Tehnica FISH

Hibridizarea fluorescent in situ (FISH – Fluorescence in situ Hybridization) este o tehnică

de citogenetică moleculară utilizată în scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice
șistructurale care nu pot fi detectate prin cariotipare.
Principiul acestei metode constă în ataşarea la secvenţa-ţintă a unei sonde de ADN
monocatenar (de circa 40 kb), marcată fluorescent, pe baza complementarităţii, de o secvenţă-
ţintă a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la microscopul cu
fluorescenţă echipat cu filtre de excitaţie şi emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice
zonei-ţintă. Se numără şi se analizează semnalele prezente în o sută de celule (de ex., trei
semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indică sindromul Down).
Tehnica FISH permite detectarea mozaicismelor, identificarea rearanjărilor
cromozomiale complexe. Mai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader Willi,
Angelman, Di George) produse de microdeleţii sau microduplicaţii, suspectate clinic, imposibil
de observat prin tehnicile citogenetice convenţionale, pot fi evidenţiate prin FISH metafazic.
Întrucât această metodă presupune ca primă etapă de lucru obţinerea unor culturi celulare
(limfocite din sânge periferic sau amniocite recoltate prin amniocenteză în săptămânile 15-17 de
sarcină), rezultatul investigaţiei este obţinut în două săptămâni.
FISH-ul interfazic permite punerea în evidenţă a anomaliilor numerice, detecţia sexului
genetic într-un timp scurt (48-72 h). Se realizează pe nuclei interfazici fără să fie nevoie de
efectuarea de culturi celulare. Se folosesc sonde de ADN corespunzătoare regiunilor
centromerice ale cromozomilor 18, X, Y, respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13
şi 21. Metoda este mai puţin informativă în cazul contaminării cu celule materne (comparativ cu
alte tehnici).
Avantaje  Mai puțin laborioasă
Mai rapidă decât citogenetica clasică (cariotiparea): 48 h vs 2 -3 săptămâni
Foarte sensibilă la detectarea rearanjărilor, amplificărilor, delețiilor
Poate subselecta populațiile celulare
Preparare directă
Dezavantaje: o Interpretarea rezultatelor este subiectivă
o Modele obținute complexe și greu de interpretat
o Grad mai mic de automatizare
o Nu determină anomalii structurale ale cromozomilor
 Tehnica PCR (Reacția de polimerizare în lanț)

Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metodă de amplificare enzimatică in

vitro a unei anumite secvenţe de ADN. Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită
din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce
hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare). Primerii
reprezintă secvenţe oligonucleotidice monocatenare de 20-30 baze care sunt obţinute prin sinteză
artificială. PCR se bazează pe hibridarea ADN cercetat - primer şi replicarea semiconservativă a
ADN.
Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in
vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi,
respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte
de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN - dependentă
(cu funcţie de replicază).
Treptele de temperatură ale unei reacţii PCR standard
o Denaturarea iniţială
Pentru ca o reacţie PCR să se desfăşoare eficient, este foarte important ca moleculele
ADN matriţă să fie denaturate iniţial complet. Acest lucru poate fi realizat prin încălzirea iniţială
a amestecului de reacţie 2 min la 94-95 oC.
o Treapta de denaturare din cadrul fiecărui ciclu
De obicei, este suficientă o denaturare de 20-30 sec la 94-95 oC, dar aceasta trebuie
adaptată funcţie de termocycler şi detuburile folosite (de ex., dacă se lucrează în tuburi de 500μl
sunt necesari timpi mai lungi decât dacă se lucrează în tuburi de 200 μl). Totodată, pentru matriţe
bogate în GC se recomandă folosirea unor timpi de denaturare mai lungi.
o Ataşarea primerilor
  În marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataşare a primerilor trebuie
determinată şi optimizată empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezintăunul din factorii cei
mai critici pentru asigurarea unei înalte specifictăţi a reacţiei PCR. Dacă temperatura de ataşare
este mult prea înaltă, nu are loc ataşarea primerilor, iar dacătemperatura este prea scăzută, atunci
creşte probabilitatea ataşărilor nespecifice.
o Polimerizarea propriu-zisă
În fiecare ciclu, o perioadă de polimerizare de 45s este suficientă pentru amplificarea
unor fragmente de până la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul
se calculează în multiplii de 45s, urmat de ajustări pentru diverse matriţe. O asemenea mărire
progresivă a timpului de polimerizare oferă enzimei mai mult timp pentru polimerizare, pentru că
pe măsură ce reacţia PCR avansează, în amestecul de reacţie se găseşte din ce în ce mai multă
matriţă şi din ce în ce mai puţină enzimă activă (randamentul enzimei scade datorită expunerii
prelungite la temperaturi înalte).
o Numărul de cicluri
 Într-o reacţie PCR obişnuită, mai puţin de 10 molecule de matriţă pot fi amplificate în
mai puţinde 40 de cicluri, obţinându-se un produs (amplicon) detectabil în electroforeză în gel de
agaroză. La o creştere mult prea mare a numărului de cicluri, se pot acumula produşi de reacţie
nespecifici.
o Polimerizarea (extensia) finală
 În multe reacţii, după ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacţie se tin 5-15 min la
o
72 C pentru a realiza polimerizarea completă a produşilor parţiali, precum şi renaturarea
moleculelor monocatenare.
Avantaje anticipate :
analiza completă în 24-48 ore
interpretare cantitativa mai puțin subiectivă decat FISH
mai putin laborioasă decat FISH
grad mai mare de automatizare
Dezavantaje:
o aplicarea pentru diagnosticele de aneuploidie este mai limitată
o costuri mai mari decât FISH

Bibliografie
1. http://www.saptamanamedicala.ro//articole/Hibrizitatea-fluorescenta
2. https://www.scribd.com/document/354378766/Genetica-tehnica-FISH-si-PCR
3. https://www.i-medic.ro/analize/reactia-de-polimerizare-lant-pcr
4. http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap3-3_Tehnologia_PCR.pdf

Muntean Raluca- Larisa

MG II, grupa 5