REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Screening-ul antenatal al gravidelor cu

patologie vasculară sistemică

Doctorand Cosmin Sebastian Surugiu

Conducător de doctorat Prof. Dr. Florin Stamatian

Cluj-Napoca
2015

1
 CUPRINS
INTRODUCERE 15
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII 18
1. Definiții 18
2. Clasificare 18
3. Incidență 21
4. Etiopatogenie 21
4.1. Alterarea balanței angiogenice placentare 22
4.1.1. Factori proangiogenici 23
4.1.2. Factorii antiangiogenici și rolul lor în patogeneza PE 24
4.2. Stress-ul oxidativ și disfuncția endotelială sistemică 25
4.2.1. Stress-ul oxidativ placentar 25
4.2.2. Activarea și disfuncția endotelială sistemică 26
4.3. Factori imunologici și genetici 27
5. Factori de risc și istorie naturală 29
6. Teste predictive ale PE 30
6.1. Teste corelate cu disfuncția vasculară și hipoperfuzia placentară 31
6.1.1. Determinarea TA 31
6.1.2. Testul roll-over și testul la angiotensina II 31
6.1.3. Velocimetria Doppler a arterelor uterine 32
6.2. Teste corelate cu disfuncția endocrină a unității feto-placentare 33
6.2.1. Proteina plasmatică A asociată sarcinii 33
6.2.2. Gonadotropina umană corionică 33
6.2.3. Proteina placentară 13 33
6.2.4. Alfa-fetoproteina 34
6.3. Teste corelate cu disfuncția endotelială și stress-ul oxidativ 34
6.3.1. Factorii angiogenici circulanți 34
6.3.2. Fibronectina 35
6.4. Teste combinate 35
6.5. Acizii nucleici fetoplacentari 37
6.6. Proteomica 39
CONTRIBUȚIA PERSONALĂ 41
1. Ipoteza de lucru/obiective 42
2. Studiul 1 – Evaluarea unui algoritm de screening multiparametric pentru 43
predicția preeclampsiei la finalul primului trimestru de sarcină
2.1. Introducere 43
2.2. Material și metodă 43
2.2.1. Selectarea cazurilor 45
2.2.2. Evaluarea ecografică 46
2.2.3. Determinări de laborator 46
2.2.4. Definiții clinice 47
2.2.5. Analiza statistică 47
2.3. Rezultate 48
2.3.1. Analiza comparativă a variabilelor demografice 49
2.3.2. Analiza comparativă a variabilelor ecografice 52
2.3.3. Analiza comparativă a parametrilor biochimici 58
2.3.4. Construirea modelului regresional binar și a curbei ROC 63
2.4. Discuții 67
2.5. Concluzii 70
3. Studiul 2 – Testarea capacității predictive a ARN-ului total, prezent în plasma 71

2
 maternă la finalul primului trimestru de sarcină, pentru dezvoltarea unui
sindrom preeclamptic
3.1. Introducere 71
3.2. Material și metodă 73
3.2.1. Selectarea cazurilor 73
3.2.2. Definiții clinice 74
3.2.3. Determinări de laborator 74
3.2.3.1. Separarea plasmei 74
3.2.3.2. Extracția ARN total 75
3.2.3.3. Determinarea concentrației ARN total 76
3.2.4. Analiza statistică 76
3.3. Rezultate 77
3.4. Discuții 80
3.5. Concluzii 82
4. Studiul 3 – Evaluarea valorii predictive a ARN-ului mesager specific placentar 83
pentru patologia vasculară sistemică la finalul primului trimestru de sarcină
4.1. Introducere 83
4.2. Material și metodă 86
4.2.1. Selectarea cazurilor 86
4.2.2. Definiții clinice 87
4.2.3. Determinări de laborator 87
4.2.3.1. Separarea plasmei, extracția ARN-ului total 87
4.2.3.2. Cuantificarea ARN-ului plasmatic total 88
4.2.3.3. Amplificarea probelor 88
4.2.4. Analiza statistică 89
4.3. Rezultate 90
4.3.1. Evoluția lotului 90
4.3.2. Analiza comparativă a parametrilor demografici 90
4.3.3. Analiza comparativă concentrațiilor acizilor nucleici 91
4.3.4. Construirea modelului regresional binar și a curbei ROC 96
4.4. Discuții 100
4.5. Concluzii 103
5. Concluzii generale 104
6. Originalitatea și contribuțiile inovative ale tezei 105
REFERINȚE 107
ANEXE 129

