Sunteți pe pagina 1din 41

5 CITOSCHELETUL

Citoscheletul este constituit dintr-o reţea de filamente proteice,


interconectate între ele, care străbate întreaga celulă. În structura
citoscheletului intră trei tipuri de filamente:
- microfilamentele de actină;
- microtubulii;
- filamentele intermediare.
Pe lângă cele trei tipuri de filamente, citoscheletul conţine o serie de
proteine accesorii, implicate în conectarea filamentelor între ele şi cu alte
componente celulare.
Procesele de polimerizare şi depolimerizare, caracteristice
microfilamentelor de actină şi microtubulilor, conferă citoscheletului un
pronunţat caracter dinamic.
Citoscheletul îndeplineşte o serie de funcţii vitale pentru celulă, fiind
implicat în menţinerea formei celulei şi localizarea precisă a organitelor,
precum şi în motilitatea şi diviziunea celulară.

5.1. Filamentele de actină

Unul dintre mecanismele implicate în motilitatea celulară este


reprezentat de citoscheletul de actină, mai mare decât orice organit.
Deoarece citoscheletul de actină este atât de mare, poate modifica cu
uşurinţă forma celulei, prin asamblări şi dezasamblări repetate. Lungimea
filamentelor de actină variază, ele fiind încrucişate în reţele şi fascicule
neregulate, iar procentul proteinelor citoscheletale este variabil. Această
flexibilitate organizatorică a citoscheletului de actină permite celulei să
adopte multe forme şi să le schimbe cu uşurinţă. În cazul celulelor care se
deplasează, citoscheletul trebuie să se asambleze rapid şi nu întotdeauna va
da naştere unor structuri perfect ordonate.
106
Actina este printre cele mai abundente proteine din celulele
eucariote. De exemplu, în celulele musculare, actina reprezintă circa 10
procente din greutatea totală a proteinelor celulare. Chiar în celulele non-
musculare, actina reprezintă între 1 şi 5 % din proteinele celulare.
Concentraţia citosolică tipică de actină în celulele non-musculare este de
circa 0,5 mM; în structurile specializate, cum sunt microvilii, concentraţia
locală de actină creşte foarte mult. O celulă hepatică conţine aproximativ 0,5
x 109 molecule de actină! Această abundenţă este caracteristică tuturor
proteinelor citoscheletului.
În organismul uman există şase gene pentru actină, care codifică
izoforme ale proteinei. Actina este una dintre cele mai bine conservate
proteine din celulă, comparabilă cu histonele, proteinele structurale ale
cromatinei. În celulele musculare ale vertebratelor există 4 izoforme de α-
actină, iar în celulele non-musculare izoformele β şi γ. Cu toate că
diferenţele structurale între cele trei izoforme sunt minime, acestea au
funcţii total diferite: actina α este asociată cu structurile contractile, în timp
ce actina β participă la polimerizare.
Recent a fost descoperită în organismele eucariote o familie de
proteine înrudite cu actina (Arps). Arp 2/3 stimulează asamblarea actinei, în
timp ce Arp 1 se asociază cu microtubulii.
Actina există sub forma unui monomer numit actina-G şi ca un
polimer filamentos (actina F), care este un lanţ linear format din subunităţi
de actină-G. Fiecare moleculă de actină conţine un ion de Mg2+, complexat
cu ATP sau cu ADP. Există astfel patru stări ale actinei: ATP – actina-G;
ADP – actina-G; ATP – actina-F; ADP –
actina-F. două din aceste forme ATP –
actina-G şi ADP – actina-F predomină în
celulă. Interconversia între ATP şi ADP în
formele actinei este importantă în
asamblarea citoscheletului (Fig. 5.1).

Fig. 5.1 – Interconversia ATP/ ADP


la nivelul actinei

107
Filamentele de actină se formează prin polimerizarea cap-coadă a
monomerilor asimetrici. Cele două extremităţi ale unui filament (desemnate
prin + şi -) diferă ca geometrie, stabilitate şi rată de creştere şi această
polaritate este fundamental importantă pentru înţelegerea modului în care
are loc asamblarea la capătul plus (situat în apropierea membranei
periferice) şi dezasamblarea la capătul minus (situat adânc în interiorul
citoplasmei). Primul pas în formarea filamentului de actină este numit
nucleaţie. Trei monomeri de actină se combină simultan, formând un nucleu
trimeric de elongaţie, termodinamic instabil (Fig. 5.2).

Fig. 5.2 – Formarea filamentelor de actină

Frecvent, nucleul trimeric disociază înapoi în monomeri; atunci când


nucleul rezistă suficient de mult, are loc procesul de elongare, prin adiţia
una câte una a moleculelor de actină monomerică (care conţine ATP) la
ambele capete ale nucleului, aşa cum arată experimentele in vitro. Adiţia
monomerilor este mai rapidă la capătul (+), în timp ce în celulă adiţia la
capătul (-) este mult mai lentă sau chiar absentă. După încorporarea
monomerilor în filamentele în creştere are loc hidroliza ATP şi formarea
subunităţilor de actină-ADP. După ce filamentele ating un stadiu de
echilibru, monomerii de actină-ADP sunt eliberaţi de la capătul (-) în acelaşi
procent în care noii monomeri de actină-ATP sunt adăugaţi la capătul (+),
fără o modificare netă a masei totale a filamentelor.
Odată atinsă faza de echilibru, concentraţia totală a subunităţilor
neasamblate (actina-G) poartă numele de concentraţie critică (Cc) şi este, in

108
vitro, de aproximativ 0,1 μM. Acest parametru reprezintă capacitatea
soluţiei de actină-G de a polimeriza: deasupra acestei valori, o soluţie de
actină-G va polimeriza; sub această valoare, va începe depolimerizarea unei
soluţii de actină-F. Diferenţa între viteza de elongaţie la cele două capete ale
unui filament de actină este cauzată de diferenţa între valorile Cc la cele
două capete. Atunci când este atinsă o stare de echilibru între Cc de la cele
două extremităţi ale filamentului de actină, subunităţile continuă să fie
adăugate la capătul (+) şi eliberate de la capătul (-). Lungimea filamentului
rămâne constantă, cu noile subunităţi adăugate alunecând de-a lungul
filamentului ca pe o bandă rulantă, până când ating capătul (-), unde se vor
disocia.
Echilibrul dintre monomerii de actină şi filamente poate fi rapid
perturbat de către anumite toxine. De exemplu, citocalazina D, un alcaloid
fungic, depolimerizează filamentele de actină prin legarea la extremitatea
(+), blocând adiţia altor subunităţi. Ca urmare, citoscheletul de actină
dispare şi mişcările celulare (locomoţia şi citokineza) sunt inhibate. O altă
toxină, faloidina, izolată dintr-o ciupercă extrem de otrăvitoare (Amanita
phalloides), are un efect contrar, împiedicând depolimerizarea filamentelor
de actină prin ancorarea subunităţilor de actină-F adiacente (Fig. 5.3).

Fig. 5.3 – Acţiunea toxinelor asupra actinei

Cu toate că actina G apare globulară la microscopul electronic, prin


cristalografie cu raze X se observă că este separată printr-un clivaj adânc în
doi lobi, care se mişcă unul în raport cu altul. Lobii şi clivajul formează
situsul ATP-azic, acolo unde se leagă ATP şi Mg2+. Când ATP sau ADP se
leagă la actina G, nucleotidele afectează conformaţia moleculei. În lipsa
nucleotidelor, actina G se denaturează rapid.

109
Adiţia de ioni (Mg2+, K+, Na+) la o soluţie de actină G induce
polimerizarea actinei G în filamente de actină F. Procesul este reversibil:
actina F se depolimerizează în actină G atunci când tăria ionică a soluţiei
scade. Asamblarea actinei G în actină F este acompaniată de hidroliza ATP
în ADP şi Pi. Hidroliza ATP modifică cinetica polimerizării, dar nu este
necesară pentru declanşarea procesului.
La microscopul electronic, prin contrastare negativă cu acetat de
uranil, actina F apare ca nişte “şiraguri răsucite de mărgele”, cu diametrul
între 7 – 9 nm. Prin cristalografie cu raze X s-a stabilit un model al
filamentelor de actină, în care subunităţile sunt organizate ca un helix strâns
răsucit. Toate subunităţile dintr-un filament au aceeaşi orientare (aceeaşi
polaritate). În acest aranjament, fiecare subunitate este înconjurată de alte
patru subunităţi şi corespunde unei “mărgele” din microscopia electronică.
Capacitatea actinei G de a se polimeriza în actină F şi
depolimerizarea actinei F constituie o proprietate importantă a actinei şi stă
la baza motilităţii celulare.

