LP3 - Insamantare - Izolare - Cuantificare - UFC

DOCUMENT : L.P.
- Microbiologie Generală DATA : 18/10/2020

TITLU :
Insamantare_Izolare_Cuantificare (UFC) PAGE : 1/32
6. TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MICROORGANISMELOR
Prin trecerea microorganismelor pe medii de cultură specifice acestora, dintr-o cultură

preexistentă, dintr-o probă patologică sau din alte surse (apă, aer, sol, lapte, vin, etc.) și cultivarea lor
în condiții optime de dezvoltare, se urmărește izolarea, studierea și identificarea taxonomică a acestora.
Termeni de bază:
Însămânțarea se realizează prin trecerea unei cantități adecvate dintr-o probă, pe suprafața sau
în profunzimea unui mediu nutritiv, cu scopul detectării și izolării unor microorganisme din proba
respectivă.
Inocularea reprezintă trecerea unei cantități adecvate dintr-o cultură pură, numită inocul, pe un
mediu de cultură steril, a cărui compoziție este favorabilă creșterii și multiplicării unei culturi noi.
Cultivarea microorganismelor presupune asigurarea condițiilor optime de creștere (aerare,
agitare, temperatură și umiditate, prezența unor principii nutritive în doze bine determinate, etc.), după
inocularea sau însămânțarea lor pe un mediu de cultură specific, în vederea obținerii de culturi
microbiene. Există două modalități de cultivare, și anume:
- cultivare discontinuă: constă în cultivarea microorganismelor pe un mediu nutritiv, până la
epuizarea substanțelor nutritive, determinând limitarea înmulțirii microorganismelor, în funcție de
disponibilitățile de hrană și de acumularea unor produse de catabolism.
- cultivare continuă: constă în cultivarea, la nivel de laborator și industrial, în instalații speciale
(bioreactoare moderne de diferite capacități - a se vedea Anexa 1), care oferă posibilitatea
reînnoirii permanente a mediului de cultură, cu o anumită rată, ce se poate regla, dirijarea
controlată a tuturor parametrilor necesari (pH, temperatură, agitare, aerare etc.) și care asigură
menținerea culturii microbiene în faza de creștere logaritmică pe timp nelimitat.
Scopurile însămânțării microorganismelor sunt:
• examinarea cantitativă (cuantificarea încărcăturii microbiene) și calitativă (identificarea taxonomică)
a unei probe luate în lucru;
• studiul unor caractere (de exemplu: morfologice, fiziologice, serologice, genetice) a
microorganismelor;
• obținerea unor metaboliți (de exemplu: enzime, vitamine, antibiotice, polizaharide, aminoacizi, etc.)
sintetizați de microorganisme;
• conservarea microorganismelor în colecții (bănci) de culturi.
Reguli generale ce se impun pentru efectuarea corectă a unei însămânțări
Efectuarea corectă, în condiții aseptice, a tehnicilor de însămânțare, presupune respectarea

următoarelor reguli de manipulare:
 să se realizeze în mod steril: inocularea/însămânțarea trebuie să se realizeze în condiții aseptice (în
hota cu flux laminar sau în apropierea flăcării unui bec de gaz, care asigură o zonă aseptică cu
diametrul de 30 cm);
 să se evite diseminarea microorganismelor în mediul înconjurător și excluderea posibilității
contaminării cu alte microorganisme a mediului nutritiv pe care îl folosim;
1
DOCUMENT : L.P. - Microbiologie Generală DATA : 18/10/2020
TITLU :
 suprafața de lucru se dezinfectează cu un tampon îmbibat într-o soluție

microbiocidă/microbiostatică (de exemplu: sublimat coroziv, spirt, etanol de 96%, etc.) la începutul
și sfârșitul lucrului;
 mâinile se spală cu săpun, atât înainte, cât și după terminarea lucrării;
 însămânțarea/inocularea se va face într-un interval de timp cât mai scurt posibil, pentru a reduce la
minimum contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă;
 în timpul lucrului, se evită conversaţia şi orice mişcare a altor persoane în jurul executantului;
 eprubetele şi plăcile Petri însămânţate se notează cu markerul, cu menționarea următoarelor:
numele sau și numărul probei, denumirea abreviată a mediului de cultură, data însămânţării și orice
caracteristică specifică probei;
 instrumentarul (acul de însămânțare, ansa de platină, ansa Drigalski de sticlă) se va steriliza înainte
și după folosire: se flambează portansa și apoi se încălzește la roșu bucla ansei direct în zona caldă
a flăcării unui bec de gaz, în timp ce ansele ude se introduc mai întâi în zona rece a flăcării și, abia
după evaporarea lichidului de pe ele, se încălzesc la roșu în zona caldă, pentru a evita astfel
„împroșcarea” cu material din ansă în jur (figura 6.1). Sterilizarea corectă a ansei/acului de
însămânțare se realizează prin flambarea port-ansei câteva secunde și apoi încălzirea la roșu a
firului acesteia.
!!!ATENȚIE: pentru a nu distruge microorganismele la prelevare, din cauza temperaturii ridicate
din bucla ansei, aceasta se răcește pe pereții interiori ai eprubetei, pe interiorul capacului plăcii
Petri sau prin atingerea mediului de cultură într-o zonă fără microorganisme. Ansa Drigalski se
sterilizează prin alcool-flambare, răcindu-se înainte de utilizare, prin atingerea interiorului
capacului cutiei Petri;
 se va evita atingerea obiectelor și a instrumentarului de lucru sterile (ansă microbiologică, ac de
însămânţare, pipetă, etc.) de orice suprafață nesterilă (halat, masă de lucru);
 gura eprubetelor și a flacoanelor și marginile plăcilor Petri din sticlă sterile se vor flamba la
deschiderea și la închiderea acestora;
 scoaterea dopurilor se va realiza prin răsucire, pentru a nu crea curenți de aer, care ar putea
împrăștia sporii germenilor în mediul înconjurător;
 în intervalul de timp în care recipientele trebuie menținute deschise, este obligatorie ținerea
acestora într-o poziție oblică şi cu deschiderea în imediata apropiere a flăcării becului de gaz;
 după utilizare, instrumentarul din sticlă/plastic (pipete gradate și pipete Pasteur, vârfuri pentru
micropipeta automată, obiecte din plastic de unică folosință) se va depune în paharul cu
dezinfectant;
 mediile nutritive însămânțate se incubează în termostat/anaerostat, la temperatura optimă de
dezvoltare a microorganismelor, pe o perioadă de timp corespunzătoare; de regulă, plăcile Petri se
depun cu capacul în jos, pentru a evita scurgerea picăturilor de condens de pe capacul plăcii pe
suprafața mediului și apariția coloniilor adiționale;
 recipientele și mediile de cultură contaminate se sterilizează (de obicei prin autoclavare), apoi
mediile decontaminate se aruncă la gunoi, iar sticlăria se spală cu detergent și se clătește bine.
2
TITLU :
Pregătirea însămânțării și timpii de desfășurare ai acesteia

Materiale necesare:
- produsul de însămânțat (produs patologic, cultură, etc.);
- medii de cultură sterile (repartizate în eprubete, baloane, cutii Petri, după caz);
- bec de gaz;
- ansă de platină sau ac de însămânțare, ansă Drigalski, pipetă gradată, pipetă Pasteur, vârfuri de pipetă
sterile, pipete automate;
- produse de dezinfecție (exemplu: sublimat coroziv, alcool etilic etc.);
Figura 6.1 Sterilizarea ansei/acului de însamânțare (sursa: Burcea, 2010)

a- flambarea unei anse uscate; b- flambarea unei anse ude
1- zona rece a flăcării; 2- zona caldă a flăcării, la nivelul căreia se realizează flambarea și încălzirea la
roșu; 3- punctul cu temperatură maximă
Pregătirea pentru lucru:

- în stânga becului de gaz se așază:
- stativul cu eprubetele, recipientele sau materialele din care se face prelevarea materialului de
însămânțat;
- eprubetele sau cutiile Petri cu mediul steril pe care se face însămânțarea;
- alte materiale sterile ce se utilizează la însămânțare.
- în dreapta becului de gaz se așază:
- recipientul conținând agent dezinfectant (exemplu: sublimat coroziv 50/00) destinat colectării
materialelor folosite pe parcursul însămânțării (vârfuri de pipetă, pipetă, anse de unică
folosință, etc.).
Cel ce execută operația de însămânțare trebuie să efectueze singur toate operațiile, cu multă
dexteritate și rapiditate, ceea ce presupune un anumit exercițiu.
3
TITLU :
Principalele tehnici de însamânțare, în funcție de tipul mediilor de pe care se realizeză

transferul microorganismelor, sunt redate în tabelul 6.1.
Tabel 6.1 Principalele tehnici de însamânțare utilizate în microbiologie

