Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

CAPÍTULO III: EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

¿Cuán individual y cuán social, comunal y colectiva es la realización

de un gran descubrimiento?
Horace Freeland Hudson
El octavo día de la creación (1979)

La primera vez que se aisló ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid, DNA)

en la historia fue en 1869 y el primero en conseguirlo fue el suizo Johann Friedrich
Miescher [Judson, 1987]. Al momento de obtenerlo –a partir de leucocitos del pus que
quedaba en las vendas quirúrgicas del laboratorio del castillo de Tübingen, en
Alemania- sólo se podía decir de este material que era de carácter ácido, de muy
elevado peso molecular y con alto contenido de fósforo. A pesar de que el
descubrimiento le llegara muy temprano en la vida (apenas contaba con 25 años
cuando logró hacerlo), el tiempo no le bastó a Miescher para entender la naturaleza de
la molécula que había mostrado al mundo.

Para la década de 1920 era claro que el gen –o la información genética, si se quiere
ser más preciso- se encontraba en el cromosoma; sin embargo, el desconocimiento
absoluto de las propiedades de los polímeros informativos (DNA y proteínas) por
mediados del siglo pasado hizo que se tuvieran concepciones poco acertadas en torno
a ellos. Un ejemplo de dicha desinformación se da en 1919 cuando Phoebus Aaron
Levene propone que el DNA no es sino una cadena monótona de tetranucleótidos de
timina, adenina, guanina y citosina siempre dispuestos en el mismo orden, y en 1937
Max Bergmann y Carl Niemann declararan haber encontrado una ley química que
determinaba el número de aminoácidos de un tipo particular de proteína. Dado que la
proteína exhibía una mayor diversidad monomérica que el DNA y demostrada la gran
variedad de formas que podía tomar –cuernos, uñas, pelos, etc.- a diferencia de este
último, era plausible pensar que la información que codificaba para formar un ser se
almacenara en el primer biopolímero.

Hacia mediados de la década de los 40, Oswald Avery41 publicó los resultados
[Avery et al., 1944] de una serie de experimentos que duraron dos décadas
desarrollados en el Instituto Rockefeller (Nueva York, EEUU) y que se caracterizan por
su tenacidad y meticulosidad, en los que mostraba que ciertas cepas de Streptococcus
pneumoniae que no poseían la capacidad de sintetizar cápsula –una estructura
extracelular implicada en la adhesión de la célula bacteriana y por tanto, en su
patogenicidad-, adquirían dicha característica tras ser expuestas al material genético –
por aquel entonces no se le denominaba de dicha forma, sino que se le conocía como
principio transformante- el cual se encontraba totalmente aislado y su pureza era
corroborada por ensayos de identidad negativos para carbohidratos y proteínas, éstas

41 Oswald Theodore Avery (1877-1955), médico e investigador estadounidense nacido en Canadá. Uno de los
primeros biólogos moleculares y pionero en el área de la inmunoquímica. Según gran parte de la comunidad
científica, incluido Arne Tiselius –quien presidiera el comité de la Fundación Nobel en 1960-, la más notoria
omisión en la entrega del premio Nobel fue Avery por demostrar que los genes no estaban hechos de proteína, sino
de DNA.

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últimas consideradas las portadoras de los genes. A pesar de la robustez de los

resultados obtenidos, Avery procedió con cautela al divulgar sus observaciones y dejó
entrever que el llamado principio transformante era de naturaleza nucleotídica, o sea,
formado por DNA, más nunca lo mencionó explícitamente. El único registro que queda
de dichas especulaciones es una famosa carta escrita a su hermano Roy Avery (quien
se encontraba en la Universidad de Vanderbilt en Nashville, Tennessee, EEUU) donde
Oswald Avery especulaba acerca de la posible naturaleza nucleotídica del DNA. A
pesar de no obtener mayor reconocimiento, el artículo publicado en 1944 en The
Journal of Experimental Medicine [Avery et al., 1944] fue altamente citado hacia finales
de aquella década y fue conocido por Max Delbrück42 (quien también leyó la carta de
Oswald) y Salvador Luria43, quienes comenzaban a dar los primeros pasos en una
nueva rama del conocimiento denominada biología molecular. Delbrück atribuye el
escaso impacto del trabajo de Avery a que no resolvía la cuestión fundamental –cómo
es que se guarda y transmite la información genética- en sí, sino que delegaba el papel
de gen al DNA en vez de que lo ostentara la proteína. Delbrück y Luria fueron los
primeros mentores académicos de James Watson44. En 1947 Francis Crick45 llegó a
Cambridge. Se debe recordar que en estos momentos el mundo atravesaba por el
reordenamiento provocado por la Segunda Guerra Mundial.

Para junio de 1949, Frederick Sanger46 dedujo que no parecía haber un principio
que definiera la naturaleza de la posición de un aminoácido en la proteína mediante el
empleo de la cromatografía. La secuencia parecía requerir de algún tipo de instrucción
que especificara el orden de los aminoácidos y éste era constante en la misma
proteína aislada de distintas fuentes, al menos, en la misma especie. Inspirado en este
trabajo, Erwin Chargaff47 empleó la cromatografía para analizar al DNA desde la

42 Max Ludwig Henning Delbrück (1906-1981), biofísico alemán. Profesor de física en la Universidad de Vanderbilt
en Nashville, Tennessee durante la Segunda Guerra Mundial. Laureado con el premio Nobel de Fisiología o
Medicina en 1969 por demostrar que los principios de la herencia no residían en el modelo lamarckiano.
43 Salvatore (Edward) Luria (1912-1991), biólogo estadounidense nacido en Italia. Huye de su país natal rumbo a

Francia donde logra conseguir visa para EEUU, en búsqueda de alejarse del régimen fascista de Mussolini. Llega a
New York en 1940, donde conoce a Hershey y Delbrück. Comparte con ambos el premio Nobel de Fisiología o
Medicina en 1969. Descubre la capacidad de evitar la proliferación de fagos por ciertas cepas de E. coli y con ello a
las enzimas de restricción a mediados del siglo XX.
44 James Dewey Watson (1928- ), biólogo molecular estadounidense; biólogo y zoólogo de formación. Laureado

junto con Crick y Wilkins con el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962 por su investigación en la
estructura de los ácidos nucleicos. Autor de The double helix (1968) –considerado uno de los mejores libros de
divulgación- y director, entre 1989 y 1992, del Proyecto del Genoma Humano por parte de los National Institutes of
Health de EEUU. Frecuentemente envuelto en polémicas por sus declaraciones, que han sido tachadas de
homofóbicas, racistas y sexistas.
45 Francis Harry Compton Crick (1916-2004), físico, médico, neurobiólogo y biólogo molecular inglés. Acuñó el

término de “dogma central de la biología molecular” para referirse al flujo de información entre las biomoléculas
de la célula. Nombrado Fellow of the Royal Society de Inglaterra y recibió la Orden del Mérito de la Corona Inglesa.
Compartió el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962 con Wilkins y Watson por su descubrimiento de la
estructura de doble hélice del DNA.
46 Frederick Sanger (1918- 2012), bioquímico ingles. Uno de los cuatro seres humanos que han sido distinguidos

con el premio Nobel en dos ocasiones en su vida. Sanger los obtuvo en el área de la química en 1958 por la
secuenciación de los aminoácidos que forman la estructura completa de la insulina humana, y en 1980 por el
desarrollo del método de secuenciación por terminación de la cadena, que adicionalmente le valió obtener en 1979
el premio Louisa Gross Horwitz de la Universidad de Columbia.
47 Erwin Chargaff (1905-2002), bioquímico austriaco. Autor de las reglas que llevan su apellido y que fueron

fundamentales para el descubrimiento de la estructura del DNA.

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misma perspectiva de Sanger. Los resultados obtenidos eran contundentes: la

proporción de las cuatro bases nitrogenadas era la misma en todos los tejidos de un
organismo, pero difería en las proporciones entre el mismo tejido de especies
distintas [Chargaff 1951]. Sus conclusiones le llevaron a rechazar la hipótesis del
tetranucleótido en un artículo publicado en 1950 en Experientia y sentó las bases para
poder hablar de la secuencia de dichas bases y la diferencia que esta secuencia
experimenta entre especies. En el mismo trabajo, expuso a modo de corolario que las
razones molares entre adenina:timina, guanina:citosina y pirimidina:purina no eran
muy distintas de 1.0 sin dar mayor detalle a este respecto. Esta relación fue
mencionada a Watson y Crick a principios de 1953, y seis años antes lo había
comentado en privado a Linus Pauling48 durante una cena en un crucero por el
Atlántico, pero el científico estadounidense no tomó en cuenta a Chargaff e ignoró su
observación. Curiosamente, tras la distinción recibida por el trabajo de Watson y
Crick, Chargaff escribió a la comunidad científica internacional para reclamar su
reconocimiento como uno de los precursores del descubrimiento de la estructura del
DNA por los datos de sus experimentos que él no pudo explicar pero que fueron
básicos para la elaboración de dicho conocimiento [Judson, 2003].