5.1.1. Proteine care reglează polimerizarea actinei

Concentraţia ionică intracelulară se menţine aproximativ constantă,


probabil datorită unui mecanism care controlează polimerizarea actinei.
Acest mecanism implică anumite proteine de legare la actină, stimulând sau
inhibând polimerizarea acesteia.
Măsurătorile efectuate au arătat că aproximativ 40 % din actina
celulară se află în stare nepolimerizată. Explicaţia constă în prezenţa unei
proteine mici, timozina β4, abundentă în citosol, care este capabilă să
formeze complexe, în raport de 1:1, exclusiv cu actina-G – ATP, fiind astfel
considerată principala proteină care împiedică polimerizarea actinei în
celulă.
O altă proteină citosolică, profilina, se leagă la monomerii de actină
– ATP, formând de asemenea un complex 1:1. Rolul principal al profilinei
constă în stimularea asamblării filamentelor de actină în celulă. Profilina
contribuie la adiţia monomerilor la capătul (+) al unui filament de actină. Un
alt mecanism prin care profilina stimulează asamblarea filamentelor de
actină este acţiunea sa ca factor de schimb nucleotidic. Atunci când actina-G
este complexată cu alte proteine, ATP sau ADP sunt reţinute în interiorul
cleştelui de legare a ATP-ului. Profilina este singura proteină de legare la
actină care permite schimbul ATP cu ADP. De asemenea, profilina
110
interacţionează cu anumite componente membranare implicate în
semnalizarea intercelulară (fosfatidil-inozitol 4,5-difosfat, PIP2), controlând
ataşarea actinei la membrana plasmatică (Fig. 5.4).

Fig. 5.4 – Interacţiunea profilină – actină la nivelul membranei plasmatice

5.1.2. Proteine care controlează lungimea filamentelor de actină

Anumite proteine controlează lungimea filamentelor de actină prin


ruperea acestora în fragmente mai scurte. Deoarece concentraţia actinei în
celulă favorizează formarea de filamente, ruperea filamentelor existente sau
a reţelelor de filamente necesită intervenţia unor proteine de fragmentare,
cum sunt gelsolina şi cofilina. Aceste proteine schimbă conformaţia
subunităţilor la care se leagă, determinând întinderea şi ruperea lor.
Proteinele rămân legate la capătul (+) al unui fragment rezultat, împiedicând
ataşarea sau schimbul subunităţilor actinei. Acest mecanism poartă numele
de “acoperire” (capping). Capătul (-), rămas neacoperit, este rapid scurtat.
Astfel se menţine un turn-over al filamentelor de actină, necesar proceselor
de locomoţie celulară şi citokineză. Activitatea proteinelor de fragmentare
este reglată pe diferite căi de semnalizare. De exemplu, ataşarea cofilinei şi
gelsolinei la filamentele de actină este inhibată de legarea acestor proteine la
PIP2. Prin hidroliza PIP2 proteinele sunt eliberate şi se iniţiază rapid
fragmentarea filamentelor. Fosforilarea şi defosforilarea reversibilă reglează
activitatea cofilinei, iar creşterea concentraţiei citosolice a Ca2+ activează
gelsolina (Fig. 5.5).

111
Fig. 5.5 – Mecanismul de acţiune al gelsolinei

Un alt grup de proteine stabilizează filamentele de actină. Ele se pot


lega la extremităţile filamentelor de actină, dar nu le pot fragmenta. O astfel
de proteină este CapZ, care se leagă la capătul (+) al filamentelor,
împiedicând ataşarea sau pierderea subunităţilor de actină la această
extremitate. Activitatea acestei proteine este inhibată de PIP2.
Tropomodulina se leagă la capătul (-) al filamentelor de actină.
Tropomiozina stimulează activitatea tropomodulinei, cele două proteine
acţionând împreună pentru stabilizarea filamentelor de actină. Astfel de
filamente stabilizate la ambele capete, care nu pot lega sau pierde subunităţi,
se întâlnesc în sarcomerul fibrei musculare şi în membrana eritrocitară,
locuri în care organizarea citoscheletului rămâne neschimbată.

5.1.3. Organizarea citoscheletului de actină

Mănunchiurile şi reţelele constituie forma comună de organizare a


filamentelor de actină în celulă. Din punct de vedere funcţional,
mănunchiurile şi reţelele au roluri identice: ambele oferă un schelet de
susţinere a membranei plasmatice şi, prin urmare, determină forma celulei.
Din punct de vedere structural, mănunchiurile diferă de reţele mai ales prin
organizarea filamentelor de actină. În mănunchiuri, filamentele de actină
sunt strâns împachetate în straturi paralele, în timp ce în reţele, filamentele
se încrucişază, adesea în unghiuri drepte, şi sunt slab împachetate. Celulele
conţin două tipuri de reţele de actină: un tip, asociat membranei plasmatice,
este bidimensional, ca o ţesătură; celălalt tip, prezent în interiorul celulei,
este tridimensional, conferind citosolului proprietăţi de gel.
Filamentele sunt ţinute împreună prin proteine de interconectare a
actinei. De lungimea şi flexibilitatea acestor proteine depinde formarea fie a
112
mănunchiurilor, fie a reţelelor: proteinele scurte (fimbrina, α-actinina) ţin
strâns împreună filamentele de actină, aliniindu-le într-un mod caracteristic
mănunchiurilor; proteinele lungi, flexibile (filamina, spectrina, distrofina)
sunt capabile să se adapteze la orice aranjament al filamentelor, dând naştere
la reţele. Fiecare dintre aceste proteine conţine o pereche de domenii de
legare a actinei, a căror secvenţă este omoloagă calponinei, o proteină
musculară.
Forma distinctă a unei celule este dependentă nu numai de
organizarea filamentelor de actină, dar şi de proteinele care conectează
filamentele la membrană. Aceste proteine, denumite proteine de legare a
microfilamentelor la membrană, acţionează ca nişte “puncte de sudură”,
care ancorează straturile membranare la citoscheletul subiacent. Când se
ataşează la o reţea plană de filamente, membrana rămâne netedă.
Aria cea mai bogată în filamente de actină dintr-o celulă se află într-
o zonă îngustă, situată imediat sub membrana plasmatică, numită cortex. În
această regiune, majoritatea filamentelor de actină sunt aranjate într-o reţea,
care exclude alte organite din citoplasma corticală. Au fost descrise mai
multe moduri de organizare a citoscheletului cortical de actină în diferite
celule.

5.1.4. Citoscheletul eritrocitar

Probabil cel mai simplu citoschelet este reţeaua bidimensională de


filamente de actină adiacentă membranei plasmatice a eritrocitului. O
hematie trebuie să străbată capilarele cele mai înguste fără să-şi distrugă
membrana. Forţa şi elasticitatea membranei plasmatice a eritrocitului depind
de reţeaua densă a citoscheletului care se întinde sub întreaga membrană, de
care se ataşează prin multiple puncte. Componenta primară a citoscheletului
eritrocitului este spectrina, o proteină fibroasă lungă. Spectrina este formată
din două subunităţi dimerice, fiecare compusă dintr-un lanţ polipeptidic α şi
unul β, care se asociază într-un tetramer. Spectrina eritrocitară menţine
forma celulelor, reglează motilitatea laterală a proteinelor membranare
integrale şi oferă suportul structural pentru bistratul lipidic. Cele două
subunităţi ale spectrinei, α şi β, sunt diferite structural şi sunt codificate de
gene separate. Tetramerul de spectrină, împreună cu un scurt filament de
actină, aducina, tropomiozina şi tropomodulina formează un complex
joncţional. Ultimele două proteine consolidează reţeaua, împiedicând
depolimerizarea filamentelor de actină (Fig. 5.6).

113
Fig. 5.6 – Citoscheletul eritrocitar şi legăturile sale cu membrana
plasmatică

Pentru a asigura menţinerea formei caracteristice a eritrocitului,


citoscheletul de spectrină şi actină este ferm ataşat de membrana eritrocitară
prin intermediul a două proteine membranare periferice, fiecare dintre ele
ataşată la o proteină membranară integrală. Ankirina conectează centrul
spectrinei cu proteina benzii trei, o proteină transportoare de anioni în
membrană. Proteina benzii 4.1, o componentă a complexului joncţional,
leagă spectrina la glicoforină, o proteină membranară integrală. Proteina
benzii 4.2 (paladina) stabilizează legătura dintre ankirină şi proteina benzii
trei. Proteina benzii 4.9 (dematina) încrucişează microfilamentele de actină,
formând mănunchiuri.
De ce sunt denumite proteinele după numărul benzii? Primele studii
privind proteinele citoscheletului membranar au utilizat electroforeza
proteinelor membranare denaturate în gel SDS (sodium dodecil sulfat).
Aceste analize au relevat prezenţa unor benzi proteice specifice, asociate
ulterior cu structurile electronomicroscopice, care aveau similarităţi cu
proteinele citoscheletului. Deoarece proteinele identificate erau
necunoscute, ele au fost denumite după numărul benzii.
O metodă de reglare a funcţiei proteice este adiţia uneia sau mai
multor grupări fosfat la o proteină, prin intermediul unei enzime
(fosfoprotein fosfatază), proces numit fosforilare. Fosforilarea proteinelor
majore, cum sunt ankirina şi proteina benzii 4.1, poate slăbi rigiditatea