Tipul mediului Instrumentarul utilizat Tehnica de însămânțare
de cultură folosită
Din mediu solid Ansă, ac
în mediu lichid
Din mediu Ansă, ac, pipetă
lichid în mediu
lichid
Ansă pentru mediu înclinat Tehnica epuizării ansei
Ac pentru mediu repartizat în Tehnica prin înțeparea
coloană mediului
Din mediu solid
Ansă pentru mediu repartizat în Tehnica în sectoare,
în mediu solid
plăci Petri Tehnica striurilor
(pentagon)
Ansă pentru mediu înclinat Tehnica epuizării ansei
Ac pentru mediu repartizat în Tehnica prin înțeparea
coloană mediului
Din mediu Ansă pentru mediu repartizat în Tehnica în sectoare,
lichid în mediu plăci Petri Tehnica striurilor
solid (pentagon)
Pipetă pentru mediu repartizat în Tehnica inundării
plăci Petri Tehnica în „gazon”
Tehnica încorporării
Pentru dobândirea dexterității în efectuarea unei însămânțări este necesară cunoașterea și

respectarea regulilor prezentate mai sus, cunoașterea și respectarea etapelor de însămănțare ce se
succed (figura 6.2).
Mod de lucru:
1. Omogenizarea suspensiei probei de analizat;
2. Sterilizarea ansei, prin flambarea portansei si apoi încălzirea la roșu a buclei ansei;
3. Deschiderea eprubetei prin mișcări de rotație a dopului;
4. Flambarea gurii eprubetei;
5. Prelevarea materialului microbian în bucla ansei;
6. Flambarea gurii eprubetei;
7. Închiderea eprubetei;
8. Însamânțarea materialului din ansă pe un mediu de cultură;
9. Sterilizarea ansei prin încălzire la roșu.
4
TITLU :
Figura 6.2 Tehnica însămânțării microorganismelor, cu ajutorul ansei de platină (sursa: Benson, 1990)
6.1. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu solid

Mediul agarizat pe care se face transferul poate fi repartizat în plăci Petri sau în eprubete
(dispus înclinat sau în coloană dreaptă).
Tehnica epuizării ansei

În bucla ansei rămâne o cantitate mică de biomasă prelevată, care va fi dispersată, sub forma
unei linii în zig-zag, pe suprafața mediului solid dispus înclinat în eprubetă sau în placă Petri, lăsând
progresiv un număr mai mic de celule microbiene, în vederea conservării microogranismelor în cultură
pură (în eprubetă) sau a posibilității obținerii unor colonii izolate (în placa Petri).
Metoda striurilor (sau metoda pentagonului) (figura 6.3) este o variantă a metodei epuizării
ansei. Epuizarea ansei se realizează trasând cu ansa, pe suprafața mediului repartizat în plăci Petri,
grupuri de linii în zig-zag, care se intersectează unele pe altele, cu excepția primei și ultimei linii.
Metoda sectoarelor (figura 6.4)

Este o altă variantă a metodei epuizării ansei. Suprafața plăcii Petri se împarte cu markerul în 4
sectoare și se numerotează. Însămânțarea se va începe în primul sector, epuizând treptat conținutul
ansei, prin trecerea buclei prin cele 4 sectoare.
Figura 6.3 a- Însămânțarea microorganismelor prin metoda striurilor fracționate; b- Obținerea de

colonii izolate după perioada de incubare
5
TITLU :
Figura 6.4 Însămânțarea microorganismelor - metoda în sectoare
Tehnica prin înțeparea mediului (figura 6.5)

Pe mediu solid repartizat în coloană dreaptă în eprubetă, însămânțarea se realizează prin
înțeparea mediului de cultură cu acul de însămânțare.
Mod de lucru:
1. Sterilizarea acului de însămânțare;
2. Deschiderea și flambarea gâtului eprubetelor;
3. Prelevarea, în condiții aseptice, a microorganismului, după răcirea acului de însămânțare pe pereții
interiori ai eprubetei și introducerea acestuia în mediul dispus în coloană dreaptă;
4. Înțeparea mediului o singură dată, pe o lungime de 2-3 cm;
5. Flambarea și închiderea gâtului eprubetei;
6. Sterilizarea acului de însămânțare.
Figura 6.5 Însămânțarea microorganismelor pe mediu dispus în coloană dreaptă în eprubetă (sursa:
Benson, 1990)
6
TITLU :
6.2. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu lichid pe mediu lichid

Acest tip de însămânțare se realizeză cu pipeta gradată, pipeta Pasteur, micropipepta automată
sau cu ansa de platină.
Mod de lucru (figura 6.6):

1. Omogenizarea suspensiei microbiene;
2. Sterilizarea ansei de platină;
4. Prelevarea și transferul culturii microbiene în eprubeta cu mediu steril, la interfața aer-lichid;
5. Flambarea gâtului eprubetelor;
6. Închiderea ambelor eprubete;
7. Sterilizarea ansei de însămânțare;
8. Dispersarea microorganismului transferat prin agitarea eprubetei.
Figura 6.6 Etapele de însămânțare a microorganismelor din mediu lichid în mediu lichid (sursa:
Benson, 1990)
6.3. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu lichid

Se realizează cu ansa de însămânțare sau cu tamponul steril de recoltare.

2. Preluarea în condiții aseptice a tulpinii microbiene, de pe mediu solid repartizat în placă Petri;
3. Deschiderea și flambarea gâtului eprubetei conținând mediul lichid;
4. Eliberarea conținutului microbian al ansei la interfața lichid-aer;
5. Flambarea și închiderea eprubetei;
6. Sterilizarea ansei de însămânțare;
7. Dispersarea microorganismului transferat prin agitarea eprubetei.
7
TITLU :
Figura 6.7 Etapele de însămânțare a microorganismelor din mediu solid în mediu lichid (sursa:
Benson, 1990)
6.4. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu lichid pe mediu solid

Mediul solid poate fi repartizat în plăci Petri sau în eprubete (dispus în coloană dreaptă sau
înclinat).
Pe mediu solid dispus în plăci Petri, se pot face însămânțări după următoarele metode:
 Metoda „prin inundare”, folosindu-se 1 mL de suspensie microbiană, determină apariția, după

incubare, de colonii izolate sau a unei culturi însămânțate „în pânză”, în funcție de scopul urmărit:

1. Omogenizarea suspensiei microbiene;
2. Deschiderea și flambarea gâtului eprubetei;
3. Prelevarea culturii microbiene, cu ajutorul unei micropipete;
5. Însămânțarea prin inundarea suprafeței mediului nutritiv repartizat în placă Petri;
6. Agitarea plăcii Petri prin mișcări de rotație, pe suprafața mesei de lucru, pentru a împrăștia
suspensia microbiană;
7. Preluarea excesului de suspensie și eliminarea lui în recipientul cu dezinfectant. Însă, dacă se
dorește cuantificarea încărcăturii microbiene, excesul de suspensie nu se mai preia. După perioada
de incubare, coloniile dezvoltate se numără, iar rezultatul obținut se raportează per mililitru sau
gram probă.
Figura 6.8 Etapele de însămânțare a microorganismelor, prin tehnica inundării (sursa: Benson, 1990)
8
TITLU :
 Prin metoda „în gazon” se însămânțează o picătură (pipeta Pasteur sterilă) sau 0,1 mL (cu
micropipeta) de suspensie microbiană;

1. Omogenizarea suspensiei microbiene prin mișcări circulare sau cu ajutorul unui vortex;
2. Deschiderea și flambarea gâtului eprubetei;
3. Prelevarea culturii microbiene cu pipeta Pasteur sterilă sau cu micropipeta;
5. Însămânțarea unei picături/0,1 mL de suspensie microbiană pe suprafața mediului repartizat în placă
Petri;
6. Dispersia suspensiei microbiene prin etalare cu ansa Drigalski sterilă.
Figura 6.9 Etapele de însămânțare a microorganismelor prin metoda "în gazon" (sursa: Benson, 1990)
 Încorporarea inoculului, metodă specifică microorganismelor, care necesită o presiune parțială de

oxigen mai mică decât cea atmosferică. Produsul de însămânțat este încorporat într-un mediu slab
agarizat, iar coloniile apar pe suprafața și în profunzimea mediului.