Hacia 1951, la atención generada en torno a la estructura del DNA iba en aumento,
en parte gracias a un trabajo publicado por Roger y Colette Vendrely y Cecilie
Leuchtenberger en Procedings of the National Academy of Sciences de EEUU, donde
confirmaban por dos métodos –químico y citoquímico- que la cantidad de DNA
presente en las células diploides de los tejidos periféricos era constante y el doble en
cantidad que aquella obtenida a partir de células sexuales (espermatozoides) y
exponen que dichos datos podrían ser una expresión del equipamiento genéticos de
las células. Los principales contendientes por el premio de encontrar la estructura
molecular del DNA para ese momento eran Pauling del Instituto de Tecnología de
California, EEUU (Cal Tech) y John Randall49, en Cambridge, así como la Unidad para el
Estudio de la Estructura Molecular de los Sistemas Biológicos del Consejo de
Investigación Médica del laboratorio de Cavendish, en la Universidad de Cambridge,
bajo la dirección de William Lawrence Bragg50, ambas en el Reino Unido. Maurice

48 Linus Carl Pauling (1901-1994), ingeniero químico estadounidense considerado el más importante investigador
en química estructural y uno de los 20 científicos más importantes en cualquier campo en la historia de la
humanidad. Incursionó en diversos campos de la ciencia: física cuántica, biología molecular, genética molecular,
medicina ortomolecular y física nuclear. Autor de la escala de electronegatividad que lleva su apellido y del libro
“La naturaleza del enlace químico”, una de las grandes contribuciones al entendimiento de la química. Descubre las
bases moleculares de la anemia falciforme y demuestra la herencia mendeliana que acompaña a dicha condición.
Propuso el modelo de la α-hélice, estructura secundaria de las proteínas. Laureado con el premio Nobel de Química
en 1954 por descubrir la naturaleza del enlace químico y con el premio Nobel de la Paz en 1962 por su labor
activista.
49 Sir John Randall (1904-1984), físico inglés que aportó el conocimiento necesario para el desarrollo del

magnetrón, un emisor de microondas a partir de energía eléctrica con aplicación en el desarrollo del radar (equipo
que fue esencial para la victoria aliada en la Segunda Guerra Mundial) y el horno de microondas. Fue nombrado
Fellow of the Royal Society of Edimburg de Escocia.
50 Sir William Lawrence Bragg (1890-1971), físico australiano que recibiera el premio Nobel en Física en 1915

junto con su padre, William Henry Bragg, por su trabajo sobre los rayos X y la estructura de los cristales,
convirtiéndose en el más joven investigador en recibir dicha distinción. Distinguido en 1921 con la mención de
Fellow of the Royal Society de Inglaterra y el de Acompañante de Honor de la Reina en 1941.

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Wilkins51, en el laboratorio del King´s College London –a cargo de Randall- de

Inglaterra, analizaba patrones de difracción de DNA y se encontraba en espera del
arribo de Rosalind Franklin52 para trabajar en la elucidación de la estructura del DNA.
Una vez que Alexander Stokes resolviera, como hiciera también Crick, las matemáticas
básicas que permitieran generar una teoría sobre cómo las estructuras helicoidales
difractan los rayos X, Franklin comenzó a trabajar sobre los datos de Wilkins y decidió
quedar a cargo del proyecto, eliminando toda colaboración directa con él. Al final de
este año, Watson y Crick deciden elaborar un primer modelo –erróneo- de dicha
estructura, que consistía en una triple hélice con el esqueleto constante formado por
fosfatos y desoxirribosas en la parte interna; Franklin hace ver que estaban en un
error. Crick persuadió a Wilkins para que esbozara nuevos modelos pero no obtuvo
resultados y el laboratorio Cavendish quedó en una posición académicamente
incómoda: tras los desaires en torno a la estructura, Bragg reconsideró las posiciones
de Watson y Crick, quien aún no terminaba el texto que conformaría su tesis doctoral.
Temporalmente suspendieron oficialmente su investigación en torno al modelo
tridimensional de la estructura del DNA; Watson retomó sus experimentos sobre la
estructura del virus del mosaico del tabaco y Crick regresó a su trabajo sobre la
hemoglobina con el que esperaba obtener el grado.

Durante 1952 Franklin también desdeñó la idea de generar nuevas explicaciones

moleculares de la estructura del DNA en colaboración y decidió que lo mejor sería
seguir trabajando por su cuenta. Pauling, a opinión de algunos científicos, pudo haber
propuesto la estructura correcta del ácido desoxirribonucleico este mismo año a no
ser por la falta de datos de calidad, su idea de que las proteínas eran quienes cargaban
con la información genética y su orgullo –creía ser la única persona capaz de resolver
la estructura molecular de las grandes biomoléculas, como ya había hecho antes con la
estructura -hélice de las proteínas-, aunados a problemas políticos por la posguerra.

Tras insistir un par de ocasiones, el Departamento de Estado de los EEUU liberó un

pasaporte por 10 meses a Pauling para asistir a Francia e Inglaterra. Fue en París
donde escuchó a Alfred Hershey53 quien, junto con Martha Chase, habían demostrado

51 Maurice Hugh Frederick Wilkins (1916-2004), biólogo molecular ingles nacido en Nueva Zelanda que
contribuyera al entendimiento de la fosforescencia, el desarrollo del radar, la separación de isótopos y la difracción
de rayos X. Laureado con el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962 junto con Watson y Crick por su
aportación a la elucidación de la estructura del DNA. Recibió la orden de Comandante del Imperio Británico y fue
nombrado Fellow of the Royal Society de Inglaterra.
52 Rosalind Elsie Franklin (1920-1958), biofísica y cristalógrafa inglesa. Colaboró en el entendimiento de las

estructuras moleculares del DNA –posiblemente su trabajo más conocido-, virus, carbón mineral y grafito. Fue su
labor en el estudio de los patrones de difracción de rayos X por cristales de DNA lo que condujo a la elucidación
final de su estructura por Watson y Crick, incluida la famosa fotografía 51, la cual mostraba el patrón de difracción
del material genético en disolución acuosa y que sirviera para el refinamiento del modelo tridimensional de la
molécula. Fallece a causa de cáncer de ovario antes que pudiera ser postulada como candidata a recibir el premio
Nobel junto con Watson, Crick y Wilkins por su contribución al descubrimiento de la estructura de doble hélice del
DNA, con lo que escribe en la historia su nombre como un símbolo de la tenacidad y capacidad femenina en la
investigación y es tomada por varios grupos feministas como símbolo de su movimiento en el campo de las
llamadas “ciencias exactas”.
53 Alfred Day Hershey (1908-1997), bacteriólogo y genetista estadounidense miembro de la famosa “Escuela del

Fago”. Coautor del experimento de la licuadora de Hershey-Chase que confirma al DNA y no las proteínas como

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que el material genético de los fagos estaba contenido en el DNA en vez de las
proteínas por medio de un famoso experimento que implicaba radioetiquetar por
separado proteínas y ácidos nucleicos mediante el uso de bacteriófagos, Escherichia
coli, 32P –sólo presente en el DNA- y 35S –únicamente encontrado en metionina y
cisteína (aminoácidos) pero no en ácidos nucleicos- y separar las nucleocápsides
virales por medio de agitación en una licuadora. Lo que funcionaba para los virus bien
podría servir para organismos complejos y por tanto dichos resultados cambiaron la
atención recibida por las proteínas como transmisores de la información genética y la
comunidad científica comenzó a buscar explicaciones en el ácido desoxirribonucleico.
En otoño del mismo año, Peter Pauling, hijo de Linus Pauling, comenzaría a trabajar en
el laboratorio donde residían Watson y Crick. Su estancia serviría para mantener
tránsito de información entre ambos grupos de manera bidireccional, si bien
involuntaria: Peter Pauling escribía con frecuencia a su padre acerca de las
discusiones de Watson y Crick y ellos a su vez se enteraban del trabajo desarrollado
por Linus Pauling por las charlas entre Peter y Jerry Donohue –también procedente
del Cal Tech-. Tras regresar a California, Pauling retomó el interés por ganar la carrera
por dilucidar la estructura de los ácidos nucleicos; no quería tener la última palabra,
sino más bien la primera: el artículo que fuera referencia para cualquier investigación
posterior en torno al DNA. Movido por este motivo, el último día de 1952 envió un
escrito que brillaba por su premura y su naturaleza tentativa. El trabajo, titulado “A
proposed structure for the nucleic acids” [Pauling y Corey, 1953], fue enviado a
Proceedings of the National Academy of Sciences y sólo mencionaba una “estructura
muy prometedora” que encajaba “moderadamente bien” con los datos de
cristalografía de rayos X.

Watson y Crick habían aprendido a tomar cautela todo dato y a reservar sus
especulaciones para momentos en los que tuvieran la certeza absoluta de que sus
resultados eran interpretados adecuadamente. Por ello habían retrasado cualquier
emisión de posibles configuraciones tridimiensionales de la molécula hasta que
tuvieran la absoluta certeza de que la información hallada fuera totalmente confiable.
La primera decisión importante fue tomada por Watson y consistió en probar suerte
con modelos de dos cadenas, en vez de las tres o cuatro que se especulaban dentro del
grupo; dicha idea se basaba en el simple argumento de que “las cosas importantes en
biología vienen en pares”. Una vez que los datos y los consejos de Franklin hacían
imposible pensar en que las bases nitrogenadas se encontraran en la parte externa de
la estructura, quedaba como reto encontrar una forma coherente de acomodarlas en
su interior, sin repulsión o impedimento molecular alguno. La respuesta vino con el
empleo de modelos con la forma ceto y no la forma enólica de las bases timina y
guanina –las cuales posibilitaban la visualización de los puentes de hidrógeno que
unirían la cadena internamente-, así como el hecho de que Watson lograra dejar de
pensar en que el apareamiento se daba entre iguales, es decir, adenina con adenina,
timina con timina, etc. Sin embargo, los análisis que habían obtenido gracias a toda la
información a su disposición eran irrefutables. Con ayuda de un modelo

portador de la información genética. Cogalardonado –junto con Luria y Delbrück- con el premio Nobel de Fisiología
o Medicina en 1969 “por sus descubrimientos concernientes a la estructura genética de los virus”.

