fiziologice.
Datorită fluidităţii bistratului, moleculele lipidice pot executa două
tipuri de mişcări: mişcări de rotaţie şi mişcări de translaţie. Mişcările de
rotaţie sunt rapide şi sunt efectuate în jurul propriei axe. Mişcările de
translaţie pot fi de două feluri: translaţie laterală (difuziune) în planul
bistratului şi translaţie de tip “flip – flop” (de basculare) dintr-un strat în
altul. Mişcările de difuzie şi de rotaţie se realizează uşor, deoarece lanţurile
acizilor graşi rămân în acest caz în interiorul hidrofob al membranei. Atât în
membranele naturale, cât şi în cele obţinute artificial, prin dispersia
fosfolipidelor în mediu apos (liposomi), o moleculă lipidică îşi schimbă
locul cu “vecinii” din acelaşi strat de până la 107 ori într-o secundă şi poate
parcurge circa 1 μm în 20 secunde, la 37°C. Mişcările de translaţie dintr-un
strat în altul (“flip-flop”) sunt foarte rare, fiind catalizate de anumite
proteine membranare. Energetic, mişcările flip-flop sunt extrem de
nefavorabile, deoarece capătul polar al fosfolipidelor trebuie transportat prin
interiorul hidrofob al membranei.
Compoziţia lipidică a celor două straturi membranare este
asimetrică. Astfel, toate glicolipidele şi cea mai mare parte din
sfingomielină şi fosfatidil-colină se
găsesc în stratul extern (exoplasmic),
în timp ce fosfatidil-etanolamina şi
fosfatidil-serina sunt localizate în
stratul intern (citoplasmic) (Fig.
2.10).

Fig. 2.10 – Distribuţia lipidelor


22
2.1.2. Proteinele membranare

Proteinele membranare pot fi clasificate în proteine integrale


(intrinseci) şi periferice (extrinseci) (Fig. 2.11)

Fig. 2.11 – Tipuri de proteine membranare

Proteinele membranare integrale sunt inclavate în miezul hidrofob


de acizi graşi al membranei. Multe din proteinele integrale străbat
membrana de la nivelul suprafeţei citoplasmice până la exteriorul celulei,
fiind denumite proteine transmembranare. În structura unei astfel de
proteine se disting trei domenii diferite: două hidrofile şi unul hidrofob. Un
domeniu hidrofil, constituit din aminoacizi hidrofili, se află la capătul N-
terminal al proteinei şi este proiectat în mediul extracelular. Domeniul
hidrofob este alcătuit din aproximativ 20 – 30 aminoacizi hidrofobi şi se află
la interiorul bistratului membranar, printre acizii graşi ai fosfolipidelor. Cel
de al doilea domeniu hidrofil, de la capătul C-terminal, pătrunde în
citoplasmă. Proteinele transmembranare au cel puţin un domeniu hidrofob
inclavat în bistrat, fiind denumite proteine cu un singur pasaj, respectiv cu
pasaje multiple. În structura proteinelor cu pasaje multiple, domeniile
hidrofobe alternează cu regiunile hidrofile, dând aspectul de proteine în
“serpentine”. Un model frecvent întâlnit este acela cu şapte domenii
hidrofobe transmembranare, întrerupte de “bucle” hidrofile în spaţiul
extracelular, respectiv în citoplasmă (Fig. 2.12).

23
Fig. 2.12 – Structura proteinelor transmembranare cu pasaje multiple

De obicei, lanţul polipeptidic traversează bistratul fosfolipidic într-o


conformaţie α-helix, dar există şi structuri proteice compacte, de tipul
planurilor β, cum este cazul porinei, care formează pori membranari (Fig.
2.13).

Fig. 2.13 – Exemple de proteine transmembranare

24
Proteinele transmembranare pot fi izolate şi purificate numai după
dizolvarea bistratului fosfolipidic cu detergenţi. Detergenţii sunt molecule
amfipatice mici, care se leagă la zonele hidrofobe ale proteinelor
membranare şi înlocuiesc moleculele lipidice (Fig. 2.14). Pentru izolarea
proteinelor membranare se utilizează detergenţi ne-ionici (Triton X-100) sau
ionici (sodium dodecil sulfat). Proteinele membranare sunt apoi analizate
prin electroforeză în gel de poliacrilamidă.

Fig. 2.14 – Izolarea proteinelor cu detergenţi

Proteinele membranare periferice sunt ataşate la suprafaţa internă


sau externă a membranei, formând legături moleculare slabe, necovalente
(ionice, de hidrogen sau Van der Waals) cu proteinele membranare
integrale. Există însă şi proteine periferice care se leagă covalent la bistratul
fosfolipidic, în diverse moduri. Astfel, pe suprafaţa citosolică a membranei,
proteinele periferice se leagă covalent de lanţurile de acizi graşi, un exemplu
în acest sens fiind miristilarea, care constă în adiţia acidului miristic (acid
gras cu 14 atomi de carbon) la Gly amino-terminală a proteinei src. La
nivelul suprafeţei externe a bistratului fosfolipidic, proteinele periferice pot
fi legate covalent la “ancorele” de glicozil-fosfatidilinozitol (GPI). Ancorele
lipidice pot fi recunoscute şi clivate de către fosfolipaza C specifică.
Exemple de proteine ataşate la GPI sunt antigenul limfoid Thy-1, molecula
de adeziune a celulelor neurale (N-CAM) şi două proteine de suprafaţă ale
unor protozoare parazite – Trypanosoma şi Leishmania.
Aşa cum rezultă din modelul de mozaic fluid, proteinele se pot
mişca în bistratul lipidic. În urma măsurătorilor efectuate asupra difuziunii
laterale, reiese că viteza de deplasare a proteinelor este de circa 100 de ori
mai mică decât cea a lipidelor, în primul rând din cauza dimensiunilor mari
25
ale proteinelor. Prima dovadă a mişcării proteinelor a fost oferită în 1970, de
experimentul realizat de Frye şi Edidin (Fig. 2.14).

Fig. 2.14 – Experimentul Frye – Edidin privind deplasarea proteinelor

Cei doi cercetători au fuzionat două celule, una de şoarece, cealaltă


umană. Proteinele celulare de suprafaţă provenite de la cele două surse au
fost marcate distinct cu anticorpi fluorescenţi (verde pentru şoarece şi roşu
pentru proteinele umane). Imediat după fuzionare, celula hibrid rezultată,
numită heterocarion, apărea jumătate verde, jumătate roşie, din cauza
segregării proteinelor umane şi de şoarece. După incubarea la 37°C, timp de
40 minute, s-a produs amestecarea culorilor, demonstrând astfel deplasarea
proteinelor membranare.
Mişcarea laterală a proteinelor în membrana plasmatică poate fi
limitată în diferite moduri, de exemplu, prin autoasamblarea în agregate de
dimensiuni mari, prin legarea la macromolecule din interiorul sau din afara
citosolului şi prin interacţiunea cu proteinele membranare ale altor celule.