1. Lichefierea mediului dintr-o eprubetă (10-15 mL) prin încălzire la 80°C;
2. Răcirea mediului până la 45° ± 0,5°C;
3. Depunerea în condiții aseptice a suspensiei de microorganisme (0,5-1 mL) într-o placă Petri sterilă;
4. Repartizarea sterilă a conținutului eprubetei cu mediul răcit peste inocul;
5. Agitarea plăcii Petri prin mișcări de rotație pe suprafață plană, pentru omogenizarea inoculului până
la solidificarea mediului.
9
TITLU :
Figura 6.10 Etapele de însămânțare a microorganismelor prin încorporare (sursa: Benson, 1990)
Pe mediu solid dispus înclinat în eprubetă, însămânțarea se realizează prin tehnica epuizării
ansei, sub forma unei linii în zig-zag, pornită de la baza eprubetei;
1. Omogenizarea suspensiei microbiene prin mișcări circulare sau cu ajutorul unui vortex;
4. Prelevarea și transferul culturii microbiene în eprubeta cu mediu nutritiv, prin tehnica epuizării
ansei, sub forma unei linii în zig-zag, pornită de la baza eprubetei;
6. Sterilizarea ansei de însămânțare.
Figura 6.11 Etapele de însămânțare a microorganismelor, prin tehnica epuizării ansei (sursa:
Benson,1990)
Atunci când mediul solid este repartizat în coloană dreaptă, microorganismele se însămânțează
prin înțepare (a se vedea mai sus modul de lucru).
10
TITLU :
6.5. Metode de realizare a condițiilor de anaerobioză
Pentru dezvoltarea bacteriilor anaerobe, este necesar ca mediul de cultură (solid, semisolid sau
lichid) să nu conțină aer (oxigen).
Metode fizice:
 însămânțarea mediilor imediat după sterilizare, deoarece nu conțin aer, urmată de închiderea
ermetică cu un dop de cauciuc sau depunerea la suprafața mediului a unui strat de parafină;
 însămânțarea prin încorporare a suspensiei microbiene;
 eliminarea aerului dizolvat în mediile de cultură prin fierbere, timp de 10 minute, urmată de răcirea
bruscă a acestora, operația numindu-se „regenerare”;
 adăugarea la suprafața mediului, după însămânțare, a unui strat de ulei de parafină;
 repartizarea mediului în coloană, în tuburi înalte Weinberg, pentru a evita difuzia oxigenului.
Metode chimice:
 utilizarea unor substanțe chimice (acid tioglicolic, tioglicolat de sodiu, clorhidrat de cisteină etc.)
sau combinații de substanțe (acidul pirogalic cu hidroxid de sodiu), care consumă o cantitate mare
de oxigen din mediu. În acest scop, se încorporează în mediu o substanță cu un asemenea efect, dar
care nu inhibă microorganismele. Capacul plăcii Petri se etanșează cu parafină, pentru a nu intra
oxigen. De asemenea, reacția se poate produce într-un exicator în care se depun la baza acestuia
substanțe cu puternic efect reducător și în care sunt incubate plăcile Petri însămânțate cu bacterii
anaerobe.
Metode biologice
 cultivarea concomitentă, într-un spațiu ermetic închis, a două specii bacteriene, una aerobă și alta
anaerobă; specia aerobă consumă oxigenul și creează condiții de anaerobioză pentru specia
anaerobă (această metodă este utilizată foarte rar).
11
TITLU :
7. TEHNICI DE IZOLARE ȘI DE SELECȚIE A

MICROORGANISMELOR
În natură, microorganismele sunt răspândite pretutindeni (apă, aer, sol, pe tegumentele și

mucoasele viețuitoarelor, produse patologice, pe toate obiectele pe care le manipulăm, etc.), găsindu-se
într-o varietate variabilă, în funcție de particularitățile mediului respectiv. Aceste microorganisme pot
exista ca saprofite, comensale, simbionte sau antagoniste. Controlul microbiologic al unei probe
presupune determinarea prezenței sau absenței microorganismelor, cuantificarea încărcăturii
microbiene și identificarea microorganismelor prezente în proba respectivă (figura 7.1). Studierea unui
microorganism presupune izolarea în cultură pură și apoi cultivarea și dezvoltarea sa pe medii de
cultură adecvate (figura 7.2).
Termeni de bază:
Cultura pură reprezintă o populație omogenă de celule sau de hife ale unei singure tulpini sau
specii microbiene. Cultivarea în condiții optime de dezvoltare a populației microbiene se realizează fie
pe suprafața (culturi statice sau de suprafață), fie în profunzimea (culturi submerse) unui mediu de
cultură solid sau lichid.
Izolatul colonial (izolatul primar) reprezintă o aglomerare de celule, dezvoltată pe o zonă bine
delimitată a suprafeței unui mediu de cultură solid, provenită dintr-o celulă viabilă din proba de
analizat.
Clona microbiană reprezintă o cultură omogenă din punct de vedere genetic, fiind descendența
unei celule-mame. Existența unei clone microbiene este limitată, deoarece, printre indivizii clonei, pot
apărea mutanți (ca urmare a mutațiilor spontane și/sau recombinărilor), aceștia manifestând proprietăți
noi.
Tulpina microbiană reprezintă unitatea practică de lucru, aflată în cultură pură, de origine
clonică, cu omogenitate genetică relativ mare. Se obține dintr-o succesiune de culturi derivate dintr-o
colonie unică inițială. Tulpinile microbiene pot aparţine aceleiași specii, dar pot fi izolate în laborator
din diverse probe prelevate.
Există mai multe tehnici utilizate în izolarea unui microorganism în cultură pură, și anume:
• Tehnica epuizării ansei pe medii solide;
• Tehnica încorporării;
• Tehnica diseminării probei diluate pe suprafața mediilor solide;
• Izolarea în cultură pură prin filtrarea pe membrane de tip Millipore.
Penicillium tip 2
Penicillium tip 1
Botrytis
Drojdie
Cladosporium
Figura 7.1 Consorțiu microbian
12
TITLU :
Figura 7.2 Izolarea microoganismelor în cultură pură
7.1. Tehnica epuizării ansei pe medii solide
Tehnica epuizării ansei se realizează pe medii solide repartizate, de obicei, în plăci Petri.
Utilizări: obținerea de colonii izolate, din probe cu densitate microbiană mare, folosindu-se mai
multe metode, dintre care cele mai importante sunt metoda striurilor și metoda sectoarelor (figura 7.3).
Figura 7.3 Tehnica obținerii de colonii izolate dintr-o probă, prin metoda striurilor (a) și metoda
sectoarelor (b)
(sursa: Antoce și Dinu, 2002)
13
TITLU :
7.2. Tehnica diseminării probei diluate pe suprafața mediilor solide
Tehnica presupune parcurgerea a două etape consecutive:

• Diluarea probei, fie prin metoda diluțiilor zecimale, fie prin metoda Domercq;
• Distribuirea probei diluate, prin una dintre tehnicile de însămânțare, pe suprafața sau în
profunzimea unui mediu nutritiv adecvat. După incubare, coloniile formate sunt izolate,
putând fi ulterior obținute în cultură pură.
Utilizări: izolarea în cultură pură a tulpinilor microbiene din probe bogate în microorganisme,
care nu se pot etala direct pe suprafața mediului de cultură; controlul microbiologic cantitativ sau
calitativ al unei probe de analizat.
7.2.1. Metoda diluțiilor zecimale - cantitativă