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tridimensional metálico, los investigadores de Cambridge midieron las coordenadas

de cada átomo de la estructura y corroboraron los datos experimentales obtenidos
por cristalografía de rayos X. Las mediciones de las fotografías de los cristales
arrojaban que una vuelta completa de la estructura era posible cada 34 Ǻ y que
constaba de diez pares de bases unidas entre sí por el enlace fosfodiéster formado
entre grupos fosfatos y 2’-desoxirribosas.

El 28 de febrero de 1953, Crick anuncia a la comunidad científica y demás

espectadores del pub The Eagle, en Cambridge: “¡Hemos encontrado el secreto de la
vida!”. Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Peter Pauling y media docena de
investigadores más, varios de ellos expertos en el área de la química orgánica, fueron
invitados a opinar sobre el modelo. Nadie emitió comentario alguno sobre algún
posible error. A principios de abril y tan sólo unos días después que los investigadores
del Cavendish enviaran su trabajo a Nature, Linus Pauling visitó Cambridge, donde vio
a su hijo y tuvo contacto con el famoso modelo tridimensional en forma de doble
hélice. Durante la conferencia de Solvay en ese mismo mes en Bruselas, Pauling
admite la derrota en la carrera por el descubrimiento de la estructura del DNA y
felicita públicamente al equipo de los laboratorios británicos.

El 25 de abril de 1953 se publica en

Nature la propuesta de una estructura de
doble hélice sobre el mismo eje para el
DNA a cargo de Watson y Crick (figura 1),
ambos miembros del Cavendish
Laboratory [Watson y Crick, 1953a]. Refuta
la hipótesis de tres cadenas entrelazadas
con los fosfatos por la parte más interna
(propuesta por Pauling y Robert Corey en
su artículo de Proceedings, y antes por los
mismos Watson y Crick) dadas las
distancias de van der Waals, el hecho de
que la cristalografía antes mencionada se
hizo sobre la sal y no el ácido (lo cual
eliminaría la posibilidad de analizar las
fuerzas que mantendrían unida a la
estructura) y la repulsión que
experimentaría la molécula por las cargas
negativas de los grupos fosfato. La única
Figura 1: Vista del artículo de Watson y Crick en el que forma en que no se repelerían dichas
exponen la propuesta de una estructura de doble hélice cadenas de fosfatos sería que estuvieran
para el ácido 2’-desoxirribonucleico
totalmente protonados, pero eso no ocurre
a pH fisiológico. El fundamento teórico de esta última aseveración, irónicamente, la
encontraron en un libro de texto llamado General Chemistry, cuyo autor era Pauling.
Asimismo enfatiza que las uniones intercatenarias se llevan a cabo siempre entre una
purina y una pirimidina por medio de una interacción por puente de hidrógeno y que
siempre siguen la especificidad adenina-timina y guanina-citosina y retoma la

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

observación de Chargaff. En ese mismo número se publicaron los trabajos sobre la

difracción de rayos X sobre la misma molécula del grupo de Wilkins, Stokes y Wilson y
el de Franklin y Gosling en retribución al esfuerzo hecho por estos autores en la
dilucidación de la estructura de la molécula objeto de estudio de la biología molecular
[Franklin y Gosling, 1953; Wilkins, Stokes y Wilson, 1953]. Sin embargo, sólo Watson,
Crick y Wilkins son laureados en 1962 con el premio Nobel de Fisiología o Medicina
“por sus descubrimientos concernientes a la estructura molecular de los ácidos
nucleicos y su importancia para la transferencia de información en la materia
viviente” dada la política del comité de la Fundación Nobel de no laurear
póstumamente el trabajo de ninguna persona: Rosalind Franklin había fallecido 4
años atrás. Watson y Crick emiten una predicción teórica que daba un toque de
elegancia adicional a la recién interpretada molécula: hablan de una replicación semi-
conservativa de la doble cadena y le otorgan dicha característica basados en la
evidencia estructural. Esta característica, como apuntaría Watson más adelante, hacía
ver una naturaleza inmortal del gen alojado en la estructura semiconservada del DNA
conforme pasa de generación en generación. Las implicaciones de dichas
aseveraciones constituyen uno de los peldaños más importantes en el entendimiento
de la biología y todas sus ramas. A pesar de la trascendencia de dicho descubrimiento
fue poca la atención que recibió este trabajo y si se sigue una línea del tiempo a partir
de la publicación de la estructura se puede observar que hasta 1960 pocos artículos
refieren la estructura o citan el texto de Watson y Crick [Olby, 2003].

Hoy día se sabe que los ácidos nucleicos54 son biopolímeros constituidos por
unidades repetitivas llamadas nucleótidos y contienen la información genética
necesaria para la biosíntesis de proteínas y otras señales intra e intercelulares. Los
podemos encontrar tanto dentro como fuera del núcleo de las células eucariontes, y
dispersos en el interior de los procariontes. Están compuestos monómeros
estructurales de grupos fosfato enlazados a un carbohidrato cíclico de la familia de las
pentosas (carbohidratos con cinco átomos de carbono) denominado ribosa y una base
nitrogenada - que consta de uno o dos anillos heterocíclicos con átomos de nitrógeno-
unida por enlace N-glicosídico al carbohidrato furanósido en su carbono 1’ (figura 2).

Figura 2: Estructura básica de un pirimidin nucleótido y un purin nucleótido. En cuadro aparece

encerrado el grupo fosfato, dentro de la elipse la pirimidina (izquierda) o purina (derecha)
correspondiente, y sin encerrar la forma furanósida de la ribosa.

54Término con el que Richard Altmann –alumno de Miescher- denominó al material genético del núcleo (el DNA)
en 1889 y que da idea de su naturaleza química y la localización celular de donde fue aislado por vez primera.
Determina que la protonación completa de la molécula ocurre a pH<1.0 y bajo esas condiciones precipita.

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

A esta estructura –la base nitrogenada más la pentosa- se le denomina nucleósido,

y en función de la base nitrogenada es el nombre específico que recibe: adenosina o 2’-
desoxiadenina, citidina o 2’-desoxicitidina, timidina, uridina y guanosina o 2’-
desoxiguanosina. Cuando el nucleósido se encuentra fosforilado en la posición 5’ se le
da el nombre de nucleótido, y estos, al igual que los nucleósidos, se les nombrará de
acuerdo a la presencia de cada una de las bases nitrogenadas. De esta manera, los
nucleótidos son adenina, timina, guanina, citosina y uracilo. Las cadenas de cada ácido
nucleico se pueden considerar por su estructura polímeros secuenciales de 5’-fosfo-2’-
desoxirribonucleótidos en el caso del DNA y de 5’-fosforribonucleótidos para el RNA.

El DNA posee ciertas cualidades fisicoquímicas muy importantes que son

aprovechadas para su extracción y purificación, por ejemplo, el hecho de que sea muy
soluble en soluciones iónicas gracias a la carga negativa conferida por el esqueleto de
fosfatos, el cual está conformado por enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos
vecinos –lo que forma un enlace entre el hidroxilo 3’ de una unidad de ribosa (en el
RNA) o 2’-desoxirribosa (cuando se trata de DNA) y un oxígeno del fosfato en la
posición 5’ del carbohidrato del nucleótido subsecuente (figuras 3 y 4)-. Estas mismas
propiedades determinan que no sea soluble en disoluciones poco polares. Una
peculiaridad de esta biomolécula consiste en que es doble, complementaria y
antiparalela (figura 5) y se une y estabiliza por medio de puentes de hidrógeno que se
generan entre las bases nitrogenadas por estas características; siempre se empalma
una purina con una pirimidina. Al codificar para aminoácidos, la secuencia de las
bases nitrogenadas implica que no es un orden al azar sino que tiene como objetivo
ser reconocida. La numeración de los extremos de las cadenas de DNA se lleva a cabo
tomando en cuenta las posiciones de fosfato libre (en el carbono 5’ de la ribosa) o el
extremo hidroxilo libre (unido al carbono 3’ del carbohidrato furanósido). Cuando se
replica dicha secuencia se comienza siempre por el extremo 5’ de la cadena.

Aprovechar las características de solubilidad es una de las premisas que se

mantienen constantes a lo largo de los protocolos a revisar, y siempre se trata de lisar
a la célula con componentes y solventes donde el DNA sea soluble y las demás
biomoléculas no, lo que ayuda a separar la fase donde se encuentra el material
genético. En esta parte del texto se revisan algunas de las propiedades fisicoquímicas
y químicas del DNA que se pueden aprovechar para la elaboración de protocolos de
purificación y para entender algunas de las situaciones que pueden mermar el
rendimiento de DNA obtenido a partir de un tipo de muestra en particular.

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

Figura 3: Estructura de las cinco bases nitrogenadas encontradas en los ácidos nucleicos en su forma trifosfatada. En
orden de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo, y nombrados de acuerdo a la nomenclatura IUPAC: trifosfato de N-
(2’-desoxirribo)-4-amino-1H-pirimidin-2-ona (citosina), trifosfato de N-(2’-desoxirribo)-5-metilpirimidin-2.4(1H.3H)-diona
(timina), trifosfato de N-(2’-desoxirribo)-9H-6-aminopurina (adenina), trifostato de N-(2’-desoxirribo)-2-amino-1H-purin-
6(9H)-ona (guanina) y trifosfato de N-ribopirimidin-2.4(1H.3H)-diona (uracilo).

Agentes caotrópicos, detergentes iónicos o no iónicos, soluciones astringentes y

abrasivos diversos se encuentran a disposición del biólogo molecular para la tarea de
lisar las células, situación que no puede tener un carácter general dada la variedad de
envolturas celulares que se presentan en la naturaleza: de esta forma, no es lo mismo
degradar una pared bacteriana con peptidoglucano que la pared quitinosa de los
hongos, o que la pared cerosa de las micobacterias.