Cuvinte cheie: preeclampsie, screening, Doppler uterin, PIGF, PAPP-A, ARN mesager

3
 INTRODUCERE

Dezvoltarea după 20 de săptămâni de sarcină a hipertensiunii arteriale (definită

prin valori ale tensiunii arteriale egale sau mai mari de 140/90 mm Hg) asociată cu
proteinurie defineşte preeclampsia, o afecțiune multisistemică gravă, fiind una din
principalele cauze de morbiditate şi mortalitate maternă şi fetală în întreaga lume.
Datele actuale estimează că la nivel mondial au loc anual peste 60000 de decese materne
secundare complicaţiilor dezvoltate pe fondul acestui sindrom, pe lângă complicaţiile
materne şi fetale imediate şi la distanţă, implicaţiile personale, familiale şi sociale ale
preeclampsiei.
Întrucât preeclampsia remite doar odată cu eliminarea completă a placentei, iar
prezența acestui organ este considerată ca necesară și suficientă pentru dezvoltarea
preeclampsiei, cercetările ultimilor ani s-au concentrat asupra placentei ca sursă a bolii.
Au fost obținute date esențiale legate de alterări ale echilibrului dintre factorii pro- și
antiangiogenici placentari implicați în patogenia sindromului clinic, alături de stress-ul
oxidativ, factori imunologici și genetici, cu toții jucând rol în generarea manifestărilor
clinice.
Dezvoltarea vascularizației utero-placentare se află sub control umoral încă din
stadiile incipente și orice dezechilibru între factorii proangiogenici (PIGF, VEGF) și
antiangionegigi (sFlt-1, endoglina) va predispune la dezvoltarea unui sindrom
preeclamptic. În prezent este demonstrată alterarea concentrațiilor acestor markeri în
cazurile de preeclampsie, iar în multe cazuri aceste modificări preced cu săptămâni/luni
debutul clinic, sugerând oportunitatea utilizării lor în screening-l antenatal.
Preeclampsia este în prezent asimilată unei stări de stress oxidativ, hipoperfuzia
placentară din preeclampsie, alături de episoade de reperfuzie, generează radicali liberi
de oxigen la nivel placentar. Acest stress oxidativ local va cauza eliberarea în circulația
maternă de microparticule trofoblastice (cu conținut de acizi nucleici) cu rol direct în
activarea și disfuncția endoteliului matern la nivel sistemic
Componenta imunologică a patogenezei acestui sindrom a fost de mult timp
stipulată, în urma unor observații empirice care au constatat că preeclampsia este o
boală a primei sarcini, iar expunerea anteconcepționala la antigene paterne scade riscul
de boală. O serie de studii au raportat o expresie locală aberanta a antigenelor HLA și a
funcției celulelor NK uterine. Componenta genetică a preeclampsiei a fost și aceasta
recunoscută de peste 100 ani, în urma semnalării unor cazuri de agregare familială și a
incidenței mai mari la rasa neagră.
Disponibilitatea unui test predictiv eficient ar permite identificarea precoce a
gravidelor cu risc crescut, implementarea unor măsuri preventive și/sau terapeutice
înainte de instalarea unor complicații majore, ceea ce ar reprezenta un progres real în
medicina materno-fetală. Pe parcursul timpului au fost încercate numeroase teste
predictive, fără ca vreunul să se apropie de parametrii unui test ideal, implementabil în
practica clinică. Cele mai bune rezultate au fost oferite de screening-ul combinat,
rerezentat de utilizarea unor algoritmi multiparametrici, compuși din factorii de risc
rezultați din istoricul matern, parametrii Doppler uterini (IP) și concentrația markerilor

4
proteici placentari (PIGF, PAPP-A, sFlt-1, endoglina). Rezultate promițătoare sunt oferite
și de studiul traficului de acizi nucleici feto-placentari în plasma maternă (în principal
specii de ARN mesager), câteva studii raportând modificări precoce ale transcripției
placentare în cazurile predispuse la preeclampie.

