¿Qué es la PCR?

La PCR es una técnica utilizada en biología molecular que permite conseguir

una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN, partiendo de una
cantidad mínima de esta biomolécula. Esta técnica fue diseñada tal y como la
conocemos por los bioquímicos Kary Banks Mullis y Michael Smith en la década
de los 90, quienes consiguieron patentarla.

La PCR se basa en una actividad enzimática que sucede de forma normal en las
células de nuestro organismo. En las células, las ADN polimerasas son capaces
de replicar el ADN nuclear, para obtener dos copias idénticas, que después serán
repartidas a las células hijas en la mitosis. Bien, pues, de igual modo, en la PCR
las polimerasas serán capaces de replicar, cual fotocopiadora, un fragmento de
ADN, en varios ciclos, para obtener una gran cantidad de copias igualitas a ella.

¿Para qué sirve una PCR?

Todo investigador que trabaje con moléculas de ADN conoce esta técnica. Y es
que la PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos. Por ejemplo,
en investigación bioquímica y médica, la PCR permite preparar fragmentos de
ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como
vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además,
en Medicina, esta técnica es utilizada para diagnosticar enfermedades
hereditarias. ¡Incluso se utiliza para identificar patógenos!

Por si fuera poco, la PCR es una técnica importantísima en las pruebas de

paternidad y en los análisis forenses de la policía científica.

¿Qué se necesita para hacer una PCR?

Los ingredientes esenciales para llevar a cabo una PCR son los siguientes:

1. ADN molde: Se trata del fragmento de ADN que queremos amplificar

mediante la PCR.
2. Desoxirribonucleótidos-trifosfato: Como sabéis, el ADN está compuesto
por 4 tipos de nucleótidos, formados por 4 bases nitrogenadas: adenina,
guanina, citosina y timina: Es de esperar, entonces, que estos 4
desoxirribonucleótidos-trifosfato sean indispensables para poder obtener
nuevas moléculas de ADN
3. Cebadores (en inglés, primers): son oligonucleótidos, secuencias cortas
de ADN, que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de
inicio para comenzar la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos
cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que
buscamos amplificar. Estos oligonucleótidos determinan la región del ADN
a amplificar.
4. ADN polimerasas: Las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se
pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios
 organismos. Sin embargo, la más utilizada dada su efectividad, es la ADN
polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también llamada Polimerasa
Taq. Esta polimerasa es idónea para la PCR por su resistencia a las altas
temperaturas que se utilizan en el proceso.
5. Iones divalentes de magnesio: En la PCR se utilizan iones de carga
positiva como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales
para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de
magnesio para que al disociarse se libere magnesio (con carga +2).
6. Solución tampón: Una solución tampón es una disolución que es capaz
de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de
nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la
disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se
produzca

En la PCR es muy importante regular las condiciones de temperatura en las que

se encuentran las reacciones. Para ello, se utiliza un “horno” especial,
el termociclador.

7. Termociclador: Un termociclador es un aparato que regula la temperatura

en cada ciclo de la PCR. Gracias a él es posible realizar esta técnica en
muchísimo menos tiempo, ya que para realizarla, se debe modificar la
temperatura de la solución en varias ocasiones.

¿Cómo funciona una PCR?

La PCR se compone de varios ciclos, que se repiten unas 30 veces, dependiendo
de la cantidad de muestra que necesitamos. Cada ciclo comprende
la desnaturalización de la doble hebra de ADN y la síntesis de la una nueva
cadena de ADN por cada cadena haya presente. De este modo, si comenzamos
con una única molécula de ADN en la muestra, obtendremos 2 en el primer ciclo, 4
en el segundo ciclo… ¡y 2 147 483 648 moléculas en el ciclo número 29!

1. En la primera parte del ciclo de una PCR, se desnaturalizan la moléculas

de ADN de la muestra. Esto significa que las dos cadenas que forman cada
molécula se separan, dando lugar a dos moléculas de ADN monocatenario.
Normalmente, este primer paso se logra realizar mediante un aumento
muy grande de la temperatura de la solución (aproximadamente a 95º).
2. El siguiente paso de un ciclo de la PCR implica unas moléculas muy
importantes, de las que hablaba antes, los cebadores. En este paso, se
disminuye la temperatura de la solución para favorecer la unión de los
cebadores al ADN monocatenario que habíamos obtenido en el proceso
anterior. Recordad que los cebadores se unen al ADN de forma específica,
así que solo amplificaremos la región de las moléculas que nos interese.
3. Acto seguido, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo, para que
la ADN polimerasa pueda actuar a partir de los cebadores. La temperatura
en este paso es dependiente de la ADN polimerasa que se esté utilizando.
 Por ejemplo, para la polimerasa Taq, la temperatura ideal está entre los
70ºC y los 80ºC. En este paso, la polimerasa utiliza como molde las
cadenas de ADN monocatenario y va añadiendo al cebador los
desoxirribonucleótidos-trifosfato complementarios a la cadena molde,
formando una nueva cadena.