Se pregătesc mai multe eprubete conținând 9 mL apă distilată sau soluție fiziologică (NaCl
0,9%) (sterilizate prin autoclavare, la 121°C, timp de 15-20 minute).
1 mL (sau 1g) din proba de analizat este transferat în condiții aseptice într-o eprubetă care
conține 9 mL apă distilată sterilă sau soluție fiziologică. Aceasta reprezintă diluția 1/10 (10-1),
deoarece materialul microbian este diluat de 10 ori.
Suspensia obținută se omogenizează foarte bine, cu ajutorul pipetei, prin barbotare sau cu
ajutorul vortexului. Apoi, cu aceeași pipetă, se preia 1 mL din diluția 10-1 și se transferă într-o altă
eprubetă cu apă distilată sau soluție fiziologică sterilă, realizându-se diluția 10-2, în care materialul
microbian este diluat de 100 de ori.
În mod asemănător se procedează pentru a obține și alte diluții zecimale (de regulă se diluează
până la 10-6 pentru drojdii și până la 10-8 pentru bacterii).
Figura 7.4 Tehnica obținerii de colonii izolate dintr-o probă, prin metoda diluțiilor zecimale
14
TITLU :
Din ultimele eprubete de diluție, se fac însămânțări pe medii de cultură adecvate, repartizate în
plăci Petri. În vederea obținerii de colonii izolate, cele mai importante tehnici de însămânțare sunt:
tehnica în „gazon” sau tehnica inundării (a se vedea Capitolul 6).
Interpretarea rezultatelor
După perioada de incubare, coloniile dezvoltate apar pe suprafața mediului de cultură și se pot
distinge prin formă, dimensiuni, culoare, etc. De asemenea, se poate calcula numărul de unități
formatoare de colonii prezente în 1 mL sau 1 g probă (UFC/mL sau UFC/g).
Utilizări: izolarea germenilor aerobi din probe, determinarea numărului total de
microorganisme aerobe (TAMC - total aerobic microbial count), determinarea numărului total de
drojdii și fungi filamentoși (TYMC - total combined yeasts and molds count), etc.
7.2.2. Metoda Domercq - calitativă
Este o variantă a metodei diluțiilor zecimale, în care transferarea materialului microbian din
probă/diluție în altă diluție, se realizează cu ajutorul ansei de însămânțare de unică folosință sau de
platină (figura 7.5).
În vederea obținerii de colonii izolate, cele mai importante tehnici de însămânțare sunt: metoda
striurilor și metoda sectoarelor (a se vedea Capitolul 6).
Figura 7.5 Tehnica obținerii de colonii izolate dintr-o probă, prin metoda Domercq
15
TITLU :
7.3. Tehnica încorporării
În acest caz, proba de analizat este încorporată și dispersată într-un mediu slab agarizat
repartizat într-o placă Petri (figura 7.6).
Mod de lucru:
1. Repartizarea în condiții aseptice în plăci Petri sterile a câte 0,1 sau 1 mL din suspensia de
microorganisme nediluată sau din diluția acesteia;
2. Turnarea în condiții aseptice a 15-20 mL mediu nutritiv adecvat, lichefiat și răcit la 45°C
(temperatură care permite viabilitatea microorganismelor şi la care mediile sunt încă în stare
lichidă);
3. Omogenizarea uniformă (fără producerea de bule de aer) a conținutului plăcii Petri prin mișcări de
rotație și lăsarea în repaus până la solidificarea mediului;
După perioada de incubare la temperatura optimă de dezvoltare, plăcile Petri sunt analizate si
sunt notate rezultatele.
Figura 7.6 Tehnica încorporării suspensiei microbiene în profunzimea mediului de cultruă

(https://microbeonline.com/)
După perioada de incubare, coloniile dezvoltate apar atât în interiorul cât și pe suprafața
mediului de cultură și se pot distinge prin formă, dimensiuni, culoare, etc . De asemenea, se poate
calcula numărul de unități formatoare de colonii prezente în 1 mL sau 1 g probă (UFC/mL sau UFC/g).
Utilizări: izolarea germenilor anaerobi sau microaerofili din probe (dezvoltați în profunzimea
mediului), determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC - total aerobic microbial
16
TITLU :
count), determinarea numărului total de drojdii și fungi filamentoși (TYMC - total combined yeasts
and molds count) etc.
O variantă a acestei tehnici o reprezintă „etalarea în profunzime”:

1. Suspensia microbiană este depusă în mediu nutritiv adecvat, lichefiat și răcit la 45°C, repartizat în
eprubete;
2. După omogenizarea uniformă, conținutul eprubetei este turnat cât mai rapid posibil în plăci Petri
sterile;
3. După solidificarea mediului de cultură, plăcile Petri sunt incubate la temperatura optimă de
dezvoltare.
Coloniile dezvoltate ramân încorporate în mediului solid și se pot număra sau izola în vederea
obținerii de culturi pure.
7.4. Izolarea în cultură pură, prin filtrare cu membrane de tip Millipore
Membranele filtrante de tip Millipore au capacitatea de a reține, pe suprafața lor, particulele și

germenii ale căror dimensiuni nu depășesc diametrul porilor membranei (0,22 µm pentru izolarea
bacteriilor și 0,45- 0,8 µm pentru reținerea celulelor de drojdie și a mucegaiurilor).

1. Prelevarea, în condiții aseptice, a membranei filtrante sterile, cu penseta sterilizată în prealabil, prin
alcool flambare;
2. Așezarea membranei filtrante sterile pe suportul de plastic steril și ansamblarea sistemului de
filtrare;
3. Turnarea probei lichide de analizat (100 mL sau volume mai mari) în pâlnia de sticlă gradată;
4. După filtrare, membrana Millipore se preia aseptic, cu penseta sterilizată în prealabil, prin alcool-
flambare;
5. Depunerea membranei pe mediu nutritiv adecvat, având grijă ca suprafața care a reținut germenii să
ajungă în contact direct cu mediul de cultură.
Pentru ca microorganismele să se poate dezvolta, mediile însămânțate sunt incubate în

termostat la temperatura corespunzătoare dezvoltării microorganismelor de dorit.
În cazul ultimelor tehnici descrise mai sus, numărarea coloniilor se poate face cu ochiul liber,
cu lupa sau folosind colony-counter-ul, special destinat acestui scop.
17
TITLU :
Figura 7.7 Tehnica obținerii de colonii izolate dintr-o probă cu ajutorul membranelor filtrante
Utilizări: cuantificarea încărcăturii microbiene a probelor cu densitate microbiană redusă, la

care numărul de colonii izolate apărute pe mediul nutritiv după filtrare este cuprins între 10 și 100 de
colonii/membrană; controlul microbiologic a unor produse alimentare lichide, aflate în faze
tehnologice finale, sau aflate în depozite, în circuitul comercial; examenul de rutină al apei, etc.
7.5. Izolarea microorganismelor utilizate în bioremediere
Microorganismele reprezintă principalul mijloc natural de descompunere a reziduurilor. Varietatea

abilităților metabolice ale microorganismelor este enormă, acestea fiind capabile să degradeze cea mai
mare parte a produșilor reziduali ai activităților umane, de la reziduuri petroliere, la pesticide reziduale
și până la reziduuri toxice.
Bioremedierea desemnează utilizarea (micro)organismelor vii, care pot degrada sau transforma
diferite substanțe din mediu, convertindu-le la forme netoxice sau ușor-extractibile din mediu. Scopul
final este distrugerea substanțelor poluante din mediu. În general, se utilizează microorganismele
existente deja în natură, în detrimentul celor modificate genetic. Se preferă ca, în loc să se lase ca
natura să își urmeze cursul, să fie grăbit acest proces de degradare.
Etapele principale ale unui proces de bioremediere sunt următoarele:
 Definirea situației poluante (poluantul, cantitatea de poluant, periculozitatea acestuia, capacitatea
acestuia de a se răspândi);
 Găsirea și punerea la punct a unei metode de degradare microbiană a poluantului;
 Izolarea și stimularea unei populații microbiene care în mod natural poate metaboliza acel poluant;
 Cultivarea în cantități mari a microorganismului implicat în bioremediere sau crearea de condiții
optime de dezvoltare chiar în mediul poluat;
 Adăugarea culturii de microorganism în mediul poluat și asigurarea unui mediu nutritiv optim și
condiții de mediu care să le permită metabolizarea poluantului.
Izolarea și stimularea microorganismelor sunt esențiale în bioremediere și au la bază tehnica

culturii îmbogățite, care presupune următoarele:
1. Într-un mediu nutritiv de bază, poluantul este adăugat ca unică sursă de carbon sau de energie;
18
TITLU :
2. Mediul va fi inoculat de exemplu cu sol (care conține o mare diversitate de microorganisme);

3. Cultura va fi incubată, de obicei în condiții aerobe, pe o anumită perioadă de timp, la anumite
temperaturi;
4. Pe parcursul incubării cantitatea de poluant va fi monitorizată; dacă în solul folosit ca inocul se
întâmplă să existe acel microorganism ce poate degrada poluantul, el va supraviețui și se va
dezvolta;
5. Dacă poluantul a dispărut, se va preleva inocul din proba biodegradată și se va însămânța din
nou pe mediu cu poluant, până când se va obține o cultură în care predomină microorganismul
ce poate metaboliza poluantul;
6. Din această cultură, microorganismul va fi izolat și studiat în vederea utilizării sale la scară
industrială.
7.6. Tehnici de selecție a microorganismelor
În unele experimente de laborator este necesară izolarea anumitor microorganisme în