Glicoproteinele sunt proteine transmembranare care conţin lanţuri


zaharidice ataşate covalent la domeniile hidrofile din spaţiul extracelular. O
celulă poate avea câteva sute de tipuri de glicoproteine distincte. Fiecare din
aceste glicoproteine are domeniul extracelular glicozilat cu un complex
ramificat de resturi (amino)zaharidice. Ataşarea carbohidraţilor se realizează
26
prin legare covalentă la grupările hidroxil (-OH) ale serinei (Ser) sau
treoninei (Thr) – O-linkată – sau la grupul amino (-NH2) al asparaginei – N-
linkată. Unele glicoproteine pot avea 2 – 3 astfel de resturi zaharidice, altele
câteva duzini (Fig. 2.15).

Fig. 2.15 – Structura glicoproteinelor

Una dintre cele mai bine studiate glicoproteine este glicoforina A


(Fig. 2.16), localizată în membrana eritrocitelor umane, fiind prima proteină
integrală a cărei secvenţă a fost descifrată. Membrana fiecărui eritrocit
conţine în jur de 500 000 de copii ale moleculei de glicoforină. În structura
sa intră 131 aminoacizi. Glicoforina are un singur pasaj transmembranar,
constituit dintr-un segment de 23 aminoacizi hidrofobi, dispuşi în α-helix.
Din masa glicoforinei, 60 % este reprezentată de carbohidraţi, ceea ce
determină o mobilitate anormală în electroforeza în gel de poliacrilamidă.
15 resturi zaharidice sunt O-linkate la serină (Ser) şi treonină (Thr) şi un rest
la asparagină (Asn), în poziţia 26. Peste 90 % din acidul sialic de pe
suprafaţa membranei eritrocitare se găseşte în compoziţia glicoforinei.
Protozoarul parazit Plasmodium falciparum, care provoacă malaria,
utilizează acidul sialic din structura glicoforinei pentru a invada eritrocitele.
Glicoforina A are două variante polimorfice, care diferă numai în
poziţiile 1 şi 5, fiind astfel responsabilă pentru existenţa grupelor sangvine
M şi N. Alelele M codifică Ser în poziţia 1 şi Gly în poziţia 5, în timp ce
alelele N codifică Leu-1 şi Glu-5.

27
Fig. 2.16 – Glicoforina A

Asamblarea proteinelor membranare depinde de tipul de proteine.


Astfel, proteinele membranare constitutive, cu rol fiziologic, codificate în
mod normal de genomul celular, sunt asamblate printr-un proces complex.
Proteinele sunt sintetizate la nivelul unor ribozomi ataşaţi tranzitoriu la un
complex proteic membranar, denumit translocon (Fig. 2.17).

Fig. 2.17 – Asamblarea proteinelor constitutive (După Borel, 1996)

Transloconul oferă un canal transmembranar prin care proteinele


nou sintetizate sunt “injectate” în membrană. După ce sinteza este completă,
ribozomii se desprind de translocon (care adoptă o conformaţie de por
închis) şi proteina este eliberată în bistratul membranar, unde este
28
împachetată în structura finală, tridimensională. Proteinele non-constitutive
sunt în general toxine (α-hemolizina stafilococică) sau peptide
antimicrobiene, care se inseră în membranele celulare fără să străbată calea
constitutivă.

Funcţiile biologice ale proteinelor asociate bistratului lipidic se


datorează capacităţii lor de a transporta materie sau informaţie prin zona
hidrofobă a membranei, care altfel ar fi impenetrabilă. Anumite proteine
membranare pot îndeplini mai multe activităţi. Câteva din rolurile
proteinelor membranare sunt rezumate în tabelul următor:

Transportori Funcţii membranare de Transducţia


suprafaţă semnalului
- Translocatori - Molecule de adeziune - Receptori cuplaţi cu
moleculari celulară proteina G
- Canale ionice - Antigene celulare de - Receptori tirozin
- Pori apoşi suprafaţă kinazici
- Receptori ai - Receptori patogenici - Canale ionice
exo/endocitozei - Enzime ancorate la comandate de ligand
membrană - Canale ionice
- Complexele lanţului comandate de voltaj
respirator - Mediatori ai
- Proteine de fuziune semnalizării
membranară intercelulare

Deoarece multe proteine membranare sunt implicate în diverse căi


biologice, membrana celulară reprezintă o ţintă terapeutică ideală pentru
medicină. Prin modificarea activităţii unei proteine membranare, un agent
farmacologic poate influenţa fiziologia celulei, fără să fie necesară
internalizarea sa în celulă.

2.1.3. Glicocalixul

Denumirea de glicocalix provine din limba greacă şi semnifică un


“înveliş dulce”, un termen adecvat pentru o regiune compusă în principal
din carbohidraţi. Întradevăr, glicocalixul este format din totalitatea
grupărilor glucidice din structura glicoproteinelor şi glicolipidelor. Este
prezent la suprafaţa tuturor celulelor, grosimea sa fiind de aproximativ 500
Å. La nivelul anumitor celule, glicocalixul este mai gros şi mai uşor de
29
evidenţiat, aşa cum este cazul celulelor din epiteliul intestinal, ceea ce
constituie o particularitate dictată de specificul funcţional al zonei (Fig.
2.18). În microscopia optică se vizualizează destul de dificil şi numai după
utilizarea unor coloraţii specifice.

Fig. 2.18 – Imagine de microscopie electronică (72 000 X) a glicocalixului


de la suprafaţa celulelor epiteliului intestinal

Datorită compoziţiei sale, glicocalixul are multiple roluri:


- constituie un înveliş protector pentru celulele expuse unui mediu
nefavorabil, cu potenţial lezional, aşa cum se întâmplă în cazul
epiteliului intestinal;
- funcţionează ca o adevărată “capcană ionică”; datorită acidului
sialic din compoziţia sa, glicocalixul este încărcat negativ şi
poate reţine diverşi cationi (Ca2+), contribuind astfel la realizarea
gradientului ionic dintre mediul extra- şi intra-celular;
- intervine în procesele de adeziune şi semnalizare intercelulară;
- la nivel intestinal are un anumit grad de activitate enzimatică şi
participă la digestie.

