UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

"OBTENCION D E P R O T O N * ÜN1CECOÜAR DE
SaccKaromyce* «aguí* CRECIDA E N E T A N O U COMO
PRINCIPAL FUENTE DE CARBONO Y ENERGIA"

^ TESIS I
COMO REQUISITO PARA OBTENER
EL' GRADO DE
MAESTRIA EN CIENCIAS

PECIALIDAD MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL)

PRESENTA
Q.BP. LUIS J. GALAN WONG
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 OBTENCION DE PROTEINA UNICELULAR DE

Saccharomyees exiguus

CRECIDA EN ETANOL COMO PRINCIPAL FUENTE DE CARBONO Y ENERGIA.

 UNIVERSIDAD A U T O N O M A D E NUEVO LEON
FACULTAD DE C I E N C I A S Q U I M I C A S

"OBTENCION D E PROTEINA U N I C E L U L A R D E saccharomces FXIGUUS

CRECIDA EN E T A N O L COMO P R I N C I P A L FUENTE DE CARBONO Y ENER

GI A".

T E S I S QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO D E

M A E S T R I A EN CIENCIAS (ESPECIALIDAD M I C R O B I O L O G I A -
INDUSTRIAL).

PRESENTA: Q.B.P. LUIS J. GALAN WONG.

JUNIO 1981.

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y. I "tr.tr ItOTECA DR.^ÍÜSE W. BUSTOS ALDAMA
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OBTENCION DE PROTEINA UNICELULAR DE Saaaharomyces exiguue

CRECIDA EN ETANOL COMO PRINCIPAL FUENTE DE CARBONO Y ENER

-GIA.

I N D I C E : P A G I N A :

Agradecimientos 01

Introducción 02

Antecedentes 04

A. Levadura como fuente de proteí-

na unicelular 04

B. Otros microorganismos como fuen

te de proteína unicelular 09

C. Sustratos usados para producir

proteína unicelular 10

D. Metanol y etanol como sustratos

para producir proteína unicelu-
lar 11

E. Procesos industriales en los -

cuales interviene Saocharomyaes
exiguue 18

Materiales y métodos 21

Resultados 29

Discusión 37

Resumen 41
 D E D I C A T O R I A :

A MI FAMILIA:

Padre - JOSE LUIS GALAN MUZQUIZ.

Madre - LUCILA WONG DE GALAN.

Esposa - ELVA NELLY FRANCO

Hijos - JOSE LUIS

NELLY MARIA

LUCILA ADRIANA. •
A G R A D E C I M I E N T O S

COMITE DICTAMINADOR DE TESIS:

DR. JORGE VALENZUELA PEREZ

Por su Asesoría prestada durante este
trabajo.

DR. MANUEL RODRIGUEZ QUINTANILLA

DR. JOSE W. BUSTOS A.
Por su revisión y comentarios del pr£
sente trabajo.

SRITA. BERTHA SALCIDO RAMIREZ

Secretaria del Centro de Investigaciones
Biológicas por la transcripción m e c a n o —
gráfica de esta tesis.
 I N T R O D U C C I O N

Actualmente la falta de proteína animal y vegetal

es problema mundial, una alternativa es usar microorganismos

como fuente de ésta.

Los microorganismos poseen una serie de propieda-

des tales como: Alto contenido en proteínas y valor nutricio

nal, tiempos de duplicación cortos, diversidad en rutas meta

bolicas, adaptabilidad para crecer en diversos sustratos y -

producción bajo condiciones totalmente controladas (no suje-

ta cambios climatológicos), haciéndolos por tanto, sumamente

atractivos para usarlos como fuente de proteína.

Nuestro país cuenta con una industria petroquími-

ca en aumento, de la cual se obtienen diversos productos pa-

ra consumo interno y exportación. Entre éstos últimos: amoní^

acó, polietileno, polovinilo, metanol, y está en posibilida-

des futuras de obtener etanol sintético.

Hoy en día, entre los microorganismos estudiados

en procesos de obtención de proteína unicelular a partir de

etanol, están: C. utilis (32), C. ingened (36,37), C.

etartothermophilum (44), Rodotorula graoilis (31), Hansenula

anómala (72), Acinetobaotev oalaoaoetiaus (42, 42).

 Por otra parte, tratar de investigar la p o s i b l l i —

dad de usar otros microorganismos además de los ya conocidos

requiere de integrar diversos conocimientos, así como bastan

tes años de estudio experimental. Entre los objetivos princi

pales de este trabajo están:

lo. Obtener proteína unicelular de Saocharomy—

oes exiguus crecida en etanol como principal

fuente de carbono y energía.

2o. Determinar la influencia de tres factores -

de enriquecimiento: agua de cocimiento de -

levadura (ACL), extracto de levadura y l í —

quido de remojo de maíz (LRM), sobre el ere

cimiento de Sacoha*omyees exiguus en medios

de cultivo con etanol como principal fuente

de carbono.

3o. Conocer la composición química proximal de

Xa biomasa anteriormente obtenida y cuanti-

ficada de aminoácidos de la proteína de

Saocharomyces exiguus crecida en etanol con

tres factores de enriquecimiento respectiva

mente.
 A N T E C E D E N T E S

A.- LEVADURAS COMO PUENTE DE PROTEINA UNICELULAR.