Para aquellos casos en los que el DNA puede no encontrarse dentro de la célula, ya
sea porque se lisó durante su transporte o porque el proceso sufrido por el material a
partir del cual se colecta la muestra es incompatible con la viabilidad celular, se deben
emplear técnicas que permitan la preconcentración del material genético antes de
quedar disuelto en su medio de almacenamiento definitivo.

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

Figura 4: Estructura desarrollada de una cadena de ácido 2’-desoxirribonucleico (izquierda) y ácido ribonucleico (derecha), que
muestra la estructura de las bases nitrogenadas GACT y GACU, respectivamente, leídas en sentido 3’→5’. Se muestra la
numeración de los anillos de purina y pirimidina, así como la numeración de los carbonos de los carbohidratos que denotan la
nomenclatura que corresponde a los extremos -OH en 3’ y -PO4= en 5’ (modificada de Miller PS, 1998).

De particular importancia resulta el contemplar la composición de las paredes

celulares cuando trabajemos con bacterias, hongos o plantas, pues serán la primera
barrera a degradar para permitir la liberación del material genético a la solución de
trabajo; diversas enzimas, detergentes o técnicas con abrasivos están disponibles para
tales efectos.

Inicia el presente capítulo con una revisión a las características biológicas,

químicas y fisicoquímicas de los ácidos nucleicos previo a la explicación de los
fundamentos de las metodologías de extracción con el fin de que se tenga una visión
global de las moléculas con las que se está trabajando. El conjunto de técnicas
descritas a continuación son algunas de las más empleadas para la extracción de DNA
a partir de diversas fuentes de material genético: plantas, bacterias, hongos, células
animales e incluso muestras forenses son la fuente a analizar y sus propiedades
fisicoquímicas el reto a vencer para lograr la obtención de ácidos nucleicos con el
mayor rendimiento y pureza posibles. La preparación de la totalidad de los reactivos
empleados en esta sección se puede encontrar en el anexo proporcionado al final de
este libro.

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

Figura 5: Esquema de la complementariedad de las bases en el ácido 2’-desoxirribonucleico.

De 3’ a 5’: A-T, G-C, C-G y T-A.

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

ORGANIZACIÓN Y RELEVANCIA BIOLÓGICA DE

LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Antes que yo no hubo nada creado, a excepción de lo inmortal,

y yo duro eternamente.
Dante Alighieri
La Divina Comedia: Infierno, c.III, 9 (c.1304)

Los ácidos nucleicos son macromoléculas biológicamente importantes dado que

poseen la característica de almacenar, transmitir y traducir la información genética
contenida en su secuencia de pares de bases. La totalidad de los procesos biológicos y
las instrucciones para dar forma a un organismo derivan de la respuesta en la
regulación de la síntesis de alguno de los intermediarios de esta vía; dicha respuesta
puede ser a un estímulo intracelular o extracelular y éstos últimos, a su vez, pueden
ser exógenos o endógenos en el caso de organismos multicelulares.

Desde la propuesta en 1957 del dogma central de la biología por Francis Crick se
tienen ideas básicas en torno a los ácidos nucleicos que permanecen constantes en
prácticamente todas las formas de vida conocidas. Sin embargo, era conocida la
existencia del gen desde mucho tiempo atrás: Gregor Mendel55 postuló en 1866, tras
ocho años de trabajo, las leyes de la herencia que llevan su apellido, en las cuales deja
entrever que existe un factor que se transmite de padres a hijos entre generaciones y
que su herencia lleva implícita la de ciertas características físicas, sin embargo, no
menciona la palabra gen –término que sería acuñado por el genetista danés Wilhelm
Johanssen, derivado de la expresión pangen empleada por el botánico y genetista
holandés Hugo de Vries para designar a las partículas responsables de la herencia de
las características fenotípicas-.
55Gregor Johann Mendel (1822-1884), monje austriaco de la orden de los agustinos considerado el fundador de la
genética por el descubrimiento de tres generalizaciones, en torno a la herencia, a saber:
a) Primera ley o Ley de la uniformidad de los híbridos de la primera generación: Dados los principios de
i) factores en parejas –las características hereditarias están determinadas en factores (más tarde serían
llamados genes) de los cuales cada individuo porta dos variantes, y éstas pueden ser iguales o distintas- y
ii) dominancia –para una característica determinada, si un individuo porta dos variedades distintas de
factores, una dominará en su expresión sobre la otra-, al cruzar dos líneas puras que difieren en un
carácter, el 100% de la descendencia será igual entre sí e idénticos al parental que posee la característica
dominante. Ésta primera generación se le denomina F1 (Filial 1).
b) Segunda ley o Ley de la separación de los alelos: Basada en el principio de segregación –Cada
característica aparece en pares de variedades de factores en los individuos, y durante la generación de los
gametos, cada uno de éstos portará una única copia de dichos factores y por tanto, una única variedad de
la característica en cuestión; dicha separación (segregación) ocurre al azar, de forma tal que la
probabilidad de que en un gameto exista uno u otro tipo de factor es la misma-, la segunda ley expresa
que cuando se cruzan dos individuos de F1 entre sí, la proporción de las características en la Filial 2 (F2)
es de 3:1 (Dom:Rec).
c) Tercera ley o Ley de la segregación independiente de caracteres: En concordancia con el principio de
segregación independiente –que establece que si se consideran dos características, cada una de ellas
determinada por un factor con dos variantes, dichas variantes se segregan de manera independiente; en
otras palabras, la herencia de un factor no influye en la herencia de otro factor distinto en el mismo
gameto, sin importar sus condiciones de dominancia o recesividad-, cuando se estudian dos
características simultáneamente, al cruzar dos individuos híbridos (heterocigotos) de la F1 entre sí, en F2
se obtendrá una proporción de características fenotípicas 9:3:3:1
(Dom/Dom:Dom/Rec:Rec/Dom:Rec/Rec).

96
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

El DNA contiene la información necesaria para sintetizar otras biomoléculas: el RNA

mensajero –que por sí mismo puede tener actividad celular- y las proteínas; de esta
manera sirve de molde para la generación de una cadena de mRNA que transmite las
instrucciones genéticas desde el genoma hasta el sitio de la síntesis proteica: los
ribosomas56; el paso de la información del material genético del DNA al mRNA se lleva
a cabo en todo el citoplasma en células procariotas y en el núcleo en el caso de los
eucariontes. Dada su estabilidad, la información se guarda en forma de DNA en las
células y muchos virus; sin embargo hay varias familias de éstos últimos que emplean
como molécula de almacenamiento al RNA57.

A continuación se discutirán algunas de las propiedades de los ácidos nucleicos

esenciales para el entendimiento de la vida como la conocemos hoy en día. Se revisan
brevemente los procesos celulares en los que están involucrados y posteriormente se
discute la relevancia de las mutaciones en el desarrollo de los procesos de adaptación
y evolución, así como en el desarrollo de ciertas características fenotípicas de interés
clínico.

ARQUITECTURA BÁSICA DEL GENOMA

El genoma de las distintas especies de seres vivos no difiere en cuanto a su naturaleza

química –todos están compuestos por las mismas bases nitrogenadas unidas a ribosas
y fosfatos- pero sí en cuanto a su organización y la presencia o ausencia de ciertos
elementos que lo conforman. Básicamente, el genoma es la secuencia de la totalidad
de los nucleótidos que conforman la información genética de un individuo, aunque
esto no signifique que se trate del contenido absoluto de dicha información del
organismo: se debe recordar que existen secuencias codificantes en el DNA
mitocondrial, en los plásmidos extracromosómicos de las bacterias y en los
cloroplastos, así como en los cromosomas artificiales de bacterias y levaduras.
Propiamente, el genoma contiene genes, y al ser una cadena doble de DNA lo que
compone a dicho genoma, los genes pueden estar codificados en una u otra cadena
indistintamente. Dado que el gen sólo codifica en una de las cadenas en esa región
existe por tanto una cadena –o secuencia- de sentido y una de anti sentido. La cadena
sentido es aquella cuya secuencia es exactamente la misma que el mRNA que servirá
como templete para la síntesis de la proteína en los ribosomas, la cadena anti sentido
es el molde para la generación de dicho mRNA, dicho de otra forma, la cadena que
contiene la información es la secuencia de sentido, pero la que sirve de molde, puesto
que es su versión complementaria la que se sintetizará, es la de anti sentido.

56 El ribosoma –de “ácido ribonucleico” y del griego σῶμα (soma) = cuerpo, literalmente “cuerpo de ácido
ribonucleico”- es una estructura presente en todas las células que está formada por proteínas y RNA ribosomal
(rRNA). El rRNA se sintetiza en el nucléolo –en los eucariontes- y es en el mismo sitio de síntesis que se acopla a las
proteínas que lo acompañan. Cuando se halla en el citoplasma sintetiza proteínas no sensibles a condiciones
oxidantes –es decir, aquellas que forman enlaces por puente disulfuro-, si se halla acoplado al retículo
endoplásmico –únicamente en eucariontes- sintetiza proteínas que se secretan unidas a membrana, en vesículas o
que requieren de modificaciones post-traduccionales dentro de los organelos membranosos.
57 Estrategia útil que permite mantener una tasa de mutación elevada dada la relativamente mayor labilidad de

este ácido con respecto al DNA, lo cual les puede conferir ventajas como mayor diversidad antigénica y con ello
genera mecanismos de escape a la respuesta inmune en animales.