detrimentul altora aflate în același consorțiu microbian.
Selecția se realizează prin diferite metode:
• Modificarea condițiilor de cultivare, aplicate întregului amestec de microorganisme (de exemplu,
aplicarea tratamentelor termice, modificarea pH-ului mediului de cultivare, a necesarului de oxigen,
etc.):
• izolarea dintr-un amestec microbian a microorganismelor sporulante, prin încălzirea
amestecului timp de o oră la 60-80°C, urmată de inocularea suspensiei microbiene rezultate
pe un mediu de cultură;
• izolarea microorgansimelor termofile, prin incubarea mediului însămânțat la temperatura de
50°C (sau mai mare);
• izolarea microorganismelor halofile, prin adăugarea în mediu de cultură a unor concentrații
mai mari de 10% NaCl;
• izolarea bacteriilor osmofile, prin adăugarea în mediu a unei soluții concentrate de zaharoză;
• separarea bacteriilor lactice de bacteriile acetice, prin cultivarea în condiții de anaerobioză,
fapt ce favorizează dezvoltarea bacteriilor lactice, care sunt microaerofile.
• Centrifugarea permite separarea microorganismelor, în funcție de greutatea lor moleculară.
Mucegaiurile și drojdiile sedimentează la cel puțin 1.000-2.000 rpm, în timp ce bacteriile la cel
puțin 2.000-4.000 rpm.
• Selecția microorganismelor pe medii speciale de însămânțare (medii selective, elective și de
îmbogățire). Există medii de cultură care, prin compoziția lor, sau prin prezența unuia sau mai
multor agenți inhibitori, evidențiază anumite caracteristici metabolice ale unor microorganisme,
ceea ce permite separarea speciilor între ele:
• pentru izolarea fungilor se folosește mediul Dichloran Rose Bengale Chloramphenicol Agar
(a se vedea Anexa 3). Adăugarea de cloramfenicol inhibă dezvoltarea bacteriilor și face ca
mediul să devină foarte selectiv pentru izolarea fungilor. Adăugarea Rose Bengale în
compoziția mediului determină creşterea lentă a mucegaiurilor.
• pentru izolarea bacteriilor acetice se folosește mediul geloză simplă, la care se adaugă,
pentru fiecare 10 mL de mediu, câte 250.000 U.I. penicilină (adică 0,1 mL de soluție
penicilină 0,25%) pentru a îndepărta bacteriile lactice și 0,2 mL soluție de natamicină 0,25%
pentru înlăturarea drojdiilor și a mucegaiurilor;
19
TITLU :
• folosirea mediilor diferențiale conținând lactoză sau lactoză și zaharoză, alături de un

indicator, permite diferențierea germenilor din genul Escherichia (capabili se fermenteze
aceste zaharuri) de cei din genul Salmonella, care nu fermentează aceste zaharuri. Un alt
exemplu, mediul Istrati-Meitert este un mediu de diagnostic diferențial între coloniile
aparținând genului Salmonella care apar verzi-albăstrui, relativ transparente de cele de E.
coli care apar galbene opace și de cele de Proteus care sunt albastru-verzi și au centru mai
opac înnegrindu-se în timp.
20
TITLU :
8. METODE DE NUMĂRARE A MICROORGANISMELOR
Determinarea încărcăturii microbiene dintr-o probă de analizat se realizează, pe de o parte,

pentru controlul calității în ceea ce privește prezența și nivelul microorganismelor, iar, pe de altă parte,
pentru aprecierea nivelului activității unei populații microbiene, utilă în diferite ramurii industriale (la
întocmirea curbei de creștere).
Cuantificarea încărcăturii microbiene a unei probe se poate realiza prin:
- procedee optice, cu ajutorul microscopului, determinând numărul total de microorganisme
(fără a putea diferenția celulele moarte de cele viabile);
- metode biologice, care țin cont de multiplicarea microorganismelor, determinând numărul de
germeni viabili prezenți în probă.
8.2. Tehnici bazate pe folosirea mediilor de cultură
Aplicarea acestor metode determină cuantificarea încărcăturii microbiene viabile, evaluarea

gradului de stabilitate microbiologică sau de contaminare a unui produs, fiind cunoscut faptul că
microorganismele viabile pot determina alterarea acestuia.
8.2.1. Tehnica determinării unităților formatoare de colonii (U.F.C.)
Metoda se bazează pe ipoteza că fiecare colonie este rezultatul multiplicării unei singure celule
viabile, pe suprafața sau în profunzimea unui mediu de cultură, în condiții favorabile de dezvoltare, și
poartă denumirea de unitate formatoare de colonie (U.F.C.).
Mod de lucru:
- Proba se diluează prin tehnica diluțiilor zecimale (a se vedea subcapitolul 7.2.1.). Pentru a stabili
diluția cea mai potrivită, se recomandă numărarea, în prealabil, a celulelor din probă cu ajutorul
lamei Thoma);
- Se însămânțează, din ultimele trei diluții, pe câte 3 plăci Petri, folosind una dintre tehnicile de
însămânțare (metoda inundării, metoda „în gazon” sau metoda încorporării) (a se vedea Capitolul 6);
- Pe plăci se notează: data însămânțării, gradul diluției, mediul de cultură și numărul probei;
- Plăcile Petri se incubează în termostat la 28°C (drojdiile și mucegaiurile) sau la 37°C (bacteriile),
timp de 24-72 ore pentru bacterii și drojdii sau 7 zile pentru mucegaiuri, cu capacul în jos, pentru a
evita apariția coloniilor adiționale;
- Coloniile, apărute pe suprafața sau în profunzimea mediului, se numără cu ochiul liber sau folosind
colony-counter-ul, special destinat acestui scop;
- Pentru a obține rezultate cât mai corecte, se recomandă numărarea și luarea în considerare doar a
plăcilor pe care au apărut între 15 și 300 de colonii/placă;
21
TITLU :
- Cuantificarea numărului de germeni viabili poate fi ușor de calculat, plecând de la numărul mediu de
colonii (media repetițiilor) dezvoltate pe suprafața sau în profunzimea mediului, atunci când s-a
însamânțat 1 mL din diluțiile corespunzătoare, prin tehnica inundării sau prin tehnica încorporării.
Valoarea rezultată se înmulțește cu inversul diluției aplicat la materialul inițial de examinat, conform
formulei:
N = m*c
în care:
N – U.F.C. - unități formatoare de colonii sau numărul celulelor viabile per mililtru sau gram probă;
m - media aritmetică a coloniilor numărate pe 3 plăci însămânțate din aceeași diluție;
c - inversul diluției din care s-a făcut însămânțarea.
- Dacă însămânțarea s-a realizat prin tehnica „în gazon”, se aplică o corecție de calcul la formula de
mai sus, după cum urmează:
N = m*c*10
în care:
N – U.F.C. - unități formatoare de colonii sau numărul celulelor viabile per mililtru sau gram probă;
m - media aritmetică a coloniilor numărate pe 3 plăci însămânțate din aceeași diluție;
c - inversul diluției din care s-a făcut însămânțarea;
10 - coeficient de raportare a rezultatului la 1 mL.
Rezultatul obținut trebuie exprimat sub forma unui număr cuprins între 1,0 – 9,9
înmulțit cu 10x per mililtru sau gram probă. Unitate de măsură este UFC/mL sau UFC/g.
Utilizări: determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC - total aerobic

microbial count), determinarea numărului total de drojdii și fungi filamentoși (TYMC - total combined
yeasts and molds count), izolarea germenilor viabili pentru obținerea de culturi pure etc.
22
TITLU :
Exemplu demonstrativ de stabilire a numărului de celule vii dintr-o probă bogată în

microorganisme
Mod de lucru:
1. Pregătirea probelor se face în condiții aseptice:
− Dacă proba este solidă, se ia un recipient steril, în care se cântărește aseptic o cantitate din
proba de analizat, astfel încât rezultatele numărătorilor să se raporteze la greutatea produsului
de analizat (echivalent per gram). Dacă proba este lichidă, se preia aseptic un volum din proba
de analizat, astfel încât rezultatele numărătorilor să se raporteze per mililitru produs.
− se adaugă diluantul stabilit prin calcul, astfel încât să obținem soluția mamă cu titrul determinat
1/5, 1/10, 1/15 etc., în funcție de cât se presupune că este încărcată microbian proba respectivă:
Pentru a obține, de exemplu, o soluție-mamă de 1/10, la 5 g cântărite dintr-un produs, se

adaugă 45 mL diluant; astfel:
La cuantificarea încărcăturii microbiene a unui gram sau un mililitru de produs, calculul se