Actualmente las levaduras son usadas en diversos

procesos Industriales obteniéndose de éstos productos tales

como: Enfcimas, coenzimas, cerveza, vinos, pulque, bebidas -

destiladas (ron, brandy, etc.), productos farmacéuticos (í*i

boflavina) y como alimento para consumo humano y animal, y

otros más. (23,46,54,65)

Entre los productos hoy en día con potencialidad

industrial, se destaca obtener levaduras para consumo huma-

no y animal (9, 50).Las cuales reúnan características favo-

rables como fuente de alimentoJ durante la segunda guerra -

mundial 16,000 toneladas de Candida utilis fueron c o n s u m í —

é
das por alemanes (7). Por otra parte, resulta barato o b t e —

ner proteína unicelular comparada contra otros tipos de pro

teínas: res, cerdo, albúmina de huevo, etc. señalando un —

contenido en aminoácidos favorable o igual a los anteriores

pero deficiente en algunos aminoácidos escenciales (11): —

dos factores tienden a incrementar el uso de microorganis—

mos para producir de ellos, alimentos a humanos y animales:

Primero, la posibilidad de usar materiales de deshecho, y -

segundo, el desarrollo técnico en cultivo continuo de micro

organismos, lo cual quizá afecte profundamente la economía

del proceso (8, 16). Por otro lado, las levaduras reúnen —
una gran parte de propiedades deseables para que un microor

ganismo pueda ser utilizado para producir proteína de o r i -

gen unicelular (SCP), en base a su composición: no tóxica,

alta digestibilidad» elevado contenido en proteínas, grasas,

carbohidratos y buen sabor (17). Las levaduras comparadas -

con bacterias tienen como ventajas: tamaño grande (fácil de

separarlas de los caldos de fermentación, bajo contenido en

ácidos nucleicos, larga historia de ser usadas como alimen-

to, alto contenido en U s i n a y habilidad de crecer a pH ba-

jos; como desventajas tiene: baja velocidad de crecimiento,

bajo contenido de proteínas ( M , 66) y más bajo contenido -

en metionina que las bacterias para procesos de proteína —

unicelular (41).

Estudios de digestibilidad con ratas, muestra —

que proteínas substituidas de carne por levaduras de cerve-

cería son altamente digestibles, siendo éstas 92$ c o m p a r a —

bles con las de huevo completo que resultó 95.5% y que cuan

do la primera se le adiciona lí de metionina, fué igual a -

esta última (15). También al evaluar proteína unicelular -

en dieta para cerdos encontró que ésta es altamente digesti

ble..

Actualmente es bien conocido que el hombre care-

ce de la URICASA, enzima que desdobla el ácido úrico, sien-

do este ácido acumulado a partir de las bases puricas de —

los ácidos nucleicos; por otra parte, el grupo Protein Calo-

rie Advisor y de la United Nation System (PAG) recomienda un

máximo de 4 g. de ácidos nucléicos al día por 100 g. de pro-

teínas y 2 g. por día representa un límite práctico de se—

gunda en la población adulta. Una alternativa es usar méto-

dos para reducir los ácidos nucléicos si va a consumo humano

(69, 73). Geotrichum oandidum es muy prometedora para produ-

cir proteínas para animales, conteniendo 32.0 g. de proteína

cruda, 12.7 g. de extracto etéreo y 37.2 g. de carbohidratos

totales por 100 g. de peso seco, todos los aminoácidos

escenciales fueron detectados. Entre las plantas que se r e —

portan hoy en día produciendo biomasa a partir de etanol es-

tán representadas en el Cuadro I. Las levaduras reportadas -

como candidatos para producir biomasa a partir de etanol, —

ver el Cuadro II.

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B.- OTROS MICROORGANISMOS COMO PUENTE DE PROTEINA —
UNICELULAR.

Otros microorganismos para producir proteí^

na unicelular a partir de diversos sustratos destacan bacte

rias y algas.

Productos de oxidación de carbón vegetal han sido

utilizados para producir proteína unicelular, entre ellos:

ácido acético (3*0» fórmico, pirocatéico y otros más, usan

do diversos microorganismos tales como: Enterobacter eloa--

aae, Baoillus megatevium, B. oereus y Pseudomonas putida, —

Pseudomonas indoloxidane, encontrando un máximo de biomasa

seca de 3.5 g/1. al usar E. oloaoae (49).

En el cuadro II se muestran aquellas bacterias -

reportadas como candidatos para producir biomasa a partir -

de etanol. Las bacterias fotosintéticas son básicamente

anaerobicas requiriendo también la presencia de luz para —

crecer, sin embargo, bajo ciertas condiciones ambientales -

de cultivo varias especies de bacterias fotosintéticas cre-

cen aeróbicamente, particularmente Rhodopseudomonas y

Rhodospirillum que son aeróbicas facultativas y crecen en -

presencia de oxígeno, pudiéndose usar para producir proteí-

na unicelular (60). Estudios comparativos de tres especies

de levaduras y Chlorella, informan que Chlorella pyrenoido-

8a parece ser una magnífica fuente de proteína y a m i n o á c i —

dos es enciales (58).

C.- SUSTRATOS USADOS PARA PRODUCIR PROTEINA UNICELU-
LAR Y ASPECTOS ECONOMICOS.