114
citoscheletului prin reducerea afinităţii de legare a acestor componente
proteice. Astfel, rigiditatea citoscheletului se află sub control.
Sferocitozele ereditare constituie un grup de afecţiuni moştenite,
caracterizate prin prezenţa unor eritrocite de formă sferică pe frotiurile de
sânge periferic. Principalul defect celular constă în scăderea ariei suprafeţei
membranei eritrocitare în raport cu volumul intracelular, datorită formei
sferice, ca şi scăderea deformabilităţii celulare. Aceste eritrocite sferice sunt
mai mici, mai fragile din punct de vedere osmotic decât cele normale şi mai
puţin flexibile, având tendinţa de a fi reţinute în capilarele înguste şi în
special în splină, determinând splenomegalie. Distrucţia splenică a acestor
eritrocite anormale este cauza primară a hemolizei observată la persoanele
afectate, ceea ce provoacă hiperbilirubinemie şi icter.
Defectele biochimice apar la nivelul proteinelor asociate membranei
eritrocitare, în special la nivelul acelor proteine implicate în interacţiunile
dintre scheletul membranar şi bistratul lipidic: ankirina, α şi β spectrina,
proteina benzii 3 şi proteina benzii 4.2. Studierea membranelor eritrocitare
ale pacienţilor cu sferocitoză ereditară a relevat diferenţe calitative şi
cantitative în cazul acestor proteine. Mutaţiile genei ankirinei, situată pe
cromozomul 8, constituie cauza cea mai frecventă a sferocitozei ereditare
dominante. Scăderea sintezei de ankirină, scăderea asamblării ankirinei la
membrane sau asamblarea unei ankirine anormale conduce la scăderea
asamblării spectrinei la membrană, deoarece situsurile de legare ale
spectrinei pe ankirină pot fi absente sau anormale.
Tratamentul sferocitozei ereditare constă în îndepărtarea chirurgicală
a splinei (splenectomie). Cu toate că defectul eritrocitar persistă, hemoliza
se reduce. Prognosticul după splenectomie este pentru un regim normal de
viaţă. Totuşi, la copii este necesară o oarecare precauţie (amânarea
splenectomiei până la vârsta de trei ani, dacă este posibil), datorită riscului
crescut de infecţii, în special cu pneumococ.

5.2. Miozina

Anumite tipuri de mişcări celulare depind de interacţiunea dintre


filamentele de actină şi miozină. Miozina este o ATP-ază care se deplasează
de-a lungul filamentelor de actină, utilizând pentru modificările
conformaţionale energia eliberată prin hidroliza ATP. Deoarece realizează
conversia energiei chimice în energie mecanică, este o enzimă mecano-
chimică sau o proteină motoare. Dacă filamentele de actină constituie “calea
de rulare”, miozina este “motorul”, iar ATP “combustibilul”.
115
Prin analiza genomului uman s-a stabilit că familia de gene ale
miozinei are 13 membri. Cele mai numeroase şi mai bine studiate izoforme,
prezente în aproape toate celulele eucariote, sunt miozina I şi II. Toate
tipurile de miozină sunt proteine motoare, deşi activitatea lor specifică
diferă: miozina II este implicată în contracţia musculară şi citokineză, în
timp ce miozinele I şi V sunt implicate în interacţiunile membrană –
citoschelet (transportul veziculelor membranare).
În compoziţia tuturor tipurilor de miozină intră unul sau două lanţuri
grele şi câteva lanţuri uşoare. În structura lanţurilor grele se diferenţiază trei
domenii structurale şi funcţionale distincte. Domeniul capătului, de formă
globulară, este bine
conservat la toate tipurile de
miozină şi este responsabil
de generarea forţei. Aici
sunt localizate situsurile de
legare la actină şi ATP.
Regiunea gâtului,
organizată ca un α-helix, se
asociază cu lanţurile uşoare.
Situsurile de legare ataşate
domeniului cozii determină
activitatea specifică a
diferitelor tipuri de miozină
(Fig. 5.7).

Fig. 5.7 – Tipuri de miozină

În timp ce miozina II şi V sunt dimeri, molecula de miozină I este un


monomer. Numărul şi tipul de lanţuri uşoare legate în regiunea gâtului
diferă la cele trei miozine. Lanţurile uşoare ale miozinei I şi V sunt
reprezentate de calmodulină, o subunitate reglatoare care leagă Ca2+ în
multe enzime intracelulare. În structura miozinei II intră două lanţuri uşoare
diferite, numite esenţial şi, respectiv, reglator. Ambele sunt proteine care
leagă Ca2+, dar într-un mod diferit faţă de calmodulină. Ca2+ intervine în
reglarea tuturor tipurilor de miozină, dar, din cauza diferenţelor dintre
lanţurile uşoare, miozinele dezvoltă răspunsuri variate ca răspuns la
semnalizarea prin Ca2+.
Proprietăţile biochimice ale domeniilor miozinei au fost studiate pe
baza analizării fragmentelor rezultate din proteoliza miozinei. Clivajul
116
miozinei cu tripsină a dat naştere
meromiozinei uşoare (LMM) şi
meromiozinei grele (HMM). LMM,
care cuprinde o porţiune importantă
din coada miozinei, se agregă pentru a
forma filamente, dar nu se leagă la
filamentele de actină şi nu hidrolizează
ATP-ul. HMM, alcătuită din capetele
globulare şi dintr-o scurtă secţiune a
cozii, nu formează filamente, dar
hidrolizează ATP-ul şi se leagă la
filamentele subţiri. Tratamentul HMM
cu papaină (o protează) clivează cele
două capete globulare (S1) de restul
cozii (S2) (Fig. 5.8).

Fig. 5.8 – Proteoliza miozinei

S-a observat că domeniul capului este o ATP-ază specializată,


capabilă să cupleze hidroliza ATP cu mişcarea, proprietate ce depinde de
prezenţa actinei. În absenţa actinei, miozina transformă ATP în ADP şi
fosfat foarte lent. Prin legarea actinei la domeniul capului, activitatea ATP-
azică a miozinei creşte de 4 – 5 ori. Deşi toate tipurile de miozină exercită o
forţă asupra actinei prin intermediul domeniului capului, rolul fiecărui tip de
miozină în celulă este dat de domeniul cozii. De exemplu, miozina I are rol
de legătură între membrana plasmatică şi mănunchiurile de microfilamente
din structura microvililor, în timp ce domeniile cozii de la mai mulţi dimeri
de miozină II se asociază pentru a forma filamentele groase din cadrul
aparatului contractil muscular. Un astfel de filament gros din musculatura
striată are o organizare bipolară, capetele fiind localizate la ambele
extremităţi ale filamentului. Prin împachetare strânsă într-un filament gros,
mai multe domenii ale capetelor pot interacţiona simultan cu filamentele de
actină.

117
5.3. Contracţia musculară

Pentru înţelegerea evenimentelor moleculare care se desfăşoară în


timpul contracţiei musculare a fost conceput modelul filamentelor glisante.
Acest model este aplicabil tuturor tipurilor de muşchi (netezi, scheletici şi
cardiac), dar şi altor activităţi contractile, incluzând fenomenele
mecanochimice din timpul locomoţiei celulare, endocitozei mediate de
receptori sau diviziunii. Caracteristicile biochimice ale acestor fenomene pot
fi cel mai bine interpretate prin studierea muşchiului scheletic.

5.3.1. Muşchiul scheletic

Totalitatea musculaturii scheletice din corpul uman reprezintă


aproximativ 40 % din masa totală a organismului. Muşchiul scheletic este
alcătuit din celule cilindrice, multinucleate (conţinând până la 100 de
nuclei), numite fibre musculare. Membrana plasmatică a fibrelor musculare
este denumită sarcolemă. Fiecare fibră este înconjurată de ţesut conjunctiv
(endomisium). Fibrele musculare sunt grupate în fascicule, delimitate de un
înveliş de ţesut conjunctiv (perimisium). Citoplasma fibrei musculare
(sarcoplasma), conţine toate organitele celulare şi, în plus, miofibrile.
Fiecare miofibrilă este compusă din mănunchiuri de proteine filamentoase
contractile, care se întind între cele două extremităţi ale celulei. În structura
unei miofibrile se disting mai multe unităţi structurale şi funcţionale, numite
sarcomere. Limita dintre două sarcomere este reprezentată de linia (discul)
Z. La microscopul electronic, în structura miofibrilei se observă o alternanţă
de regiuni întunecate (banda A, anizotropă) şi luminoase (banda I,
izotropă). În zona centrală (banda H) a benzii A există numai filamente
groase de miozină II, ancorate de linia M, în timp ce zonele periferice conţin
atât filamente de miozină, cât şi de actină. În compoziţia benzii I intră numai
filamente subţiri, de actină. În centrul benzii I se află linia Z, ce conţine α-
actinină (care ancorează filamentele de actină) şi proteina CapZ, care
blochează extremitatea (+) a filamentelor de actină şi împiedică
depolimerizarea acestora. Extremitatea (-) a filamentelor de actină este
blocată de tropomodulină. Astfel, blocate la ambele capete, filamentele de
actină sunt extrem de stabile (Fig. 5.9).