97
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

El gen es la unidad funcional básica de la herencia del genoma, un segmento de ácido

nucleico que contiene el mínimo necesario de instrucciones para transcribir un
producto de RNA funcional de manera controlada con la concomitante generación o
modificación de un fenotipo, y se compone de regiones codificantes y no codificantes.
Se denominan regiones codificantes a aquellas cuya información será traducida a
proteína o transcrita a un RNA funcional, mientras que las secuencias contenidas en
las regiones no codificantes no son expresadas como algún otro producto celular.
Estas últimas comprenden, dentro de la estructura básica del gen, a los intrones 58 y
regiones promotoras y potenciadoras –ambas más complejas en los genomas
eucariontes que en los procariontes-. Dentro de las regiones codificantes se localizan
los exones. Fuera del gen, las regiones no codificantes –que constituyen la mayor parte
del genoma en los organismos más complejos- contienen vestigios de genes no
funcionales denominados pseudogenes, elementos transponibles (llamados
transposones) e inserciones antiguas de genomas virales no codificantes.

LOS ÁCIDOS NUCLEICOS COMO PORTADORES DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA:

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

La síntesis de proteínas es uno de los mecanismos que tiene la célula para responder
ante una modificación en su entorno inmediato –el ambiente celular- o ante cambios
en su interior. En el caso de las respuestas celulares inducibles, el primer paso ante la
presencia de un estímulo involucra la translocación de un factor transcripcional
específico del citoplasma al genoma –en el núcleo en el caso de los eucariontes-, el cual
es capaz de reconocer la o las regiones promotoras de él o los genes involucrados en la
respuesta de interés. En el caso de los procariontes, no hay tales factores
transcripcionales, sino que la síntesis de RNA comienza tan pronto la RNA polimerasa
se ha unido a la secuencia promotora del genoma bacteriano. Cabe señalar que la
transcripción de organismos del dominio Archaea es muy similar a la de los
eucariontes. Es importante mencionar que el proceso de transcripción puede llevarse
a cabo varias veces sobre el mismo genoma prácticamente de manera simultánea,
incorporando a la región promotora RNA polimerasas o complejos transcripcionales
adicionales, según sea el caso, con lo que se puede producir más de una copia a la vez
de mRNA de una secuencia en particular. Una vez localizados dichos sitios, ciertas
secuencias –como la caja TATA59- son reconocidas por los factores transcripcionales
que se unen a ella; esto conlleva la adición de una RNA polimerasa60 al complejo factor

58 Éste término, así como el de exón, fueron empleados por primera vez por el bioquímico estadounidense Walter
Gilbert; intrón deriva de la condensación del término inglés intragenic region (región intragénica).
59 Segmento de DNA encontrado en la región promotora de la mayoría de los genes, usualmente dentro de los 50

nucleótidos anteriores al sitio de inicio del gen y cuya secuencia, conservada entre los dominios Archaea y Eukarya,
es 5’-TATA(A/T)A(A/T)-3’.
60 Enzima que cataliza la formación de polímeros de RNA y que en función del dominio que se trate, puede ser de

alguno de los siguientes tipos:

a) RNA polimerasa bacteriana (dominio Bacteria): compuesta por 6 subunidades, con un peso aproximado
de 480 KDa; controla la producción de mRNA, así como de ncRNA –el cual está implicado en el control de
diversas funciones celulares involucradas con la replicación del DNA y la frecuencia de la síntesis de
proteínas en general-.
b) RNA polimerasa; dominio Archaea: RNA polimerasa que se encuentra estructuralmente emparentada con
las tres RNA polimerasas principales del dominio Eukarya. Ésta relación molecular ha generado

98
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

transcripcional-DNA y, una vez disgregado el complejo proteico de la región

promotora, copiará la información genética de interés en forma de su cadena
complementaria pero en lenguaje de RNA: la cadena de DNA templete se lee de 3’ a 5’,
mientras que la síntesis del RNA, en tanto copia antiparalela de dicha cadena blanco
de DNA, se sintetiza de 5’ a 3’ y es exactamente igual a la cadena opuesta de la región
de DNA que se transcribe, con las únicas diferencias de que en vez de empalmar una
timina cuando se presente en la secuencia blanco una adenina la molécula enlazada
será un uracilo, y que el carbohidrato del esqueleto del ácido nucleico naciente es una
ribosa, no una 2’-desoxirribosa.

Si el RNA fue transcrito por una RNA polimerasa tipo II, contará con un extremo 5’-
Cap, el cual consiste en la adición de una 7-metilguanosina unida por enlace bifosfato
5’-5’, lo que modula la exportación de mRNAs (desde el núcleo, en eucariontes) al
citosol y por ende, regula su traducción a proteínas y previene su degradación
mediada por enzimas. Asimismo, otro mecanismo de protección del transcrito
primario es la adición independiente de templete de una cola poliadenilada en su
extremo 3’; cabe señalar que este proceso de poliadenilación es exclusivo de
eucariontes y que no existe una secuencia en el DNA molde que indique la adición de
dicho polímero de adeninas al final del transcrito primario. Sin embargo, la misma
poliadenilación de ncRNAs61 es una señal para inducir su degradación. Éste RNA
contiene en los extremos, de manera adicional al extremo 5’-Cap y la cola
poliadenilada, un par de regiones en los extremos que se denominan regiones no
traducidas (Untranslated region, UTR).

Este transcrito primario, en el caso de los eucariontes, sale por los poros nucleares y
sufre un proceso denominado splicing62, que constituye parte de los denominados
fenómenos de modificación post-transcripcional. Dicha modificación ocurre en el
spliceosoma, en el cual se reconocen las secuencias intrónicas a ser removidas –
caracterizadas por la presencia de las secuencias consenso GU (guanina-uracilo) en el
extremo 5’ y AG (adenina-guanina) en 3’- y se empalman de nuevo los exones, para
formar al mRNA maduro. Una vez ensamblados los exones para formar el mRNA
maduro se lleva a cabo la traducción de la información contenida en ésta biomolécula
en cuatro unidades (adenina, timina, guanina y uracilo) al lenguaje de veinte
aminoácidos de las proteínas. Esto ocurre en los ribosomas gracias al reconocimiento
de la secuencia del mRNA –localizada en el sitio A del ribosoma- por aminoacil-
tRNAs63 -en el sitio P del ribosoma- que interaccionan por medio de puentes de

especulación en torno a la posibilidad de que sean éstas las moléculas ancestrales de las polimerasas
eucariontes, lo cual apoyaría la teoría del origen endosimbiótico de los organismos de dicho dominio.
c) RNA polimerasas del dominio Eukarya: divididas a su vez en RNA polimerasa I –involucrada en la síntesis
de rRNA 45S-, RNA polimerasa II –responsable de la mayoría de los mRNA y RNA de interferencia- y RNA
polimerasa III –implicada en la síntesis de tRNA, principalmente-.
61 Entre los que se encuentran rRNA, tRNA y RNA de interferencia pequeño (small interference RNA, siRNA).
62 Del término inglés para “empalme”; sin embargo, el uso tan extendido del vocablo anglosajón ha promovido su

incorporación como parte de la terminología habitual del vocabulario empleado por la lengua hispana en lo
referente a la biología molecular e incluso existen palabras latinizadas derivadas de dicha raíz.
63 tRNA se refiere al RNA de transferencia, una porción de RNA con longitud variable entre los 70 y 90 pb. Un

aminoacil-tRNA se refiere a la molécula antes mencionada unida en su extremo 3’ al grupo carboxilo del

99
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

hidrógeno con la secuencia de mRNA y de esta forma la adición de aminoácidos a la

cadena proteica naciente es específica de secuencia. Esta especificidad está
determinada por un código genético (figura 6) en el que se puede observar la
secuencia de cada combinación de tres bases nitrogenadas (codón) y su resultado en
la síntesis de proteínas. Hay aminoácidos que son codificados por más de un codón, lo
que da origen a la llamada redundancia del código genético, y que son la razón por la
cual en algunas ocasiones una mutación puede no tener repercusión sobre el producto
proteico final. Asimismo, la secuencia de inicio está determinada por la metionina y
existen tres codones de término.

Figura 6: Código genético. Se puede apreciar cómo pueden existir varias secuencias que determinan la posición de
un único aminoácido o señal (redundancia). El cuadro incluye el codón, el nombre del aminoácido, su abreviatura de
tres letras y su abreviatura de una letra.

Una vez posicionado el aminoacil-tRNA se forma el enlace peptídico entre el extremo

amino del aminoácido a añadir y el extremo carboxilo del péptido en síntesis. Por
último, se escinde el enlace éster que mantenía unido al aminoácido a su
correspondiente tRNA (se dice que el tRNA se descarga) y el mRNA es movido en su
marco de lectura por tres bases (un codón) para dar paso al siguiente sitio a ser
reconocido por un tRNA específico de secuencia y seguir con este ciclo hasta el
término de la traducción, cuando el sitio A del ribosoma encuentre alguna de las
señales de término que posee el código genético. Se estima que la cantidad de ATP
requerida para llevar a cabo este proceso es de 4n-1, donde n es el número de
residuos de la cadena. La tasa de adición de aminoácidos a la cadena proteica recién
sintetizada es de cerca de 18 residuos por segundo en procariontes y 6 en eucariontes.

aminoácido correspondiente por medio de un enlace éster. La unión específica por enlace covalente entre el tRNA y
su aminoácido es catalizada por la aminoacil-tRNA sintetasa.

100
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

REPLICACIÓN DEL DNA

Cuando una célula se divide, debe originar dos células con la misma cantidad de
material genético (excepto en el caso de la meiosis, ver apartado siguiente). Para ello,
deberá obtener una copia de toda la información que posee en su DNA de forma tal
que al final tenga dos paquetes teóricamente idénticos de instrucciones codificadas en
su genoma. La división celular ocurre por fisión binaria en el caso de los procariontes
y por medio de la regulación del ciclo celular en las células eucariontes.

