PRACTICA N° 11

OBTENCIÓN DE CLOROFILINA CUPRICA DE SODIO

I. OBGETIVOS.

 Extracción de la clorofila a partir de un vegetal.

 Obtención de la sal clorofilina de sodio cúprica
 Cuantificación de la clorofilina

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Los complejos sintéticos cúpricos de clorofila provienen de la clorofila (E140), un
colorante verde natural presente en todas las plantas y algas, se extrae
comercialmente de las ortigas, el césped, espinaca y la alfalfa. Adicionalmente,
las feofitinas se forman a través de la desesterificación química de la clorofila.
Además de sus utilidades terapéuticas, las CFL también se usan como colorantes
en alimentos, fármacos, complementos alimenticios y cosméticos. En concreto el
E141ii corresponde a complejos cúpricos de clorofilinas, aditivo muy utilizado en
refrescos, licores, chicles, caramelos o conservas vegetales, autorizado como
aditivo alimentario en la Unión Europea en conformidad con el anexo II del
Reglamento (CE) no 1333/20083.
De todas las clorofilinas, la más utilizada a nivel terapéutico y en investigación
biológica es la clorofilina de sodio y cobre (CFL-Na-Cu).

El E141i es hidrosoluble, mientras que el E141ii es liposoluble, al calentar el

E141, se libera cobre; sin embargo; las concentraciones alcanzadas de este
elemento no representan niveles tóxicos. La ingesta máxima diaria es de 15 mg/kg
de peso corporal.

La clorofila es el pigmento fotorreceptor responsable de la primera etapa en la

transformación de la energía de la luz solar en energía química, y
consecuentemente la molécula responsable de la existencia de vida superior en la
Tierra. Se encuentra en orgánulos específicos, los cloroplastos, asociada a lípidos
y lipoproteínas. En el campo de la Ciencia y la Tecnología de los Alimentos el
interés fundamental de la clorofila está en el color que confiere a los vegetales
verdes, ya que desde el punto de vista nutricional, solamente el magnesio tiene
alguna relevancia, y más bien escasa. La falta de estabilidad del color de la
clorofila es un problema importante. No obstante esta falta de estabilidad, se
utiliza también la clorofila extraída de vegetales como colorante natural en
algunos alimentos. Es soluble en disolventes polares, como alcohol o acetona.
Estructura de la clorofila

La estructura de la molécula de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina

(sustituida con pequeños grupos enlazados, sustituyentes) y una cadena larga
llamada fitol que es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol
enlazados para formar un anillo mayor que es la porfirina. La hemoglobina de la
sangre y otras proteínas contienen también una porfirina, que en ese otro caso
constituye lo principal de un grupo hemo y también se encuentra porfirina en la
estructura de la vitamina B12. El grupo hemo contiene un átomo de hierro (Fe); la
porfirina de la clorofila lleva en lugar equivalente un átomo de magnesio (Mg 2+).
La absorción de determinados picos del espectro de radiación (ver gráfica más
abajo) es una propiedad de aquellas moléculas orgánicas que contienen dobles
enlaces conjugados (dobles enlaces alternando con enlaces simples); puede verse
en las fórmulas desarrolladas contiguas que el anillo porfirínico es rico en tales
enlaces.

El fitilo (o resto de fitol; llamamos resto o residuo a la parte de una molécula

incorporada a la estructura de otra mayor) es una cadena hidrocarbonada con
restos de metilo (-CH3) a lo largo. Tiene, como todas las cadenas orgánicas
basadas sólo en C e H, un carácter “hidrófobo”; es decir, que repele al agua. La
cadena del fitilo sirve para anclar la molécula de clorofila en la estructura
anfipática de los complejos moleculares en que residen las clorofilas.

Alteraciones de la clorofila
La clorofila puede sufrir distintos tipos de alteraciones. La más frecuente, y la más
perjudicial para el color de los alimentos vegetales que la contienen, es la pérdida
del átomo de magnesio, formando la llamada feofitina, de un color verde oliva con
tonos marrones, en lugar del verde brilante de la clorofila.
Esta pérdida del magnesio se produce por sustitución por dos iones H+, y
consecuentemente se ve favorecida por el medio ácido. La pérdida es irreversible
en medio acuoso, por lo que el cambio de color de los vegetales verdes es un
fenómeno habitual en procesos de cocinado, enlatado, etc. La clorofila b es algo
más estable que la clorofila a. Hay que tener en cuenta que los vegetales son
siempre ácidos, y que en el tratamiento térmico se liberan generalmente ácidos
presnetes en vacuolas en las células, y que hacen descender el pH del medio.
La adición de bicarbonato, que eleva el pH, ayuda a mantener el color, pero a
costa de aumentar la destrucción de la tiamina. También estabiliza algo el color la
presencia de sal común o de compuestos solubles de magnesio o calcio

El calentamiento de materiales que contienen clorofila produce también

isomerizaciones dentro de la molécula, que pueden llegar a afectar hasta el 10%
del contenido en el cocinado normal o en el escaldado de vegetales verdes. Esta
isomerización carece de importancia desde el punto de vista alimentario.