118
Fig. 5.9. – Structura fibrelor musculare striate

119
În structura sarcomerului, filamentele groase şi subţiri se
întrepătrund, astfel că, în secţiune transversală, ele formează un model
hexagonal, în care şase filamente de actină sunt dispuse în jurul unui
filament de miozină. În timpul contracţiei şi relaxării musculare, distanţa
dintre liniile Z (lungimea sarcomerului) variază, micşorându-se în activitate
şi crescând în repaus. Linia M rămâne localizată central în sarcomer.
Modificările lungimii sarcomerului sunt determinate de împingerea
filamentelor subţiri de-a lungul filamentelor groase în direcţia liniei M.
Muşchiul are o structură extrem de elastică. După încetarea forţei care
acţionează asupra sa, muşchiul revine rapid la lungimea de repaus, în timp
ce aranjamentul regulat al filamentelor de actină şi miozină se reface. Sursa
acestei elasticităţi este reprezentată de anumite proteine, care menţin
organizarea tridimensională a filamentelor de actină şi miozină.
Una dintre proteine este titina (conectina), care conectează capetele
filamentelor de miozină cu linia Z şi se extinde de-a lungul lor spre banda
H. Titina acţionează ca o bandă elastică, care menţine filamentele de
miozină centrate în sarcomer atunci când muşchiul se contractă sau este
întins. O altă proteină, nebulina, formează filamente lungi, neelastice, care
se întind de-a lungul filamentelor de actină. Nebulina acţionează ca o “riglă”
moleculară, controlând numărul de monomeri de actină care polimerizează
într-un filament subţire în timpul formării fibrelor musculare mature (Fig.
5.10).

Fig. 5.10 – Dispunerea titinei şi nebulinei în sarcomer

În celulele musculare scheletice, concentraţia citosolică a Ca2+ este


menţinută la nivele scăzute (0,1 μM) cu ajutorul unei Ca2+-ATP-aze, care
pompează în continuu ionii de Ca2+ din citosol în reticulul sarcoplasmic, ce
120
devine astfel un rezervor intracelular de Ca2+. Un stimul care depolarizează
sarcolema determină creşterea rapidă a concentraţiei citosolice a Ca2+,
datorită unui sistem de invaginaţii ale sarcolemei, numite tubi transversali,
prin intermediul cărora semnalul ajunge în imediata vecinătate a reticulului
sarcoplasmic, provocând eliberarea Ca2+ prin canalele din membrana
reticulului. Atunci când încetează contracţia, canalele se închid şi Ca2+ este
repompat în reticulul endoplasmic (Fig. 5.11).

Fig. 5.11 – Reticulul sarcoplasmic

Atunci când concentraţia citosolică a calciului atinge un nivel optim,


ia naştere un complex actomiozinic. Interacţiunea dintre filamentele de
miozină şi cele de actină, dependentă de energia eliberată prin hidroliza
ATP, generează o forţă care determină alunecarea filamentelor de actină pe
cele de miozină. În acest proces intervin capetele miozinei, care formează
punţi încrucişate cu filamentele de actină în zona AI, acolo unde cele două
tipuri de filamente se suprapun. Deplasarea capetelor miozinei de-a lungul
filamentelor de actină se datorează modificărilor conformaţionale în
structura acestor punţi. Forţa de contracţie depinde de gradul de
întrepătrundere dintre cele două tipuri de filamente. Deoarece filamentele
groase sunt bipolare, acţiunea capetelor miozinice la cele două extremităţi
conduce filamentele subţiri spre centrul sarcomerului, care astfel se
scurtează şi muşchiul se contractă. (Fig. 5.12).
121
Fig. 5.12 – Alunecarea filamentelor de actină în timpul contracţiei
musculare

Aceste evenimente se desfăşoară pe parcursul unui adevărat ciclu, în


urma căruia un capăt al miozinei se deplasează cu două subunităţi actinice
mai aproape de linia Z sau de extremitatea (+) a filamentului (Fig. 5.13).

Fig. 5.13 – Modificări ciclice în timpul contracţiei musculare

122
Contracţia musculaturii scheletice este reglată prin intermediul unor
proteine care se ataşează la actină (tropomiozina şi troponina).
Tropomiozina (TM) formează un lanţ continuu de-a lungul fiecărui filament
de actină. Fiecare moleculă de tropomiozină prezintă şapte situsuri de legare
la actină, prin intermediul cărora se leagă la şapte monomeri de actină din
filamentul subţire. În
muşchiul în repaus
moleculele de tropomiozină
acoperă situsurile de legare
a miozinei de pe monomerii
de actină, împiedicând
astfel interacţiunea dintre
actină şi miozină şi
menţinând muşchiul relaxat.
Troponina (TN), o proteină
asociată tropomiozinei, este
un complex format din trei
subunităţi: TN-I, TN-T şi
TN-C, care controlează
poziţia TM pe suprafaţa
filamentelor de actină.
Structura TN-C este
similară calmodulinei.
Imediat după eliberarea
Ca2+ în sarcoplasmă, acesta
se leagă la TN-C. Ca
rezultat, întreaga moleculă
de troponină suferă anumite
modificări conformaţionale,
care determină îndepărtarea
tropomiozinei şi eliberarea
situsurilor de legare a
miozinei de pe filamentele
de actină (Fig. 5.14).

Fig. 5.14 – Mecanismul de acţiune al complexului troponinic şi al


tropomiozinei la nivelul filamentelor de actină

123
După încetarea stimulării la nivelul joncţiunilor neuro-musculare,
sarcolema îşi recapătă potenţialul de repaus, ca şi sistemul tubilor T şi
membrana reticulului sarcoplasmic. Concomitent, Ca2+ este pompat înapoi
în cisternele reticulului sarcoplasmic de către o pompă de Ca2+ extrem de
activă, dependentă de ATP. Pentru fiecare ATP hidrolizat, doi ioni Ca2+ sunt
introduşi în reticulul sarcoplasmic, până când concentraţia sarcoplasmică a
calciului scade sub nivelul de legare la TN-C. La acumularea de Ca2+ în
reticulul sarcoplasmic contribuie şi calsequestrina, o proteină avidă de
calciu, situată pe suprafaţa cisternelor reticulului sarcoplasmic. De
asemenea, mitocondria are o pompă de calciu controlată de potenţialul
chemo-osmotic generat de transportul de electroni. În condiţii aerobe,
această pompă utilizează energia transportului de electroni pentru a
sechestra Ca2+ în matricea mitocondrială.
Tetania şi rigiditatea cadaverică constituie două tipuri de contracţie
musculară anormală. Tetania apare uneori după o perioadă prelungită de
stimulări musculare sumate, repetitive şi este cauzată de depleţia ATP şi
creatin fosfat. Deoarece stimulările tetanice cresc concentraţia
sarcoplasmică de Ca2+ şi scad ATP, în final va rezulta un muşchi puternic
contractat, cu Ca2+ legat la TN-C şi cu deficit de ATP, incapabil să
reintroducă Ca2+ în reticulul sarcoplasmic şi să desfacă punţile
actomiozinice. În aceste condiţii, muşchiul este “obosit”, adică are o
capacitate limitată de a genera o activitate contractilă ca răspuns la noi
stimuli.
În momentul morţii organismului, toate reacţiile tind spre o stare de
echilibru. Una dintre primele manifestări ale acestui proces este echilibrarea
ionică între toate compartimentele organismului, datorită pierderii
rezervelor energetice ale pompelor ionice. În cazul muşchilor, acest
fenomen se reflectă în descărcarea calciului extracelular şi a celui din
reticulul sarcoplasmic, ceea ce duce la creşterea rapidă a nivelului Ca2+
sarcoplasmic. Ca rezultat, apare o activitate contractilă necontrolată, care
conduce la epuizarea rezervelor de ATP şi la formarea masivă de complexe
actomiozinice. Astfel, la scurt timp după moartea organismului, musculatura
va adopta un aspect rigid, caracteristic, cunoscut drept rigor mortis.

124
5.3.2. Muşchiul neted

Musculatura netedă căptuşeşte organele interne şi vasele de sânge.


Comparativ cu muşchii scheletici, celulele musculare netede se contractă şi
se relaxează mult mai lent şi pot menţine o stare de tensiune un timp
îndelungat. Muşchiul neted este compus din celule alungite, fuziforme,
fiecare având un singur nucleu. În structura muşchiului neted intră filamente
groase şi subţiri, dar aceste filamente nu au o organizare atât de precisă ca în
muşchiul scheletic. Filamentele sunt ataşate în citosol la nişte corpusculi
compacţi, care par să îndeplinească acelaşi rol ca şi liniile Z de la muşchiul
scheletic. Filamentele subţiri
sunt conectate cu plăcile de
adeziune, localizate la nivelul
membranei plasmatice.
Aceste plăci de adeziune
conţin α-actinină (o proteină
care leagă actina) şi
vinculină, care se leagă la
proteinele integrale
membranare, conectând
filamentele de actină la
membrana plasmatică (Fig.
5.15).