La fisión binaria se lleva a cabo por medio de tres pasos principales: replicación del
genoma –que posee un único origen de replicación-, segregación cromosómica –en la
que cada una de las copias circulares del genoma del procarionte se une a la
membrana en polos opuestos de la célula- y la citocinesis –la separación propiamente
de la célula, por medio de una serie de proteínas que forman una estructura
denominada anillo séptico-. Tres hechos notables en torno a este tipo de
reproducción: los organismos cuya reproducción está dada por fisión binaria por lo
general tienen tasas de crecimiento exponenciales, no recombinan su material
genético al no ser un proceso de reproducción sexual, y es el mecanismo de
replicación de los cloroplastos y mitocondrias (ambos organelos de células
eucariontes) y su replicación dentro de la célula no está mediada por el ciclo celular; la
forma en la que se segregan dichos organelos en las células generadas en un proceso
de división eucariótica aún no es conocida.

En el caso de los eucariontes, la división celular está mediada por el ciclo celular, el
cual está compuesto por dos periodos: el denominado interfase, durante el cual la
célula acumula nutrientes y energía química necesaria para el proceso de división, y la
fase M o mitosis. La interfase, que es el período más largo del ciclo celular, se compone
a su vez de tres fases64: G1 –crecimiento celular-, S –síntesis y duplicación del material
genético, con una duración aproximada de ~6 h- y G2 –preparación para la mitosis-. La
mitosis está dividida en cuatro fases principales:

a) Profase: Durante esta fase, la cromatina –el genoma entero de una célula
disperso en el núcleo- se condensa para formar las estructuras cromosómicas,
se destruye la membrana nuclear –en la mayoría de los organismos
multicelulares- y se forman los husos mitóticos por unión de microtúbulos
unidos a la membrana en los polos opuestos de la célula y se unen a los
cromosomas en la porción centromérica. Los cromosomas se encuentran
unidos por pares en el centrómero –cada uno de los cuales se denomina
cromátida hermana- y a su vez a un complejo proteínico de la misma
naturaleza que los microtúbulos denominado cinetocoro.
b) Metafase: Es en este momento en que se alinean los cromosomas en el
denominado huso mitótico, al centro de la célula en la llamada placa
metafásica.

64Existe una cuarta fase denominada fase G0 en la cual el ciclo celular se encuentra arrestado, sin posibilidad de
generar copias de DNA y por tanto incapacitada para dividirse.

101
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

c) Anafase: Las cromátidas unidas se separan y son jaladas al extremo de la

célula al cual están unidos los microtúbulos que formaban el huso mitótico. Al
final de la anafase, la célula ahora contiene dos copias idénticas separadas de
material genético.
d) Telofase: Durante esta etapa, los microtúbulos no cinetocóticos continúan su
elongamiento, de esta forma ensanchando aún más la célula. Las cromátidas
hermanas se unen a extremos opuestos de la célula y se forma una nueva
envoltura nuclear en torno a ellas a partir de fragmentos del núcleo inicial. Por
último, las cromátidas se desenvuelven nuevamente en el recién formado
núcleo.

Al término de la mitosis, y de manera simultánea que la telofase, ocurre el fenómeno

de citocinesis, en el cual se separa la célula mitótica en dos células en las que la mitad
del material genético ha sido recién sintetizado, y la otra mitad proviene de la célula
que le dio origen.

Dada la composición química de las pentosas presentes en la cadena de ácidos

nucleicos, es posible concebir una direccionalidad en la molécula, es decir, un “río
arriba” y un “río abajo” en la secuencia. Como se ha visto antes (figura 4, en la
introducción a este capítulo), cada cadena posee dos extremos claramente
distinguibles: uno de ellos determinado por la presencia de un hidroxilo libre unido al
carbono en la posición 3’ de la ribosa y el otro por un grupo fosfato en el carbono
colocado en la posición 5’ de la cadena –lo que otorga las denominaciones de extremos
3’ y 5’, respectivamente-. Ésta direccionalidad es la razón sine qua non se puede
entender la conformación de doble hélice antiparalela y complementaria del DNA, así
como su replicación semiconservativa, dado que dicho proceso ocurre únicamente en
dirección 5’→3’ en todo caso, dado que los nuevos nucleótidos se adicionan a la
cadena naciente vía una reacción de deshidratación en el extremo 3’ del ácido nucleico
cuyo hidroxilo actúa como nucleófilo y reacciona de esta manera con el fosfato 5’ del
siguiente monómero. La adición de las unidades nucleotídicas se estima en tasas de 2
000 nucleótidos por minuto en células eucariotas y hasta 50 000 unidades por minuto
en células procariotas.

La forma en la que se lleva a cabo la replicación del DNA depende del

desenrrollamiento de la estructura por medio de una topoisomerasa65 e involucra el
reconocimiento de las secuencias en las cadenas de DNA llamadas “origen de
replicación” por parte de proteínas iniciadoras de la replicación. Éstas reclutan más
proteínas que a su vez inician el proceso formando las denominadas horquillas de
replicación. Las horquillas por lo general son ricas en su contenido de adenina y
timina, dado que la energía necesaria para separar estas bases es menor que la
empleada en el mismo proceso entre guaninas y citosinas, pues la primera asociación
contiene dos puentes de hidrógeno, mientras que la segunda posee tres (ver figura 5,

65 Enzima cuya función es la de aliviar la tensión molecular en la estructura de doble hélice del DNA mediante el
corte en cierta región de la cadena, su reacomodo en una forma no condensada y su posterior unión a la cadena
original en su forma laxa. Existen dos tipos principales de DNA topoisomerasas: tipo I (independientes de ATP) y
tipo II (dependientes de ATP).

102
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

al inicio de este capítulo). La generación de dicha horquilla depende de la presencia de

una proteína denominada helicasa, cuya función es la de eliminar las interacciones por
puente de hidrógeno entre las dos cadenas de DNA. Las regiones genómicas ubicadas
entre dos orígenes de replicación se conocen con el nombre de replicones y se les
define como unidades funcionales de replicación; estas regiones son activadas
alternadamente en la fase S del ciclo celular y poseen una longitud de entre 40 Kb y
100 Kb en eucariontes, mientras que en procariontes el replicón es el genoma entero.
En cualquier caso, sólo se pueden activar una vez por cada ciclo de replicación del
material genético.

Una vez que se genera la horquilla, la replicación dará origen a dos cadenas
sintetizadas de novo en la región gracias al complejo de reconocimiento de origen: la
cadena líder o conductora y la cadena retardada o seguidora, que son simplemente
efectos del crecimiento direccionado 5’→3’. La cadena líder se sintetiza de manera
continua en ésa dirección sobre la cadena de DNA molde (la cual posee
direccionalidad 3’→5’), mientras que la cadena retardada debe esperar al avance de la
cadena líder para continuar con su síntesis sobre la secuencia molde 5’→3’.

MECANISMOS DE GENERACIÓN DE LA VARIABILIDAD BIOLÓGICA EN LOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

Las mutaciones (o cambios) en regiones –codificantes o no codificantes- ocurren

espontáneamente en la naturaleza, pero pueden ser inducidas también en condiciones
de laboratorio o cuando un organismo es expuesto a un agente mutagénico. La tasa de
mutaciones se incrementa cuando un ser vivo se encuentra expuesto a condiciones
mutagénicas, y es parcialmente disminuida o contrarrestada cuando entran en acción
mecanismos de reparación de daño a nivel del DNA. Por ejemplo, en el caso de
Escherichia coli, cuando sus sistemas de reparación de daños del material genético
funcionan adecuadamente, la tasa de mutación es tan baja como una sustitución por
cada 109 o 1010 pb por célula por generación. Para efectos didácticos, se considerarán
las mutaciones como espontáneas o inducidas. Las mutaciones espontáneas, en tanto
generadores de variabilidad a nivel de genoma, se estudian en este apartado, mientras
que las mutaciones inducidas por mutágenos se abordan con mayor profundidad en el
siguiente capítulo del libro.

Mutaciones espontáneas

Las mutaciones consideradas ‘espontáneas’ surgen de varias fuentes, pero

principalmente son producidas por errores en la replicación del DNA o lesiones
espontáneas. Aquí no consideraremos las producidas por elementos genéticos
transposables o por inserciones virales.

103
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

 Errores en la replicación del DNA

Un error común en la replicación del DNA ocurre cuando se origina un desfase en el

marco de lectura del DNA, generalmente inserciones o deleciones de un número de
bases que no es divisible entre tres, dada la naturaleza de triplete del codón. Este tipo
de mutaciones provoca, por lo general, proteínas gravemente alteradas pues
introduce un cambio en la secuencia de lectura de codones del mRNA derivado de la
transcripción del sitio alterado como se ve a continuación:

En este ejemplo, es claro que la desaparición de una base nitrogenada (G) en la

posición 14 cambia por completo el marco de lectura y ocasiona no sólo el cambio de
dos residuos de aminoácido (Arg por Leu y Ser por Ala) sino el paro en la síntesis de la
cadena de aminoácidos, lo que da lugar a una proteína trunca.

Las deleciones e inserciones de material genético más allá de unos cuantos pb por
regla general ocurren en regiones donde existe una gran cantidad de secuencias
repetidas, lo que forma sitios conocidos como hotspots (“sitios calientes”) en los que la
tasa de mutación es mayor que en el resto del genoma. La existencia de estos sitios
particulares hace pensar que existen propiedades intrínsecas a estas secuencias que
intervienen en el proceso de mutagénesis, tales como especificidad de secuencia –o al
menos de ambiente fisicoquímico en la región de mutación- tanto para agentes
mutagénicos como para las maquinarias moleculares de reparación y replicación del
DNA e incluso, de enzimas que modifican su secuencia.

