Sunteți pe pagina 1din 37

Universitatea POLITEHNICA din Bucureşti

Facultatea de Chimie Aplicată şi Ştiinţa Materialelor


Catedra de Ştiinţa şi Ingineria Materialelor Oxidice şi Nanomateriale

BIOMATERIALE
Curs 2 – continuare (2)

INTERACŢIUNEA CU
MEDIUL FIZIOLOGIC
Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 Evaluarea bicompatibilităţii presupune:


 Determinarea compatibilităţii material – ţesut;
 Determinarea eficacităţii dispozitivului, având în
vedere funcţia căreia îi este destinat.
 Testarea presupune întotdeauna existenţa
mai multor variabile care depind de condiţiile
experimentale, numărul acestora crescând cu
cât este mai complex sistemul (organismul
uman în comparaţie cu o cultură de celule).
 Se utilizează metode statistice, pentru a:
o determina numărul de teste necesare;
o prelucra rezultatele.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 Testarea biomaterialelor poate să nu fie


relevantă:
 în ceea ce priveşte comportamentul dispozitivului
realizat din acesta, în mediul de implantare;
 având în vedere timpul limitat în care se
realizează, în comparaţie cu durata de viaţă a unui
implant, care se poate măsura în zeci de ani.

 mai ieftină şi mai uşor de realizat.


3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 Clasificare:
 In-vitro: în condiţii de laborator, în general pe
culturi de celule;
o relativ uşor de realizat, limitează utilizarea animalelor
în astfel de experimente;
o pot să apară diferenţe faţă de comportarea în mediul
fiziologic, mult mai complex.
 In-vivo: testarea pe animale;
o trebuie utilizate animale care să fie similare cu omul,
şi totuşi este posibil ca datele obţinute să nu fie
valabile pentru acesta;
o se cere minimizarea utilizării animalelor în
experimente, asigurându-ne că rezultatele obţinute
sunt relevante şi obţinute în condiţii de tratament
adecvat al subiecţilor.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 Evaluarea siguranţei lansării pe piaţă a


oricărui dispozitiv medical constă în
decelarea efectelor adverse rezultate în
urma utilizării lui normale, nu greşite.
 Testarea preclinică a potenţialului toxic al
biomaterialelor componente minimalizează
efectele neaşteptate.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 În prezent există teste de


biocompatibilitate stabilite de:

 ISO (International Organization for Standardization)


 FDA (Food & Drug Administration)
care permit predicţii privind modul în care un
biomaterial va reacţiona la contactul cu un ţesut viu.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 ISO a publicat un ghid ISO al


biocompatibilităţii (Biocompatibility Testing
Matrix), care cuprinde diferite teste în funcţie
de:
 tipul de contact biomaterial-om; Pentru o anumită categorie
de dispozitive se recomandă
 durata contactului; un număr de teste de
 utilizarea clinică. biocompatibilitate.

 Majoritatea testelor trebuiesc realizate în


condiţii de laborator controlate, conform GLP
(Good Laboratory Practices).
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi
 În Europa, până recent, diferitele ţări aveau
reglementări proprii privind fabricarea şi
comercializarea dispozitivelor pentru uz uman.
 Din ianuarie 1995, aceste dispozitive sunt
comercializate în Uniunea Europeană conform
reglementărilor EU Medical Devices Directive
93/42/EEC, care specifică cerinţele evaluării
biocompatibilităţii.
(http://eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:3
1993L0042:EN:HTML).
 În prezent, evaluările de biocompatibilitate ale
dispozitivelor medicale se realizează conform
recomandărilor standardului ISO 10993-1/EN
30993-1.
Lista părţilor ISO 10993

Parte Titlu Parte Titlu


1. Evaluare şi testare 10. Teste pentru iritare şi sensibilitate
Cerinţe de întreţinere a
2. 11. Teste pentru toxicitatea sistemică
animalelor
Teste de genotoxicitate,
Prepararea probei şi materiale de
3. carcinogenicitate şi toxicitate 12.
referinţă
reproductivă
Selectarea testelor pentru Identificarea şi dozarea cantitativă a
4. 13.
interacţia cu sângele produşilor de degradare din polimeri
Teste de citotoxicitate – metode Identificarea şi dozarea cantitativă a
5. 14.
in vitro produşilor de degradare din ceramici
Identificarea şi dozarea cantitativă a
Teste pentru efectele locale
6. 15. produşilor de degradare din metale
după implantare
şi aliaje
Reziduurile sterilizării cu oxid Schema studiului toxico-cinetic al
7. 16.
de etilenă produşilor de degradare eliberaţi
Reziduri de glutaraldehidă şi
Investigarea clinică a
8. 17. formaldehidă în dispozitive medicale
dispozitivelor medicale
sterilizate industrial
Degradarea materialelor pentru
9.
testarea biologică
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi

 Protocolul evaluării biologice a unui dispozitiv


medical depinde de:

 natura materialelor utilizate la construcţia lui;


 natura contactului cu organismul uman;
 durata contactului cu organismul uman.
Clasificarea dispozitivelor utilizate în scopuri medicale,
în funcţie de natura contactului cu organismul
CATEGORII DE DISPOZITIVE EXEMPLE
electrozi, proteze externe, benzi de fixare, bandaje de
Piele
comprimare, monitoare
lentile de contact, catetere urinare, dispozitive
Superficiale Membrane mucoase intravaginale şi intraintestinale, tuburi endotraheale,
bronhoscop, proteze dentare, dispozitive ortodontice
Suprafeţe cu dispozitive de vindecare sau bandajare, pansamente
leziuni/ compromise ocluzive
Indirect, flux garnituri de transfer sau extensie, utilizate în
sangvin administrare de sânge, soluţii, etc.
Comunicare Comunicare laparoscoape, artroscoape, sisteme de drenare, cimenturi
externă ţesuturi, os, dentină dentare, materiale de umplutură dentare, capse piele
catetere intravasculare, electrozi pacemaker temporari,
Flux sanguin
tuburi şi accesorii pentru oxigenatoare şi dializă
cuie şi plăci ortopedice, implanturi subperiostal şi de sân,
înlocuire de articulaţii şi tendoane, proteze osoase,
Dispozitive implant
cimenturi şi dispozitive intraosoase şi de eliberare de
ţesut/os
medicamente, senzori şi stimulatori neuromusculari,
Implanturi laringe artificial, cleme de legare
electrozi pacemaker, fistule arteriovenoase artificiale,
valve cardiace, grefe vasculare, catetere interne de
Sânge
eliberare medicamente, dispozitive de asistenţă
ventriculară
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Generalităţi
 În funcţie de durata contactului cu
organismul deosebim dispozitive cu un
contact:
 limitat (<24 ore) - A;
 prelungit (24 ore - 30 zile) - B;
 permanent (>30 zile) - C.

 Un dispozitiv destinat unui contact superficial, o


perioadă limitată de timp, nu este necesar să
răspundă acelorlaşi cerinţe în ceea ce priveşte
biocompatbilitatea, ca un implant obţinut din acelaşi
material şi folosit permanent.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
Matrice de testare a biomaterialelor

Toxicitate cronică

Carcinogenicitate
Hemocompatibili
Genotoxicitate
Citotoxicitate

Sensibilitate

Implantare
Toxicitate

Toxicitate
sistemică

subacută
Durata

Iritaţii
CATEGORII DE
contactului
DISPOZITIVE

tate
A   
Piele
B   
C   
A   
Membrane
Superficiale B      
mucoase
C        
A    
Suprafeţe
cu leziuni/ B      
compromise
C        

 Teste ISO
 Teste FDA
 Teste ISO  Teste FDA
Matrice de testare a biomaterialelor

Toxicitate cronică

Carcinogenicitate
Genotoxixicitate

Hemocompati-
Citotoxicitate

Sensibilitate

Implantare
Toxicitate

Toxicitate
sistemică

subacută
Durata

Iritaţii
CATEGORII DE
contactului

bilitate
DISPOZITIVE

A     
Indirect, flux
sangvin
B      
C          
A    
Comunicare
Comunicare
ţesuturi, os, B       
externă
dentină
C         
A      
Flux sanguin B        
C          
A    
Dispozitive
implant ţesut/os
B       
C         
Implanturi
A       
Sânge B        
C          
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Pregătirea probelor
 Proba de testat trebuie să reprezinte un specimen
reprezentativ pentru dispozitivul produs în cantităţi
industriale.
 Ea trebuie să fie finisată sau tratată (acoperită sau
sterilizată) în acelaşi mod ca şi dispozitivul comerciabil.
 Deoarece potenţialul toxic al materialelor şi dispozitivelor
depinde de gradul de eliberare a unor componente
solubile, toxice, sunt testate uzual extracte din proba de
analizat.
 Totuşi unele teste necesită o evaluare în condiţiile
normale de folosire a dispozitivului, şi atunci se testează
direct citotoxicitatea unei piese din acesta.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Pregătirea probelor
 În cazul solubilizării unor componente din
dispozitiv se utilizează o serie de soluţii cu o
polaritate descrescătoare pentru a asigura o
extracţie corespunzătoare a compuşilor cu
diferite solubilităţi.
 Cele mai comune medii de extracţie utilizate
sunt:
 ser fiziologic;
 ulei vegetal;
 dimetilsulfoxid;
 etanol;
 mediul de cultură al celulelor - pentru testarea
citotoxicităţii in vitro.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Pregătirea probelor