realizează prin înmulțirea rezultatului obținut în urma analizei microbiologice a 1 mL soluție-mamă cu
10.
Diluantul utilizat la obținerea de suspensii este apa distilată sterilă sau soluția fiziologică sterilă
(NaCl 0,9%). El trebuie să asigure supraviețuirea tuturor microorgansimelor și nu trebuie să
influențeze, cantitativ sau calitativ, microflora prezentă în produsul de analizat.
În plus, pentru trecerea microorganismelor de pe suprafața produsului de analizat în diluant,
sau pentru cele care au un conținut ridicat de grăsimi, se recomandă adăugarea unui agent tensioactiv
în diluant (de exemplu, Tween 80/polisorbat 80), fără efect microbiocid. Omogenizarea probei cu
diluantul trebuie să se realizeze fără distrugerea microorganismelor prezente, astfel încât suspensia
rezultată să fie cât mai limpede, fără particule de produs;
2. Efectuarea de diluții zecimale conform tehnicii prezentate mai sus;
3. Însămânțarea în triplicat prin tehnica inundării din ultimile diluții (de exemplu, 10-4-10-6) pe mediu
nutritiv adecvat repartizat în plăci Petri, notarea și incubarea plăcilor la termostat;
4. După perioada de incubare, se constată că, pe plăcile însămânțate cu diluția 10-6, s-au dezvoltat 33,
38, respectiv 25 colonii, astfel că media numărului de colonii reale este 32 colonii/placă; în cazul
diluției 10-5 au apărut 310, 300 și 284 colonii, adică o medie aritmetică a coloniilor reale de 298
colonii/placă; iar din diluția 10-4 s-au dezvoltat prea multe microorganisme pentru a putea fi
cuantificate și se notează cu T.N.T.C. (too numerous to count);
5. Se calculează media numărului de colonii obținute, adică (33+38+25)/3 = 32 colonii;
6. Media coloniilor se înmulțește cu inversul diluției de reper (106), astfel că numărul de celule viabile
per mL de probă este 32x106 = 3,2x107 UFC/mL.
23
TITLU :
8.2.2. Determinarea numărului cel mai probabil de celule (MPN)
Metoda pentru determinarea cantitativă a numărului cel mai probabil (MPN = most probable
number) de microorganisme dintr-o probă se mai numește și metoda McCrady, sau tehnica tuburilor
multiple, și se bazează pe un calcul statistic.
Un mediu de cultură adecvat este însămânțat cu un volum determinat de inocul (suspensie-
mamă sau diluție). După incubare, se apreciază prezența (+) sau absența (-) caracteristicii fiziologice
urmărite (de exemplu: fermentația unui glucid prin virajul unui indicator, eliberarea de gaz, cu ajutorul
tubușoarelor Durham, etc.).
Metoda care permite estimarea concentrației celulare dintr-o suspensie microbiană răspunde
postulatului conform căruia, într-un mediu lichid, microorganismele sunt dispersate total aleator
(exemplu: 1 mL de suspensie poate să conțină un număr de celule ce va putea fi egală cu 0, 1, 2, 3, 4,
5, ș.a.m.d.).
Validarea procedeului presupune anumite condiții:
- Microorganismele trebuie să fie distribuite aleator în suspensie, fără să existe forțe de repulsie sau de
atracție între ele (floculare);
- O singură celulă microbiană viabilă, existentă într-o probă, trebuie să determine un răspuns pozitiv;
- Orice probă lipsită de microorganisme nu poate da un răspuns pozitiv;
- O atenție sporită trebuie acordată manipulărilor ce se impun în laborator, pentru a evita posibile
contaminări.
Dezavantajele folosirii acestei metode sunt:
- Determinarea numai a numărului probabil de microorganisme viabile prezente într-o probă;
- Necesitatea efectuării de calcule și citirea cu atenție a tabelului McCrady; în caz contrar, rezultatele
obținute nu reprezintă realitatea;
- Implicarea unui timp de lucru și a unui consum de materiale destul de mare, de care depinde reușita
rezultatelor obținute.
Densitatea microbiană a unei probe, în special în probele sărace în microorganisme (care conțin
mai puțin de 10 germeni/g), poate fi stabilită statistic, cu ajutorul tabelelor de probabilitate McCrady
(Anexa 4), prin subdivizarea probei și cultivarea diluțiilor pe mediu lichid selectiv.
Această metodă se folosește mai ales pentru determinarea microorganismelor din anumite
grupe fiziologice (de exemplu: drojdiile fermentative, bacteriile celulozolitice), dar se aplică cu succes
și în determinarea microflorei totale.
Principalele medii selective recomandate pentru determinarea MPN sunt:
• Medii în care se evidențiază creșterea microorganismelor prin metode turbidimetrice;
• Medii în care se evidențiază producerea de gaz;
• Medii în care se evidențiază producerea de acizi sau baze, cu ajutorul substanțelor indicatoare de
pH;
• Medii în care se evidențiază reducerea unor substanțe.
Mod de lucru:
 Proba se diluează prin tehnica diluțiilor zecimale (de regulă, până la diluția 10-8);
 Din proba inițială sau din fiecare diluție, se însămânțează câte 1 mL în 3 eprubete cu mediu lichid
selectiv (de exemplu, pentru drojdiile fermentative se folosește mediul YPG lichid, repartizat în
24
TITLU :
eprubete în care s-au introdus tubușoare Durham, ce captează CO2 produs prin fermentarea
glucozei);
 Se păstrează 3 eprubete martor cu mediu selectiv neînsămânțat;
 Eprubetele se incubează la termostat, la temperatura optimă de dezvoltare a microorganismului, pe
o perioadă delimitată de timp, de obicei între 3 și 48 de ore;
 Se numără eprubetele în care au apărut reacții pozitive (în cazul drojdiilor fermentative acumularea
CO2 în tubușorul Durham evidențiază reacția pozitivă);
 Se iau în considerare reacțiile pozitive apărute la mediile selective însămânțate din ultimele trei
diluții consecutive aflate la limita pozitivității, care vor forma un număr caracteristic, ce se
regăsește în tabelele McCrady. Numărul caracteristic este format din trei cifre: prima cifră
reprezintă numărul eprubetelor cu reacție pozitivă însămânțate din diluția de referință (prima
diluție), iar cifra a doua și a treia reprezintă numărul eprubetelor cu reacție pozitivă însămânțate din
diluțiile următoare. Numărul caracteristic are un corespondent în tabelele McCrady, stabilit pe baza
unor calcule statistice, număr care se va înmulți cu inversul diluției de reper.
 Calcularea numărului cel mai probabil de germeni (MPN) se realizează cu ajutorul formulei:
MPN = n*c
în care:
MPN - numărul cel mai probabil de germeni;
n - corespondentul numărului caracteristic, din tabelele McCrady (Anexa 4);
c - inversul diluției de referință;
Pentru stabilirea numărului probabil de microorganisme, în exemplul următor se folosesc câte 3

eprubete pentru fiecare diluție (figura 8.3). Se constată că:
 Cele trei diluții consecutive, aflate la limita pozitivității, sunt: diluția 10-2, unde s-au obținut 3
reacții pozitive, diluția 10-3, la care s-a evidențiat reacția pozitivă într-o singură eprubetă și diluția 10-
4
, unde au apărut 2 reacții pozitive. Se notează într-un tabel, întocmit după exemplul din tabelul de
mai jos, eprubetele în care s-a constatat creșterea microorganismelor, pentru fiecare diluție;
 Numărul caracteristic este 312, iar diluția de reper 10-2, pentru că diluția 10-2 este ultima diluție la
care toate reacțiile au fost pozitive (figura 8.3);
 Cifra corespunzătoare numărului caracteristic 312 din tabelele McCrady pentru trei tuburi per
diluție este 12 (a se vedea Anexa 4);
 Pentru aflarea rezultatului final (exprimat la 1 mL), numărul citit în tabelul McCrady este înmulțit
cu inversul diluției la care au crescut microorganisme în toate eprubetele, conform formulei de calcul
a MPN, astfel : 12×102 = 1,2x103 germeni/mL.
În cazul în care la una sau la ambele eprubete din diluțiile următoare n-au crescut
microorganisme, se ia cifra zero la determinarea numărului caracteristic (ex. 301, 310 sau 300). În
cazuri foarte rare, când numărul de microorganisme este foarte mic, e posibil ca pentru nici una din
diluții să nu avem trei eprubete care să prezinte creștere. În aceste condiții, numărul caracteristic poate
începe cu cifra 2 sau 1 (211, 210, 100 etc.).
Exemplu
25
TITLU :
Diluția 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Rezultatele obținute + ++ +++ +-- ++- --- --- ---
(in triplicat)
Numărul corespunzător 3 3 1 2 0 0 0
testelor +
Figura 8.3 Determinarea numărului cel mai probabil de microorganisme pe baza observării creșterii
acestora în eprubete diluate succesiv
26
TITLU :
8.4. Citometria în flux
Principiul metodei
Metoda se bazează pe sortarea celulelor, aflate în suspensie, în funcție de fluorescența obținută
prin expunerea lor la acțiunea unei raze laser, după marcarea, în prealabil, cu substanțe din categoria
fluorocromilor care se fixează pe acizii nucleici, proteine sau alte molecule. Este posibilă folosirea
simultană a mai multor fluorocromi ceea ce permite realizarea mai multor măsurători asupra celulei.
Atunci când fasciculul întâlnește o celulă marcată, moleculele de fluorocromi sunt excitate și emit o
fluorescență care este captată și preluată de către detectori. Prelucrarea informatizată a datelor obținute
permite indicarea numărului de celule de diferite categorii, existente în suspensie.
Figura 8.4 Schema reprezentativă a unui citometru de flux