Entre los diversos sustratos reportados para pro

ducir proteína unicelular» están los hidrocarburos, - - - -

proceso que no ha sido permitido en Japón (por fuerte oposi

ción de grupos minoritarios de consumidores de levaduras -

derivadas a partir de hidrocarburos) obligándolos a e x p o r —

tar su tecnología a otros países (78). Además de éstos, es-

tán: celulosa, etanol, metanol, ácido acético, isopropanol,

metano, subproductos agrícolas, almidón de vegetales (sorgo,

yuca) y otros más (20, 43).

El hacer proteína de origen unicelular (SCP) ec£

nómica deberá tomar en cuenta tres criterios básicos:

a) Buscar sustratos baratos para el crecimiento de

los microorganismos.

b) Buscar el microorganismo capaz de utilizar el -

sustrato.

c) Solución de problemas de ingeniería encontrados

en la comercialización del producto (74).

En términos económicos, la selección de un pro-

ceso de SCP depende de la localización y utilización del -

sustrato.

Lo más significativo en el costo, para la p r o —

ducción de la proteína, es el sustrato (43-77$ del proceso)

concluyendo que el metanol y el etanol serán sustratos de -

fuerte elección a un futuro sobre otros (40).

Un fuerte incentivo económico es emplear microor

ganismos con bajos coeficientes de mantenimiento (m). Para

procesos de biomasa, el impacto de la (m) es mínimo sobre

el Y «x/s cuando el microorganismo exhibe bajo (m). Si exhi-

be un rápido descenso sobre el Y x/s. No debe seleccionarse

el sustrato para producir biomasa en base solamente al

Y x/s, sino en base al precio en sustrato a largo tiempo y

disponibilidad, sustratos de cero costo obviamente son una

ventaja, pero no se dispone de ellos en grandes cantidades

en una localidad para suplir una planta de producción gran-

de, si la disponibilidad no es un problema, Se requiere al-

gún tipo de pretratamiento (ejemplo: hidrólisis de celulosa)

ó postratamiento (remoción de aceites residuales), causando

ésto un costo adicional (1).

D.- METANOL Y ETANOL COMO SUSTRATOS PARA PRODUCIR —

PROTEINA UNICELULAR.

Asthana, 1971. Aisla de suelo cuatro diferentes

actinomicetos y dos especies de levadura en cultivos de en-

riquecimiento que utilizan metanol como única fuente de car

bono usando Torupoais glabrata en matraces agitados, deter-

mina que el extracto de levadura es un factor que se requie

re para crecer, posteriormente en fermentadores de un litro

determina que a una temperatura de 30° C., un tiempo de ge-

neraclón mínimo de 8 horas y no crece a pH abajo de 2 y su-

perior a 9 (3).

Entre los géneros de levaduras que usan metanol

como principal fuente de carbono, están: Kloecheva, Torulo]¿

qí8j Candida, Píahia, Hansenula y 35 diferentes cepas de —

Candida boidinii y Piaohia pinus (13, 70) así como bacte

rias (55).

Trabajando con Tovutopsie mathanosorbosa, una —

nueva especie no reportada en el Manual de Lodder y usando

0.25% de líquido de remojo de maíz como sustituto de una —

mezcla de vitamina, se reporta para esta levadura un tiempo

de duplicación de 4 horas (79).

Entre las ventajas del metanol está el bajo cos-

to, disponibilidad, alta pureza y uso restringido por pocos

microorganismos, lo cual minimiza problemas de contamina

ción, fácil manejo y almacén, baja demanda de oxígeno y ca-

lor (10). Además puede ser producido de un amplio rango de

sustancias, hidrocarburos, carbón vegetal ó nafta y gas na-

tural (33).

Las levaduras asimilantes de metanol son incapa-

ces de crecer en otros compuestos con carbono (C.), metano,

metilamina, formaldehido y formato, indicando que la utili-

zación de compuestos C., no está ampliamente dispersa en le;

vaduras y muchos organismos procariotes (13).

 Entre las bacterias que utilizan metanol resal-

tan: Pseudomonas extoquenes, Ps. rosea MO-1, Pe. methylo--

tropha MP-4, Ps. metanolica, Methytomonas mefhanoliaa. Pa-

ra Ps. methanoliaa reporta en cultivo "Batch" un Y x/s de

0.40 y máximo de 49 hrs. - 1 (22). La alcohol-oxidasa de-

pendiente de FAD y catalasa con enzimas inducibles en Can-

dida boidiniiy creciendo en metanol y que están l o c a l i z a —

das en unos microcuerpos intracelulares denominados peroxi_

somas los cuales actúan en secuencia ( 5 6 ) . Por otra parte,

pollos de engorda alimentados con 15% de SCP derivada de -

metanol, fué usada en dietas normales encuentran limitan—

tes en aminoácidos azufrados, debiendo considerar en según

do término a la arginina para aves de engorda (38, 76).

Metanol y etanol producidos por oxidación cata-

lítica de correspondientes hidrocarburos han sido utiliza-

dos como fuente de carbono por levaduras y bacterias para

producir alimentos, debido a que los alcoholes son altamen

te puros, completamente solubles en agua, requieren poco -

oxígeno y generan menos calor que los hidrocarburos; en el

futuro estos sustratos deberán ser tomados como muy prome-

tedores (29).