 Temperatura de extracţie este un factor


important în evaluarea citotoxicităţii unor
materiale.
 Unii compuşi solubilizaţi din probă sunt alteraţi
chimic la temperaturi înalte, motiv pentru care se
recomandă ca extracţia să fie realizată la 37°C
(temperatura corpului), timp de 72 ore.
 Pentru testele de citotoxicitate in vitro se
recomandă extracţia la 37°C timp de 24 ore,
deoarece unii constituenţi din mediu sunt relativ
labili.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Culturi de celule
 Cultura de celule (sau de ţesut) îşi are originile în
secolul al XIX-lea, când oamenii au început să
examineze în detaliu ţesuturile şi organele din
organism în recipiente de sticlă.
 Termenul in vitro înseamnă literal “în sticlă”, deşi în
prezent majoritatea culturilor celulare se realizează în
vase de plastic.
 Prima încercare, încununată de succes, de a cultiva
celule izolate din organismul vertebratelor a fost
realizată în anul 1907 de către Ross Harrison, care
era interesat în diferenţierea neuronilor.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Culturi de celule

 În prezent, este posibilă reproducerea


condiţiilor existente in-vivo, pentru a permite
celulelor “normale” (netumorale) să crească
în cultură.
 Iniţial, celulele prelevate/izolate din orice tip de
ţesut, de la diferite organisme, au fost cultivate în
laborator pentru studii de morfologie şi fiziologie.
 Ulterior, culturile celulare au progresat de la
examinarea celulelor izolate care mor după un
număr limitat de diviziuni (culturi primare), la
cultura de lungă durată (linii celulare), ale căror
celule supravieţuiesc un număr mare de generaţii,
datorită unui proces de transformare spontană sau
indusă.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Culturi de celule

 Celule care pot fi crescute în cultură:


 elemente ale ţesuturilor conjunctive (fibroblaste,
osteoblaste, condrocite);
 celule musculare;
 celule epiteliale (de la nivelul ficatului, plămânului,
pielii, sânului, rinichiului);
 celule nervoase.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in - vitro

 Presupune evaluarea biomaterialelor prin


metode care utilizează culturi de celule,
pentru a măsura citotoxicitatea şi
compatibilitatea biologică a unui material.

 Citotoxicitatea identifică efectele toxice la


nivelul celulelor:
 moartea celulelor;
 alterarea permeabilităţii membranei celulare;
 inhibiţia enzimatică etc.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Pentru studiile in vitro de caracterizare a


biocompatibilităţii materialelor se pot folosi
culturi de osteoblaste, obţinute:

 din explante de os;


 din celule stem mezenchimale.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Citomorfologia osteoblastelor în cultură se


testează în prezenţa şi absenţa materialelor,
prin:
 microscopie în contrast de fază;
o pe tot parcursul realizării experimentului;
 microscopie de fluorescenţă;
o la sfârşitul perioadei de menţinere în cultură a
celulelor – de regulă 48-72 ore;
o pentru vizualizarea celulelor în fluorescenţă
cultura va fi tratată cu hipericină, care pătrunde
în celule şi le marchează fluorescent.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Estimarea numărului de celule viabile se


realizează prin testul cu Albastru tripan.
 albastru tripan este un colorant care permite
identificarea celulelor moarte, în care pătrunde
datorită deteriorării structurii şi permeabilităţii
membranei;
 celulele moarte - colorate în albastru se deosebesc
de cele vii - incolore;
 numărarea se realizează cu ajutorul unui
hemocitometru = lamă de sticlă mai groasă, în
care este practicată o fantă; în fantă este plasat un
volum mic din suspensia celulară de evaluat.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

Hemocitometru
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Etape de lucru:
 se introduce proba de material în placa Petri şi se
sterilizează (8-10 ore) cu ajutorul lămpii cu
ultraviolete, pe ambele suprafeţe alternativ;
 se sterilizează proba prin cufundare în soluţie PBS
(Phosphate Buffer Saline) sterilă (2-4 ore);
 se însămânţează 100.000 celule/placă Petri,
inclusiv în proba control (placă Petri care nu
conţine proba de material);
 se incubează culturile în atmosferă cu 5% CO2, la
37oC;
 după 18-20 ore se vizualizează celulele la
microscopul cu inversie şi se fac poze în VIS
(vizibil) cu o cameră foto digitală.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Etape de lucru:
 culturile se incubează (în atmosferă cu 5% CO2, la
37oC) cu hipericină (1-2 ore) care pătrunde în
celule şi le marchează fluorescent;
 se îndepărtează mediul care conţine hipericină
(pentru reducerea ecranării semnalului de la celule
datorată difuziei colorantului în mediu) şi se
adaugă EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium)
proaspăt;
 se vizualizează la microscopul cu inversie şi se fac
poze în VIS şi UV (ultraviolet);
 se îndepărtează probele şi se spală celulele de 2 ori
cu soluţie PBS.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