Una vez se ha realizado un ciclo, se repiten los pasos de nuevo. De este modo,
las cadenas obtenidas en el primer ciclo se utilizan como molde en el segundo
ciclo, las obtenidas en el segundo se usan como molde en el tercero y así
consecutivamente.

Este es el tipo de PCR más sencillo. Sin embargo, existen muchas variaciones de
esta técnica que nos permiten obtener diferentes resultados. Veamos algunas de
ellas:

Otros tipos de PCR

1. PCR anidada: se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos
pares de cebadores. En un primer paso, se realiza la amplificación de una
región del genoma, para después concretar más la región mediante una
segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza para amplificar
fragmentos muy específicos del genoma.
2. RT-PCR: Esta técnica convierte el ARN de una muestra en ADN. Para
ello utiliza la transcriptasa inversa, una enzima utilizada por los retrovirus
Se utiliza para múltiples objetivos. Por ejemplo se puede utilizar para saber
si un gen se está expresando en una muestra biológica. También se utiliza
para genotipar diferentes virus de ARN, como el SARS-Co-V o el VIH.
3. PCR cuantitativa: es una PCR que permite medir en tiempo real la
cantidad de fragmentos que se van produciendo. Se utiliza a menudo
para analizar la expresión de los genes.

4. PCR múltiple: en este tipo de PCR se realizan amplificaciones

simultáneas de más de un fragmento de ADN. Para ello, se utilizan varios
cebadores diferentes en una misma reacción.
5. PCR in situ: esta PCR se realiza en células o tejidos. Se utiliza para
poder detectar secuencias de ADN en el interior de las células que no
son detectables mediante otras técnicas.
6. PCR digital: es una de las últimas generaciones en técnicas de
amplificación de ADN. Está basada en la separación de cada muestra en
múltiples particiones (microgotas), de forma que la reacción de
amplificación se produce de forma independiente cada una de ellas.

Estos solo son algunos de los tipos más conocidos de PCR, aunque también
existen muchas otras variaciones de la PCR, como la PCR asimétrica, o la PCR
específica de alelo, que consiguen diferentes resultados a partir de las muestras
de ADN obtenidas.
Un termociclador es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de
temperaturas necesarios para la amplificación de diversas hebras de ADN en la técnica de
la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) o para reacciones de secuencia con el método
de Sanger. El modelo más común consiste en un bloque de resistencia eléctrica que distribuye
una temperatura homogénea a través de una placa durante tiempos que pueden ser
programables, normalmente con rangos de temperatura de 4 °C a 96 °C donde ocurre la
desnaturalización, hibridación y extensión de una molécula de ADN. Dado que las reacciones
incubadas en el aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir en la tapa una placa
calentada constantemente a 103 °C para evitar la condensación del agua en las tapas de los
tubos donde ocurre la reacción, y así evitar que los solutos se concentren, lo que modificaría
las condiciones óptimas para la enzima polimerizante (Taq Polimerasa) y la termodinámica del
apareamiento de los iniciadores conocidos como primers o cebadores.
Desde hace algunos años se ha implemetado un nuevo método para cambiar la resistencia de
estos termocicladores, utilizando para ello la tecnología o efecto Peltier (Descubierto en 1834)
aprovechando las propiedades de los semiconductores. El efecto Peltier hace referencia a la
creación de una diferencia de temperatura debido a un voltaje eléctrico. Esto ocurre cuando
una corriente se hace pasar por dos metales o semiconductores conectados por dos “junturas
de Peltier”. La corriente propicia una transferencia de calor de una juntura a la otra: una se
enfría, mientras que la otra se calienta. Este material ofrece mejor uniformidad en la
temperatura y rampas de incremento y decremento de la temperatura mucho más
pronunciadas, obteniendo mejores resultados en los procesos de la PCR.

Hoy día, se ha implementado en los laboratorios un Termociclador en Gradiente. La PCR de

gradiente es actualmente el método que se utiliza para seleccionar las condiciones térmicas
óptimas de la reacción. Un gradiente de temperaturas programado libremente hasta 20°C no
sólo permite optimizar la temperatura de renaturalización, sino también todos los pasos de
temperatura de un protocolo de la PCR en las aplicaciones más complejas. Gracias a la
tecnología de pendiente constante, siempre se utilizan índices de calentamiento y
refrigeración constantes, de forma que los resultados del experimento gradiente se pueden
realizar con sencillez y precisión en aplicaciones rutinarias. En la búsqueda de mejorar la
precisión, exactitud y homogeneidad de la temperatura también se han introducido metales
como el oro, la plata y otras aleaciones en los bloques de los pozos, logrando estabilidad y
reproducibilidad en los ensayos.

Pcr isotermica