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

În cercetarea de față am evaluat capacitatea a 3 baterii diferite de teste predictive

de a depista riscul de preeclampsie. Cele 3 teste au fost aplicate simultan pe o cohortă de
250 gravide, aflate la finalul primului trimestru, după obținerea consimțământului
informat, ele fiind urmărite prospectiv până la naștere. Întreaga metodologie de studiu a
fost supusă în prealabil spre aprobare Comisiei de Etică a Universității.
Criteriile de includere au fost: primipare, secundipare cu primă sarcină
complicată cu preeclampsie, vârstă gestațională cuprinsă între 11 – 13+6 săptamâni.
Criteriile de excludere au fost: secundipare cu prima sarcină normotensivă,
multipare, sarcini gemelare/multiple, vârstă gestațională în afara limitelor stabilite,
confirmată ecografic, suspectarea de aneuplodii sau anomalii fetale decelabile ecografic
la vârsta gestațională menționată, refuzul de a participa la studiu.
Incidența globală a preeclampsiei la nivelul lotului a fost de 5%.

Studiul 1. Evaluarea unui algoritm de screening multiparametric pentru predicția

preeclampsiei la finalul primului trimestru de sarcină

Scop. În acest studiu am evaluat capacitatea unui algorim de screening compus din
elementele clasice de risc provenite din istoricul matern, indicele de pulsatilitate (IP) al
arterelor uterine măsurat ecografic Doppler și concentrația plasmatică a 3 proteine
trofoblastice (PIGF, PAPP-A și β-hCG) de a identifica gravidele cu risc de preeclampsie.
Material și metodă. Cele 250 de cazuri incluse in studiu au furnizat informații legate de
vârsta, mediul de proveniență (urban/rural), antecedente heredo-colaterale de
preeclampsie (mama/soră), greutate, înălțime, cu calcularea indicelui de masă corporală
(I.M.C.), prezența avortului în antecedente (spontan/provocat), boli asociate
(hipertensiune arterială preeexistenă sau altă vasculopatie, diabet zaharat, nefropatie,
trombofilie), consumul de țigarete. IP uterin a fost măsurat bilateral cu ajutorul unui
ecograf Voluson E8® – General Electric. Concentrația celor 3 proteine placentare a fost
determinată în plasma maternă cu, kit-uri dedicate pe platformă automată Delfia
Express 6000 Immunoanalyzer (Perkin Elmer®). Analiza statistică s-a facut prin
regresie logistică cu generarea funcției scor și a curbei ROC, pe baza căreia s-au calculat
ratele de detecție a preeclampsiei.
Rezultate. Am constatat valori semnificativ mai mari ale IP minim uterin în rândul
viitoarelor preeclamptice, ca și concentrații semnificativ mai mici ale PIGF și PAPP-A. β-
hCG nu a prezentat corelație statistică cu riscul de boală. În urma analizei statistice, a
generării funcției scor și a curbei ROC am reusit o rată de predicție a riscului de

5
preeclampsie de 58.3% la o rată a rezultatelor fals pozitive de 5%, și de 83.3% la o rată a
rezultatelor fals pozitive de 10%.
Concluzii. În acest prim studiu am demonstrat posibilitatea depistării precoce a riscului
de preeclampsie, plecând de la elementele descrise, iar datele obținute sunt apropiate de
cele comunicate până în prezent în literatură.

Studiul 2. Testarea capacității predictive a ARN-ului total, prezent în plasma

maternă la finalul primului trimestru de sarcină, pentru dezvoltarea unui
sindrom preeclamptic.

