DETERMINAREA PRIN CHEMILUMINESCENŢÃ A ACTIVITÃŢII PRO ŞI

ANTIOXIDANTE A BIOMOLECULELOR

NOŢIUNI TEORETICE
Chemiluminescenţa (CL) este un proces fizico-chimic în care, în urma unei reacţii
chimice exergonice se eliberează energie sub formă de lumină. Acest proces face parte din clasa
proceselor de luminescenţă ce au ca scop relaxarea moleculelor aflate pe stări energetice
excitate, în starea fundamentală.
Excitarea unui electron într-un atom consta în trecerea acestuia pe un orbital superior. În
cazul moleculelor, excitarea electronului îl va duce dintr-un orbital de legatura într-unul de
antilegatura (   *) cel mai adesea, (   *) mai rar, sau (n *) în caz anizotropic. Acest
lucru rupe efectiv jumătate din legatura atomica dintre cei doi atomi. Rezultatul este o rearanjare
structurala a nivelelor electronice în molecula care va prezenta proprietăţi fizice şi chimice
diferite faţă de starea fundamentală.
Apariţia unor emisii chemiluminescente (CL) în timpul unor reacţii chimice este
cunoscută de mult timp şi este strâns legată de formarea unor radicali liberi intermediari. Astfel
chemiluminescenţa a fost observată în cursul oxidării hidrocarburilor policiclice aromate, dar
mai ales a reacţiei apei oxigenate cu o gamă de compuşi: cum sunt aminoacizii, proteinele,
omogenatele de ficat, riboflavina, polifenoli sau fumul de ţigară. În procesele menţionate, H2O2
este un component, iar al doilea pare să fie una din speciile de compuşi oxidabili de tip tirozină,
riboflavină, polifenoli.
În literatură se folosesc mai multe sisteme generatoare de chemiluminescenţă: luminol -
H2O2, ftalhidrazidă – H2O2, hipoclorit - H2O2, acridină radiolizată + KO2, acridină radiolizată +
NaOH. Intensitatea semnalului chemiluminescent depinde de: natura şi concentraţia reactanţilor,
pH-ul mediului, temperatura mediului, volumul de probă.
Cuplul generator de chemiluminescenţă cel mai frecvent utilizat este luminol - apă
oxigenată. Luminolul, o ftalhidrazidă ciclică în mediu alcalin, în prezenţa peroxidului de
hidrogen reactionează exoterm transformându-se în aminoftalat dianion în stare excitată şi care
prin dezexcitare emite o cuantă cu lungime de undă maximă de 430 nm. Dacă produşii finali au
fost bine stabiliţi, stadiile intermediare nu sunt încă caracterizate chimic dar sunt dependente de
compoziţia sistemului de reacţie, concentraţiile componentelor, natura oxidantului, aditivi,
tampon şi pH, în timp ce stadiul final, descompunerea intermediarului cheie, este unică şi
depinde doar de pH.
 Reacţia luminescentă care nu conţine şi fazele intermediare este prezentată în fig. 1.

NH2 O NH2 O-

NH .- O
+ O2 OH-
NH O + H2O + N 2 + h

O O-

Fig. 1. Reacţia luminolului

Lucrând pe un sistem generator de CL format din luminol (LH2) şi peroxid de hidrogen
în mediu bazic s-a evidenţiat o scădere a intensităţii emisiei chemiluminescente, dar nu
epuizarea totală a fenomenului fapt ce indică existenţa a încă cel puţin a unui mecanism paralel
sau secvenţial care să utilizeze alte specii de radicali liberi ai oxigenului.
Caracterul pro sau antioxidant se determină prin introducerea în sistemul generator de
chemiluminescenţă a unei substanţe şi urmărirea variaţiei intensităţii semnalului
chemiluminescent. Dacă intensitatea semnalului chemiluminescent a probei analizate este mai
mare decât intensitatea semnalului chemiluminescent al martorului, proba respectivă are caracter
prooxidant, în schimb dacă intensitatea semnalului chemiluminescent a probei analizate este
mai mică decât intensitatea semnalului chemiluminescent al martorului, proba are caracter
antioxidant.
Evaluarea cantitativă a activităţii antioxidante (AA %) sau a stingerii chemiluminescente
se determină cu relaţia:

0
I0  I
0 AA   100
I0

unde: I0 – intensitatea semnalului martorului la t = 5 secunde;

I – intensitatea semnalului probei la t = 5 secunde.

MOD DE LUCRU
Scopul lucrării este determinarea caracterului pro sau antioxidant a unor biomoleculelor:
aminoacizi (tirozină şi triptofan), vitamine (vitamina C) şi cupluri ale acestora, precum şi
studierea influenţei concentraţiei acestor biomolecule asupra intensităţii semnalului
chemiluminescent. Pentru aceasta se utilizează drept sistem generator de chemiluminescenţă
luminolul + H2O2, în tampon TRIS – HCl, pH =8,6.
 Pentru stabilirea caracteristicilor biomoleculelor supuse oxidării cu H2O2 se utilizează
chemiluminometru TD 20/ 20 TURNET DESIGNES (USA) cuplat cu calculator, prevăzut cu
cuve de sticlă capsulate de 1 mL. Semnalul este înregistrat la fiecare 5 secunde şi serveşte la
stabilirea evoluţiei semnalului chemiluminiscent în timp, curba fiind de tipul CL = f(t).
Apa oxigenată este reactivul care declanşează reacţia şi din acest motiv este adaugată
ultima. Volumul de lucrul pentru fiecare reactiv este precizat în tabelul următor:
Nr. probe Vluminol [μL] Vtampon [μL] Vprobă [μL] V H2O2 [μL]
Martor 200 750 - 50
Trp 200 700 50 50
Tyr 200 700 50 50
Vit C 200 700 50 50
Cupluri 200 600 150 50

Se folosesc soluţii de Trp şi Tyr 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M respectiv de vitamina C 10-5 M,
10-6 M, 10-7 M.

PREZENTAREA REZULTATELOR
1. Să se calculeze activitatea antioxidantă pentru fiecare biomoleculă.
2. Să se reprezinte grafic variaţia semnalului chemiluminescent în timp.
3. Să se calculeze viteza iniţială sau la un anumit timp al procesului v = I/t [s-1]
unde: v – viteza reacţiei exprimată în timp –1;
I – intensitatea semnalului chemiluminiscent;
t – timp corespunzător intensităţii (sec –1).
4. Să se stabililească ordinului de reacţie:
- prin procedee grafice şi analitice cu relaţiile: lgv = lg c sau c= f(t), verificând
liniarizarea acestora;
- - stabilirea constantei vitezei de reacţie corespunzătoare ordinului de reacţie.
1 a pentru reacţii de ordinul de ordinul 1;
k1  ln
t ( a  x)

1 b (a  x )
k2  ln pentru reacţii de ordinul de ordinul 2;
t ( a  b ) a (b  x )