30
2.2. Funcţia de transport a membranei

Celulele îşi procură moleculele şi ionii de care au nevoie din mediul


extracelular (de exemplu, glucoză, Na+, Ca2+), iar pe de altă parte,
substanţele toxice şi reziduurile rezultate din metabolismul celular trebuie
eliminate. Funcţia de transport a membranei reglează volumul celular,
concomitent cu menţinerea pH-ului şi a compoziţiei ionice, contribuind
astfel la realizarea homeostaziei necesare desfăşurării activităţii celulare.
Între cele două medii – intra- şi extracelular – există un trafic continuu, prin
care se realizează schimburi permanente de materie şi energie, coordonate
de membrana celulară. În plus, la celulele eucariote există şi un transport
prin membranele care delimitează compartimentele intracelulare (nucleu,
reticul endoplasmic, mitocondrii, etc.). Prin aceste membrane se transportă
proteine, ARNm, Ca2+, ATP. Abolirea acestei funcţii determină moartea
celulară.
Referitor la schimburile care au loc prin intermediul membranelor
celulare, trebuie avute în vedere două aspecte:
1. Concentraţiile relative. Moleculele şi ionii se deplasează spontan
în sensul gradientului lor de concentraţie, prin difuziune, dintr-un mediu cu
o concentraţie mai ridicată, spre o concentraţie mai scăzută. Dar, moleculele
şi ionii se pot deplasa şi împotriva gradientului, printr-un proces numit
transport activ, care necesită consum energetic (ATP).
2. Bistratul lipidic impermeabil. Moleculele de apă şi alte câteva
molecule mici, fără sarcină electrică, cum sunt O2 şi CO2, difuzează liber
prin membrană, în timp de ionii (K+, Na+, Ca2+, Cl-, HCO3-), moleculele
hidrofile mici (glucoza) şi macromoleculele (proteine şi ARN) necesită
mecanisme speciale de transport.
În funcţie de consumul energetic, se disting două tipuri de transport:
activ şi pasiv.
În funcţie de substanţele transportate, se diferenţiază:
a) transportul ionilor şi moleculelor mici, numit şi transport prin
membrane (ionii şi moleculele străbat bistratul lipidic);
b) transportul macromoleculelor şi particulelor, denumit transport
cu membrane, realizat prin intermediul unor vezicule ce se
desprind din membrane.

31
2.2.1. Transportul prin membrană

Difuziunea simplă (pasivă)

În acest caz, moleculele traversează membrana direct, fără


intervenţia unor sisteme de transport şi fără consum energetic, singurul
element care influenţează viteza de difuziune fiind gradientul de
concentraţie a moleculelor dintre cele două medii între care se face
schimbul. Prin difuziune pasivă sunt transportate molecule mici, hidrofobe:
benzenul, alcoolul etilic, unele gaze (O2, CO2, N2), precum şi unele
molecule polare mici, fără sarcină electrică, cum este apa. Cercetările au
arătat că, pentru transportul anumitor molecule polare mici, neutre (glicerol,
amoniac, uree) este necesară prezenţa unor “pori hidrofili”, prin care
moleculele difuzează liber (Fig. 2.19).

Fig. 2.19 – Transportul diferitelor tipuri de molecule prin bistratul lipidic

Osmoza este un termen special utilizat pentru difuziunea apei prin


membranele celulare. Cu toate că apa are o moleculă polară, ea este capabilă
să treacă prin bistratul lipidic, în sensul gradientului său de concentraţie.
Acesta se referă strict la concentraţia apei şi nu la concentraţia eventualilor
electroliţi dizolvaţi în apă.
Aquaporinele reprezintă o clasă aparte de proteine, care formează
pori hidrofili în membrană. Porii accelerează difuzia apei, dar prezenţa lor

32
nu este absolut necesară pentru acest proces. Aquaporinele se găsesc în
majoritatea membranelor implicate în menţinerea homeostaziei, în
metabolismul electrolitic şi în secreţia/ retenţia de apă (de exemplu, în
rinichi şi epiteliul pulmonar).
Apa nu este niciodată transportată activ, astfel încât nu se va deplasa
împotriva gradientului de concentraţie. Totuşi, concentraţia apei poate fi
influenţată de transportul activ al electroliţilor şi, în acest mod, mişcarea
apei prin membrane poate fi controlată. De exemplu, reabsorbţia apei din
tubii renali înapoi în sânge se bazează pe faptul că apa urmează transportul
activ al sodiului.
Dacă concentraţia apei în mediul extracelular este mai mare decât în
citosol, mediul este hipoton. Apa va intra în celulă prin osmoză. O hematie
plasată într-o soluţie hipotonă (apă distilată) se sparge imediat (hemoliză)
prin influxul de apă (Fig. 2.20)

Fig. 2.20 – Comportarea hematiilor în mediu izoton, hipoton şi hiperton

Un articol publicat în 1998 în The New England Journal of Medicine


trăgea un semnal de alarmă privind ignorarea fenomenului osmozei, care
poate duce la complicaţii grave, uneori fatale. În cazul unei proceduri
medicale, numită plasmafereză, sunt injectate la pacienţi volume relativ
mari de albumină umană 5 %. Albumina este dizolvată în ser fiziologic (0,9
%), fiind astfel izotonă cu plasma umană (moleculele proteice mari ale
albuminei au un efect osmotic redus). Dacă soluţia 5 % nu este disponibilă,
poate fi înlocuită printr-o diluţie corespunzătoare a unei soluţii de albumină
25 %, amestecând 1 parte soluţie 25 % cu 4 părţi diluant. Dacă diluantul
33
utilizat este apa şi nu serul fiziologic, soluţia rezultată este puternic hipotonă
faţă de plasmă, declanşând o hemoliză masivă, chiar fatală pentru pacienţi.
Când celulele se află într-o soluţie salină 0,9 % NaCl, ele nici nu
primesc, nici nu pierd apă. O astfel de soluţie este izotonă. În mod
fiziologic, mediul extracelular este izoton cu citoplasma celulară. Acest
echilibru trebuie menţinut activ, datorită prezenţei unui număr mare de
molecule dizolvate în citosol, dar care nu sunt prezente în fluidul
extracelular. Aceste molecule organice exercită un efect osmotic care, dacă
nu ar fi compensat, ar determina influxul masiv de apă în celulă, creşterea
volumului şi în final spargerea celulei. Fenomenul este evitat prin pomparea
activă a ionilor de Na+ din celulă, cu ajutorul ATPazei Na+/K+.
Dacă celulele ar fi plasate în apă de mare (salinitate aproximativ
3%), ar pierde apă prin osmoză şi s-ar deshidrata. Apa de mare este
hipertonă faţă de citosol.

Difuziunea facilitată

Difuziunea facilitată este o altă modalitate de transport pasiv, prin


care ionii, moleculele polare şi încărcate electric (monozaharidele,
aminoacizii, nucleotidele) străbat membrana în sensul gradientului de
concentraţie.
Ionii (cationi sau anioni) nu pot trece liber prin porţiunea
fosfolipidică a membranei celulare, din cauza încărcării electrice.
Difuziunea lor este facilitată de proteine, care formează canale ionice (Fig.
2.22).

