Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

CULTURI DE CELULE

Culturile celulare (CC) sunt cele mai folosite sisteme de izolare a

virusurilor.

CC pot fi obtinute din tesuturi umane sau animale, din tesuri adulte sau
embrionare, din tesuturi normale sau tumorale. Biopsia tisulara se obtine in
conditii sterile.

Toate etapele pentru realizarea unei CC au loc in conditii sterile, lucrandu-se

la hota microbiologica. Fragmentul biopsiat este triturat, tratat cu tripsina
(proteaza ce desface legaturile intercelulare) si EDTA, cu rol de protectie pentru
membrana celulara. Suspensia obtinuta este filtrata pentru indepartarea resturilor
tisulare, apoi este centrifugata. Celulele vor sedimenta la baza tubului de
centrifuga. Aceste celule disociate pot fi folosite pentru realizarea culturilor
celulare.

Celulele sunt transferate pe placi speciale pentru CC sau in flacoane (flask-

uri) de diferite forme si dimensiuni. Pentru stimularea diviziunii celulare se adauga
un mediu nutritiv, care contine solutie salina tamponata, ser fetal de vitel (SFV)
pentru aport proteic si de factori de crestere, vitamine, antibiotic si antifungice
pentru a preveni suprainfectiile bacteriene , respectiv fungice. CC sunt tinute la
incubator , la 37 de grade Celsius si sunt verificate zilnic la microscopul optic cu
inversie (sursa de lumina este inversata cu obiectivul). Se urmareste formarea
monostratului celular, care acopera intreaga baza a placii/flaconului .

Dupa aparitia monostratului celular se poate realiza un pasaj celular

(subcultivare), care reprezinta trecerea de la o cultura la urmatoarea cultura. Pentru
realizarea pasajului se arunca mediul nutritiv al culturii , se spala cultura cu solutie
tampon, se adauga tripsina si EDTA, pentru a obtine celule disociate care pot fi
folosite pentru urmatoarele doua culturi celulare.

Aspectul CC difera in functie de celulele din care provin:

Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

- normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică până

acoperă peretele flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul inhibiţiei de
contact);

- tumorale: se multiplică şi după acoperirea suprafeţei disponibile, cresc în

mai multe straturi şi în suspensie.

In functie de tesuturile din care provin, exista mai multe tipuri morfologice
de CC :

- CC epiteliale;

- CC de tip fibroblastic;

- CC de tip neuronal;

- CC endoteliale.

Clasificarea culturilor celulare :

1. Culturi de oragan – fragmente de organ mentinute in vitro in vederea

pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor diferentiate ( de ex. culturi de
trahee care sunt necesare izolarii rhinovirusurilor);

2. Culturi de celule dispersate, care se clasifica dupa timpul de

supravietuire in vitro in :

a) Culturi primare (mentin caracteristicile organului din care provin, dar

achizitioneaza si proprietati de suprafata noi, care le fac susceptibile la infectii
virale; pot fi mentinute in vitro timp limitat : 3-5 pasaje);

b) Tulpini celulare (au durata de viata limitata la 50-60 de pasaje; au

cariotip diploid; sunt folosite pentru prepararea vaccinurilor virale si pentru
diagnosticul virusologic);

c) Linii celulare ( pot avea un numar nelimitat de pasaje; au cariotip

heteroploid, de aceea nu sunt folosite pentru preparearea vaccinurilor virale vii;
sunt folosite pentru diagnosticul virusologic; sunt cunoscute sute de linii celulare ,
de ex. Vero, LLC-MK2- derivate din rinichi de maimuta, HeLa- derivate din
carcinom de col uterin etc.).
Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

Celulele transformate sunt linii celulare ce au suferit o modificare stabila,

spontana sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare
care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro sau transplant in vivo.
Caracteristicile lor sunt :

1. conţin gene implicate în imortalizarea în vitro (cultivare nr. infinit

pasaje) modificari cromozomiale => cariotip aneuploid;

2. se multiplică haotic, cerinţe nutritive foarte scăzute (se multiplică

la concentraţii foarte scăzute de SFV), glicoliza anaerobă = sursa principala de
energie.

3. membrană celulară modificată în compoziţie (absenţa

fibronectinei => scaderea adeziunii intercelulare

4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de ţesutul

din care derivă

5. au telomeraza activa; inoculate la animale => TUMORI

6. modificarea morfologiei (rotunde, refrigente)

7. au antigene de suprafaţă diferite de N codif. de virus /celule

gazda=> neoantigene

8. aglutinează uşor cu lectinele (antigene vegetale)

9. modificarea mesageri secunzi (AMPc)

IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE

In CC replicarea virala este recunoscuta datorita efectului citopatic (ECP).

Tipuri de efecte citopatice :

1. Sincitial (caracteristic virusurilor anvelopate, care parasesc celulele

infectate prin inmugurire, se leaga de receptorii celulelor invecinate, exprima
factorul de fuziune si se internalizeaza; se formeaza astfel o masa celulara giganta
multinucleata- sincitiu) (de ex. v. rujeolos, v. sincitial respirator, HIV)
Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

2. Incluzionar (incluziile reprezinta proteine virale timpurii, care se

formeaza in faza de crestere logaritmica a ciclului replicativ viral; ele pot fi
localizate intranuclear, de ex. adenovirusurile, papovavirusurile,
intracitoplasmatic, de ex. v. rabic sau mixt (intracitoplasmatic si intranuclear , de
ex. v. herpetice si v. rujeolos)

3. Picnotic (caracteristic virusurilor neanvelopate, care parasesc celula

infectata prin liza, in faza de platou a ciclului replicativ viral; de ex.
enterovirusurile).

Exista cateva ECP patognomonice : corpii Babes-Negri incluzii

intracitoplasmatice acidofile produse de v. rabic; incluzii intranucleare “in ochi de
bufnita” caracteristice infectiei cu citomegalovirus (CMV).