Scop. Traficul de acizi nucleici dinspre unitatea feto-placentară spre sectorul matern
este modificat în sarcinile complicate de preeclampsie, iar unele studii au semnalat
modificări ale acestuia înainte de debutul clinic al bolii. În acest studiu am evaluat
comparativ concentrația plasmatică maternă a ARN-ului total la finalul primului
trimestru de sarcină, în cazul sarcinilor normotensive și al celor complicate ulterior de
preeclampsie și am testat eventuala capacitate predictivă a acestui marker pentru
dezvoltarea preeclampsiei.
Material și metodă. De la fiecare participantă la studiu s-au recultat 2 ml sânge venos în
eprubetă tip Vacutainer cu EDTA, în vederea extracției ARN-ului plasmatic total la
Departamentul de Biologie Celulară și Moleculară al Universității de Medicină și
Farmacie “Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca. Pentru extracție s-a folosit kitul dedicat
MasterPureTM Complete DNA and RNA Purification Kit® (Epicentre®, Madison, USA),
conform instrucțiunilor producătorului. Concentrația ARN a fost stabilită prin
nanospectrofotometrie, cu dispozitiv Implen NanoPhotometer, Scimetrics, USA. După
analiza comparativă a datelor pe baza testului egalității mediilor, s-a efectuat analiza
regresională logistică binară, și s-a generat curba ROC.
Rezultate. În urma analizei efectuate nu am găsit nicio corelație între nivelul acestui
marker și riscul de preeclampsie și nicio corelație între concentrația de ARN plasmatic
total si caracteristicile materne.
Concluzii: concentrația ARN-ului total în plasma maternă în primul trimestru de sarcină
nu prezintă corelație cu riscul de boala, astfel nu este utilă în predicția preeclampsiei.

Studiul 3. Evaluarea valorii predictive a ARN-ului mesager specific placentar

pentru patologia vasculară sistemică la finalul primului trimestru de sarcină.
Scop. În acest studiu am evaluat capacitatea predictivă a 2 transcripte specific
placentare (ARNm al PIGF și ARNm al PAPP-A), datele din literatură și rezultatele
noastre arătând o corelație cu riscul de boală al produsului proteic final al acestor gene.
Unele studii au remarcat o modificare precoce a nivelului plasmatic al unor specii de
ARN mesager specific placenter în sarcinile care ulterior au dezvoltat preeclampsie.
Astfel, am încercat să generam un model predictiv multivariat al preeclampsiei, compus
din concentrația acestor transcripte și elementele de istoric matern.

6
Material si metodă. Depistarea și amplificarea celor 2 transcripte placentare s-a facut
cu ajutorul reacţiei Real-Time PCR, utilizându-se aparatul RT-PCR Light Scanner 32
(Idaho Technology Inc., USA) și primeri ADN dedicați pentru fiecare genă, produși de
PrimerDesign®, Marea Britanie.
Rezultate: Am constatat diferențe semnificative statistic ale concentratiilor celor 2
transcripte între gravidele sănătoase și cele ce au dezvoltat ulterior preeclampsie,
diferente demonstrabile încă de la finalul primului trimestru de sarcină. După generarea
funcției scor și a curbei ROC am obținut o rată de detecție a preeclampsiei de 33%
pentru o rată a rezultatelor fals pozitive de 5% și de 75% la o rată a rezultatelor fals
pozitive de 10%.
Concluzii. Rezultatele noastre sugerează că gravidele destinate să dezvolte
preeclampsie prezintă modificări precoce ale transcriptomului placentar, identificabile
și cuantificabile în plasma materna.

CONCLUZII GENERALE

1. Preeclampsia continuă să rămână, prin morbiditatea și mortalitatea materno-fetală

asociată, una din problemele majore ale practicii obstetricale, necesitatea unui
screening precoce și eficient, fiind pe deplin justificată.
2. Screening-ul multimodal construit pe istoricul matern, velocimetria Doppler a
arterelor uterine și concentrația plasmatică a PIGF și PAPP-A, permite detectarea
precoce a gravidelor cu risc de preeclampsie la o rată ce justifică utilizarea acestor
algoritmi în practica curentă.
3. Evaluarea strict cantitativă a ARN-ului total, prezent în plasmă la finalul primului
trimestru de sarcină, nu se coreleaza cu riscul subsecvent de preeclampsie și nici cu
parametrii individuali materni.
4. Expresia genetică placentară este modificată precoce, la nivel transcriptomic, nivelul
plasmatic al unor specii de ARN mesager de origine placentară fiind alterat în cazul
viitoarelor preeclamptice comparativ cu cele cu sarcini normotensive, aspecte
demonstrabile încă de la finalul primului timestru de sarcină.
5. Screening-ul preeclampsiei, construit pe istoricul matern și concentrația
transcriptelor placentare este posibil, datele noastre arătând rate de detecție
apropiate, dar ușor inferioare celor oferite de screening-ul bazat pe Doppler arterial
uterin și concentrația proteinelor PIGF și PAPP-A.