Fig. 2.21 – Modelul transportului prin canalele ionice

34
Aceste proteine nu utilizează energie pentru a-şi modifica
conformaţia, dar sunt acţionate fie de liganzi (hormoni, neurotransmiţători,
nucleotide), fie de voltaj (potenţial transmembranar), fie de diferenţa de
presiune osmotică de o parte şi de alta a membranei (sensibilitatea la
presiune este denumită şi sensibilitate mecanică). Canalele ionice nu pot
controla direcţia fluxului ionic, dar oferă o cale apoasă, care manifestă
proprietăţi selective faţă de ioni (de exemplu, separă sarcinile pozitive de
cele negative). Atunci când canalele adoptă o conformaţie de por deschis,
ionii difuzează într-o direcţie determinată de potenţialul electrochimic
transmembranar, care constă din două componente: potenţialul membranar
(ionii pozitivi, de exemplu, se deplasează către partea negativă a membranei
celulare) şi potenţialul chimic (sau gradientul de concentraţie ionică, în
funcţie de care ionii se deplasează spontan de la o concentraţie mai mare la
una mai mică).
Canalele cu poartă comandate de ligand se deschid sau se închid ca
răspuns la ataşarea unor mici molecule semnal (liganzi). Unele canale ionice
sunt comandate de liganzi extracelulari, altele de liganzi intracelulari. În
ambele cazuri, ligandul nu este substanţa transportată prin canalul deschis.
Liganzii externi se ataşează la un situs din regiunea extracelulară a
canalului:
- Acetilcolina este un neurotransmiţător care, prin legarea la
anumite sinapse, deschide canalele responsabile pentru intrarea Na+ şi
iniţiază un impuls nervos sau o contracţie musculară.
- Acidul gama-aminobutiric (GABA) se ataşează la unele sinapse
din sistemul nervos central, determină intrarea ionilor de Cl- în celulă şi
inhibă impulsul nervos.
Liganzii interni se leagă la regiunea canalului proteic expusă spre
citosol:
- Mesagerii secundari, cum sunt AMPc sau GMPc reglează
canalele implicate în iniţierea impulsurilor în neuronii responsabili pentru
miros şi, respectiv, văz.
- Adenozin trifosfatul (ATP) este necesar pentru deschiderea
canalelor de Cl-, permiţând ieşirea Cl- din celulă. Proteina CFTR formează
canale permeabile pentru clor în membrana plasmatică a multor celule.
Pasajul prin aceste canale este posibil numai după ce domeniile de legare a
nucleotidelor ancorează şi clivează ATP, iar domeniul reglator este saturat
cu grupări fosfat (Fig. 2.22). Deşi energia eliberată prin hidroliza ATP este
necesară pentru deschiderea canalului, acesta nu este un exemplu de
transport activ, deoarece ionii de Cl- difuzează prin canal în sensul
gradientului.
35
Fig. 2.22 – Structura canalului de Cl- (După Scientific American, 1995)

Canalele de clor nu funcţionează sau sunt absente la bolnavii cu


fibroză chistică. Mecanismul molecular al fibrozei chistice este complex. În
mod normal, la nivelul celulelor epiteliale care delimitează căile aeriene
există cel puţin două tipuri de canale proteice, localizate în membrana
plasmatică învecinată lumenului bronşic. Unul dintre acestea – canalul
CFTR – eliberează Cl- în lumen, iar celălalt captează sodiul. Acest
mecanism permite mucusului secretat de către celulele glandelor
submucoase să rămână umed, într-un strat subţire şi uşor de îndepărtat din
căile aeriene, care astfel se menţin libere. La pacienţii cu fibroză chistică,
absenţa sau funcţionarea anormală a canalelor CFTR împiedică pasajul Cl-
şi, indirect, determină captarea unei cantităţi sporite de Na+. În consecinţă,
mucusul devine gros şi dificil de îndepărtat. Bacteriile, celulele imune,
ADN-ul rezultat din distrugerea bacteriilor se acumulează şi lezează
ţesuturile sănătoase (Fig. 2.23).
Fibroza chistică este o boală multiorganică, cu o incidenţă de 1:2500
nou-născuţi, care afectează căile respiratorii, pancreasul şi intestinul.
Incapacitatea menţinerii hidratării lumenului canalelor duce la blocarea
36
acestora cu mucus, la infecţii repetate şi, în cele din urmă, la incapacitate
funcţională. Formele de manifestare clinică diferă, de la forme relativ uşoare
până la forme letale.

Fig. 2.23 – Mecanismul molecular al fibrozei chistice.


A – normal; B – patologic

Identificarea genei CF, ale cărei mutaţii sunt responsabile pentru


etio-patogenia fibrozei chistice, a permis elucidarea structurii proteinei
CFTR codificată de această genă şi a mecanismelor prin care se realizează
transportul ionilor Cl-.
Canalele cu poartă comandate de voltaj din celulele excitabile
(neuronii şi celulele musculare) se deschid, respectiv se închid ca răspuns la
modificările de sarcină electrică (măsurată în volţi) de-a lungul membranei
plasmatice. De exemplu, în timp ce un impuls străbate un neuron, scăderea
voltajului deschide canalele de Na+ în porţiunea adiacentă a membranei. Ca
urmare, se produce influxul de Na+ în neuron şi astfel impulsul nervos se
propagă. Circa 7000 de ioni de Na+ trec prin fiecare canal în timpul foarte
scurt, de aproximativ o milisecundă, cât acesta rămâne deschis.
Canalele cu poartă comandate de voltaj conţin patru domenii
transmembranare, fiecare dintre acestea contribuind la delimitarea porului
central prin care se face deplasarea ionilor. În poziţia de repaus, “poarta”
obturează canalul, inhibând deplasarea ionilor Na+, iar segmentul de
inactivare a canalului este liber în citosol. Cele patru domenii

37
transmembranare din structura canalului proteic, dispuse în α-helix, conţin
lanţuri încărcate pozitiv. Atracţia acestor sarcini pentru interiorul negativ al
celulelor în repaus ajută la menţinerea canalului în poziţia “închis”. Atunci
când se produce depolarizarea membranei, exteriorul devine negativ şi
helixurile sensibile la voltaj se deplasează către suprafaţa externă a
membranei, determinând o modificare conformaţională imediată a
segmentului de poartă, care deschide canalul pentru influxul ionilor de Na+.
În mai puţin de o milisecundă după deschidere, helixurile sensibile la voltaj
revin la poziţia de repaus şi segmentul de inactivare se deplasează în
interiorul canalului, blocând mişcarea ionilor de Na+. Atunci când
potenţialul de membrană revine la valoarea de repaus şi interiorul este din
nou negativ, poarta închide canalul. După 1 – 2 ms, segmentul de inactivare
este eliberat şi canalul proteic intră în repaus, putând fi deschis de o nouă
depolarizare (Fig. 2.24).