https://www.univ-reims.fr/urcacyt/urcacyt-plateau-technique-de-cytometrie-en-flux,17140,31442.html
În general, un citometru în flux (flowcitometru) este alcătuit din trei sisteme diferite:
- un sistem fluidic, care vizează pe de o parte alinierea celulelor marcate cu fluorocromi una în
spatele celeilalte într-un flux de lichid concentrat hidrodinamic și, pe de altă parte, permite trecerea cu
viteză mare a unui maximum de celule într-un timp minim;
- un sistem optic (format din lasere ca sursă de lumină, precum și filtre optice, care separă lumina
emisă și o direcționează spre detectoare). În general, doi senzori (detectori) sunt utilizați pentru
numărarea celulelor: FSC care oferă informații despre dimensiunea celulelor și SSC care oferă
informații despre complexitatea internă a celulelor.
- un sistem electronic care convertește diferitele semnale luminoase în date
IT utilizabile.
Utilizări: Aplicațiile citometriei în flux sunt în continuă evoluție în numeroase domenii, precum:
microbiologie, biologie vegetală, toxicologie, procesarea alimentelor, hematologie, imunologie,
oncologie, farmacologie, genetică, etc.).
27
TITLU :
8.4. Determinarea numărului de germeni viabili, prin filtrare cu filtre de tip

Millipore
Metoda are la bază trecerea unui volum determinat din proba de analizat, printr-o membrană
filtrantă, cu porozitate adecvată. Această metodă este frecvent folosită pentru controlul microbiologic
al produselor alimentare lichide, cu un conținut scăzut de microorganisme. Membrana filtrantă permite
reținerea particulelor și a microorganismelor, ale căror dimensiuni depășesc diametrul porilor
membranei (0,22 µm pentru reținerea bacteriilor și 0,45- 0,8 µm pentru reținerea drojdiilor și a
mucegaiurilor). Fiecare membrană este steril ambalată individual, în folie de plastic.
Figura 8.5 Determinarea numărului de microorganisme viabile dintr-o probă lichidă, cu ajutorul
membranelor filtrante
După filtrarea rapidă a probei de analizat, cu ajutorul vidului, filtrul încărcat cu
microorganisme se depune în condiții aseptice pe mediu de cultură adecvat și se incubează în condiții
optime: 37°C pentru bacterii, 28-30°C pentru fungi, timp de 24-96 ore (figura 8.5).
Cuantificarea numărului de germeni viabili din probă se determină prin numărarea coloniilor
dezvoltate pe filtru și raportarea acestora la volumul inițial al probei din care provin (figura 8.5).
Rezultatele se exprimă în U.F.C./mL probă, după tehnica de calcul cunoscută. Pentru o
determinare corectă, pe o membrană filtrantă, cu un diametru de 47 mm, nu trebuie să se depășească o
încărcătură de 60-80 colonii. În cazul probelor prea bogate în microorganisme, care determină apariția
unui număr prea mare de colonii pentru a putea fi numărate, se notează rezultatul cu T.N.T.C (Too
Numerous To Count), conform sistemului de notare U.E.
Utilizări
Această metodă este aplicată pentru examenul de rutină al apei, al laptelui; controlul
microbiologic al unor produse alimentare lichide aflate în faze tehnologice finale sau aflate în
depozite, în circuitul comercial; izolarea microorganismelor din produse sărace în microorganisme
(însămânțarea filtratului pe medii de cultură), etc.
28
TITLU :
8.5. Metode turbidimetrice
Densitatea unei populații microbiene, care manifestă o creștere uniformă și care tulbură omogen
mediul lichid în care sunt cultivate, se poate stabili prin spectrofotometrie, adică prin măsurarea
gradului în care suspensia microbiană reduce transmiterea luminii. Metoda poate fi aplicată doar
bacteriilor și drojdiilor (cu creștere uniformă), în cazul mucegaiurilor aceasta nefiind potrivită (nu dă
rezultate satisfăcătoare).
Relația dintre numărul de celule și densitatea optică la o anumită lungime de undă variază, în
funcție de tulpina microbiană folosită și de condițiile de mediu. De exemplu, atunci când concentrația
în bacterii atinge 10 milioane de celule viabile/mL (107 cel./mL), mediul lichid devine ușor tulbure.
Creșterea concentrației de celule conduce la creșterea turbidității mediului lichid și, prin urmare,
determină o reducere a intensității luminoase la trecerea fasciculului de lumină prin mediul respectiv
(figura 8.6.).
Principiul metodei
La trecerea unui fascicul luminos prin suspensia microbiană, o parte a luminii incidente este
difuzată de celulele existente, distingându-se la ieșire, un con de difuzie a razei luminoase inițiale.
Reducerea intensității luminii incidente, la traversarea suspensiei, se exprimă prin absorbanță (A)
și se calculează după următoare formulă:
; unde:
I0 - intensitatea luminii incidente;
I - intensitatea luminii emergente.
Rezultatele sunt exprimate sub formă de densitate optică (D.O.), prin determinarea gradului
lungimi de undă cuprinse între 400 și 660 nm.
Aprecierea numărului de microorganisme, dintr-o suspensie necunoscută, se poate determina
rapid, pe baza unei curbe etalon (realizată cu suspensii cu număr cunoscut de celule microbiene), prin
extrapolare pe grafic.
Figura 8.6 Determinarea numărului de microorganisme, pe baza turbidității probei de analizat
29
TITLU :
Utilizări
Această metodă este aplicată în industriile fermentative (industria berii, a vinului), pe parcursul
fluxului tehnologic; în controlul microbiologic, pentru estimarea florei totale a unor produse
alimentare; pentru evaluarea creșterii populațiilor microbiene; pentru testarea sensibilității
microorgansimelor la antibiotice; etc.
8.6. Alte metode de determinare a numărului de microorganisme
8.6.1. Microcalorimetria
Această metodă se bazează pe faptul că activitatea microbiană duce la eliberare de energie

calorică, produsă ca rezultat al reacțiilor exoterme (ale catabolismului) și a celor endoterme (ale
anabolismului). De exemplu, dacă un aliment, sau un mediu nutritiv contaminat, este introdus într-un
calorimetru și se compară termogeneza acestei probe cu cea a unui martor steril, este posibil să se
determine prezența chiar a unui mic număr de microorganisme.
Utilizări
Examinarea căldurii degajate de o cultură de microorganisme poate aduce anumite informații,
din punct de vedere al microbiologiei fundamentale: studierea comunităților complexe de
microorganisme, stabilirea curbei de creștere a unei populații microbiene, aprecierea intensității
potențialului de degradare a compușilor chimici, detecția rapidă a contaminării bacteriene şi măsurarea
răspunsului microorganismelor la medicamente (antibiogramă microcalorimetrică), etc.
8.6.2. Metode bazate pe fluorescență și bioluminiscență
Ambele metode au ca scop diferențierea rapidă, dintr-un amestec, a microorganismelor vii de

