Metode si materiale

Un singur centru, cu studii paralele a fost efectuat. Aprobarea etică pentru studiu
a fost dată de comitetul RECA HSC, ref. 14 / NI / 1107. Patruzeci și trei de
pacienți cu carie activă au fost recrutați de la cei care frecventează clinicile
studenților de licență și clinicile de consultanți de la Spitalul Dental Guy. Pacienții
aveau vârsta sub 18 ani și au un risc ridicat de carii dentare, pe baza prezenței
unuia sau mai multor dintre următorii indicatori ai bolii: cavități vizibile sau
evidență radiografică a penetrării leziunilor în cearină; dovezi radiografice
interproximale ale penei leziunii în dentină; leziuni ale petei albe pe suprafețe
netede; restaurari în termen de 3 ani anteriori din cauza cariilor. Pacienții au fost
diagnosticați cu carii dentare active, cu cel puțin o leziune primară activă în smalț
și / sau dentină, cu excepția cariilor recurente sub restaurări sau carii arestate.
Tratamentul leziunilor carioase a fost efectuat după terminarea studiului. Studiul a
avut o durată scurtă și a fost efectuat în timp ce pacienții așteptau o programare la
tratament.

Douăzeci de voluntari sănătoși au fost recrutați din personal și studenți la King’s

College London și nu aveau carie activă. Toți subiecții aveau cel puțin 20 de dinți
naturali, cu cel mult patru coroane (excluzând al treilea molar), erau în stare bună
de sănătate generală și nu aveau istoricul cunoscut al reacțiilor la alcoolii din zahăr.

Subiecții potențiali au fost excluși din studiu dacă aveau boală parodontală
avansată; boli ale țesuturilor moi bucale; aparate ortodontice; funcție salivară
anormală în afecțiunile care duc la gură uscată, cum ar fi sindromul Sjögren; a
primit antibiotice cu o lună înainte sau în timpul acestui studiu; erau însărcinate sau
alăptau; participase la un alt studiu clinic în luna precedentă acestui studiu; au fost
imunocompromisi (de exemplu, suferind de HIV / SIDA sau au primit terapie
medicamentoasă imunosupresivă); sau consumat regulat mai mult de trei bețe de
gumă de mestecat pe zi.

În urma recrutării, subiecților li s-a oferit o pastă de dinți cu fluorură standard și

o perie de dinți pentru a fi utilizate cu cel puțin 2 săptămâni înainte de începerea
studiului, continuând până la sfârșitul acestuia. Nu a fost oferită nicio instrucțiune
suplimentară de igienă orală. S-a recomandat subiecților să se spele în mod normal,
dar să utilizeze numai produsele furnizate. În această perioadă, subiecților li sa
solicitat să se abțină de la alte proceduri de igienă orală, cum ar fi curățarea
interdentară și să nu folosească alte paste de dinți, clătiri bucale, gumă de mestecat
sau produse fără zahăr. Subiecții erau repartizați în mod obișnuit la guma de
mestecare activă sau la control grup. Au fost colectate probe de placă la început,
după care subiecții li s-a cerut să utilizeze guma de mestecat de cinci ori (două
bucăți de gumă de maltitol SweetPearl® sau o bucată de gumă de bază) pe zi timp
de 2 săptămâni, după care s-au recoltat alte probe de plăci.

Gumele de mestecat au fost formulări experimentale. Guma maltitol a fost

formată din 0,35 g bază de gumă (Cafosa SA, Barcelona, Spania), 0,49 g maltitol
(SweetPearl®, Roquette Frères, Lestrem, Franța), 0,02 g sirop de maltitol
(LYCASIN HBC 80/55, Roquette Frères), 0,004 g glicerină (Dow Chemicals
Company, Midland, MI) și 0,009 g aromă de scânteie (Mane SA, Le Bar-sur-Loup,
Franța). Controlul bazei de gumă a fost constituit din 0,7 g bază gumă (Cafosa
SA), 0,24 g talc (Talc de Luzenac, Rio Tinto Minerals - Luzenac Operations,
Luzenac, Franța) și 0,03 g aromă de sub formă de vânt (Mane SA). Deoarece
maltitolul a inclus mai multe ingrediente în greutate decât baza de gumă,
formulările au fost ajustate astfel încât cantitatea de bază de gumă pe aport este
aceeași pentru ambele produse. O granulă de bază pentru gumă conținea 0,7 g bază
de gumă, în timp ce o peletă de gumă de maltitol conținea 0,35 g de bază de gumă.
În consecință, subiecții din grupul maltitol au mestecat două bucăți de fiecare dată,
în timp ce cei din grupul de control al bazei gingiei au mestecat doar una.
Subiecții au dat confirmarea verbală a conformității cu regimul de mestecat și au
returnat flacoanele de gumă goale după tratament.

