Cromatografía de Líquidos (HPLC) 

¿Qué es?
Cromatografía donde la fase móvil es un líquido y la fase estacionaria es un sólido o
un líquido.
Fundamento: Una muestra soluble en la fase móvil es transportada hacia la columna,
los componentes de la muestra se separan con base en su afinidad por la fase
estacionaria, los componentes separados (solutos) salen de la columna y se detectan.
Este proceso es la elución. Se trata de la distribución de un analito en 2 fases
inmiscibles.

+Extracción: Proceso de transferir (pasar) un soluto de una fase a otra:

-Líquido-sólido
-Líquido-líquido

La eficiencia cromatográfica dependerá de:

-Diámetro de la columna, longitud y el flujo.
Se tiene que hacer un estudio de fuerza de elusión para evitar que se arruine el
estudio, se analizan sustancias con más de 2000 Daltons.

Hay dos métodos para compactar la fase estacionaria:

-Método seco: Se seca la sílica y se desgasifica el disolvente por centrifugado.
-Método húmedo: Se hace una mezcla (pasta), sólido-líquido.

Fenómenos de sorción:
Adsorción: partículas microporosas, partículas se adsorben en la superficie.
Reparto: fases químicamente unidas, partículas se absorben en el interior de la
superficie.

Instrumento
1. Sistema o fuente de fase móvil Recipientes de fase móvil
2. Sistema de bombeo Bombas
3. Sistema de introducción de muestra Válvula de 6 pasos
4. Sistema de separación Columna
5. Sistema de detección Detector
6. Sistema de registro Registro

1. Sistema o fuente de fase móvil.

Recipientes en donde se almacena la fase móvil: materiales inertes tales como
vidrio o acero inoxidable.
+Propiedades para los disolventes para HPLC:
Alta pureza (99.99% o 99.999%)
Desgasificados. (Por burbujeo con gas inerte, manual con membrana y con
membrana de teflón).
 Baja resistencia a la transferencia de masa (que pueda salir de él y entrar a él).
Baja viscosidad. (Para que no se condicionen las velocidades de migración del
analito, que se distribuya de manera homogénea en ambas fases.)
Accesibilidad.
Baja toxicidad.
Económicos.
Baja peligrosidad.

+Requisitos para analizar en CL:

Soluble en fase móvil.
Estable en disolución.

Se analizan compuestos: POLARES, NO VOLÁTILES, TERMOLÁBILES, DE

ELEVADA MASA MOLECULAR.

+Problemas con burbujas: en el sistema de bombeo, de separación y en el sistema de

detección porque “crean picos fantasmas”. A veces una burbuja tiene un límite de
compresibilidad, se comportará entonces como una piedra y puede dañar las válvulas
check de las bombas. Si la burbuja llega a la columna se puede cuartear y la
transferencia de masa se vería impedida. El analito puede venir en una banda muy
fina.

+Mezclado de disolventes: Son dispositivos que permiten realizar mezclas de

disolventes de forma automatizada y precisa. También son llamados “programadores
de fase móvil”.
-Mezcladores en cámara: La mezcla se lleva a cabo antes de entrar al sistema
de bombeo.
-Mezcladores en corriente: La mezcla de disolventes se realiza con sistemas de
bombeo binarios, ternarios, cuaternarios.

Definición IUPAC de cromatografía: método físico de separación en el que los

componentes a separar se distribuyen entre 2 fases, una de las cuáles está en reposo
(fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección
definida.
-Corrección: Es un proceso FISICOQUÍMICO ya que depende de las
interacciones del soluto con la fase estacionaria.

2. Sistema de bombeo
Propulsa la fase móvil hacia el sistema cromatográfico.
+Calidad de las bombas con base en su capacidad para producir volúmenes
constantes, reproducibles y no pulsantes.
-Tiene que vencer altas presiones.
-Proporcionar flujo constante y no pulsantes.
Hay mecánicas:
a) recíprocas o reciprocantes que constan de un pistón y un diafragma.
b) Desplazamiento continuo.
También hay neumáticas.

En cuanto a las presiones de trabajo en HPCL, se abarca de 7 a 40 MPa, 70 a 400 atm

y hasta 900 atm en sistemas de UHPLC y UPLC.

3. Sistema de Introducción de muestra

Es un arreglo de acero inoxidable con 6 orientaciones, que permiten la conexión del
sistema de flujo. Su nombre técnico es: válvula de 6 pasos. Consiste de un RIZO O
UN LOOP, el cual determina el volumen de inyección total.

POSICIÓN DE CARGA CONEXIONES: Inyección-loop-descarga y columna-bomba.

POSICIÓN DE DESCARGA CONEXIONES: Bomba-loop-columna e
inyección-descarga.
AQUÍ INSERTAR DIBUJO DE LA VÁLVULA DEL HARRIS.