En la clorofila puede hidrolizarse el enlace éster que mantiene unido el grupo

fitol. Esta hidrólisis está catalizada por el enzima clorofilasa, presente en los
vegetales verdes. La estructura que queda al eliminarse el fitol recibe el nombre
de clorofilida. Su color es semejante al de la clorofila, y consecuentemente su
formación no representa un problema desde ese punto de vista, e incluso son algo
más estables que las propias clorofilas frente a la pérdida del magnesio. La
feofitina es capaz de unir eficientemente iones de Zn o de Cu en el lugar que
ocupaba el magnesio, formando pigmentos estables y de color verde atractivo. La
toxicidad del cobre limita su uso, pero los complejos cúpricos de clorofilas o
clorofilidas están autorizados en la Unión Europea como colorantes alimentarios
en algunos productos.

Posiblemente la formación de pequeñas cantidades de complejos cúpricos, que

mantienen el color, explica la reiteración con la que se especifica en los libros de
cocina antiguos el uso de recipientes de cobre para cocinar los guisantes. La
clorofila se puede extraer fácilmente mediante solventes orgánicos polares, como
etanol, metanol o acetona, y utilizarse como colorante alimentario. En Europa
tiene el código E-140. Los complejos cúpricos tienen el código E-141.
E 141 Complejos Cúpricos de Clorofilinas

Las sales alcalinas de las clorofilinas cúpricas se obtienen mediante la adición de

cobre al producto obtenido por saponificación de un extracto con disolventes de
cepas naturales de materiales vegetales comestibles, hierba, alfalfa y ortigas. La
saponificación elimina los grupos estéricos metilo y fitol y puede abrir
parcialmente el anillo de ciclopentenilo. Tras adición de cobre a las clorofilinas
purificadas, los grupos ácidos se neutralizan para formar las sales de potasio o de
sodio.

Sólo pueden utilizarse para la extracción los siguientes disolventes: acetona,

metiletilcetona, diclorometano, dióxido de carbono, metanol, etanol, propan-2-ol
y hexano. La clorofila absorbe la energía solar necesaria para iniciar el ciclo
fotosintético de muchas plantas y bacterias. La principal propiedad fisicoquímica
responsable de este hecho es la elevada absorbancia que presenta la clorofila en el
intervalo de longitudes de onda entre 400 nm y 700 nm (ver la figura más abajo).
La molécula de clorofila puede absorber un fotón de estas longitudes de onda al
excitar un electrón de los que ocupan los orbitales moleculares que forman los
dobles enlaces conjugados C=C y C=N de la estructura central que rodea al átomo
de magnesio. Existen dos tipos principales de clorofila, la clorofila a y la clorofila
b, que se diferencian por la presencia de un grupo CH 3 o CHO, respectivamente,
en uno de los anillos C4N (ver figura). La presencia de este grupo funcional altera
ligeramente la estructura y energía de los dobles enlaces conjugados, dando lugar
a espectros de absorción distintos para cada tipo de clorofila. Así, la clorofila a en
disolución alcohólica presenta máximos de absorción en 430 nm y 662 nm,
mientras que la clorofila b los presenta en 453 nm y 642 nm (ver figura). La
posición exacta de estos máximos depende del disolvente que se utilice. Nosotros
trabajaremos con acetona al 80%, por lo que es de esperar que los máximos de
absorción estén sólo unos pocos nanometros desplazados respecto de estos
valores.

Como aplicación de esta técnica, en el desarrollo de esta práctica se extraerán 4

tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas. Todos ellos
tienen carácter apolar, aunque su grado de polaridad varía en función de su
composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el
más apolar al menos apolar.
 Esta propiedad permite su separación, y su distinto color su identificación. Su
color permite también su cuantificación por técnicas espectrofotométricas.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

a) Materiales:
 Material de vidrio de laboratorio
 1 mortero
 1 cocinilla
 2 papel filtro de filtrado rápido
 Espectrofotómetro UV-Visible

b) Reactivos
 Alcohol (etanol)
 Metanol
 Hexano
 Solución de KOH-metanólica 30% (p/v)
 Hidróxido de sodio 3.5g
 Cloruro de cobre q. p. 1.8g
 Hojas de espinaca fresca

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXPERIENCIA N° 1.- EXTRACCIÓN DE LA CLOROFILA
1. Extracción: pesar 10 gramos de hojas de espinaca, trocear la hoja de
espinaca. Introducir los trozos en un tubo de ensayo grueso y añadir 20 mL de
etanol. Taparlo y calentarlo al baño ‘María’ durante aproximadamente 10 min
(retirarlo cuando el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol
con los pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo.
2. Separación:

 Añadir al embudo de decantación (con la llave cerrada) 10 mL de

hexano.
 Tomar 10 mL de extracto de pigmentos y añadirlos sobre el embudo de
decantación. Se formarán dos fases (A y B)
 Añadir 2 mL de agua (o más, hasta que la fase inferior quede sin
pigmentos).
 Desechar la fase inferior (B).
 Añadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarán dos fases
(C y D).
 Recoger ambas fases en dos tubos de ensayo (usar un tubo de ensayo
largo para la fase C)
  Añadir al tubo con la fase C, 2 mL de solución de KOH-metanólica 30%
(p/v) y agitar bien durante 2 min. Se formarán dos fases (E y F). (para la
experiencia trabajar con la fase “F”)

3. Espectro UV-visible: Registrar el Espectro UV-Visible de la clorofila de la fase

C

EXPERIENCIA N° 2.- OBTENCIÓN DE LA CLOROFILINA DE SODIO

 Colocar el extracto de clorofila en un vaso de precipitado.

 Solubilizar el hidróxido de sodio en 20ml de agua destilada y el cloruro de
cobre en 10 ml de agua destilada
 Agregar el hidróxido de sodio agitando e inmediatamente agregar la
solución de cloruro de cobre
 Calentar a 24°C para acelerar el proceso.
 El producto obtenido se separa por filtración.

EXPERIENCIA N° 3.-CUANTIFICACIÓN DE LA CLOROFILINA.

La clorofila a presenta un máximo de absorbancia a 665 nm. Utilizando técnicas

espectrofotométricas, se cuantificará la cantidad de clorofila a presente en el
extracto de pigmentos de hoja de espinaca en etanol obtenido en la experiencia 1.
Para ello, se aplicará la fórmula de Marker.

 Tomar 1 ml del sobrenadante en un tubo de ensayo

 Añadir 4 ml de etanol y medir la absorbancia a 665 nm. Utilizar etanol como
blanco.
 Para la determinación de clorofila, utilizar el valor de 34.5 mg -1.ml.cm-1
como coeficiente de extinción (), y referir el resultado a peso húmedo de
hojas:
 La Ley de Beer-Lambert se formula como:
Abs (DO) =  x C x l

A 665
Clorofila (mg/ml extracto ) = x 5 ml
34 . 5

Vextracto (ml )
Clorofila (mg/ gr hoja)=Clorofila ( mg/ml extracto ) x
peso de hojas ( gr )
 REPORTE DE RESULTADOS N° 4

OBTENCIÓN DE CLOROFILINA CUPRICA DE SODIO

NOMBRE:
_____________________________________________________________

CODIGO: _________________________

1. ¿Qué contiene cada una de las fases separadas?¿Por qué esa distribución?

Clorofilas a y b, carotenos y xantofilas.

Todos ellos tienen carácter apolar, aunque su grado de polaridad varía en función de su
composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el más apolar al
menos apolar.

2. ¿Cómo se separarían los pigmentos de la fase D?

https://es.scribd.com/doc/16675209/6-EXTRACCION-Y-SEPARACION-DE-
PIGMENTOS-VEGETALES

3. ¿A qué propiedad de los pigmentos se debe su separación?

Debido a su grado de polaridad

4. Qué tipo de pigmento es la clorofila?

es una clorina que absorbe longitudes de onda amarillas y azules de la luz
mientras que refleja verde. Es la presencia y abundancia relativa
de clorofila la que da a las plantas su color verde.

5. Cuáles son los complejos cúpricos que se forman en la Práctica?

6. Cuál es el fundamento teórico de la cuantificación espectrofotométrica de las
clorofilinas?
Cuando una solución de clorofila es iluminada con luz blanca o azul se produce un
fenómeno de excitación molecular, observable por la emisión de luz de color rojo
vinoso intenso. La luz emitida por fluorescencia es siempre de mayor longitud de onda
y de menor energía que la luz incidente, pues siempre algo de esa energía se disipa en
forma de calor.
Esta emisión de luz por parte de la clorofila, demuestra que es capaz de realizar
reacciones fotoquímicas. Las clorofilas son poco estables in vitro, especialmente bajo
iluminación intensa. El átomo central de magnesio es fácilmente reemplazado por
hidrógeno, dando lugar a las feofitinas respectivas, pigmentos de color pardo oliva.

7. Calcular la concentración de clorofila a en el extracto inicial de la hoja de espinaca.

8. ¿Cuántos mg de clorofila a se han extraído de la hoja de espinaca?

9. ¿Interfieren otros pigmentos en la determinación de clorofila a?

10. Discusión de Resultados

11. Conclusiones

12. Bibliografía