Fig. 5.15 – Structura


muşchiului neted

Dacă modelul filamentului glisant descrie în mod adecvat


mecanismul de bază al contracţiei musculare în general, între contracţia
musculaturii netede şi a celei scheletice există câteva diferenţe
semnificative. În primul rând, cu toate că muşchiul neted nu conţine
troponină, activitatea sa contractilă este totuşi reglată de nivelul
citoplasmatic al calciului. Aceasta se explică prin existenţa unei proteine
care interacţionează cu complexul Ca2+ - calmodulină (CaCM), cunoscută
sub numele de caldesmon. În cazul unei concentraţii scăzute de Ca2+,
caldesmonul formează un complex cu actina şi tropomiozina, blocând
legarea miozinei şi declanşarea contracţiei. Mărirea concentraţiei citosolice
a Ca2+ induce formarea CaCM. Acesta se leagă la caldesmon, pe care-l
125
îndepărtează din complexul format cu actina şi tropomiozina. Consecutiv,
tropomiozina îşi modifică poziţia pe filamentul de actină, fiind astfel
stimulată constituirea complexului actomiozinic. Legarea caldesmonului la
actină este influenţată de fosforilarea sa de către diferite kinaze, printre care
MAP kinazele (protein kinazele activate de mitogen). Forma fosforilată a
caldesmonului nu se leagă corespunzător la filamentele de actină şi este
incapabilă să blocheze ataşarea miozinei la actină. Prin urmare, MAP
kinazele stimulează direct contracţia musculaturii netede.
O altă diferenţă majoră între muşchiul neted şi cel striat o constituie
existenţa în cazul muşchiului striat a unei singure subunităţi a lanţului uşor
al miozinei, numită lanţul uşor-p. Lanţul uşor-p poate exista în formă
fosforilată sau nefosforilată, în funcţie de activitatea unei alte proteine
dependente de complexul CaCM şi anume kinaza lanţului uşor al miozinei
(MLCK). În absenţa CaCM, kinaza este inactivă şi lanţul uşor-p nu este
fosforilat. Prezenţa CaCM determină activarea MLCK, fosforilarea lanţului
uşor-p şi declanşarea funcţiei ATP-azice a complexului actomiozinic.
Legarea epinefrinei la receptorii β-adrenergici creşte nivelul AMPc,
activează kinaza dependentă de AMPc (PKA), care reduce afinitatea MLCK
pentru CaCM şi modulează forţa contracţiei generată de creşterea
concentraţiei citosolice a Ca2+. Prin urmare, pentru contracţia musculaturii
netede, este necesară atât fosforilarea lanţurilor uşoare-p, cât şi îndepărtarea
caldesmonului de pe filamentele subţiri (Fig. 5.16).

Fig. 5.16 – Reglarea contracţiei muşchiului neted (După King, 1996)

126
5.4. Actina şi miozina în celulele nonmusculare

În regiunile celulare de contact cu substratul (pentru celulele aflate


în culturi) sau cu celulele învecinate (in vivo) există fascicule de actină şi
miozină II. Când sunt izolate din celule, aceste fascicule se contractă, în
prezenţa ATP. Între fasciculele contractile din celulele nonmusculare şi cele
necontractile de actină există două diferenţe fundamentale: în primul rând,
fasciculele contractile sunt localizate în imediata vecinătate a membranei
plasmatice, formând o adevărată “centură”, în timp ce filamentele
necontractile de actină formează miezul prelungirilor membranare
(microvili); în al doilea rând, printre filamentele de actină din fasciculele
contractile se află dispusă miozină II, pe când filamentele de actină din
microvili sunt asociate cu miozină I.
În celulele epiteliale, fasciculele contractile sunt dispuse ca un inel
care înconjură suprafaţa internă a celulei la nivelul joncţiunilor de aderenţă.
În compoziţia acestor fascicule intră mai multe proteine, printre care
vinculina, tropomiozina, α-actinina. Împreună cu joncţiunile de aderenţă,
fasciculele contractile participă la menţinerea formei celulei. În plus, în
cazul unei leziuni epiteliale, contracţia fasciculelor din celulele aflate în
vecinătate obturează breşa creată în stratul de celule şi astfel contribuie la
vindecare (Fig. 5.17).

Fig. 5.17 – Fascicule contractile dispuse în “centură” la nivelul celulelor


epiteliale

127
Microfilamentele de actină, organizate sub forma unor fascicule
lungi, care se întind de-a lungul suprafeţei ventrale a celulelor cultivate pe
suporturi artificiale (sticlă sau plastic), poartă numele de fibre de stres. În
compoziţia fibrelor de stres intră miozină, α-actinină, tropomiozină,
caldesmon şi protein kinaza
reglatoare LC. La extremitatea
fibrelor de stres se află
adeziunile focale, structuri
specializate care ataşează celula
la substrat (Fig. 5.18).

Fig. 5.18 – Fibrele de stres şi


adeziunile focale

Cu toate că fibrele de stres sunt structuri contractile şi se găsesc în


celule mobile, se pare că sunt implicate mai degrabă în adeziunea celulară,
decât în motilitate. Dacă fibroblastele dintr-o cultură sunt îndepărtate de pe
substrat, celulele îşi pierd forma, devin sferice şi fibrele de stres dispar.
După reamplasarea pe suport, fibrele de stres reapar în câteva ore.
Adeziunea celulelor la substrat induce un stres la nivelul citoscheletului,
care determină alinierea filamentelor de actină şi miozină în fibre de stres.
Miozina II întăreşte citoscheletul cortical de actină. Studii genetice şi
biofizice au indicat faptul că membranele celulelor mutante, care nu au
miozină II, se deformează mult mai uşor decât membranele celulelor
normale. De asemenea, miozina II este responsabilă pentru deplasarea
proteinelor membranare de suprafaţă. În mod normal, proteinele
membranare de suprafaţă sunt imobile, dar, în prezenţa unor anticorpi, de
exemplu, ele se grupează în anumite regiuni ale membranei. În lipsa
miozinei II, această agregare este inhibată.
Actina şi miozina II au un rol esenţial în citokineză. În timpul
mitozei, actina şi miozina II se aliniază, sub forma unui inel contractil, în
planul ecuatorial al celulei aflate în diviziune. În cursul procesului de
citokineză (diviziunea citoplasmei), diametrul acestui inel se reduce
progresiv, până când celula este clivată în două părţi. În lipsa miozinei II,
celulele aflate în mitoză devin multinucleate, deoarece citokineza este
inhibată, dar nu şi cariokineza (diviziunea nucleului).
Miozina participă la transportul citoplasmatic al unor vezicule
membranare. Încă de la primele cercetări asupra citoplasmei s-a observat că
anumite vezicule se deplasează în citosol pe direcţii bine stabilite, urmând
128
traiectorii deloc întâmplătoare, ceea ce exclude posibilitatea difuziunii
libere. În aceste procese sunt implicate alte tipuri de miozină, printre care
miozina I şi V, care se deplasează de-a lungul filamentelor de actină,
tractând veziculele membranare. De exemplu, în celulele epiteliului
intestinal, miozina I este asociată cu membranele golgiene, sugerând astfel
implicarea sa în transportul veziculelor între diferite compartimente
membranare. În ţesutul cerebral există cantităţi importante de miozină V, cu
rol în deplasarea veziculelor implicate în transmiterea sinaptică.

5.5. Locomoţia celulară

Mecanismele implicate în deplasarea celulară presupun o serie de


procese, de la formarea filamentelor de actină şi gruparea acestora în
mănunchiuri şi reţele, până la contracţia ansamblurilor actină – miozină şi
alunecarea moleculelor de miozină pe filamentele de actină. Aceste
mecanisme generează forţele necesare migrării celulare.
Keratinocitele şi fibroblastele care migrează prezintă modificări
similare ale morfologiei celulare: extensia
membranei celulare, ataşarea la substrat,
deplasarea anterogradă a citosolului şi
retracţia părţii posterioare a celulei. În
etapa iniţială – deplasarea lamelipodului –
are loc polimerizarea controlată a
filamentelor de actină de la nivelul
segmentului de înaintare şi încrucişarea
acestor filamente în mănunchiuri şi reţele.
Polimerizarea filamentelor de actină
împinge membrana în direcţia de înaintare,
cu participarea miozinei I. După extensia
membranei şi asamblarea citoscheletului,
are loc ataşarea membranei la substrat.
Mănunchiurile de actină de la nivelul
segmentului anterior se ancorează la situsul
de ataşare, dezvoltând rapid o adeziune
focală. Scopul ataşării constă în ancorarea
celulei la substrat şi prevenirea retracţiei
lamelipodului (Fig. 5.19).