El etanol y metanol como sustratos para p r o d u —

cir SCP presentan desventajas en costo y disponibilidad, -

entre algunas de sus desventajas se señala la disponibili-

dad y costo de etanol y metanol como sustratos para produ-

cir biomasa (SCP). Otras objeciones incluyen la pared celu

lar, el alto contenido de ácidos nucleicos y el carecer de

textura para nutrición humana; otro problema es la sucepti

bilidad de algunos individuos a altos porcentajes de pro-

teína de levadura en la dieta, lo cual provoca trastornos

gastrointestinales (29).

Hernández y Johnson, 1967 (25). Trabajando con

Candida utilie en medios de cultivo limitantes con etanol

(0.02 M), como fuente de carbono y teniendo el primero ex-

tracto de levadura 0.5 g/lto. y el segundo adicionado de -

aminoácidos, encuentra en el primero un Y x/s de 0.68 y un

mayor g. peso seco/lto. En este último, de 1.35.J 0.62 en -

el primero y menor tiempo de generación en el segundo, 1.8

horas y 3.5 horas en el primero (26).

Fracciones de "gas oil" no alcanos han sido con

siderados como sustratos para producir biomasa (78). Estos

materiales no son, sin embargo, adecuados para el propósi-

to de producir ácidos grasos típicos. Desde este punto de

vista, el etanol sintético es una excelente fuente de car-

bono, siendo un problema la volatilidad y toxicidad del —

sustrato. Krumpnanzl et. al. 1973 (31). Trabajando con

Rhodotorula graoilia crecida en etanol sintético y fermen-

tación de n-alkanos, menciona que esta levadura se inhibe

a un 2 - 2.5% (v/v) y a 7.5% (v/v) para su crecimiento, es

tableciendo que la pérdida del etanol por la salida de ga-

ses va a depender de: a) Aereación, b) Temperatura, c) Can-

tidad de etanol y se hace necesario mantener un rango de —

0.1 - 0.355 (v/v) como su óptimo no debiendo exceder de 2% -

(v/v). No se han encontrado diferencias en la producción de

biomasa, ni diferencias significativas en los aminoácidos -

de la proteína cuando se usó etanol de fermentación y sint£

tico trabajando en semicontínuo (31).

Las características nutritivas de Hansenula ano-

mala crecida en etanol de síntesis son: Contenido proteico

del 51.2%, espectro de aminoácidos satisfactorio aunque pre

sentando deficiencias en aminoácidos azufrados de tipo me—

tionina y cistina pero con un contenido en lisina, su- -•rior

a otras levaduras crecidas en hidrocarburos (72).

La riboflavina estimula el consumo de etanol y -

la producción de L-malato en Sehizopyllum oommune. Reportes

anteriores mencionan que esta cepa asimila etanol y produce

cantidades considerables de L-malato con altos rendimientos

0.6 g., L-malato/100 mi. de medio de cultivo a partir de —

etanol (68).

En cultivo "batch" con Candida ingenes y usando

etanol como única fuente de carbono y energía, se obtienen

•t
un Y x/s de 0.53 y un td 4 horas 0.17 hrs. -1 en condicio-

nes de 30° C. 700 r.p.m, I W M y etanol 1% añadido a d i v e r —

sos intervalos de tiempo logrando hasta 26 g. lto. de biorrta

sa (36).
 1G

Entre los primeros microorganismos que se usaron

en este tipo de procesos está Candida utilis A 49* crecida

en etanol sintético como única fuente de carbono y energía,

pasta de levadura como factor de crecimiento y sales inorgá

nicas.Se produce proteína unicelular en fermentadores de 15

lts. obteniendo alrededor de 10 g. de levadura por litro —

(32).

El rendimiento de SaaQharomyc&e o&revisiae ——

desarrollada en un medio con etanol como factor limitante -

de crecimiento y sales minerales, es función de dos facto—

res: pH y temperatura. Se ha encontrado un rendimiento al'1

mo de 0.635 a un pH 4.1 y una temperatura de 28.3° C. (18),

Usando Myeoderma en condiciones de cultivo contí

nuo en medios conteniendo 5% de etanol se determina un coe-

ficiente de utilización del etanol de 58 al 59$ y se repor-

ta que el contenido de la proteína de la biomasa es igual -

en valor nutritivo a Xa caseína, concluyendo que ei etanol

es una excelente materia prima para ser usada en nutrición

animal.

El etanol puede ser utilizado por muchas "bacte—

rias y levaduras como fuente de carbono y energía y ésto a

la vez resulta en una desventaja, ya que determina una

gran facilidad para que los medios de -cultivo puedan conta-

minarse, Por otra parte el <Jap6n desarrollado .proceros

con Candida» desarrollada a altas temperaturas y bajos va-

lores de pH, reduciendo así los problemas de- contaminación.

En Madrid España, se tiene programada una p l a n t a para pro-

ducir 100 Kg/día de Banaenula anómala crecida e n etanol y

entre sus planes -está el producir 100,000 t o n e l a d a s por —

año (43).