Un eșantion de placă a fost colectat după 2 săptămâni de utilizare a unei paste de

dinți standard. Placa a fost colectată la cel puțin 1 oră după ultima masă din zonele
interproximale de pe toți dinții premolari și molari superiori și inferiori. O sondă
parodontală a fost trecută pe suprafețele mesiale și distale ale fiecăruia dintre dinți.
Placa de la fiecare subiect la fiecare vizită a fost colectată și plasată într-un tampon
SSDE de 1 ml (soluție salată saturată 20% DMSO-0,25 M EDTA, pH 8,0) și
păstrată la -70 ° C până când a fost supusă analizei.

ADN-ul a fost extras din probele de plăci cu ajutorul kitului de extracție a ADN-
ului Genelute (Merck, Gillingham, Marea Britanie), cu pretratamentul suplimentar
cu lizozimă (Merck), recomandat de producători pentru bacteriile Gram-pozitive și
genele ARN ARS 16S amplificate de PCR cu primerii 27F (cu modificarea YM) și
519R, care vizează regiunile variabile 1–3.
Fiecare eșantion a fost amplificat folosind clienți care încorporează un cod de bare
unic și adaptoare Roche 454. Ampliconele PCR au fost purificate, dimensionate,
cuantificate și reunite în proporții echimolare. Emulsia PCR și secvențializarea
unidirecțională a bibliotecilor au fost efectuate folosind kitul Lib-L și secvențatorul
Roche 454 GS-FLX Titanium la Departamentul de Biochimie, Universitatea din
Cambridge. Procesarea și analiza secvențelor s-au efectuat folosind versiunea
1.36.1 [6], bazată pe SOS Schloss (ianuarie 2016) [7]. Secvențele au fost grupate în
operaționale, unități taxonomice (OTU) la o distanță de disimilaritate de 0,015,
folosind un algoritm mediu vecin și apoi clasificate folosind un clasificator
Bayesian naiv implementat în mothur cu baza de date Human Oral Microbiome
Database (HOMD) (versiunea 13.2). Diversitatea α a comunităților bacteriene
bazate pe OTU-uri a fost analizată folosind abordări implementate de mothur:
diversitatea comunităților a fost estimată folosind indicele de diversitate inversă
Simpson [8] și bogăția totală a comunităților a fost estimată folosind Chao1 [9].
Pentru analizele β-diver- sitate, seturile de date au fost sub-eșantionate astfel
încât numărul de secvențe a fost egal în toate eșantioanele (egal cu cel al
eșantionului cu cel mai mic număr de secvențe din setul de date).
Pentru a compara diversitatea β a eșantioanelor bazate pe OTU-uri, s-a utilizat
indicele Jaccard (raportul dintre OTU-urile partajate cu OTU-uri distincte) și
metrica θ-YC (compară structura comunității ținând cont de abundența relativă a
taxonilor) [10]. pentru a genera matrice de distanță în molie și vizuate ca parcele de
ordonare prin parcele de scalare multimetrică (NMDS) nemetrică.
Parcele de ordonare au fost generate în R (r-project.org) folosind pachetele rgl și
ggplot2.

Analiza varianței moleculare (AMOVA) [11], astfel cum a fost implementată de

mothur, a fost realizată pentru a determina dacă modelele de clustering văzute în
comploturile NMDS au fost susținute statistic de diferențele din matricea de
distanță. S-a efectuat omogenitatea variației moleculare (HOMOVA) pentru a
compara diversitatea genetică între grupuri.
Parsimony [12] a fost utilizat pentru a compara structura comunității între grupuri.
Probele au fost comparate între grupul de tratament.

De asemenea, a fost efectuată o analiză de oligotipare. Secvențele identificate ca

aparținând genului Actinomyces au fost extrase din setul de date mothur filtrat de
calitate și formatate cu ajutorul instrumentului „mothur2oigo” (disponibil la
https://github.com/michberr/ MicrobeMiseq / tree / master / mothur2oligo).
Analiza descompunerii minime a entropiei (MED) [13] a fost realizată pe 33 777
citite din 117 eșantioane cu conducta MED versiunea 2.1 (disponibila).