Fig. 5.19 – Etapele locomoţiei celulare


129
Într-o etapă ulterioară, întregul conţinut al celulei este translocat
anterograd, probabil prin contracţia dependentă de miozină a citoscheletului
cortical. Implicaţia contracţiei corticale dependente de miozină la nivelul
keratinocitelor aflate în mişcare este susţinută de organizarea miozinei II
sub forma unor benzi, localizate la limita dintre lamelipode şi corpul celular.
În ultima etapă, adeziunile focale sunt dezintegrate şi segmentul posterior al
celulei este tracţionat în direcţia de migrare, probabil prin contracţia fibrelor
de stres sau datorită tensiunii elastice.
O caracteristică importantă a motilităţii celulare este polaritatea: o
celulă are un segment anterior şi unul posterior. Pentru a se deplasa într-o
anumită direcţie, o celulă are nevoie de semnale care să coordoneze
procesele de la cele două extremităţi. Atunci când celula îşi schimbă direcţia
de deplasare, se formează un nou lamelipod, orientat pe noua traiectorie. În
cazul unor forme mutante ale miozinei I, se formează lamelipode în toate
direcţiile, astfel încât celula nu este capabilă de deplasare.
În cazul producerii unei leziuni, de exemplu, factorii locali
stimulează fibroblastele latente să crească, să se dividă şi să emită
lamelipode şi filopode, ducând în final la închiderea leziunii prin asamblarea
fibrelor de stres şi a adeziunilor focale. Aceste procese presupun
polimerizarea filamentelor de actină, activarea moleculelor de miozină şi
asamblarea reţelelor şi mănunchiurilor de actină. Rearanjarea citoscheletului
face parte din răspunsul fibroblastelor la vindecarea leziunilor şi implică
anumite căi de semnalizare, coordonate de trei proteine înrudite cu Ras:
Rac, Rho şi Cdc42. Astfel, s-a demonstrat că Rho şi Rac stimulează
formarea contactelor focale şi a fibrelor de stres, iar Cdc42 controlează
etapele timpurii, de formare a filopodelor.
Un aspect important al locomoţiei celulare este modul în care
mişcarea este coordonată de diverşi stimuli. De exemplu, asamblarea
filamentelor de actină la membrană este stimulată de acţiunea fosfatidil-
inozitol bifosfatului (PIP2). Hidroliza PIP2 de către fosfolipaza C (PLC)
eliberează profilina, cofilina şi gelsolina de la nivelul membranei. În plus,
inozitol-trifosfatul (IP3) stimulează eliberarea Ca2+ din reticulul
endoplasmic, ceea ce are drept rezultat stimularea activităţii miozinei II şi a
gelsolinei, cu creşterea corespunzătoare a turn-over-ului actinei (Fig. 5.20).

130
Fig. 5.20 – Acţiunea diverşilor stimuli asupra locomoţiei celulare

5.6. Microtubulii

Microtubulii se formează prin polimerizarea subunităţilor de α- şi β-


tubulină, o proteină globulară cu greutatea moleculară de 55 000 daltoni.
Rezultă astfel o structură cilindrică având un diametru de aproximativ 24
nm. Interacţiunile dintre monomerii de tubulină se materializează într-un
complex heterodimeric, suficient de puternic pentru a nu disocia în condiţii
normale. Fiecare subunitate de tubulină leagă două molecule de GTP.
Situsul de pe α-tubulină leagă GTP ireversibil, în timp ce situsul localizat pe
β-tubulină, numit situs de schimb, leagă GTP în mod reversibil, permiţând
hidroliza la GDP. Guanina legată la β-tubulină reglează adiţia subunităţilor
de tubulină la extremitatea microtubulilor.
Forma tubulară a microtubulilor este menţinută de interacţiunile
laterale şi longitudinale dintre subunităţi. Legarea longitudinală, de tip “cap
– coadă”, a monomerilor are ca rezultat formarea unui protofilament linear,

131
în care subunităţile se repetă la 8 nm. Asocierea prin interacţiuni laterale a
unui număr de 13 protofilamente constituie un microtubul (Fig. 5.21).

Fig. 5.21 – Structura unui microtubul (După Song, 1993)

Microtubulii sunt structuri polare, datorită aranjamentului dimerilor


de tubulină în protofilament. Deoarece toate protofilamentele unui
microtubul au aceeaşi orientare, o extremitate a microtubulului este
înconjurată de α-tubulină, iar cealaltă de β-tubulină. Ca şi în cazul actinei,
cele două capete (+ şi −) au rate diferite de asamblare.
Există două categorii de microtubuli: stabili şi instabili. Microtubulii
instabili se pot asambla şi dezasambla rapid, în funcţie de necesităţile
celulare de moment. De exemplu, în timpul mitozei, reţeaua citosolică de
microtubuli caracteristică interfazei se dezintegrează, iar tubulina este
utilizată la constituirea fusului de diviziune. După încetarea mitozei, fusul
dispare şi reţeaua interfazică de microtubuli se reformează. În schimb,
anumite celule, de obicei nereplicative, conţin structuri bazate pe
microtubuli stabili. Astfel de microtubuli intră în compoziţia flagelilor
spermatozoizilor sau a benzii marginale din eritrocite şi plachete. De
asemenea, axonii neuronali au un miez intern format din microtubuli, care
contribuie la menţinerea lungimii axonilor. Dezasamblarea unor astfel de
structuri stabile ar avea cosecinţe dezastruoase: spermatozoizii ar fi
incapabili de deplasare, hematiile şi-ar pierde flexibilitatea, iar axonii s-ar
retracta.
Microtubulii din reţeaua citosolică interfazică iradiază de la un situs
central, numit centrul de organizare al microtubulilor (MTOC), care este
reprezentat, la celulele animale, de către centrozom. În celulele animale
nepolarizate, cum sunt fibroblastele, MTOC este localizat în apropierea
nucleului. MTOC (centrozomul) are rolul de a iniţia asamblarea
microtubulilor citosolici, astfel că extremităţile (−) ale microtubulilor sunt
132
orientate către MTOC. Centrozomul este format din doi centrioli,
înconjuraţi de un material
pericentriolar, cu aparenţă
amorfă, dar de fapt foarte
riguros organizat, care
conţine multe proteine
necesare iniţierii asamblării
microtubulilor, cum este γ-
tubulina. În timpul mitozei,
centrozomul suferă un proces
de duplicare şi migrează de o
parte şi de nucleului,
devenind centrul de
organizare al microtubulilor
care formează aparatul
mitotic (Fig. 5.22).

Fig. 5.22 – Organizarea


microtubulilor

5.6.1. Dinamica microtubulilor

Microtubulii pot oscila între creştere (asamblare) şi descreştere


(dezasamblare), manifestând o adevărată complexitate dinamică.
Asamblarea microtubulilor se produce prin polimerizarea dimerilor de
tubulină. Cinetica polimerizării tubulinei depinde de o serie de factori:
- temperatura: la 37°C, în prezenţa GTP, are loc polimerizarea, în
timp ce la 4°C se produce depolimerizarea în monomeri stabili
de tubulină;
- concentraţia critică (Cc): la concentraţii ale monomerilor
superioare Cc, are loc polimerizarea tubulinei, iar sub Cc începe
dezasamblarea microtubulilor;
- adiţia fragmentelor de microtubuli la un amestec de monomeri
de tubulină accelerează rata iniţială de polimerizare, oferind noi
situsuri de nucleaţie.
Atât asamblarea, cât şi dezasamblarea microtubulilor, se desfăşoară
preferenţial la extremitatea (+). Unele experimente realizate in vitro au
133
arătat că în cazul microtubulilor este valabil modelul de “bandă rulantă”, în
care monomerii se adaugă la o extremitate şi sunt eliberaţi la cealaltă.
Asamblarea microtubulilor implică trei etape:
- formarea protofilamentelor din subunităţile de tubulină;
- asocierea protofilamentelor şi constituirea peretelui
microtubulului;
- adiţia de subunităţi la extremităţile protofilamentelor şi elongaţia
microtubulilor (Fig. 5.23).

Fig. 2.23 – Sinteza microtubulilor

Anumite substanţe, printre care se numără colchicina, taxolul şi


vinblastina, toate de origine vegetală, influenţează dinamica microtubulilor.
Aceste substanţe se leagă exclusiv la microtubuli sau la monomerii de
tubulină, iar concentraţia lor în celule poate fi uşor controlată. Tubulina are
un situs de care colchicina se ataşează ireversibil. Prezenţa colchicinei (sau a
colcemidului înrudit) la extremităţile microtubulilor împiedică adiţia sau
pierderea altor subunităţi de tubulină, alterând astfel echilibrul între
asamblare şi dezasamblare. Ca urmare, are loc blocarea celulelor în
metafaza mitozei.
La concentraţii scăzute, taxolul (sau derivatul chimic taxotere) şi
vinblastina stabilizează microtubulii, inhibând dinamica acestora. Deoarece
blochează preferenţial formarea fusului de diviziune şi inhibă celulele cu o
134
rată crescută a diviziunii, cum sunt celulele canceroase, sunt utilizaţi în
terapia antitumorală. De exemplu, tratamentul cu taxol în cancerul ovarian
blochează mitoza, dar nu afectează alte funcţii ale microtubulilor.

5.6.2. Kinezina, dineina şi transportul intracelular

Kinezina este o proteină dimerică, format din două lanţuri grele,


fiecare fiind complexat cu câte un lanţ uşor. Molecula este organizată în trei
domenii: o pereche de capete globulare mari, conectate printr-un domeniu
central cu alte două capete globulare mici, care conţin lanţurile uşoare (Fig.
5.24).

Fig. 5.24 – Structura kinezinei

Fiecare domeniu îndeplineşte o anumită funcţie: capetele globulare


mari leagă microtubulii şi ATP-ul, fiind responsabile pentru activitatea
motorie a kinezinei, iar capetele globulare mici se ataşează de veziculele
membranare. Kinezina face parte din categoria proteinelor motorii. Ea
direcţionează deplasarea de-a lungul microtubulilor dinspre capătul (−) spre
(+). Această direcţie de mişcare corespunde transportului anterograd, aşa
cum este, de exemplu, transportul veziculelor secretorii către membrana
plasmatică sau al veziculelor sinaptice prin axoni (Fig. 5.25).