Fig. 2.24 – Mecanismul de funcţionare a canalelor de Na+ comandate de


voltaj (După Miller, 1991)

38
Un alt exemplu de difuziune facilitată este transportul glucozei.
Glucoza, o sursă majoră a metabolismului energetic, este procesată de către
celulele hepatice şi redistribuită în întreg organismul. Glucoza este
transportată selectiv (glucoza D) prin difuziune facilitată, fără a necesita
consum energetic. Ca şi în cazul canalelor ionice, concentraţia glucozei
(potenţialul chimic) direcţionează fluxul prin membrană. Potenţialul
membranar nu are însă nici un efect în cazul glucozei, întrucât carbohidraţii
nu au sarcini electrice.
Difuziunea facilitată a glucozei necesită intervenţia unor proteine
transportoare (“carrier”). Transportorii, spre deosebire de canalele proteice,
leagă numai câteva molecule substrat (sau chiar una singură) la un moment
dat, după care suferă o modificare conformaţională, astfel încât moleculele
respective sunt transportate prin membrană. Deoarece la fiecare modificare
conformaţională este transportat un număr redus de molecule, rata de
transfer este de aproximativ 102 – 104, mult mai scăzută decât în cazul
canalelor proteice.
Au fost identificate trei tipuri de transportori. Sistemele uniport
transportă la un moment dat un singur tip de moleculă, în sensul
gradientului său de concentraţie. Din această categorie fac parte transportorii
glucozei şi aminoacizilor. În contrast, sistemele antiport şi simport
catalizează transportul unui tip de ion sau moleculă împotriva gradientului
său de concentraţie, cuplat cu transportul altui tip de ion sau moleculă în
sensul gradientului de concentraţie (Fig. 2.25). Sistemele antiport şi simport
fac parte din categoria transportorilor activi, cu toate că energia utilizată
pentru acest tip de transport nu provine din hidroliza ATP.

Fig. 2.25 – Tipuri de transport membranar

39
Pentru a înţelege proprietăţile diferitelor tipuri de proteine
membranare de transport, precum şi rolurile lor în fiziologia celulei şi a
organismului, cercetătorii au utilizat metode ce implică extracţia şi
purificarea unei proteine
specifice şi reîncorporarea sa
în bistraturi fosfolipidice
obţinute artificial, cum sunt
liposomii. Proteinele integrale
din membrana eritrocitară au
fost solubilizate cu detergent,
iar transportorul proteic al
glucozei, de tip uniport, a fost
purificat şi încorporat în
liposomi (Fig. 2.26).

Fig. 2.26 – Izolarea


transportorului uniport al
glucozei din membrana
eritrocitară

Prin această metodă s-a constatat că transportorul glucozei este o


proteină carrier, cu masa moleculară de 55 000 daltoni, care reprezintă circa
2 – 5 % din totalul proteinelor membranare, însumând aproximativ 300 000
situsuri de transport al glucozei. Proteine carrier similare sunt prezente în
multe ţesuturi, facilitând transportul zaharidelor, aminoacizilor şi al altor
molecule necesare funcţionării celulelor.
Transportorul glucozei alternează între două stări conformaţionale,
în care glucoza este legată, alternativ, pe faţa externă, respectiv pe cea
internă. Deplasarea unidirecţională a glucozei, de la exterior spre interior, în
sensul gradientului de concentraţie, se produce atunci când proteina
transportoare, cu glucoza legată pe faţa externă, suferă o modificare
conformaţională. În urma acestei transformări, situsul extern este inactivat şi
glucoza se deplasează către situsul intern nou format, de care se leagă
tranzitor, fiind apoi eliberată în celulă. După eliberarea glucozei,
conformaţia transportorului se modifică din nou, situsul intern este inactivat
şi se reface situsul extern (Fig. 2.27).

40
Fig. 2.27 – Modelul transportorului proteic al glucozei

După ce este transportată în celulă, glucoza este rapid fosforilată,


formând glucozo 6-fosfatul, care nu mai poate părăsi celula.
Difuziunea facilitată poate fi inhibată prin expunerea la diverse
substanţe chimice care interacţionează cu proteinele carrier, ca de exemplu
clorura de mercur sau dinitro-fluorbenzenul. Transportorul glucozei poate fi
blocat specific de fluorizină, care se leagă cu mare afinitate de proteina
transportoare, împiedicând interacţiunea cu glucoza.

Transportul activ

Spre deosebire de transportul moleculelor prin difuziune, transportul


activ intervine în deplasarea (“pomparea”) unui anumit substrat împotriva
gradientului de concentraţie (de la o concentraţie mai scăzută la una mai
ridicată) şi este cuplat cu o sursă de energie: hidroliza ATP sau gradientul
ionic electrochimic (gradientul ionului de Na+ la eucariote). Proteinele
carrier cuplate direct cu hidroliza ATP poartă numele de ATPaze şi
realizează transportul activ primar (direct). Transportorii cuplaţi cu un
gradient ionic participă la transportul activ secundar (indirect) şi
funcţionarea lor depinde de energia stocată în gradientul unui ion pompat
direct. Cu alte cuvinte, un ion transportat de o ATPază realizează un
gradient de concentraţie. Atunci când ionul este eliberat prin difuziune
facilitată, energia degajată poate fi utilizată pentru transportul altui ion sau
moleculă. Hidroliza ATP şi gradientul ionic modifică afinitatea pentru
substrat şi conformaţia proteinei carrier.