ORIGINALITATEA ȘI CONTRIBUȚIILE INOVATIVE ALE TEZEI

Deși ultimii ani au adus progrese majore în descifrarea mecanismelor

patogenetice ale preeclampsiei, această afecțiune continuă să rămână o “boală a
teoriilor”, lămurirea completă a mecanismelor bolii fiind încă departe de final, ca și

7
existența unei metodologii unice de screening, care să întrunească acceptanța
practicienilor și a pacientelor, implementabilă în practica zilnică.
În teza de față am încercat să îmi aduc contribuția la evaluarea unor metode de
screening precoce, aplicabile de la finalul primului trimestru de sarcină, a gravidelor cu
risc de a dezvolta această patologie obstetricală, prin aplicarea și analizarea comparativă
a 3 seturi de teste predictive, pe aceeași cohortă de paciente.
Am demonstrat că screening-ul preeclampsiei este posibil, cele mai bune
rezultate au fost furnizare de screening-ul multimodal, prin asocierea elementelor de
istoric matern cu velocimetria Doppler a arterelor uterine și cu concentrația plasmatică
a PIGF și PAPP-A.
Am demonstrat că transcriptomul placentar prezintă modificări precoce în cazul
sarcinilor cu risc preeclamptic și că aceste modificări pot fi evidențiate prin metode non-
invazive pe unitatea feto-placentară.

8
SUMMARY OF THE PhD THESIS

Prenatal screening of pregnant women

with systemic vascular pathology

PhD Student Surugiu Cosmin Sebastian

PhD Scientific Coordinator Prof. Dr. Florin Stamatian

Cluj-Napoca
2015

9
 SUMMARY
INTRODUCTION 15
CURRENT STATE OF THE ART 18
7. Definitions 18
8. Classification 18
9. Incidence 21
10. Etiopathogeny 21
10.1. Placental angiogenic balance alteration 22
10.1.1. Proangiogenic factors 23
10.1.2. Antiangiogenic factors and their role in PE pathogenesis 24
10.2. Oxidative stress and systemic endothelial disfunction 25
10.2.1. Placental oxidative stress 25
10.2.2. Systemic endothelial activation and disfunction 26
10.3. Imunological and genetic factors 27
11. Risk factors and natural history 29
12. Predictive tests for PE 30
12.1. Vascular disfunction and placental hypoerfusion related tests 31
12.1.1. Blood pressure measurement 31
12.1.2. Roll-over test and angiotensin II test 31
12.1.3. Uterine arteries Doppler velocimetry 32
12.2. Fetal-placental endocrine unit disfunction related tests 33
12.2.1. Pregnancy-associated plasmatic protein A 33
12.2.2. Human chorionc gondatropin 33
12.2.3. Placental protein 13 33
12.2.4. Alfa-fetoprotein 34
12.3. Oxidative stress and endothelial disfunction related tests. 34
12.3.1. Circulating angiogenic factors 34
12.3.2. Fibronectin 35
12.4. Combined tests 35
12.5. Fetal placental nucleic acids 37
12.6. Proteomics 39
PERSONAL CONTRIBUTION 41
7. Working hypothesis/Goals 42
8. Study 1 – The assessement of a multiparametric screening algorithm for 43
preeclampsia prediction at the end of the first trimester of pregnancy.
8.1. Introduction 43
8.2. Material and method 43
8.2.1. Case selection 45
8.2.2. Ultrasound scan evaluation 46
8.2.3. Laboratory findings 46
8.2.4. Clinical definitions 47
8.2.5. Statistical analysis 47
8.3. Results 48
8.3.1. Comparative analysis of demografic variables 49
8.3.2. Comparative analysis of the sonographic variables 52
8.3.3. Comparative analysis of the biochemical parameters 58
8.3.4. Binary regressive model and ROC curve construction 63
8.4. Discussions 67
8.5. Conclusions 70
9. Study 2 – Testing the predictive value of total maternal plasmatic RNA, at the 71