Factores como pH, temperatura* agitación y reci

cío de nutrientes, afectan el costo de operación, bajos pH

2.5 - 4.0, minimiza problemas de contaminación en sistemas

no estériles y altas temperaturas 35 - 45° C. , disminuye -

los problemas de enfriamiento. Por otra parte, menciona --

un proceso de obtención con Candida ethanothermcphi.lum pa-

w
ra obtener SCP a partir de etanol en cultivo b a t c h " usan-

do fermentadores de 30 litros conteniendo 17 litros de m e -

dio a 40° (Í.T., aereación I W M , pH 3.5 con la cual se ob—

tiene una p» hrs. -1, Y x/s- 0.84 (44).

En el presente, la capacidad mundial de produc-d

ción de etanol sintético es de alrededor de dos millones -

de toneladas por año del total: 1.15 E.U.A., Europa 0.65 y

O;13 la República Popular de China y Corea (14). El prime-

ro cambió' su tecnología de producir etanol de melaza por -

procesos sintéticos desde 1950 (51) (52).

Entre los requerimientos del producto final se

incluyen: 1) Polvo seco soluble, 2) No color y olor,

3) Baja cuenta viable, 4) No microbios patógenos, 5) Alto -

valor biológico, 6) Bajo RNA y otros factores tóxicos, 7 ) -

Buena funcionalidad. (69)

E.- PROCESOS INDUSTRIALES EN LOS CUALES INTERVIENE -

Saeeharomyces exiguus.

Entre las levaduras responsables del levantaraien

to de masas agrias de panadería, está Saccharomyces exiguus*

preferida mejor que Saeeharomyces eerevisiae debido a tres

propiedades entre las que está crecer mejor que la segunda

en ácido acético (66).

Por otra parte, se encontró que para esponjar ma

sas agrias Saooharomyoes exiguus es eficaz debido a: - - —

1) Que tolera mayor cantidad de ácido, 2) Es resistente a -

la cicloheximdda, 3) Es incapaz de utilizar maltosa y entre

los requerimientos nutricionales de Saeeharomyees exiguus -

está la metionina y requiere ácido pantoténico y parcialmen

te biotina, además requiere niacina y tiamina, concluyendo

que solo la tiamina incrementa los rendimientos celulares -

arriba de 400 g/ml. De ésta ya no aumenta el crecimiento de

Saccharomyces exiguus y no requiere huellas de metales y so

lo lo afecta el manganeso (24). Sustituyendo todo esto por

extracto de levadura fresca preparada de acuerdo a Kline, -

encuentra que ésta proporciona los factores nutricionales -

necesarios (30, 66).

 Los vinos de palma son conocidos en muchas áreas

del mundo, conteniendo un promedio aproximado de 4-5* de -

etanol y un pH de 3-4. Se lian aislado repetidas veces ce-

pas de Saooharomycea exiguue como levadura que interviene

en este tipo de producto sobre todo en vinos de palma de Ni

geria (46, 47).

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 MATERIAL Y METODOS

I.- LEVADURA USADA.

Actualmente es bien conocida que un precursor in-

termediario importante que se forma al crecer un microorga-

nismo en etanol como principal fuente de carbono, es el áci

do acético que posteriormente es rápidamente metabolizado -

para obtener energía (42); por tal motivo, en el presente -

trabajo se utilizó un microorganismo con buenos anteceden-

tes para crecer en medios con ácido acético, que fué Saccha

romyoee exiguus (66), cepa aislada por Jorge Saldaña, Facul-

tad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma do

Nuevo León, quien la obtuvo de una muestra de agua miel y -

la identificó por los Métodos de Lodder (44, 45).

II.- MANTENIMIENTO DE LA CEPA.

Se efectuó por el método de resiembras periódicas

en medios conteniendo agar de Saboraud glucosa 2% (Merck),

pH 5 y por el método de liofilización; éste último se efec-

tuó sembrando la cepa en agar Saboraud glucosa 2$, incubán-

dolas a 30° C., por 48 horas. Posteriormente se suspendie—

ron en leche desnatada al 10$ estéril y transfiriendo 0.1 -

mi. ascepticamente a ámpulas de liofilización estéril las -

cuales se conectaron a un equipo de liofilizar Lab Con —

Con - 1 y semantuvieron 8 horas a -20° C., y un vacío de 150

mieras Thor. Una vez secas se sellaron al vacío y se compro

bó éste por medio de un detector luminoso en cada ámpula. -

Se almacenaron a temperatura de refrigeración (26),

III.- MEDIOS DE CULTIVO.

El etanol fué proporcionado por el Ingenio Azuca-

rero de El Mante, Tamaulipas, destilado en columnas. Tenía

una pureza aproximada de 95$ (v/v). El alcohol fué adiciona

do a un medio de cultivo de sales minerales conteniendo: —

NHf|CI 5.0 KH2PO4 5.0 MgSOij . 7H 2 0 2.5, CaCl2 1.6 g/lto

mas "factor de enriquecimiento". De éstos, el L.R.M. fué —

proporcionado por Productos de Maíz, Guadalajara. El A.C.L.

se preparó (21) y Extracto de Levadura (Merck) (28, 71).

IV.- CONDICIONES EXPERIMENTALES DE FERMENTACION.