41
Transportul activ primar

ATP-aza Na+ - K+ (pompa de sodiu) este o proteină membranară


integrală prezentă în toate celulele organismelor superioare. Ca dovadă a
importanţei sale, se estimează că, în cazul organismului uman, până la 25 %
din totalul ATP-ului citoplasmatic este hidrolizat de către această pompă, iar
la nivelul celulelor nervoase aproximativ 70 % din ATP este consumat drept
“combustibil” pentru ATP-aza Na+ - K+.
Transportul ionic realizat de pompa de sodiu crează un gradient
chimic şi electric la nivelul membranei plasmatice, cu implicaţii celulare
multiple. De exemplu, potenţialul membranar de repaus este o manifestare
a gradientului electric şi constituie baza excitabilităţii în celulele musculare
şi nervoase. Pe de altă parte, translocarea sodiului dintr-o parte în alta a
epiteliului dă naştere unui gradient osmotic, care determină absorbţia apei,
cu importanţă deosebită la nivelul lumenului intestinal şi în rinichi.
În funcţie de tipul de celulă, există între 800 000 şi 30 de milioane de
pompe pe suprafaţa unei celule, distribuite aleator sau, dimpotrivă, grupate
în anumite domenii, aşa cum se întâmplă în membranele bazolaterale ale
celulelor epiteliale polarizate din rinichi şi intestin.
Anomaliile privind numărul sau funcţia ATP-azelor Na+ - K+ sunt
implicate într-o serie de stări patologice. Anumite tipuri de afecţiuni
cardiace sunt asociate cu reduceri semnificative ale concentraţiei
miocardice de ATP-aze Na+ - K+. De asemenea, reabsorbţia renală excesivă
de sodiu datorată hipersecreţiei de aldosteron determină hipertensiune
arterială. Experimental s-a observat că o mutaţie punctiformă a subunităţii
α-1 a pompei de sodiu are drept consecinţă apariţia hipertensiunii la
şobolanii cu o dietă bogată în sare.
ATP-aza Na+ - K+ este compusă din două subunităţi. Subunitatea α
leagă ATP şi cationii (Na+ şi K+) şi conţine situsul de fosforilare. Mica
subunitate β facilitează localizarea în membrana plasmatică şi activarea
subunităţii α.
Transportul cationilor are loc într-un ciclu de modificări
conformaţionale, declanşate de fosforilarea ATP-azei:
- pompa, la care este ataşat ATP, leagă intracelular trei ioni Na+;
- ATP este hidrolizat, determinând fosforilarea buclei
citoplasmatice a pompei şi eliberarea ADP;
- o modificare conformaţională a pompei expune cei trei ioni Na+
la exterior, unde sunt eliberaţi;
- pompa leagă extracelular doi ioni K+;

42
- are loc defosforilarea subunităţii α şi o nouă reorientare
structurală a pompei, conducând la eliberarea ionilor K+ în
celulă;
- în final, pompa adoptă conformaţia iniţială, cu ATP ataşat, fiind
gata pentru un nou transport (Fig. 2.28).

Fig. 2.28 – Modificările conformaţionale ciclice ale ATP-azei Na+-K+

Modificările rapide în activitatea pompei sunt induse de o serie de


căi de semnalizare intracelulare. Fosforilarea subunităţii α creşte activitatea
pompei, probabil prin creşterea turn-over-ului sau a afinităţii pentru substrat.
Anumiţi hormoni stimulează activităţile kinazice sau fosfatazice din celulă,
modificând activitatea pompei. De asemenea, se pare că anumite tipuri de
celule conţin un depozit citoplasmatic de pompe, care pot fi puse rapid în
stare funcţională la nivelul membranei.

43
Controlul hormonal asupra ATP-azei poate fi rezumat după cum
urmează:
- hormonii tiroidieni menţin concentraţia de echilibru a pompelor
în majoritatea ţesuturilor, ca rezultat al stimulării transcripţiei
genelor;
- aldosteronul este un hormon steroidian cu efecte majore asupra
homeostaziei sodiului; aldosteronul stimulează creşterea rapidă
şi susţinută a numărului de pompe în ţesuturi, ca urmare a
creşterii transcripţiei genelor ambelor subunităţi;
- catecolaminele au efecte variate, în funcţie de hormonul specific
şi de ţesut; de exemplu, dopamina inhibă activitatea pompei la
nivelul rinichiului, în timp ce epinefrina o stimulează în
muşchiul scheletic; aceste efecte sunt mediate de fosforilarea şi
defosforilarea pompelor;
- insulina este un reglator major al homeostaziei potasiului; la
câteva minute după creşterea secreţiei de insulină, la nivelul
pompelor se manifestă o creştere a afinităţii pentru sodiu şi a
ratei turn-over-ului; în muşchiul scheletic, insulina recrutează
pompele stocate în citoplasmă şi activează pompele latente deja
prezente în citoplasmă.
Subunitatea α a ATP-azei Na+-K+ este un receptor pentru glicozidele
cardiace din categoria digitalei şi a ouabainei. Legarea acestor substanţe la
pompa de sodiu inhibă activitatea acesteia în mod specific. Glicozidele
cardiace sunt utilizate pentru creşterea forţei de contracţie a inimii.
Inhibarea activităţii pompei de sodiu în miocitele cardiace determină
creşterea concentraţiei sodiului intracelular şi, în consecinţă, creşterea
concentraţiei calciului intracelular prin schimburile sodiu – calciu. Acest
mecanism se pare că intervine primul în stimularea contractilităţii cardiace.

ATP-azele membranare pot fi împărţite în patru clase majore:

1) ATP-aze de tip P:
• pompa de Na+ - K+;
• pompa de protoni (H+) din membrana plasmatică, pompează H+
în afara celulei, având rol în scăderea pH-ului sucului gastric;
• pompa de Ca2+ din membrana reticulului endoplasmic (RE) şi
membrana plasmatică, pompează Ca2+ în RE şi la exteriorul
celulei, menţinând concentraţia citoplasmatică a Ca2+ foarte
scăzută.

44
Pompa de Ca2+ din membrana RE este cunoscută şi ca SERCA
2+
(Ca - ATPaza Reticulului Sarco/Endoplasmic) şi are o activitate ciclică:
- Ca2+ se leagă strâns la domeniul citosolic;
- o modificare conformaţională, determinată de fosforilarea
domeniului enzimatic Asp, permite accesul situsurilor de legare a
Ca2+ dintr-o parte a membranei în cealaltă, concomitent cu
scăderea afinităţii pentru Ca2+;
- Ca2+ disociază în lumenul RE;
- hidroliza grupării fosfat de la nivelul enzimei Asp determină
revenirea la conformaţia iniţială (Fig. 2.29).

Fig. 2.29 – Activitatea ciclică a SERCA

2) ATP-aze de tip V:
• pompele de protoni (H+) din membrana lizozomală menţin pH-ul
foarte scăzut din interiorul acestor organite; au o structură
complexă, alcătuită din mai multe subunităţi proteice; sunt
inhibate de diverse substanţe chimice

3) ATP-aze de tip F:
• sintaza ATP mitocondrială

4) ATP-aze ABC (ATP binding cassette, caseta de legare la ATP)


ATP-azele ABC formează o superfamilie de transportori extrem de
vastă. Din această categorie fac parte, printre altele, proteinele de rezistenţă
multiplă la medicamente (MDR), implicate în dezvoltarea rezistenţei la
terapie, inclusiv în cazul celulelor tumorale. De asemenea, reglatorul
transmembranar al fibrozei chistice (CFTR) este înrudit cu membrii familiei
ABC. În structura acestor transportori intră domenii transmembranare
multiple, un domeniu (“casetă”) de legare la ATP şi un canal central.
45
Transportul activ secundar