10
 end of the first trimester, for preeclampsia development
9.1. Introduction 71
9.2. Material and method 73
9.2.1. Case selection 73
9.2.2. Clinical definitions 74
9.2.3. Laboratory findings 74
9.2.3.1. Plasma separation 74
9.2.3.2. Total RNA extraction 75
9.2.3.3. Total RNA concentration determination 76
9.2.4. Statistic analysis 76
9.3. Results 77
9.4. Discussions 80
9.5. Conclusions 82
10. Study 3 – The assessment of the placenta-derived messenger RNA predictive 83
value for vascular systemic pathology at the end of the first trimester of
pregnancy
10.1. Introduction 83
10.2. Material and method 86
10.2.1. Case selection 86
10.2.2. Clinical definitions 87
10.2.3. Laboratory findings 87
10.2.3.1. Plasma separation, total RNA extraction 87
10.2.3.2. Total plasmatic RNA cuantification 88
10.2.3.3. Samples amplification 88
10.2.4. Statistical analysis 89
10.3. Results 90
10.3.1. Study cohort evolution 90
10.3.2. Comparative analysis of demografic variables 90
10.3.3. Comparative analysis of nucleic acids concentrations 91
10.3.4. Binary regresional model and ROC curve construction 96
10.4. Discussions 100
10.5. Conclusions 103
11. General conclusions 104
12. Originality and innovative contributions of the thesis 105
REFERENCES 107
ANNEXES 129

Key words: preeclampsia, screening, uterine Doppler, PIGF, PAPP-A, messenger ARN

11
 INTRODUCTION
The development after 20 weeks of pregnancy of arterial hypertension (defined
as blood pressure values equal to or greater than 140/90 mm Hg), associated with
proteinuria defines preeclampsia, a severe multisystemic disorder, one of the main
causes of maternal and fetal morbidity and mortality worldwide. Current data estimates
that there are annually over 60,000 maternal deaths worldwide secondary to
complications developed amid this syndrome, in addition to immediate and remote
maternal and fetal complications, the implications of personal, family and social
consequences of preeclampsia.
Since preeclampsia delivers only with the complete removal of the placenta and
the presence of this organ is regarded as necessary and sufficient for the development of
preeclampsia, recent years research have focused on the placenta as a source of disease.
Thus essential data were obtained related to alterations in the balance between pro- and
anti-angiogenic factors involved in the pathogenesis of the clinical syndrome , along with
oxidative stress , genetic and immunological factors , all playing a role in generating
clinical manifestations.
The utero-placental vessels development is under humoral control since its early
stages and any imbalance between proangiogenic factors (PIGF, VEGF and
antiangionenic (sFlt -1, endoglin) will predispose to the development of a preeclamptic
syndrome. Currently alterations in concentrations of these markers is demonstrated in
cases of preeclampsia, and in many cases these changes precede the clinical onset with
weeks / months, suggesting the opportunity of their use in screening.
Preeclampsia is now considered as a condition of oxidative stress, placental
hypoperfusion of preeclampsia along with reperfusion episodes generating free oxygen
radicals at the placental level. This local oxidative stress will cause the release into
maternal circulation of trophoblastic microparticles (containing nucleic acids) with
direct role in the activation and disfunction of the maternal endothelium at systemic
levels.
The immunological component of the pathogenesis of this syndrome has been
long time stipulated, following some empirical observations who noticed that
preeclampsia is a disease of first pregnancy and preconceptional exposure to paternal
antigens lowers the risk of disease. A number of studies have reported an aberrant local
expression of HLA molecules and uterine NK cell function. Preeclampsia’s genetic
component has been recognized for over 100 years after the cases of familial
aggregation and higher incidence among black race.
The availability of an effective predictive test would allow early identification of
pregnant women at high risk, implementation of preventive and/or therapeutic
measures prior to major complications installation, which would represent a real
progress in maternal-fetal medicine. Numerous predictive tests have been tried over
time, without any of them having approached the features of an ideal test ready to be
implemented in clinical practice. The best results were offered by the combined
screening represented by the use of multiparametric screening algorithms, composed of

12
risk factor derived from maternal history , uterine Doppler parameters (PI) and the
concentrations of proteic markers of placental origin (PIGF , PAPP -A, sFlt- 1 , endoglin).
Promising results are offered by the study of fetal-placental nucleic acids traficking in
maternal plasma (mainly species of messenger RNA ), few studies reporting early
changes in placental trasncription in cases prone to preeclampia development.