+Nos sirve conocer el FLUJO para saber dónde encontrar al analito, cuánto
disolvente se necesita y en qué momento se puede extraer. HABÍA UN EJERCICIO
DE FLUJO AQUÍ, ESTÁ EN EL CUADERNO.

4. Sistema de separación
Está conformado por la columna. El sistema de control de temperatura rodea al
sistema de separación.
TEMPERATURA: Eluye más rápido porque disminuye la viscosidad del eluyente.

-Columnas: son de acero inoxidable con longitudes de 5-30 cm.

-Los diámetros de las columnas son de 1-5 mm.
-Comúnmente se utilizan precolumnas. Para no “ensuciar” la fase estacionaria
de la columna como tal, funciona como un filtro adicional, porque se pueden tapar y
aumenta la presión. Alargan la vida útil de la columna.

+Cuando inyectamos una muestra desconocida siempre hay que lavar la columna.
+Importa el tamaño de partícula de empaque.
++Menor tamaño de partícula: mayor eficiencia en la separación, mayor
presión. Las presiones altas son para aumentar el flujo.
++Partículas más pequeñas implican un flujo más uniforme a través de la
columna y una mejor difusión del soluto en la fase móvil.

+Mayor área de contacto favorece la separación.

CL ADSORCIÓN (TODO SÍLICE): La fase estacionaria más común son las partículas
micro-porosas de sílice fundida. Su uso está limitado a pH=8, si no se respeta el pH
el sílice se puede disolver.

CL REPARTO: Fases químicamente unidas, fases estacionarias enlazadas

covalentemente a sílice.
El enlace solixano funcionalizado puede hidrolizarse a pH=2.
Fases químicamente unidas se utilizan en un intervalo de pH 2-8.
END CAPPING: DESPUÉS DE UNA FUNCIONALIZACIÓN PARA LOS
SILANOLES QUE NO REACCIONAN. RX LOS SILANOLES QUE FALTARON PARA
QUE NO QUEDEN COMO ESPECIES NO REACTIVAS.

MODOS DE TRABAJO EN CL
+Fase normal:
-Fase estacionaria: POLAR
-Fase móvil: NO POLAR
+Fase reversa:
-Fase estacionaria: NO POLAR.
-Fase móvil: POLAR.
En la fase reversa, se usan polímeros o soportes de sílice + cadenas alquílicas que
vuelven más inerte a la fase estacionaria.

Elución binaria: Capacidad de sacar al analito de la fase estacionaria.

A: Disolvente débil.
B: Disolvente fuerte.
Esto genera una fuerza de elución de gradiente y eso es lo que queremos.

Hay 2 maneras de trabajar:

-ISOCRÁTICO: MISMA FUERZA DE ELUCIÓN.
-GRADIENTE DE ELUCIÓN: CAMBIA LA FUERZA DE ELUCIÓN.
Para esto es necesario saber de EULOTROPÍA.
 5. Sistema de detección
Detector: Dispositivo que identifica al analito con base en alguna propiedad
física, química o fisicoquímica.
La deriva es el tiempo entre cada medición.
-Un detector ideal es:
+Sensible
+Tiene amplio intervalo lineal
+Baja relación señal/ruido
+Estable
+Bajo costo

Índice de refracción:
Celda binaria: tiene una división para 2 compuestos diferentes. Cuenta con un
lente colimador. Cuando el haz pasa por la 2da sección, no llega al fotodetector.
Adentro hay un dinodo. Es un circuito que permite el flujo de energía en una sola
dirección. Al no percibir el estímulo radiante, el fotodetector se calienta y se prende.
Mientras más tiempo sin detección, mayor amplitud en el pico.

La amplificación de la señal tiene lugar en cada dínodo. Cada uno de los dínodos es
unos 90 voltios más positivo que el anterior.

Tubo fotomultiplicador
Es un dispositivo muy sensible, donde los electrones emitidos por una superficie
fotosensible inciden sobre una segunda, llamada dínodo, que se encuentra a un
potencial positivo respecto del emisor fotosensible. Los electrones son acelerados, e
inciden contra el dínodo con mayor energía que la energía cinética que tenían al
principio. Todo electrón energetizado extrae más de un electrón al chocar con el
primer dínodo. Estos nuevos electrones son acelerados hacia un segundo dínodo, que
se encuentra a un potencial aún más positivo que el primer dínodo. Al incidir en el
segundo dínodo, se extraen todavía más electrones, que se aceleran a su vez hacia un
tercer dínodo. Este proceso se repite varias veces, de manera que, finalmente, se
recogen más de 106 electrones por cada fotón que incidió en la primera superficie.
Intensidades de luz extremadamente bajas se pueden transformar así en señales
eléctricas medibles.
Espectrofotómetro:
1. Fuente de radiación
2. Sistema óptico-dispersivo (espejos y monocromador)
3. Celda muestra
4. Detector
5. Registro