Transportul multor ioni sau molecule prin membrana celulară este


cuplat cu Na+. Mecanismul transportului activ secundar poate fi simport, ca
în cazul glucozei şi aminoacizilor (moleculele se deplasează spre interior, în
aceeaşi direcţie cu Na+) sau antiport, de exemplu transportorul Na+-H+, care
reglează pH-ul celular (moleculele se deplasează spre exterior, în direcţie
opusă faţă de Na+).
Transportorul de Na+ şi glucoză permite ionilor de Na+ şi glucozei
să pătrundă în celulă împreună (transport simport). Ionii de Na+ se
deplasează în sensul gradientului lor de concentraţie, în timp ce moleculele
de glucoză sunt transportate împotriva gradientului. Legarea Na+ reglează
afinitatea pentru glucoză a proteinei carrier, precum şi conformaţia acesteia.
Astfel, concentraţia ridicată a ionilor de Na+ din mediul extracelular
determină creşterea afinităţii pentru glucoză şi modificarea conformaţională,
care duce la orientarea către citoplasmă a proteinei transportor. Datorită
concentraţiei sale reduse în citoplasmă, Na+ se desprinde de situsul reglator
al proteinei carrier. Concomitent, afinitatea pentru glucoză scade şi glucoza
este eliberată în citoplasmă. În absenţa Na+ legat, conformaţia
transportorului revine la starea iniţială. Ieşirea ionilor de Na+ din celulă se
face cu ajutorul ATP-azei Na+-K+ (Fig. 2.30). Acest sistem este utilizat
pentru a transporta activ glucoza din lumenul intestinal în celulele epiteliale
şi din tubii renali înapoi în sânge.

Fig. 2.30 – Transportul cuplat al Na+ şi glucozei

46
Transportorul de Na+ şi iod asigură, tot printr-un mecanism simport,
aportul de iod în celulele glandei tiroide (pentru sinteza de tiroxină) şi în
celulele glandei mamare (pentru a suplini necesarul de iod al nou-
născutului).

2.2.2. Transportul cu membrane

Macromoleculele şi particulele sunt preluate de celule din mediul


extern printr-un proces numit endocitoză (fagocitoză şi pinocitoză) (Fig.
2.31).

Fig. 2.31 – Tipuri de transport cu membrane (După Pastan, 1985)

Fagocitoza

Apare sporadic, constă din ingestia unor particule (de exemplu,


bacterii) din lichidul extracelular şi se desfăşoară în celule specializate
(neutrofile, macrofage), fără a fi necesară prezenţa receptorilor. Celulele
emit prelungiri şi captează macromolecule, diverse particule, resturi celulare
şi chiar celule întregi în interiorul unor vezicule numite fagozomi.
Fagozomii fuzionează apoi cu lizozomii, eliberându-şi conţinutul, care va fi
distrus de către enzimele lizozomale degradative.
Celulele fagocitare, precum macrofagele şi neutrofilele, se află în
prima linie de apărare împotriva bacteriilor. Totuşi, unele bacterii au
dezvoltat mecanisme de autoprotecţie pentru a evita distrugerea chiar după
ce au fost fagocitate. Salmonella enterica, o bacterie care produce
toxiinfecţii alimentare, secretă după fagocitare o proteină care împiedică
fuzionarea fagozomilor cu lizozomii. Mycobacterium tuberculosis, agentul
etiologic al tuberculozei pulmonare, constituie un alt exemplu de rezistenţă.

47
Când fagozomul se desprinde de membrana plasmatică, este tapetat cu o
proteină numită TACO (proteina de înveliş ce conţine triptofan – aspartat),
care trebuie îndepărtată înainte ca fagozomul să fuzioneze cu lizozomul.
Mycobacteria introdusă în fagozom este capabilă să blocheze îndepărtarea
învelişului TACO, împiedicând astfel fuziunea.

Pinocitoza

Prin acest proces, celulele ingeră material solubil (lichid). Ca şi în


cazul fagocitozei, nu este necesară prezenţa receptorilor. După ingestie, în
interiorul celulei se formează vezicule numite macropinozomi. Spre
deosebire de fagocitoză, pinocitoza se desfăşoară continuu în aproape toate
celulele, iar cantitatea de lichid introdusă este relativ mică.

Endocitoza mediată de receptori

Acest mecanism de transport depinde de interacţiunea moleculelor


care urmează să fie internalizate (liganzi) cu proteine specifice de legare din
membrana celulară, cu rol de receptor.
Prin endocitoza mediată de receptori este introdusă în celule o gamă
foarte largă de molecule:
- toxine (toxina difterică, pseudomonică, holerică; ricinul);
- virusuri (virusul sarcomului Rous, virusul stomatitei virale,
adenovirusuri);
- hormoni şi factori de creştere (insulina, factorul de creştere
epidermal, hormonul de creştere, hormonul de stimulare a
tiroidei, factorul de creştere neuronal, calcitonina, glucagonul,
prolactina, hormonul luteinizant, hormonii tiroidieni, factorul de
creştere derivat din plachete, interferonul, catecolaminele);
- proteine serice de transport şi anticorpi (transferina, LDL,
transcobalamina, imunoglobulinele).

Când ligandul se ataşează de receptorii săi specifici, complexele


ligand – receptor se acumulează în depresiuni cu înveliş de clatrină. În
multe celule, aceste depresiuni, împreună cu complexele, se concentrează în
anumite regiuni ale membranei celulare. Regiunile sunt plasate aleator pe
suprafaţa celulară, uneori însă se pot grupa la un pol al celulei. Acest proces
constituie un avantaj: dacă celulele ar endocita complexe ligand – receptor
pe toată suprafaţa membranei, cantităţi foarte mari de lichid extracelular ar
pătrunde în interiorul celulelor, datorită unui număr crescut de vezicule de
48
endocitoză. Pre-concentrarea complexelor în anumite zone ale membranei
minimalizează cantitatea de lichid captată în vezicule, prin scăderea
numărului acestora din urmă.
Receptorii se deplasează în planul membranei atât timp cât
temperatura se menţine la 37°C. Scopul deplasării laterale este de a colecta
complexele ligand – receptor în depresiunile cu clatrină. Unii receptori par a
se deplasa mai repede decât alţii şi o posibilă explicaţie în acest sens ar
putea fi mărimea ligandului sau a receptorului. Temperatura poate afecta
rata de legare a ligandului, ca şi mobilitatea laterală a complexului ligand –
receptor. Anumiţi liganzi nu se ataşează corespunzător la temperatură
scăzută, în timp ce alţii se leagă, dar nu pot fi internalizaţi.
Învelişul de clatrină tapetează depresiunile. Asamblarea moleculelor
de clatrină pare să determine invaginarea depresiunilor şi formarea
veziculelor. În plus, clatrina contribuie la stabilizarea veziculelor în timpul
înmuguririi şi desprinderii din membrană (Fig. 2.32).