cele moarte, pe baza proprietăților specifice celulelor vii, care sunt determinate de activitatea lor
metabolică.
Metoda cu fluorescență
Această metodă este bazată pe capacitatea anumitor coloranți fluorescenți (de exemplu acridin-
oranjul) de a se lega de microorganismele vii, pe care le colorează (în roșu), în timp ce
microorganismele inactive metabolic se vor colora diferit (în verde). Practic, tehnica este frecvent
expusă erorilor determinate de concentrația colorantului, de timpul de colorare, de pH, etc.
Metoda cu bioluminiscență
Această metodă se bazează pe proprietatea celulelor vii, de a elibera, în mediul de cultură, un
produs specific de biosinteză, adenozin trifosfatul (ATP). ATP-ul poate fi dozat, pe baza
bioluminiscenței provocate de adăugarea de luciferină în prezența luciferazei. Cunoscând cantitatea
medie de ATP eliberată de o celulă vie, este posibilă cuantificarea numărului de microorganisme din
probă.
30
TITLU :
Utilizări
Deși prezintă numeroase dezavantaje, metodele bazate pe fluorescență și bioluminiscență pot
avea implicații industriale importante, în special în cazul probelor sărace în microorganisme, în
industria vinului, în controlul microbiologic al liniilor de îmbuteliere, etc.
8.6.3. Metode de evaluare automată a numărului de celule
Se realizează cu ajutorul unor aparate special proiectate în acest scop, care funcționează pe
principiul aspirării, printr-un orificiu, a celulelor individuale, aflate într-o suspensie, trecerea fiecărei
celule modificând rezistența electrică a sistemului și producând un impuls care este înregistrat de un
dispozitiv de numărare electronică.
Pe o placă Petri cu mediu nutritiv adecvat, proba este însămânțată în spirală, astfel încât spre
marginile cutiei are loc o diminuare progresivă a volumului de probă (ce corespunde unei diluții
1:1.000). După perioada de incubare în condiții optime de dezvoltare, citirea rezultatelor se realizează
fie manual (folosind o grilă specială de evaluare a numărului, după care rezultatele sunt ulterior
analizate statistic), fie automat (folosind un numărător automat cu fascicul laser și un computer ce
poate determina și înregistra concentrația microbiană din proba de analizat, plecând de la volumul
depus și de la numărul de colonii apărute pe mediu respectiv).
Utilizări
În laboratoarele de control microbiologic al produselor alimentare, unde volumul de lucru este
foarte mare (de exemplu: în industria laptelui, este folosit aparatul Spiral Autoplate 3000, complet
automatizat, care permite cuantificarea numărului de microorganisme dintr-o probă lichidă, prin
însămânțarea probei sub forma unei spirale, ce pornește din centrul plăcii).
31
TITLU :
ANEXA 4
Tabelul McCrady (din J.C. de Man European J. Appl. Microbiol. 1, 67-78, 1975, după J. N. Joffin,
1992)
Numărul de tuburi pozitive la MPN Intervalul de încredere Categoria*
nivelul a 3 diluții reținute
3 tuburi 3 tuburi 3 tuburi 95% 99% 1 2
1 ml 0,1 ml 0,01 ml
0 0 0 ˂0,3
0 0 1 0,3 ˂0,1 1,7 ˂0,1 2,3
0 1 0 0,3 ˂0,1 1,7 ˂0,1 2,3 X
0 2 0 0,6 0,2 2,3 0,1 2,9
1 0 0 0,4 0,1 2,1 ˂0,1 2,8 X
1 0 1 0,7 0,2 2,7 0,1 3,5 X
1 1 0 0,7 0,2 2,8 0,1 3,6 X
1 1 1 1,1 0,4 3,4 0,2 4,3
1 2 0 1,1 0,4 3,5 0,2 4,4 X
1 2 1 1,5 0,6 4,1 0,4 5,1
1 3 0 1,6 0,6 4,2 0,4 5,2
2 0 0 0,9 0,2 3,8 0,1 5,0 X
2 0 1 1,4 0,5 4,8 0,3 6,2 X
2 1 0 1,5 0,5 5,0 0,3 6,5 X
2 1 1 2,0 0,8 6,1 0,5 7,7 X
2 2 0 2,1 0,8 6,3 0,5 8,0 X
2 2 1 2,8 1,1 7,5 0,7 9,3
2 3 0 2,9 1,2 7,8 0,8 9,7
3 0 0 2,3 0,7 12,9 0,4 17,7 X
3 0 1 4 1 18 1 23 X
3 0 2 6 2 23 1 29
3 1 0 4 2 21 1 29 X
3 1 1 7 2 28 2 37 X
3 1 2 12 4 35 2 45
3 2 0 9 3 39 2 52 X
3 2 1 15 5 51 3 65 X
3 2 2 21 8 64 5 82 X
3 2 3 29 12 80 8 99
3 3 0 20 10 140 ˂10 190 X
3 3 1 50 20 240 10 320 X
3 3 2 110 30 480 20 640 X
3 3 3 ˃110
*Categoria 1- combinații de tuburi cel mai frecvent corespunzătoare unui procent de 95% din cazuri
Categoria 2- combinații de tuburi mai puțin frecvente decât cele de la categoria 1 și corespunzătoare doar unui procent de
4% din cazuri (în 99% din cazuri combinația obținută va aparține deci categoriei 1 sau 2)
32

LP3 - Insamantare - Izolare - Cuantificare - UFC

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LP3 - Insamantare - Izolare - Cuantificare - UFC

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DOCUMENT : L.P.

- Microbiologie Generală DATA : 18/10/2020

6. TEHNICI DE ÎNSĂMÂNȚARE A MICROORGANISMELOR

Prin trecerea microorganismelor pe medii de cultură specifice acestora, dintr-o cultură

Efectuarea corectă, în condiții aseptice, a tehnicilor de însămânțare, presupune respectarea

 suprafața de lucru se dezinfectează cu un tampon îmbibat într-o soluție

Pregătirea însămânțării și timpii de desfășurare ai acesteia

Figura 6.1 Sterilizarea ansei/acului de însamânțare (sursa: Burcea, 2010)

Pregătirea pentru lucru:

Principalele tehnici de însamânțare, în funcție de tipul mediilor de pe care se realizeză

Tabel 6.1 Principalele tehnici de însamânțare utilizate în microbiologie

Pentru dobândirea dexterității în efectuarea unei însămânțări este necesară cunoașterea și

6.1. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu solid

Tehnica epuizării ansei

Metoda sectoarelor (figura 6.4)

Figura 6.3 a- Însămânțarea microorganismelor prin metoda striurilor fracționate; b- Obținerea de

Figura 6.4 Însămânțarea microorganismelor - metoda în sectoare

Tehnica prin înțeparea mediului (figura 6.5)

6.2. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu lichid pe mediu lichid

Mod de lucru (figura 6.6):

6.3. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu solid pe mediu lichid

Mod de lucru (figura 6.7):

6.4. Însămânțarea microorganismelor de pe mediu lichid pe mediu solid

 Metoda „prin inundare”, folosindu-se 1 mL de suspensie microbiană, determină apariția, după

Mod de lucru (figura 6.8):

Mod de lucru (figura 6.9):

 Încorporarea inoculului, metodă specifică microorganismelor, care necesită o presiune parțială de

Mod de lucru (figura 6.10):

6.5. Metode de realizare a condițiilor de anaerobioză

7. TEHNICI DE IZOLARE ȘI DE SELECȚIE A

În natură, microorganismele sunt răspândite pretutindeni (apă, aer, sol, pe tegumentele și

Figura 7.1 Consorțiu microbian

Figura 7.2 Izolarea microoganismelor în cultură pură

7.1. Tehnica epuizării ansei pe medii solide

7.2. Tehnica diseminării probei diluate pe suprafața mediilor solide

Tehnica presupune parcurgerea a două etape consecutive:

7.2.1. Metoda diluțiilor zecimale - cantitativă

Mod de lucru (figura 7.4):

7.2.2. Metoda Domercq - calitativă

7.3. Tehnica încorporării

Figura 7.6 Tehnica încorporării suspensiei microbiene în profunzimea mediului de cultruă

O variantă a acestei tehnici o reprezintă „etalarea în profunzime”:

7.4. Izolarea în cultură pură, prin filtrare cu membrane de tip Millipore

Membranele filtrante de tip Millipore au capacitatea de a reține, pe suprafața lor, particulele și

Mod de lucru (figura 7.7):

Pentru ca microorganismele să se poate dezvolta, mediile însămânțate sunt incubate în

Utilizări: cuantificarea încărcăturii microbiene a probelor cu densitate microbiană redusă, la

7.5. Izolarea microorganismelor utilizate în bioremediere

Microorganismele reprezintă principalul mijloc natural de descompunere a reziduurilor. Varietatea

Izolarea și stimularea microorganismelor sunt esențiale în bioremediere și au la bază tehnica

2. Mediul va fi inoculat de exemplu cu sol (care conține o mare diversitate de microorganisme);

7.6. Tehnici de selecție a microorganismelor

În unele experimente de laborator este necesară izolarea anumitor microorganisme în

• folosirea mediilor diferențiale conținând lactoză sau lactoză și zaharoză, alături de un

8. METODE DE NUMĂRARE A MICROORGANISMELOR

Determinarea încărcăturii microbiene dintr-o probă de analizat se realizează, pe de o parte,

8.2. Tehnici bazate pe folosirea mediilor de cultură

Aplicarea acestor metode determină cuantificarea încărcăturii microbiene viabile, evaluarea

8.2.1. Tehnica determinării unităților formatoare de colonii (U.F.C.)

Utilizări: determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC - total aerobic

Exemplu demonstrativ de stabilire a numărului de celule vii dintr-o probă bogată în

Pentru a obține, de exemplu, o soluție-mamă de 1/10, la 5 g cântărite dintr-un produs, se

La cuantificarea încărcăturii microbiene a unui gram sau un mililitru de produs, calculul se