Los experimentos a escala de matraz fueron extra-

polados a un microfermentador de 14 litros (New Bruswick —

Scientific Co.), conteniendo un volumen de trabajo de 7.7 -

litros bajo las siguientes condiciones: agitación: 400 r.p.

m., aereación I W M y 30° C. de temperatura, el antiespuman-

te usado fué de silicones (Dow-Corning FG-10) usando 1 mi.,

concentrado al inicio y en las siguientes horas diluido en

agua al 10$ (64). La espuma fué controlada automáticamente

el pH inicial fué de 4.0 y el tiempo de fermentación de 30

horas.

V.- PREPARACION DEL INOCULO.

La cepa se activó en medio de agar Saboraud glu-

cosa 2$ (Merck) y se dejó a 30° C, por 24 horas. Posterior

mente se inoculó a matraces de un litro (Erlenmeyer) conté

niendo 500 mi. de medio base, 30 p.p.m. de extracto de le-

vadura y 1% (v/v) de etanol. Se dejaron los matraces en —

agitación a 200 r.p.m. a temperatura ambiente hasta alcan-

zar una densidad óptica de 0.6 absorbancia, medida con un

espectofotómetro Coleman Júnior 11. a una longitud de onda

620 nm. Se utilizaron 700 mi. de este cultivo para i n o c u —

lar el fermentador de 14 litros conteniendo 7 litros del -

mismo medio (9).

VI.- ADICION DE ETANOL.

El medio base conteniendo los factores de e n r i —

quecimiento fueron estilizados al autocloro a 121° C. por

30 minutos. Una vez enfriados a temperatura ambiente fué -

adicionado el Inóculo y el etanol se agregó a diversos in-

tervalos de tiempo. Esto fué con el fin de evitar la pérdi_

da de etanol por volatilización (31).

VII.- CINETICA DEL CRECIMIENTO.

Se utilizaron los siguientes parámetros para es-

tablecer la cinética de crecimiento de Sacckaromyces exi~-

guus; Densidad óptica, peso seco, pH y cuantificación de -

etanol. Esto sirvió para determinar el coeficiente de ren-

dimiento, tiempo de generación y velocidad de crecimiento.

a) Densidad óptica:

Se efectuaron en un espectrofotómetro Júnior 11

Coleman. Las determinaciones se hicieron a 650 nm inmedia-

tamente después de tomar las muestras, efectuándose en cel^

das de 5 mm de diámetro interno y usando como blanco el me

dio de cultivo sin células (27).

b) Peso seco:

Se realizó usando membranas "Milipore" de 25 mm.

de diámetro con poros de 0.2 um. Las membranas se mantuvi^

ron en una estufa de secado a 100° C. durante 18 horas ha£3

ta tener peso constante y se pesaron. Se filtró 1 mi» de -

cultivo, se lavaron las células con solución salina al —-

0.85$ y los filtros fueron llevados de nuevo hasta peso —

constante. La diferencia en peso se convirtió a peso seca

celular/litro de medio (75).

c) Cuantificación del etahol:

Del filtrado libre de células obtenido anterior-

mente, se tomó en una microjeringa 0.5 ul., los cuales fue

ron inyectados a un cromatógrafo de gases Beckman modelo -

GC-72-15 con integrador electrónico y detector de inoniza-

ción de flama, usando N2 como gas transportador. La colum-

n a usada fué "Porapack Q" de 1.83 metros de largo y 0.32 -

cip. de diámetro y las condiciones de análisis fueron las -

siguientes: temperatura de la columna, 140° C., temperatu-

ra del inyectar 130° C., temperatura del detector 140° C.

En el registro se usó atenuación de 128 y velocidad de car

ta de 2.54 cm/min. (5, 35) (62).

d) Coeficiente de Rendimiento:

Una vez calculado el peso seco (g/lto.) y cuanti-

ficado la cantidad de etanol residual, se procedió a utili-

zar la siguiente ecuación: Y (x/s) donde "x" representa g -

peso seco celular/litro y la "s" g. de etanol/litro para ob

tener finalmente los g. de peso seco celular/g de etanol u-

sado.

f) Cálculo de tiempo de Generación y Velocidad de —

Crecimiento:

De los datos obtenidos de peso seco celular/litro

graficados contra tiempo en papel semilogarítmico, se

desarrolló un análisis estadístico por medio de una r e g r e —

sión exponencial (48) utilizando la siguiente ecuación; u—

sando una calculadora TI-58 Texas Instruments Corp.

X = Xogit

X = g. de peso celular/litro (g/lto) a un tiempo de--

terminado.

Xo= g. de celular por litro (g/lto) Inicial.

Representa una constante.

ja = Velocidad de crecimiento,

t = Tiempo dado.

VIII. Análisis Químico Proxlmal de la Biomasa:

La levadura obtenida de los caldos de fermenta -

ción por separada por centrifugación (41) a 3000 r.p.m.,

por 30 minutos y lavada con solución salina al 0.85$ la

cual se secó a 100° por 18 horas; de aquí se procedió deter

minar de la biomasa proteínas, lípidos, cenizas y fibra cru

da (2, 57).