Otro tipo de error en la replicación puede originarse cuando un par de bases se alinea
inespecíficamente durante la síntesis de DNA, lo que origina una sustitución de un
solo nucleótido (single nucleotide polymorphism, SNP). Esto ocurre porque las bases
nitrogenadas pueden aparearse de varias formas, llamadas tautómeros66. Por lo
general, la forma de la base que se encuentra presente en el DNA es la cetónica,
mientras que la forma imino y enol son más bien raras. Cuando la aparición del
tautómero incorrecto es la causante de un emparejamiento inadecuado de las bases y
por tanto, de la generación de una mutación, se le conoce como cambio tautomérico.
Sin embargo, es más frecuente que estos cambios debidos a modificaciones en la
estructura de la molécula se deban a formas iónicas de las bases.

66 Un tautómero es un isómero estructural que difiere en la posición de sus átomos y enlaces entre ellos.
Generalmente se encuentran en equilibrio con un porcentaje de la molécula en una forma y otro porcentaje en la
otra forma.

104
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

Estos emparejamientos inadecuados se les conocen como mutaciones por transición, y

resultan en una sustitución de una purina por una purina o de una pirimidina por una
pirimidina.

Existen, sin embargo, otro tipo de mutaciones por emparejamiento no adecuado que
no depende de los mecanismos antes descritos. Se les conoce como transversiones y
se trata de sustituciones de purina por pirimidina o viceversa, y requieren, en algún
punto de la replicación, un emparejamiento entre purinas o pirimidinas –aun cuando
esto no sea energéticamente favorable-.

 Lesiones espontáneas

El otro gran mecanismo de generación de mutaciones es el daño en la cadena del DNA.

Estos pueden ser de dos tipos principalmente: la despurinización y la desaminación de
las bases nitrogenadas.

La despurinización de las bases nitrogenadas es la forma más común de lesión o daño

que sufre el DNA y es resultado de la pérdida del enlace glicosídico entre la base y la
2’-desoxirribosa, lo que conlleva la pérdida de la guanina o adenina en esa posición de
la cadena. Una célula de mamífero puede perder hasta 10 000 purinas en un periodo
de generación de unas 20 horas a 37 °C. Esta pérdida implica la aparición de sitios
apurínicos que no pueden complementarse con ninguna base. A pesar de contar con
sistemas eficientes de reparación de sitios apurínicos, la célula por lo general regenera
estos sitios con un cambio en la base nitrogenada original.

La desaminación de la citosina da por resultado un uracilo que, si no es reparado, se

emparejará con una adenina durante la replicación, lo que convierte el par G-C
original en un sitio con A-T (transición GC→AT). Este tipo de mutaciones son más
frecuentes en posiciones con 5-metilcitosina. ¿Por qué? Una de las enzimas que repara
el DNA, la uracil-DNA glicosilasa, reconoce los residuos de uracilo en la cadena de
DNA; sin embargo, la desaminación de 5-metilcitosina no degenera en uracilo, sino en
timina, nucleótido no reconocido por la uracil-DNA glicosilasa y por tanto, no es
reparado.

Lesiones al material genético causadas por agentes oxidantes (H2O2, OH∙ y O2∙, entre
otros) se estudiarán en el siguiente apartado, ya que no son considerados como
trascendentes entre los mecanismos de generación de variantes genéticas.

Mutaciones inducidas

Básicamente, existen tres mecanismos distintos de mutación inducida por mutágenos:

incorporación de análogos de base, emparejamiento inespecífico y daño de base.

105
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

 Incorporación de análogos de base

Existen compuestos químicos suficientemente parecidos a las bases nitrogenadas

como para ser incorporados a una de las cadenas de DNA durante su síntesis. Aunque
el análogo de base se incorpora sólo en una de las cadenas, puede causar sustituciones
de un par de bases al unirse un nucleótido inespecífico en esa posición.

 Emparejamiento inespecífico

Otro grupo de mutágenos no son incorporados directamente en la cadena durante la

síntesis, sino que más bien alteran la estructura de la base nitrogenada, lo que
ocasiona emparejamientos inespecíficos entre purinas y pirimidinas. Tal es el caso de
los agentes alquilantes (como nitrosoguanidina, N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina y
etilmetanosulfonato) que, como su nombre indica, transfieren grupos alquilo (como
metilos o etilos) a las bases nitrogenadas con repercusiones en sus capacidades de
emparejamiento.

Otro mecanismo de emparejamiento inespecífico es provocado por agentes

intercalantes, como los colorantes naranja de acridina y bromuro de etidio, la
talidomida, la proflavina y un conjunto de químicos denominados compuestos IRC.
Dada su configuración planar, los agentes intercalantes se posicionan entre las bases
nitrogenadas y pueden provocar inserciones o deleciones de un par de bases.

 Daño de las bases

Se trata de un mecanismo que puede dañar una o más bases nitrogenadas, lo que
provoca pérdidas de bases, inserción de bases en sitios nuevos, cambios de bases
nitrogenadas e incluso daño irreparable de bases adyacentes, uno de los mecanismos
mutagénicos más eficientes. En este grupo podemos encontrar a la aflatoxina B1, la luz
ultravioleta y la radiación ionizante.

106
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

REACCIONES TÍPICAS Y FISICOQUÍMICA CARACTERÍSTICA DE LOS COMPONENTES

ESTRUCTURALES DEL DNA

Los ácidos nucleicos poseen ciertos centros reactivos –como el enlace fosfodiéster
internucleotídico y los heteroátomos y los grupos amino exocíclicos de las bases
nitrogenadas- que tienen influencia en el comportamiento fisicoquímico de estas
moléculas. Es de importancia entender las condiciones bajo las cuales algunas
reacciones pueden llevarse a cabo para controlar esas variables, lo que favorece o
impide la conservación de su estructura o la formación de enlaces con otras
sustancias.

Muchas de las reacciones son influidas por el pH de la solución que circunda al DNA. Si
bien la estructura básica de DNA y RNA son similares en muchos aspectos, la
presencia o ausencia del hidroxilo en la posición 2’ del nucleótido puede acarrear
diferencias en ciertas situaciones. En el RNA se hidroliza el esqueleto de fosfatos y
ribosas por ataque intramolecular del hidroxilo 2’ cuando se encuentra a pH básico;
huelga decir que esto no ocurre en el DNA. En cambio, en condiciones ácidas, el DNA
pierde grupos púricos dado que el enlace N-glicosil es lábil cuando no se presenta el
hidroxilo en la posición 2’. Esto termina por generar sitios apúricos que con el paso
del tiempo se vuelven más susceptibles a la hidrólisis, sea ácida o básica.

Figura 7: Reacciones de desaminación de los grupos nitrogenados exocíclicos en las bases nitrogenadas del ácido 2’-
desoxirribonucleico en medio acuoso

Otras reacciones de interés son aquellas en las que los grupos amino exocíclicos son
reemplazados por grupos carbonilo o hidroxilo en medio acuoso, lo que genera que la
adenina se convierta en hipoxantina, la citosina en uracilo y la guanina en xantina
(figura 7). De éstas reacciones, la conversión de citosina en uracilo es una de las
reacciones que mayor repercusión tiene en los ulteriores procesos de secuenciación,
dado que la DNA polimerasa encargada de catalizar la generación del enlace
fosfodiéster en dicho proceso no tiene la capacidad de corregir errores en la

107
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

secuencia, y el recién formado

uracilo se asociará
complementariamente a una
adenina. Esta adenina será
detectada por la polimerasa en el
siguiente paso de elongación y se
asociará a una timina, lo que puede
ocasionar la aparición de un sitio
polimórfico producto de un
artefacto de la reacción de PCR
empleada para la secuenciación
(ver capítulo IV). La tasa de
desaminación (frecuencia de la
pérdida del grupo –NH2 exocíclico)
en estos grupos funcionales es
relativamente alta: se estima un
valor cercano a 1.7 x 102
desaminaciones diarias en ácidos
nucleicos de cadena doble por lo
que se debe tomar en cuenta lo Figura 8: Reacciones de oxidación, ataque hidrofílico, alquilación
anterior en el momento de armar y condensación de aminas exocíclicas que pueden sufrir las
secuencias a partir de DNA distintas bases nitrogenadas del DNA (en particular DNA
antiguo). En orden de 5’ a 3’: timina, citosina, adenina y guanina
antiguo. Preferiblemente se valida (modificado de Hofreiter et al, 2001).
el método extrayendo DNA de
diversas zonas de un solo organismo y se secuencian por separado cada una de las
muestras; de manera óptima se debería de secuenciar por duplicado cada extracción
individual para minimizar la cantidad de errores en la asignación de nucleótidos en la
secuencia que pudiese haber en las muestras. En condiciones de temperatura elevada,
pH ácido y alta humedad ambiental los procesos tafonómicos que se desencadenan
con la muerte del organismo comienzan a degradar los ácidos nucleicos por
reacciones de oxidación, ataque hidrofílico (entrada de moléculas de agua a la
estructura del DNA), alquilación (principalmente metilación y etilación) y
condensación de las aminas exocíclicas (figura 8).

Existen además reacciones de oxidación características de la interacción de las bases

con radicales reactivos de oxígeno, cloro y nitrógeno (revisado ampliamente en
Halliwell, 1996), principalmente ácido hipocloroso (HClO), radical hidroxilo (·OH),
oxígeno atómico (1O2), cloruro de nitrilo (NO2Cl) y peroxinitrito (ONOO-) que pueden
desembocar en cambios en la estructura de la base nitrogenada, ruptura del enlace
fosfodiéster en una o ambas cadenas, sitios abásicos, unión covalente a proteínas y
modificaciones en el anillo heterocíclico del carbohidrato [Dizdaroglu, 1990; Floyd,
1990; Nackerdien et al., 1991; Wiseman y Halliwell, 1996]. La oxidación de las pases
pirimídicas puede dar como resultado la presencia de un anillo de cinco miembros en
la posición donde normalmente se encuentra la base nitrogenada denominado

108
 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

hidantoína [Jenner et al., 1998], la cual bloquea a las DNA polimerasas y por tanto
inhibe la PCR (figura 9).