Fig. 2.32 – Formarea depresiunilor şi a veziculelor cu înveliş de clatrină


(După Alberts, 1994)

În afară de clatrină, la asamblarea învelişului contribuie şi alte


proteine specifice, numite generic adaptine, care constituie un adevărat
complex multiunitar (vezi: Aparatul Golgi - Mecanismele moleculare ale
traficului vezicular). Adaptinele care acţionează la nivelul membranei
plasmatice sunt denumite AP2. Adaptinele se ataşează cu o extremitate la o
secvenţă semnal din molecula de receptor, iar cu cealaltă extremitate la
clatrină. Se realizează astfel un mecanism care reţine receptorii în
depresiunile cu înveliş. În anumite situaţii patologice receptorii pot suferi
mutaţii, în urma cărora conformaţia secvenţei semnal se modifică şi nu mai
este recunoscută de proteinele adaptoare. Ca rezultat, receptorii nu se mai
grupează în depresiunile cu înveliş.
49
După pătrunderea în citoplasmă, veziculele îşi pierd învelişul, cu
participarea unei chaperone (Hsc70) din familia proteinelor de şoc termic.
Apoi veziculele fuzionează rapid între ele, formând endozomii timpurii.
Fiecare veziculă conţine o pereche de proteine SNARE (receptorul proteinei
de ataşare la NSF solubil), care intervin în procesul de fuziune. Fuziunea,
numită homotipică, este iniţiată prin formarea perechilor SNARE (v-
SNARE şi t-SNARE), cu participarea factorului sensibil la N-etilmaleimidă
(NSF) şi a proteinei de ataşare la NSF (SNAP) (Fig. 2.33).

Fig. 2.33 – Mecanismul fuzionării veziculelor, cu formarea endozomului


timpuriu

Proteinele t-SNARE de pe o veziculă se aliniază cu proteinele v-


SNARE de pe vezicula cu care urmează să fuzioneze. În acelaşi timp,
factorii specifici de ancorare (Rabaptina-5 şi GTP/GDP) apropie veziculele
una de alta. Proteina asociată endozomilor timpurii (EEA-1) se leagă prin
intermediul capătului C-terminal la fosfatidil-inozitol-3-fosfatul din
membrana endozomilor. Rolul EEA-1 constă în ancorarea endozomilor şi în
activarea fuzionării lor.
Astfel, markerii pentru endozomii timpurii includ:
- proteinele EEA-1;
- rab 5 – GDP;
- pH aproximativ 6.

50
Endozomii timpurii au un pH mai scăzut (5,9 – 6) şi, drept urmare,
se produce disocierea receptorilor de liganzi. Receptorii se pot recicla la
suprafaţă prin vezicule care înmuguresc de pe endozom şi se îndreaptă spre
membrana plasmatică. După fuzionarea veziculelor de reciclare cu
membrana plasmatică, receptorii se reîntorc la suprafaţa celulei şi îşi reiau
activitatea (Fig. 2.34).

Fig. 2.34 – Formarea endozomilor şi reciclarea receptorilor

Evoluţia exactă a receptorilor membranari variază în funcţie de tipul


de celulă. Unii receptori sunt degradaţi, alţii sunt translocaţi spre complexul
Golgi, pentru a fi inseraţi în membrane în regiunea Golgi trans, de unde vor
fi reciclaţi. În multe cazuri, receptorii sunt returnaţi la membrana plasmatică
prin intermediul unor vezicule de transport înmugurite din endozomi.
Prin scăderea în continuare a pH-ului, endozomii timpurii se
transformă în endozomi maturi. Veziculele cu înveliş de clatrină din reţeaua
trans a complexului Golgi transportă enzimele digestive către endozomii
maturi şi fuzionează cu aceştia, eliberându-şi conţinutul. Endozomii maturi
devin astfel corpusculi degradativi. În vederea fuzionării cu noile vezicule
51
ţintă, markerul de suprafaţă rab 5 al endozomilor este înlocuit cu rab 7 –
GTP.
Endozomii maturi nu sunt capabili de digestie totală, astfel încât
următorul pas îl constituie fuziunea dintre endozomi şi lizozomi (pH = 5,5 –
6). Lizozomii sunt consideraţi compartimentul final al endocitozei.

Endocitoza particulelor LDL

Una dintre formele de transport al colesterolului în sânge este


reprezentată de complexele LDL
(lipoproteine cu densitate joasă). În
structura LDL intră colesterol
esterificat şi neesterificat,
fosfolipide şi o moleculă de
apoproteină B100 (Fig. 2.35).

Fig. 2.35 - Structura particulei LDL

Colesterolul legat în complexul LDL este captat de către celule prin


endocitoză mediată de receptori şi utilizat în diverse scopuri (de exemplu,
sinteza de hormoni steroizi sau
formarea membranelor). Calea
pe care sunt endocitate
particulele LDL cuprinde mai
multe etape: concentrarea
complexelor ligand (LDL) –
receptor în depresiunile cu
înveliş, formarea veziculelor cu
înveliş, îndepărtarea clatrinei,
fuzionarea veziculelor şi
constituirea endozomilor
timpurii, maturi şi, în final, a
lizozomilor (Fig. 2.36).

Fig. 2.36 – Endocitoza LDL

52
Receptorii sunt reciclaţi şi ligandul (LDL-colesterol) este
metabolizat la nivelul endozomilor maturi şi al lizozomilor, cu acumularea
consecutivă de colesterol. Colesterolul este apoi eliberat şi utilizat de celulă.
Concentraţiile serice crescute de LDL se traduc printr-o
colesterolemie ridicată. Reducerea nivelului colesterolului seric se poate
obţine prin captarea sa în celule, pe calea endocitozei mediată de receptori
LDL specifici. Anumiţi indivizi prezintă un defect genetic la nivelul
situsului de legare a adaptinei-2 la receptorul LDL. Acest situs participă la
concentrarea receptorilor LDL în depresiunile cu înveliş. Datorită mutaţiei
genetice, gruparea complexelor ligand – receptor în depresiunile cu înveliş
şi internalizarea lor este blocată. Ca urmare, nivelul colesterolului seric
creşte foarte mult, cu implicaţii în patologie (hipercolesterolemia familială,
cu valori mari ale colesterolului seric, hipertensiune arterială şi infarct
miocardic la vârste tinere).
Studii recente (Neufeld, 1999) s-au axat pe o proteină importantă,
numită NPC-1. Proteina NPC-1 este localizată la nivelul lizozomilor, de
unde este trimisă către endozomii maturi pe calea transportului retrograd,
stimulat de concentraţia de colesterol în endozomii maturi. Această proteină
intervine în efluxul colesterolului din endozomii maturi şi în transportul său
către reţeaua Golgi trans şi, de aici, la membrana plasmatică. Denumirea
proteinei provine de la maladia Nieman Pick tip C, cauzată de o mutaţie
autozomal recesivă, în care proteina NPC-1 este anormală. Ca urmare, are
loc o acumulare excesivă de colesterol în endozomii maturi, care îşi măresc
volumul.

53