135
Fig. 5.25 – Transportul mediat de proteinele motorii, asociate
microtubulilor, la nivelul axonului

Dineina este o proteină multimerică, cu o masă moleculară de peste


1 000 000 daltoni. Este compusă din două sau trei lanţuri grele, la care se
adaugă un număr greu de determinat de lanţuri uşoare şi intermediare.
Dineina este tot o proteină motorie, care asigură deplasarea dinspre capătul
(+) al microtubulilor spre capătul (−), participând astfel la transportul
veziculelor de endocitoză de la membrana plasmatică către lizozomi sau la
transportul retrograd de la nivel axonal. Dineina este împărţită în două clase
funcţionale: dineina citosolică, implicată în transportul veziculelor şi
cromozomilor şi dineina axonemală, responsabilă pentru mişcarea cililor şi
flagelilor. Spre deosebire de kinezină, dineina nu poate media singură
transportul, fiind necesară prezenţa unui complex format din proteine de
ataşare la microtubuli. Un astfel de complex este reprezentat de dinactină,
care cuprinde cel puţin opt subunităţi, printre care proteina p150 – Glued,
proteina asociată actinei Arp1 şi dinamatina. Dinactina creşte motilitatea
dependentă de dineină, probabil prin interacţiunea cu microtubulii şi
veziculele (Fig. 5.26).
136
Fig. 5.26 – Dineina şi complexul de proteine ataşate microtubulilor
(După Hirokawa, 1998)

Transportul în celulă poate fi controlat prin intermediul proteinelor


motorii asociate microtubulilor. De asemenea, mişcarea veziculelor de
transport depinde şi de orientarea microtubulilor, care sunt fixaţi de către
MTOC. În anumite situaţii (granulele de pigment din celulele melanofore,
de exemplu), direcţia de deplasare de-a lungul unui singur microtubul poate
varia. În acest caz sunt active, alternativ, proteinele motorii de transport
anterograd, respectiv cele de transport retrograd (Fig. 5.27).

Fig. 5.27 – Transportul anterograd şi retrograd (După Hirokawa, 1998)

137
5.6.3. Microtubulii şi mitoza

În timpul mitozei se formează temporar o structură microtubulară


specializată, numită aparat mitotic. Acest aparat are rolul de a captura şi
alinia cromozomii şi, în final, de a-i separa, astfel încât fiecare celulă fiică
nou rezultată să primească o cantitate egală de material genetic.
În metafază, aparatul mitotic este organizat în două compartimente:
un mănunchi de microtubuli, care formează fusul de diviziune, împărţit în
zona centrală (ecuatorială) a celulei de către placa cromozomială metafazică
şi o pereche de asteri, reprezentaţi de câte o grupare de microtubuli în jurul
fiecăruia din cei doi poli ai fusului de diviziune.
În urma duplicării interfazice, în zonele polare se află câte un
centrozom, care organizează trei seturi distincte de microtubuli, orientaţi cu
extremităţile (−) către centrozom. Microtubulii astrali iradiază de la
centrozom către periferia celulei şi formează asterii. Microtubulii
kinetocorici se fixează de cromozomi la nivelul unor situsuri speciale,
numite kinetocori, situate de o parte şi de alta a centromerului cromozomial.
Microtubulii polari se întrepătrund în plan median cu microtubulii de la
polul opus, fără însă a intra în contact cu cromozomii. Interacţiunile laterale
între extremităţile (+) ale microtubulilor polari în zona de întrepătrundere,
precum şi fixarea cromozomilor de către microtubulii kinetocorici
contribuie la stabilizarea fusului de diviziune (Fig. 5.28).

Fig. 5.28 – Formarea fusului de diviziune în mitoză

138
Stabilitatea microtubulilor se modifică în timpul mitozei, fapt
observat încă din profază, când microtubulii interfazici lungi dispar, fiind
înlocuiţi cu microtubulii astrali şi cei ai fusului de diviziune. Noii
microtubuli sunt mai scurţi şi mai puţin stabili, durata lor medie de viaţă
scăzând de la 10 minute pentru microtubulii interfazici, la numai 30 de
secunde. Creşterea turn-over-ului tubulinei face posibilă asamblarea şi
dezintegrarea rapidă în timpul mitozei.
Dinamica microtubulilor kinetocorici la extremitatea (+) şi
intervenţia proteinelor motorii asociate contribuie la poziţionarea
cromozomilor în placa
ecuatorială metafazică, la
distanţe egale faţă de cei doi
poli. Ciclul celular intră în
anafază numai când toţi
kinetocorii sunt ataşaţi la
microtubulii kinetocorici
corespunzători. Deşi odată cu
realizarea plăcii metafazice
lungimea microtubulilor
kinetocorici şi polari pare a
se stabiliza, există totuşi un
flux continuu, corespunzător
modelului de bandă rulantă,
prin care pierderea de
subunităţi de la capătul (−)
este compensată de adiţia
monomerilor la capătul (+)
(Fig. 5.29).

Fig. 5.29 – Modelul de


“bandă rulantă” la nivelul
microtubulilor kinetocorici şi
polari

Anafaza este împărţită în două stadii distincte. Anafaza A (timpurie)


este caracterizată prin scurtarea microtubulilor kinetocorici, însoţită de
ruperea fiecărui cromozom în cele două cromatide şi tracţionarea acestora
către polii fusului de diviziune. În anafaza B (târzie) microtubulii polari
alunecă unul faţă de altul şi polii fusului de diviziune, împreună cu
cromatidele, se îndepărtează de planul ecuatorial al celulei (Fig. 5.30).
139
Fig. 5.30 – Îndepărtarea polilor fusului de diviziune prin polimerizarea
microtubulilor polari

Diviziunea citoplasmei (citokineza) este punctul final al mitozei. Se


presupune că microtubulii astrali trimit un semnal (probabil kinaza cdc2)
către zona mediană a cortexului celular. Semnalul iniţiază constituirea
inelului contractil de actină şi miozină, care separă cele două celule fiice
nou formate.

5.7. Filamentele intermediare

Filamentele intermediare se întâlnesc în aproape toate celulele


eucariote ale organismelor multicelulare. În celulele epidermale şi în axonii
neuronali, filamentele intermediare sunt de peste zece ori mai numeroase
decât microtubulii sau microfilamentele de actină. Filamentele intermediare
îndeplinesc rolul de suport mecanic al membranei plasmatice, atunci când
aceasta vine în contact cu alte celule sau cu matricea extracelulară. Spre
deosebire de celelalte componente ale citoscheletului, filamentele
intermediare nu participă la motilitatea celulară.

140
Diametrul filamentelor intermediare este de aproximativ 10 nm,
fiind situat între cel al microfilamentelor de actină (7 nm) şi diametrul
microtubulilor (24 nm). Filamentele intermediare sunt extrem de stabile,
structura lor rămânând intactă chiar după tratarea cu soluţii de detergenţi sau
cu soluţii saline.
Subunităţile proteice ale filamentelor intermediare au un model
structural asemănător: un domeniu central, dispus în α-helix, flancat de
două domenii globulare (N- şi C-terminal). Domeniul central, care este
acelaşi pentru toate clasele de filamente intermediare, constă din patru α-
helixuri, separate prin trei regiuni non-helicale, ale căror poziţii se conservă,
de asemenea, la toate tipurile de filamente intermediare. Segmentele dispuse
în α-helix se grupează câte două, formând un dimer. Asocierea laterală,
antiparalelă, a dimerilor constituie un tetramer, considerat unitatea de
asamblare a filamentelor intermediare. Prin legarea cap la cap a mai multor
tetrameri iau naştere protofilamentele de 2 – 3 nm diametru, care la rândul
lor se grupează în protofibrile. În final, patru protofibrile formează un singur
filament intermediar de 10 nm diametru (Fig. 5.31).