PERSONAL CONTRIBUTION

In the present research work we evaluated the ability of three different batteries
of predictive tests to detect the risk of preeclampsia. These three tests were applied
simultaneously at the end of the first trimester of pregnancy to a cohort of 250 pregnant
women after obtaining their informed consent, They were prospectively followed until
delivery. The whole research methodology was initially submitted for approval by the
Ethics Committee of the University.
Inclusion criteria were: primiparous, secundiparous with first pregnancy
complicated by preeclampsia, gestational age of 11-13 + 6 weeks.
Exclusion criteria were: secundiparous with previous normotensive pregnancy,
multipara , twin pregnancy / multiple pregnancy, gestational age outside set boundaries,
confirmed by ultrassound, suspicion af aneuploidies or fetal abnormalities detectable by
ultrasound, refusing to participate in the study.
The overall incidence of preeclampsia was 5 % .

Study 1. The assessement of a multiparametric screening algorithm for

preeclampsia prediction at the end of the first trimester of pregnancy.

Purpose. In this study we evaluated the ability of a screening algorithm consisting of

classic risk elements derived from maternal history , pulsatility index (PI) of the uterine
arteries measured by Doppler ultrasound and the plasma concentration of three
trophoblast-derived proteins (PIGF, PAPP -A and β -hCG) to identify pregnant women
with preeclampsia risk.
Material and method. The 250 cases included in the study provided information about
age, origin (urban/rural ), family history of preeclampsia (mother / sister ), weight ,
height, with calculation of body mass index (BMI), presence of a previous miscarriage
(spontaneous/provoked), comorbidities (preexistent arterial hypertension or other
vasculopathy , diabetic nephropathy, thrombophilia), cigarette smoking. Uterine arterial
PI was measured bilateral using a Voluson E8® - General Electric ultrasound equipment.
The concentration of the 3 placental proteins in maternal plasma was determined with
dedicated kits on Delfia Dedicated Auto Express 6000 Immunoanalyzer (Perkin Elmer®)
automatic platform. Statistical analysis was done by logistic regression generating the
score function and the ROC curve that were subsequently use to calculate preeclampsia
detection rates.
Results. We found significantly higher values of minimal uterine IP among future
preeclamptic women, also concentrations of PIGF and PAPP-A were significantly lower

13
in the same group. β -hCG showed no statistical correlation with preeclampsia risk .
Following statistical analysis, based on the function score and the ROC curve we
obtained a preeclampsia risk detection rate of 58.3 % at a false positive rate of 5% and
of 83.3 % at a rate of false positive 10 % respectively.
Conclusions. In this first study we demonstrated the possibility of early detection of
preeclampsia risk , based on the described elements and the data obtained are similar to
those reported in the literature to date.

Study 2 – Testing the predictive value of total maternal plasmatic RNA, at the end
of the first trimester, for preeclampsia development

Purpose. Nucleic acids traffic from the fetal placental unit to the mother is altered in
pregnancies complicated by preeclampsia and some studies have reported its changes
before the clinical onset of the disease. In this study we evaluated in a camparative
manner total RNA concentration in maternal plasma at the end of the first trimester of
pregnancy between normotensive pregnancies and those complicated by preeclampsia
and tested wether this marker has any predictive power for preeclampsia development.
Material and method. From each subject 2 ml venous blood were obtained in EDTA-
Vacutainer type tube in order to extract the RNA total plasma at the Department of Cell
and Molecular Biology at the University of Medicine and Pharmacy " Iuliu Haţieganu "
Cluj- Napoca. We used for RNA extraction the deditaced kit DNA and RNA Purification
Full MasterPureTM Kit® ( Epicentre® , Madison , USA ) according to manufacturer's
instructions. RNA concentration was determined by nanospectrophotometry with
NanoPhotometer Implen device , Scimetrics , USA. After benchmarking data based on
averages equality test, binary logistic regression analysis was performed , and the ROC
curve was generated.
Results. The analysis we perform did not prove any correlation between either the level
of this marker and the risk of preeclampsia or between plasma concentration of total
RNA and maternal characteristics.
Conclusions. Total RNA concentration in maternal plasma in the first trimester maternal
shows no correlation with the risk of disease, thus it is not helpful in predicting
preeclampsia.