Todas las reacciones anteriormente mencionadas, en conjunto con las catalizadas por
enzimas del tipo de las DNAsas y aquellas que degeneran el material genético por
formación de puentes inter o intracatenarios en las bases nitrogenadas –como las
provocadas por radiaciones ionizantes y UV- deben considerarse como parte de los
mecanismos que inutilizan una muestra de DNA antiguo dado que ocurren como parte
de los procesos tempranos de putrefacción y por tanto el grado de conservación del
material genético dependerá en gran medida de las condiciones edafológicas y
climatológicas a las que se enfrente el organismo.

Figura 9: Reacciones de oxidación de las bases pirimídicas para dar origen a los derivados de hidantoína mostrados.
Arriba: reacción de oxidación de la citosina que origina hidroxihidantoína; abajo: reacción de oxidación de la timina que
da lugar a la presencia de hidantoína metilada e hidroxilada en la posición 5.

Asumiendo condiciones con concentraciones de sales equivalentes a las fisiológicas,

pH neutro y una temperatura constante de 15 °C se estima que se habrá degradado
por hidrólisis todo el DNA que puede ser razonablemente recuperable para análisis en
una muestra en el curso de 100 000 años. La reactividad diferencial en función del
clima y la composición del suelo explican por qué es más factible obtener DNA a partir
de restos de zonas desérticas o de sitios con bajas temperaturas todo el año en
comparación con restos de lugares con clima selvático o incluso templado: una
disminución de 20 °C resulta en una caída de 10 a 25 veces en la tasa de las reacciones
de sustitución química; el congelamiento pronuncia esta tendencia aún más. Esto
explica por qué se pueden obtener datos a nivel molecular más confiables y con mayor
frecuencia a partir de restos de las regiones nórdicas de Europa y las zonas polares de
Asia o América o de las regiones desérticas de Norteamérica y Sudamérica que de la
región mesoamericana o del sureste asiático. A pesar de que se observe una cantidad
relativamente elevada de DNA en buenas condiciones en una extracción llevada a cabo
a partir de fuentes antiguas, siempre se debe tener en cuenta que gran parte de ese
material genético proviene de microorganismos, tanto modernos como aquellos que
acompañan al material desde el momento del deceso de su portador original o al
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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

inicio de los procesos de decaimiento y que cuentan con algún tipo de protección
como pueden ser los esporulados. Y se debe recordar que una gran proporción de
dicho material genético corresponderá al DNA mitocondrial, dada la abundancia
relativamente mayor de este organelo –entre 100 y 1 000 mitocondrias por célula-
con respecto al DNA genómico del cual sólo existe una copia por cada núcleo.

Una de las degeneraciones moleculares que resulta de interés es aquella que ocurre
entre el cloroacetaldehído y las bases citosina y adenina y da como resultado bases
derivadas del eteno. El grupo amino del nucleótido reacciona con el carboxilo del
reactivo en dos pasos: primero, ocurre un desplazamiento del halógeno por N1 de la
adenina o N3 de la citosina; posteriormente se deshidrata y forma la base de eteno
(figura 10). Los derivados etenoadenina y etenocitosina son fluorescentes, lo que
implica que aquellas cadenas con extremos poli-C o poli-A pueden identificarse por
esta reacción para producir moléculas fluorescentes que permita su detección en
ensayos por hibridación.

Figura 10: Formación de etenoadenina (arriba) y etenocitosina (abajo) por tratamiento con cloroacetaldehído

Ciertos metales actúan como catalizadores de la hidrólisis de las cadenas de ácidos

nucleicos, como el cobre, por ejemplo, que desestabiliza la estructura del DNA y por
ende favorece la ruptura de los enlaces fosfodiéster. Esta es una consideración de
especial cuidado cuando se trabaja DNA antiguo a partir de muestras que han
permanecido un tiempo prolongado en sitios con alto contenido de este metal.
También las concentraciones importantes del catión Fe3+ pueden formar complejos y
catalizar la oxidación de las moléculas de DNA, lo que imposibilita su análisis
posterior por métodos enzimáticos [Nackerdien et al., 1991; Netto, Ferreira y Augusto,
1991].

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DEL ÁCIDO 2’-DESOXIRRIBONUCLEICO

El DNA es una doble hélice formada por moléculas poliméricas informativas gracias a
la secuencia de sus unidades monoméricas, los nucleótidos. La cadena compuesta por
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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

sus dos cadenas constitutivas de monómeros, cada uno de ellos unido a los demás por
el enlace fosfodiéster, mide 2.2-2.6 nm (22-26 Ǻ) de grosor y contiene 10 unidades
monoméricas por cada vuelta completa, que ocurre cada 33 nm (330 Ǻ) de longitud de
la molécula. Se encuentra enrollado de manera altamente compacta dentro de las
células y virus a pesar de que se trata de un biopolímero relativamente largo: el
genoma humano contenido dentro de cada célula está hecho de suficiente DNA como
para formar una hebra ininterrumpida de 1.8 m de largo que cuando se une a las
histonas67 para formar los cromosomas y una vez que se condensa dentro del núcleo
celular mide unos 120 m. Esto lo logra gracias a que interacciona por medio de
puentes de hidrógeno entre los fosfatos del DNA y la histona –las cuales son
predominantemente básicas (por su contenido de lisina y arginina) y por tanto, con
abundancia de cargas positivas-. A la propiedad de compactarse de dicha manera se le
conoce como condensación, la cual difiere de la mera precipitación o agregación en
que la primera se trata de un estado molecular morfológicamente organizado
mientras que los otros dos presentan un arreglo molecular desordenado. Dicha
propiedad de empacamiento compacto es el fundamento empleado en el caso de
ciertas técnicas que emplean DNA unido a una superficie con la cual interacciona ya
sea para su purificación, ya sea para otras técnicas moleculares. Algunos agentes
condensantes del DNA son cationes multivalentes con carga 3+ o superior,
polipéptidos catiónicos –básicos-, alcoholes y ciertos polímeros [Zhang y van der
Maarel, 2008]. El DNA en disolución diluida puede condensar sobre superficies de
compuestos de silicio –
cuarzo, sílica gel, mica-, en
particular cuando se
agregan dichos agentes, lo
que es de utilidad cuando
se emplean en los
procesos de extracción de
ácidos nucleicos. La
morfología observada
principalmente es en
forma de bastones o
toroides de morfología
variable pero por lo
general dentro de una
monocapa de DNA sobre
la superficie, sin importar
ni la naturaleza de ésta ni
del disolvente empleado.
Figura 11: Interacciones entre una partícula de sílica (SiO2) y a) agua (parte
El uso de cationes –para
superior) por formación de puentes de hidrógeno; y b) DNA (parte inferior) en ciertas aplicaciones en
presencia del catión Na+.
biología molecular se

67Proteínas de empaquetamiento celular del DNA e implicadas en regulación génica. Se encuentran presentes en
células del dominio Archaea (algunos organismos) y Eukarya, pero no en Bacteria. El origen etimológico de la
palabra “histona” viene del alemán Histon, que a su vez deriva del griego ‘ (histanai = permanecer).

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 Capítulo III: Extracción de ácidos nucleicos

prefiere el Mg2+- intensifica los fenómenos de adsorción dada la formación de un

puente que permite el establecimiento de un enlace salino entre las estructuras
parcialmente negativas de la superficie y los grupos fosfato negativamente cargados
de manera puntual del DNA (figura 11). La unión a la matriz de sílica involucra un
aumento en la entropía del sistema, más no una contribución entálpica [Glazer et al.,
2007].

Entre las contribuciones dominantes del proceso de unión del esqueleto de ribosas y
fosfatos de la molécula de ácido 2’-desoxirribonucleico se pueden contar las fuerzas
electrostáticas intermoleculares, la deshidratación de la superficie tanto del DNA
como de la sílica (razón por la que agentes caotrópicos68 favorecen la interacción
entre ambas sustancias) y formación de interacciones intermoleculares –inclusive
puentes de hidrógeno- en la capa de contacto entre el material genético y la superficie
de la sílica [Melzak et al., 1996]. El agente caotrópico desnaturaliza al DNA por
deshidratación, ya que desestabiliza la esfera de hidratación de la biomolécula y por
tanto se forma un puente entre la superficie negativa de la sílica y la superficie
negativa del DNA en presencia de algún catión metálico a altas concentraciones de
sales. Este fenómeno también se propicia cuando se emplean disoluciones con pH
elevado (pH ≥ 8.0). Algunos autores proponen incluso un modelo por atracción
hidrofóbica en presencia de altas concentraciones de sales como explicación para la
unión DNA-SiO2.

Una vez unido por dichas interacciones es posible lavar al DNA con solventes
orgánicos (etanol, acetona) y soluciones igualmente concentradas de sales. La elución
se lleva a cabo en un medio con poca concentración de sales (buffer TE, por ejemplo) o
inclusive en agua pura, situaciones que cambian la fuerza iónica del medio y por tanto
promueven la separación del DNA de la matriz de sílica [Glenn, Bavis y Bollback,
2008].

68 Desnaturalizante de macromoléculas –en particular biopolímeros- con importante actividad de interferencia en

la formación de interacciones por fuerzas no covalentes.

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