Fig. 5.31 – Asamblarea filamentelor intermediare

141
Domeniile globulare terminale diferă foarte mult ca greutate şi
secvenţă de la o clasă de filamente intermediare la alta, oferind astfel
specificitate funcţională. În plus, domeniul N-terminal are rol în asamblare,
în timp ce domeniul C-terminal menţine stabilitatea filamentului. Astfel,
domeniile globulare controlează interacţiunile laterale din interiorul unui
filament, ca şi interacţiunile cu alte componente celulare.
Până în prezent au fost identificate şase clase (tipuri) majore de
filamente intermediare, clasificate pe baza secvenţei de aminoacizi.
Clasele I şi II, cuprind keratinele acide, respectiv bazice. La rândul
lor, keratinele cuprind o serie de izoforme şi pot fi împărţite în două grupuri:
keratinele din compoziţia unghiilor şi părului formează un grup, în timp ce
altul este reprezentat de citokeratinele aflate în celulele epiteliale care
delimitează organele cavitare. În general, în structura unui anumit epiteliu se
regăseşte o combinaţie caracteristică de keratine de tip I şi II. Conexiunile
dintre filamentele intermediare şi joncţiunile celulare specializate, de tipul
desmozomilor şi hemidesmozomilor, oferă forţă şi consistenţă epiteliilor. În
lipsa suportului oferit de reţeaua de filamente intermediare, epiteliul rămâne
intact, dar celulele pot fi lezate uşor sub acţiunea unor factori variaţi.
Termenul de epidermoliză buloasă (EB) defineşte un grup de
afecţiuni genetice heterogene, a căror caracteristică principală constă în
formarea de vezicule în urma unor traumatisme minore sau la presiune. Unii
pacienţi cu epidermoliză buloasă au dificultăţi în realizarea unor activităţi
simple, în timp ce alţii sunt asimptomatici şi manifestă veziculaţii
ocazionale. EB simplă (EBS) este caracterizată prin formarea de vezicule
intraepidermale, încă de la naştere sau din primele luni de viaţă, ca rezultat
al frecării, al unor traume minore sau chiar în urma transpiraţiei, combinată
cu creşterea temperaturii corpului. Afecţiunea se transmite autozomal
dominant. Examinarea ultrastructurală a probelor recoltate prin biopsie din
zonele afectate evidenţiază separarea epidermului de derm datorită
fragilităţii celulelor bazale, cu apariţia unor clivări suprabazale. Această
fragilitate este datorată mutaţiilor genice ale keratinelor 5 şi 14, care sunt
filamente intermediare exprimate în citoscheletul keratinocitelor
suprabazale. În loc să formeze filamente subţiri, keratinele 5 şi 14 mutante
se agregă, cauzând clivări în keratinocite. Aceasta constituie etiologia
formării veziculelor în EBS. Pe lângă tratamentele clasice, care cuprind
măsuri de evitare a traumelor, suport nutriţional, controlul infecţiilor şi
aplicarea de corticosteroizi pentru reepitelizare, terapiile viitorului se axează
pe tehnici de înlocuire proteică şi/ sau terapie genică. Înlocuirea proteinelor
presupune sinteza unei proteine defective prin metode de recombinare şi
aplicarea locală în loţiuni sau crème. Terapia genică constă în administrarea
142
de keratinocite crescute în cultură sau celule stem direct la pacienţii cu
defect genic. Experimentele efectuate pe modele murine cu EBS oferă
speranţe pentru eventuala aplicare a acestor metode la pacienţii umani.
Din clasa a III-a fac parte vimentina, desmina, proteina glială
fibrilară acidă şi periferina.
Vimentina este cea mai răspândită dintre toate proteinele din
categoria filamentelor intermediare. Ea se găseşte la nivelul leucocitelor,
celulelor endoteliale din pereţii vaselor de sânge şi în fibroblaste. Vimentina
se organizează sub formă de reţele, care constituie un suport pentru
membranele celulare şi, de asemenea, menţin nucleul şi alte organite în
poziţii bine definite în citosol. Vimentina se asociază frecvent cu
microtubulii, reţelele de vimentină fiind paralele cu cele de microtubuli.
Vimentina (ca şi alte tipuri de filamente intermediare) poate fi
utilizată ca marker pentru localizarea tisulară a unui anumit tip de proces
tumoral malign. De exemplu, în cazul cancerului de sân sau de tract
gastrointestinal, se poate şti dacă procesul malign derivă din celulele
epiteliale (care conţin keratine, dar nu vimentină) sau din celulele
mezenchimale ale stromei subiacente (care conţin vimentină, dar nu
keratine). Deoarece cancerele epiteliale şi cele mezenchimale sunt sensibile
la terapii diferite, identificarea proteinelor caracteristice, din categoria
filamentelor intermediare, poate ajuta la stabilirea unui protocol corect de
tratament.
Desmina reprezintă o categorie de filamente intermediare specifică
fibrelor musculare, constituind astfel un marker timpuriu în dezvoltarea
musculaturii scheletice, netede şi cardiace. Filamentele intermediare de la
nivelul fibrelor musculare înconjură liniile Z şi conectează aparatul
contractil cu sarcolema şi nucleul. Studiile efectuate asupra celulelor stem
embrionare au demonstrat implicarea desminei în diferenţierea miogenică.
Absenţa desminei determină moarte celulară şi apariţia unor miopatii
scheletale şi cardiace, în special cardiomiopatie şi insuficienţă cardiacă.
Proteina glială fibrilară acidă (GFAP) este localizată exclusiv la
nivelul astrocitelor şi a celulelor cu origine astroglială de la nivelul
sistemului nervos central. Prezenţa GFAP este necesară pentru formarea
prelungirilor astrocitare stabile, esenţiale în organogeneza sistemului nervos
central. Subunităţile GFAP se pot co-asambla cu alte filamente
intermediare. Dincolo de importanţa sa în dezvoltarea sistemului nervos
central, GFAP este implicată şi în patologia anumitor afecţiuni
neurodegenerative, ca de exemplu boala Creutzfeldt Jakob. De asemenea,
GFAP este un marker pentru maladia Alzheimer, în care s-au identificat
plăci ce conţin peptide GFAP.
143
Periferina se găseşte la nivelul sistemului nervos periferic, dar
despre rolul său exact se cunosc relativ puţine informaţii.
În interiorul axonilor neuronali se află neurofilamentele (NF),
compuse din trei tipuri de polipeptide din clasa a IV-a, denumite, după
greutatea lor moleculară, NF uşoare (L), medii (M) şi grele (H). Spre
deosebire de microtubuli, care controlează elongaţia axonală,
neurofilamentele sunt responsabile pentru creşterea diametrului axonal, în
funcţie de viteza de conducere a impulsurilor nervoase. S-a demonstrat
faptul că anumiţi markeri ai bolii Parkinson, denumiţi corpusculi Lewy,
conţin proteine din categoria neurofilamentelor, dar nu se cunoaşte dacă
aceste proteine sunt o cauză sau o consecinţă a bolii. De asemenea, scleroza
laterală amiotrofică este asociată cu denaturarea oxidativă a
neurofilamentelor şi acumularea de agregate proteice.
Proteinele din clasa a V-a, numite lamine, sunt localizate exclusiv la
nivelul nucleului, unde formează o reţea fibroasă de suport, ataşată la
membrana nucleară internă.

5.8. Cilii şi flagelii

Denumirea de cili şi, respectiv, flageli desemnează de fapt o


structură identică, ce apare în secţiune transversală la microscopul electronic
ca fiind alcătuită dintr-un grup de microtubuli, numit axonemă, în care nouă
dublete externe de microtubuli înconjură o pereche centrală de microtubuli
individuali. Fiecare dublet conţine un microtubul complet, cu 13
protofilamente (tubul A) şi unul incomplet, cu 10 protofilamente (tubul B).
Axonema este înconjurată de membrana plasmatică.
Joncţiunile dintre tubulii A şi B ai dubletelor externe se realizează
prin intermediul braţelor externe şi interne ale dineinei. La aceste joncţiuni
contribuie, probabil, şi tectina, o proteină cu structură similară filamentelor
intermediare. Structura axonemei este menţinută cu participarea mai multor
tipuri de proteine de legătură. În primul rând, perechea centrală de
microtubuli este conectată prin intermediul unor punţi proteice cu o teacă
internă fibroasă care îi înconjură. O altă proteină, nexina, care face parte din
complexul reglator al dineinei, leagă două dublete adiacente. În plus,
perechea centrală de microtubuli este conectată prin intermediul unor spiţe
radiare cu fiecare tubul A din dubletele periferice (Fig. 5.32).

144
Fig. 5.32 – Structura cililor şi flagelilor

La punctul de contact cu celula, axonema se ataşează la corpusculul


bazal, o structură cilindrică ce conţine nouă triplete de microtubuli şi care
are un rol important în iniţierea creşterii axonemei.
Baza mişcării cililor şi flagelilor o constituie alunecarea una faţă de
alta a filamentelor proteice, reprezentate de dubletele de microtubuli, în
prezenţa ATP. Forţa care produce alunecarea este determinată de formarea
şi ruperea succesivă a punţilor dintre braţele dineinei şi tubulul B, datorită
legării şi, respectiv, hidrolizei ATP.
Cilii şi flagelii realizează în organism diferite tipuri de mişcare.
Astfel, celulele epiteliale care tapetează căile respiratorii superioare sunt
prevăzute cu un număr mare de cili (107/ mm2), care contribuie, prin
mişcarea lor, la îndepărtarea particulelor colectate în secreţiile de mucus. Un
alt exemplu este reprezentat de deplasarea spermatozoizilor, cu ajutorul
flagelilor.
145
Sindromul Kartagener sau sindromul cililor imobili este datorat unor
mutaţii genice, care fac imposibilă mişcarea cililor şi flagelilor. Ca rezultat,
spermatozoizii nu se pot deplasa şi apare sterilitatea masculină. De
asemenea, la indivizii afectaţi s-au constatat boli respiratorii cronice, ca
urmare a acumulării de mucus şi bacterii în căile aeriene superioare, de unde
nu pot fi eliminate, din cauza imobilităţii cililor. Tot la aceşti indivizi, s-a
remarcat prezenţa cu frecvenţă mare a fenomenului de situs inversus, care
constă în localizarea organelor interne în partea contra-laterală a corpului
faţă de normal, ceea ce ilustrează importanţa mişcărilor cililor şi flagelilor în
cursul dezvoltării embrionare.

146