Les Marqueurs

moléculaires

Les Marqueurs moléculaires et techniques de mise en évidence

Un marqueur moléculaire sert à décrire/caractériser un sujet parmi plusieurs d’autres dans une
population (animaux, plantes, micro-organismes).
Le terme moléculaire s’applique à l’ADN (au génome).Ainsi un marqueur moléculaire
correspond à une petite séquence d’ADN qui permet de caractériser/différencier l’individu qui
la contient par rapport aux autres individus. Ce sont des fragments d’ADN, correspondant à des
locus, pour lesquels il existe dans le génome, d’une espèce, plusieurs formes, plusieurs allèles
: c’est le polymorphisme.
D’autre part, si la mutation est provoquée sur un endroit au niveau de l’ADN génomique
correspondant à une partie codante d’un gène, on aura comme conséquence :

 Soit un polymorphisme lié au phénotype si la mutation est sans effet néfaste

(Marqueurs moléculaires de séquences exprimées).
 Ou un polymorphisme moléculaire associé à des pathologies si la mutation en
question est à l’origine de disfonctionnement de la protéine codée par le gène muté. Ces
séquences font apparaitre des marqueurs moléculaires de maladies génétiques chez les
animaux et chez les plantes ce marqueur fait apparaitre le caractère de sensibilité vis-à-
vis de phyto-pathogènes (champignon, bactérie et virus).

Les différents types de polymorphismes

1. Polymorphisme de répétition du motif de l’ADN répétitif : ce type de polymorphisme repose
sur la variation entre allèles par le nombre de répétitions des motifs de séquences minisatellite
(VNTR) ou microsatellite (STR).
2. Polymorphisme de séquence : ces marqueurs sont dus à des mutations ponctuelles spontanées
(inversion, transvertion, insertion et délétion). Parmi les variations de séquences entre individus,
l'identification d'une mutation ponctuelle (SNP, single-Nucleotide Polymorphism) est une
information utile dans de nombreux domaines et plus particulièrement comme marqueur de
maladie génétique.

Si la mutation est située sur un site de restriction, on utilise sauvant les enzymes de restrictions
pour révéler ce polymorphisme appeler aussi Polymorphisme de longueur des fragments de
restriction (RFLP). Selon la démarche optée pour la mise en évidence de ce plymorphisme,
on peut utiliser la technique de southerne blot ou la PCR:

2.1 SNP (RFLP) révélé par southern blot et enzyme de restriction: dans ce type de marqueur,
la mutation est provoquée sur un site de restriction d’une enzyme de restriction quelconque. La
mise en œuvre de cette technique commence par la digestion et la séparation sur un gel
d’électrophorèse en fonction de la taille des fragments de restriction. Apres séparation, les
fragments sont transférés sur une membrane de nylon et révélés par une sonde (Southern blot).
Comme conséquence de la présence de la mutation, on aura des profils des fragments de
longueur obtenus après digestion de l’ADN génomique par l’enzyme de restriction. Leur

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révélation se fait grâce à une sonde radioactive spécifique à la région qui est susceptible porter
le SNP.

2.2 La technique A F L P (Vos et al ., 1995).

Elle est fondée sur la mise en évidence conjointe de
polymorphisme de sites de restriction et d’hybridation d’amorces arbitraires. Cette technique utilise à la
fois les enzymes de restriction et l’amplification PCR. L’ADN génomique est clivé par deux enzymes
de restriction. Des adaptateurs de séquences connues et spécifiques des enzymes de restriction utilisées
sont ajoutés aux extrémités des fragments de restriction générant ainsi une matrice pour l’amplification.
Une première amplification, dite pré-amplification, est réalisée à l’aide d’amorces de séquences
complémentaires à la séquence des adaptateurs et des sites de restriction. La deuxième amplification,

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dite sélective, utilise des amorces identiques aux premières mais prolongées à l’extrémité 3’ de quelques
nucléotides arbitraires (de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont amplifiés les fragments possédant les
bases complémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorces sélectives permettent de réduire le
nombre de fragments amplifiés à une centaine. Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel
d’acrylamide dénaturant puis visualisés par coloration au nitrate d’argent ou révélés grâce à un marquage
radioactif ou fluorescent réalisé lors de l’amplification sélective. C’est la combinaison enzyme de
restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme entre les individus et constitue donc le
marqueur AFLP. Cette technique est puissante, stable et rapide. En outre, l’AFLP ne nécessite aucune
connaissance préalable de séquences du génome de la plante étudiée.