IX.- Análisis de Aminoácidos de la proteína de Saaoha-

romyce8 exiguue:

Se efectuó de la manera siguiente:

a) . Rompimiento celular: Se efectuó por medio de per-

las de vidrio en tubo de ensayo usando 0.5 g. de células se

cas de Saecharomycee exiguue adicionando con 5 mi de H2O —

destilada empleando un agitador "Vortex" ajustado a la máxi

ma velocidad por 15 minutos a 4 o C. Se preparó un frotis pa

ra observar al microscopio la eficiencia del rompimiento ce

lular.

b) Obtención de Concentrados Protéicos: Se usaron 2

mi. de la fracción subcelular obtenida anteriormente y se -

procesó para obtener un concentrado protéico. (Ver cuadro -

III).

c) Cuantlflcaclón de proteínas: Se efectuó por fluo-

metría. Al concentrado proteínico obtenido anteriormente se

le agregó 2 mi. de NaOH 0.1N y se hizo una dilución 1:40;

de aquí se tomaron 50 mi. a los cuales se le adicionaron 2.5

mi. de un "buffer" de boratos pH 8 . 9 y se agitaron en un —

"vortex". Se le agregó el reactivo de FLURAM* (Fisher) 15 -

 CCADIO III

OB' i-UClüN HE ODNCEN'1-^.DO PROTEICO

Fracción subaelular (2 mi.) y TCA al 10% (5 mi.)

Agitar y centrifugar 5 min/2000 g.

Precipitado,

Descartar sobrenadante Fopetir el paso anterior

(Iones y nctabolibos) (TCA y centrifuga -ión).

Precipitado.

Descartar sobrenadante Etanol 10 mi. a 60-70°Q/5 min.

(Iones y mctabolitos) Centrifugar 5 min/2000 g.

Precipitados.

Lípidos (descartarlos) Repetir el paso anterior

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precipitados.

Lípidos (descartarlos) ATC 5% (2.5 mi.) a 90°C/15 min.

Agitar y centrifugar 5 min/2000
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Precipitado

.ATC al 2% (2.5) a 70°C/15 min.

con agitación centrifugar ^/min/
2000 g.

Acidos nucleicos Precipitado

Proteínas

* Er\ frío a 4*C.

ATC = Acido tricloroacético

APC = Acido pe re 16 rico.

mg. í y se siguió agitando durante 30 seg. La fluoresencia

se leyó entre 5 minutos y 3 horas utilizando para la longi-

tud de onda de excitación 390 nm. (filtro azul) y para la -

longitud de onda de emisión 470 nm. (filtro amarillo) en un

fluorómetro Turner III. El blanco usado fué 50 ¿il de agua -

destilada. La fluoresencia de la muestra se relaciono con -

standares de albúmina sérica bovina en concentraciones de -

5j 10, 25 y 50 ug. ya que la linearidad se pierde por arri-

ba de 100 mg. de proteína.

d) Hidrólisis de Proteínas: Se utilizó la técnica —

descrita por Simpson y Newberg (6l).

e) Cuantlficaclón de Aminoácidos: El hidrolizado se

neutralizó con NaOH 3»5N y se secó en un rotavapor. Se

agregó 0.5 mi. de H2O destilada más 0.5 mi. de Norleucina -

standard interno con ácido sulfanílico al 60?; se ajustó el

pH a 2 y se centrifugó a 3000 r.p.zn. por 5 min. y se inye£

taron 100 mi. a un autoanalizador de aminoácidos Beckman —

121 provisto con una columna de intercambio catiónico tipo

Durrum (poliestireno-divinilbenceno) (6), integrando los re

sultados computarizados de acuerdo a un tiempo de retención

y absorbancia determinados.

( * )FLU0RAM:- Reactivo desarrollado de fluorescencia para

proteínas de marca registrada de Fisher, Co.

St. Louis. Mo. U.S.A.

 R E S U L T A D O S

Se muestran los resultados obtenidos con Saccha

romyaes exiguus creciendo en etanol como principal fuente

de carbono y energía en las gráficas (1, 2 y 3). Todos es-

tos experimentos fueron efectuados bajo las siguientes con

diciones: Temperatura 30° C., agitación 400 r.p.m.. aerea-

ción I W M , tiempo de fermentación 30 horas. Inóculo 10% va

riando los factores de enriquecimiento (A.C.L., L.R.M. y -

Extracto de Levadura).

En la fig. 1 se observa la cinética de creci

miento de Saacharomyoea exiguus creciendo en etanol al 1%

(v/v) añadiendo intermitentemente, medio con sales, más —

parte por millón de Extracto de Levadura. El crecimiento -

siguió en forma lineal durante las 10 primeras horas y el

etanol fué agotado casi en su totalidad a las 22 horas de

fermentación, el pH descendió de 3.7 inicial hasta 2.2, —

presentando la levadura una velocidad de crecimiento de —

0.165 hras. -1 y un tiempo de duplicación de 4.2 hrs. El

rendimiento fin&l fué de 5.64 g, de levadura seca/1 de me-

dio cultivo y un Y Y (x/s) de 0.75. Ecuación de regresión

exponencial X* 0.419 e, 0.1652 1.