 Etape de lucru:
 se tratează celulele cu soluţie MTT [bromură de 3-
(4,5dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazoliu] şi se
incubează în atmosferă cu 5% CO2, la 37oC (2-4
ore);
 se îndepărtează soluţia MTT şi se solubilizează
formazanul obţinut (culoare albastru-închis) cu o
soluţie de izopropanol (15-20 minute);
 se citeşte densitatea optică a formazanului
solubilizat la 595nm cu ajutorul unui
spectrofotometru, obţinându-se o funcţie
absorbanţă – concentraţie colorant – număr de
celule active metabolic din cultură.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

Micrografie în contrast de fază a fibroblastelor CCD-1070Sk din control (obiective A-10x; B-20x; C-40x).

I II III

Micrografie în contrast de fază a fibroblastelor CCD-1070Sk din plăcile Petri cu probele: I; II; III (obiectiv 10x).
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste

Micrografie în fluorescenţă a fibroblastelor CCD-1070Sk de


pe suportul II (obiective A-20x; B-40x).
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro pe osteoblaste
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro în SBF

 Pentru analiza comportamentului în mediul


fiziologic a materialelor, probe pulverulente
sau sub formă de corp solid sunt imersate în
SBF (simulated body fluid) şi sunt menţinute
la 370C, urmând a fi extrase şi studiate după
diferite perioade de timp: 6 zile, 14 zile, 21
zile şi 28 zile.
 Probele extrase sunt analizate prin
microscopie electronică şi difracţie de raze X,
în vederea detectării modificărilor
compoziţionale şi microstructurale care apar.
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro în SBF

Valorile concentraţiei de ioni din


SBF şi plasma umană

Ioni Concentraţia ionilor


[mmoli/l]
SBF Plasmă umană
Na+ 142 142
Cl- 126 103
HCO3- 27 27
K+ 5 5
Mg2+ 1,5 1,5
Ca2+ 2,5 2,5
HPO42- 1,0 1,0
SO42- 0,5 0,5
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro în SBF

 Materiile prime utilizate pentru obţinerea SBF


sunt: NaCl, Na2CO3, KCl, (NH4)H2PO4,
MgCl2·6H2O, CaCl2·2H2O, Na2SO4.
 Materiile prime se adaugă în ordinea
prezentată, într-o soluţie tampon, obţinută
prin dizolvarea TRIZMA (tri hidroximetil
aminometan) în apă deionizată.
 După dizolvarea tuturor materiilor prime, dacă
este necesar, se reglează pH-ul cu HCl, pentru
a fi menţinut în intervalul 7,2 – 7,4.
 Testarea in – vitro în SBF
▲ CaSiO3 27-0088

in♠ vitro în SBF


2500

 Studii
▲ 70S - 28 zile SBF ♦ HAp 46-0905

▼Ca3(PO4)2 01-0941
♠ ▲
♦ ♠ CaCO3 70-0095
▲ ▲ ▲ ▼ ▼ ♦ ►NaCl 78-0751
▲ ▲ ▲▼♠ ▲ ► ▲ ♦ ▲ ►

2000
► 70S - 21 zile SBF
▲ ♦
♠ ▼ ►
▲ ▲ ▲ ▲♠ ▼ ♦
▲ ▲ ▲▼♠ ▲ ▲ ♦ ▲ ►

1500
70S - 14 zile SBF

♠ ►
▲ ▲ ▲ ▲♠ ♦ ♦
▲ ▲ ▲ ▲ ♠ ▲
► ▲ ♦ ▲ ►
1000
70S - 6 zile SBF



▲♠
▲ ▲ ▲ ♦ ▲ ▲

▲ ▲ ▲ ♠ ▲ ▲

500 ▲

70S - iniţial
▲ ▲ ▲ ♦
▲ ▲ ♦ ▲ ▲
▲ ▲
▲ ▲ ♦ ▲

0
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Spectre de difracţie de raze X pentru o probă de biosticlă, tratată termic la


1000OC / 2h, înainte şi după imersarea 6, 14, 21 şi 28 zile în SBF
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vitro în SBF

Iniţial 6 zile 14 zile

21 zile 28 zile

Micrografii de MEB pentru o probă de biosticlă, înainte şi după


imersarea timp de 6, 14, 21 şi 28 zile în SBF
3. Evaluarea interacţiunii
implant – mediu fiziologic
 Testarea in – vivo

 Evaluarea comportamentului materialelor la


implantarea in-vivo, pe animale, este
necesară pentru determinarea următoarelor
interacţiuni biologice:
 Interacţiunea diferitelor tipuri de celule cu implantul,
sau unele cu celelalte;
 Acţiunea factorilor endocrini sau paracrini celulari;
 Interacţiunea cu celule, proteine, molecule din
sânge etc.

S-ar putea să vă placă și