Study 3. The assessment of the placenta-derived messenger RNA predictive value

for vascular systemic pathology at the end of the first trimester of pregnancy.

Purpose. In this study we evaluated the predictive ability of two placental specific
transcripts (PIGF mRNA and PAPP-A mRNA), the literature data and our results showing
a correlation with the risk of disease of the final protein products of these genes. Some
studies have noted an early change in plasma levels of placental specific messenger RNA
species in pregnancies subsequently complicated by preeclampsia. So we tried to
generate a multivariate predictive model of preeclampsia prediction, consisting of these
transcripts plasmatic concentration and elements derived from maternal history.

14
Material and method. The detection and amplification of two placental transcripts was
performed using Real-Time PCR reaction using RT-PCR machine 32 Light Scanner
(Idaho Technology Inc., USA) and dedicated DNA primers for each gene were used,
produced by PrimerDesign®, UK.
Results. We found statistically significant differences in the concentrations of the two
transcripts between healthy pregnant women and those who later developed
preeclampsia, demonstrable since the end of the first trimester. After generating the
function score and the ROC curve we achieved a preeclampsia detection rate of 33 % at a
false positive rate of 5% and a detection rate of 75% at a false positive rate of 10%.
Conclusions. Our results suggest that pregnant women experience changes destined to
develop preeclampsia experience early changesof the placental transcriptome, changes
that are identifiable and measurable in maternal plasma.

GENERAL CONCLUSIONS

1. Preeclampsia continues to remain, through associated maternal and fetal morbidity

and mortality, one of the major problems of obstetrical practice, thus the need for
early and effective screening being fully justified.
2. Multimodal screening built on maternal history, uterine artery Doppler velocimetry
and serum PlGF and PAPP–A concentrations allow early detection of preeclampsia
risk pregnant women at a rate that justifies the use of these algorithms in practice.
3. Strictly quantitative assessment of total RNA present in maternal plasma at the end
of the first trimester does not correlate with subsequent risk of preeclampsia and or
with individual maternal parameters.
4. Placental gene expression is early altered at transcriptomic level, plasma levels of
messenger RNA species of placental origin being altered in cases of future
preeclamptic women compared with normotensive ones, as demonstrated since the
end of the first timestru load.
5. Preeclampsia screening, built on maternal history and concentration of placental
transcripts is possible, our data showing detection rates close but slightly below
those offered by the combined screening based on uterine artery Doppler and
plasma concentrations of PlGF and PAPP.

THESIS ORIGINALITY AND INNOVATIVE CONTRIBUTIONS

Although recent years have brought major advances in deciphering the

mechanisms of preeclampsia pathogenesis, this disease remains a " disease of theories ",
complete clarification of disease mechanisms is still far from final, alongside with a
uniform screening methodology for screening that meets acceptance practitioners and
patients acceptance, ready to be implemented in daily practice.
In this thesis I tried to contribute to the evaluation of early screening methods,
applicable from the end of the first trimester to pregnant women at risk of developing

15
this obstetric pathology, through implementation and benchmarking 3 sets of predictive
tests on the same cohort of patients.
We have proved that screening for preeclampsia is possible, the best results have
been providing by the multimodal screening, associating elements derived from
maternal history, uterine artery Doppler velocimetry and serum PlGF and PAPP –A
concentrations.
We demonstrated that placental transcriptome show early changes in
pregnancies at risk for preeclampsia and that these changes can be highlighted by
methods that are non -invasive on the fetal-placental unit.

16
17