Al crecer Sacoharomyoes exiguus en medios conté

niendo etanol y L.R.M. como factor de enriquecimiento —

(fig, 2), se encontró un rendimiento celular de 4.7 g. de

levadura seca/1, de medio y un Y x/s igual 0.62. «Es el

tiempo de duplicación de 3.85 hrs. y una velocidad de -

crecimiento de 0.179 hrs.~l. El etanol fue agotado a —

las 19 horas de fermentación. Ecuación de regresión ex-

ponencial X=0.4200.17972.t

En la fig. 3 se muestran los resultados obte

nidos con Saocharomyaes exiguus al crecer en medios de

etanol como principal fuente de carbono y A.C.L. como -

factor de enriquecimiento en los cuales el etanol fue -

agotado a las 17 horas de fermentación encontrándose un

rendimiento de 5.1 g/lto. y un T x/s igual 0.68, la ve-

locidad de crecimiento fué de 0.184 h r s . - 1 y un tiempo

de duplicación igual 3.74 hrs. Ecuación de regresión ex

ponencial X=0.421e0. 18492.t. Se muestra el consumo de —

etanol durante la fermentación (Cuadro I).

El resumen de los tres experimentos anterio-

res está representado en el Cuadro No.2. Los resultados

encontrados del análisis químico proximal están r e p r e —

sentados en el cuadro No.3, así como de los concentra—

dos de proteínas de Saaoharomyoes exiguus (ver Cuadro -

No.4), respectivamente.

En el Cuadro I está representado un análisis

cromatográfico de etanol añadido intermitentemente de -

Saaoharomyoes exiguus creciendo en etanol y A.C.L. como

factor de crecimiento.
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 DISCUSION Y CJNCLUSIONES

Este estudio abre la posibilidad de utilizar -

Saaaharomyoes exiguus er. otro proceso industrial, además

de los ya estudiados (56, 65) el de obtener proteína uni-

celular a partir de etanol como principal fuente de carbo

no.

Se encontró que al crecer Sacaharomyaes exiguus

en medios conteniendo etanol como principal fuente de e—

nergía, un mayor rendimiento Y (x/s) de 0.75 g. de c é l u —

las secas/litro en medios de cultivo enriquecidos con ex-

tracto de levadura, en segundo término el A.C.L. y por ul

timo al crecer con L.R.M., no estando muy alejado este úl_

timo del primero.

Otra parte de Saecharomyoes exiguus presentó -

tiempos de duplicación más bajos al crecer en A.C.L. en -

primer término seguido de L.R.M. y por ultimo extracto de

levadura. Con respecto a la composición química proximal

se encontró que la cantidad de proteína es ie;ual en los

tres factores de crecimiento. Las cenizas, son bajos sus

valores pero iguales entre ellos. En el caso de los amino

ácidos escenciales se aprecia fácilmente que los aminoác ji

dos azufrados constituyen un factor limitante si se compa

ran con los reportados por la FAO (Ver Cuadro No.5) .y un

desbalynre considerable PS también observado.

 En el caso de los aminoácidos aromáticos y

treonina al comparar el patrón de aminoácidos de las pro-

teínas de Saecharomyoes exiguus crecidas en los tres dife

rentes factores de enriquecimiento, se nota un mayor ba—

lance y una cantidad mayor con L.R.M., que aunado a que -

Saoaharomyoes exiguus al crecer en etanol con este factor

de enriquecimiento muestra una favorable Y (x/s) y rendi-

miento celular, así como bajo tiempo de duplicación, lo -

sitúa en primer término para usarse con un factor de enri

quecimiento en este tipo de proceso. Aunque los experimen

tos se realizaron con etanol de fermentación, ésto servi-

rá como base para estudios futuros usando etanol sintéti-

co, ya que las investigaciones llevadas a cabo demuestran

que no existe diferencia significativa ni en los rendi

mientos ni en calidad nutritiva de la biomasa obtenida al

utilizar etanol sintético o de fermentación (31).

Saocharomyces exiguus crecida en etanol y l í —

quido de remojo de maíz comparado en diferentes paráme

tros con otras levaduras ya estudiadas en otros procesos -

para obtener proteína unicelular a partir de etanol (Ver

Cuadro Noj5), son bastante buenos para considerarla a és-

ta levadura como nuevo candidato a usarse para este tipo -

de proceso.
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 R E S U M E N

Saeaharomyces exiguus fué estudiada con el obje

to de obtener proteína unicelular a partir de etanol, como

principal fuente de energía y carbono. Usando tres diferen

tes factores de enriquecimiento, Agua de Cocimiento de Le-

vadura (A.C.L.), Extracto de Levadura (E.L.) y Líquido de

Remojo de Maíz (L.R.M.) la cual presenta un mejor Y (x/s)

de 0.75 g. de células secas/litro al crecer en medios de -

cultivo con (E.L.) como factor de enriquecimiento y un me-

jor tiempo de duplicación 3.5 hrs. en medios con (A.C.L.).

Un mejor balance y cantidad de aminoácidos con L.R.M. que

ahunado a que Saaahavomyoes exiguus muestra un favorable -—

Y (x/s) y rendimiento celular, así como bajo tiempo de du-

plicación sitúa al L.R.M. como el mejor factor de enrique-

cimiento para usarse con Sacoharomyces exiguus en este ti-

po de proceso. Se concluye que esta levadura es un buen —

candidato para obtener proteína unicelular a partir de eta

nol y L.R.M. como factor de enriquecimiento, así como abre

la posibilidad de usar a Saceharomyces exiguus en otro pro

ceso industrial además de los ya estudiados.

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