Cultura de meristeme şi apexuri

Plantele superioare deţin ţesuturi cu o mare capacitate de proliferare care au ca rol

creşterea în lungime a unor organe, îngroşarea altora şi chiar generarea de noi organe atât la
nivelul tulpinii cât şi al rădăcinii.
Aceste ţesuturi denumite meristeme de creştere, sau simplu, meristeme, sunt
alcătuite din celule bogate în citoplasmă, cu numeroase mitocondrii, cu nucleu mare şi cu
vacuole reduse ca dimensiuni. Pereţii celulari sunt subţiri, celulozici iar forma celulelor variază
de la poligonală la tabulară.

Clasificarea meristemelor
Meristemele se pot clasifica după mai multe criterii, astfel:
1. După tipul structurilor pe care le formează meristemele sunt clasificate în meristeme
organogene şi meristeme histogene. Din acest punct de vedere se cunosc meristemele primare,
meristemele secundare şi cele speciale.
Meristemele primare sunt de mai multe feluri:
- meristeme terminale (apicale) sunt situate în vârful ramificaţiilor tulpinii şi rădăcinii
asigurând creşterea acestora în lungime. Aceste meristeme se formează în momentul în care ia
naştere embrionul şi rămân active o perioadă îndelungată. În decursul anului există perioade de
diviziune intensă a celulelor meristematice (perioada vegetativă) şi perioada de repaus relativ (în
timpul sezonului rece).
În perioadele de inactivitate relativă meristemele sunt protejate în structuri de tipul
mugurilor. Se cunoaşte procesul de inhibiţie corelativă pe care meristemele apicale îl manifestă
în raport cu cele axilare, fapt explicat prin conţinutul ridicat în auxine al celor dintâi.
- meristeme axilare (laterale) - se formează la subsuoara frunzelor pe lăstarii în creştere.
Formarea lor este legată de evoluţia meristemului apical. Prin diviziunea rapidă a celulelor
meristematice existente la nivelul meristemului terminal se formează spre exteriorul conului de
creştere primordiile foliare iar la subsuoara acestora, primordiile mugurilor laterali (axilari).
Primordiile mugurilor axilari sunt alcătuite la rândul lor, din celule de tip meristematic cu rol în
dezvoltarea viitorilor muguri.

În acelaşi timp, spre baza conului de creştere în zona centrală, se formează vasele
conducătoare şi ţesut parenchimatic.
La plantele perene, formarea meristemelor laterale are loc deci, cu un an înaintea pornirii

1
lor în activitate.
- meristeme adventive - sunt în general meristeme profunde situate atât pe tulpină cât şi
pe rădăcină, în zona periciclului. Activarea acestor meristeme se face frecvent la speciile care
emit drajoni sau în situaţia în care planta pierde din diferite cauze, organe sau părţi importante. În
acest caz, meristemul adventiv va genera organe sau structuri similare pentru compensarea
pierderilor.
- meristemele intercalare se găsesc la monocotiledonate, fiind situate la baza
internodiilor.
- meristemele foliare sunt meristeme de tip adventiv care prezintă importanţă în
generarea unor organe noi, lăstari sau rădăcini, la speciile cu înmulţire vegetativă, prin frunze sau
fragmente de frunze. Aceste meristeme au un rol esenţial în regenerarea unor structuri noi în
cazul organogenezei directe şi a embriogenezei somatice.
Meristemele secundare se întâlnesc la speciile lemnoase, care prezintă creştere în grosime
la nivelul tulpinii sau rădăcinii. Dintre meristemele caulinare cambiul, generează elemente
conducătoare liberiene spre exterior şi vase lemnoase spre interior. În culturile in vitro cambiul
este folosit frecvent ca ţesut regenerativ.
Felogenul, denumit şi strat regenerator subero-felodermic, produce suber spre exterior
şi feloderm spre interiorul organului.
Promeristemul apare la nivelul calusului sau a ţesuturilor care au suferit procese de
dediferenţiere. Fiind un ţesut meristematic în fază incipientă, evoluţia sa ulterioară este
influenţată de condiţiile de cultură.
Meristemoidul este folosit ca termen tot pentru a defini o structură asemănătoare
promeristemului şi care poate evolua diferit.
Embrioidul este o structură evoluată care este capabil să genereze elemente bipolare de
tipul embrionilor somatici.
Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in vitro.
Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile să
genereze organe diferite, deci, în final, plante întregi. În general, se folosesc pentru iniţierea de
culturi meristematice terminale şi cele axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in
vitro plăntuţe, care sunt folosite apoi pentru înmulţirea rapidă.

Cultura de apexuri

2
 Pe lângă folosirea meristemelor, iniţierea culturilor in vitro se poate face şi prin folosirea
unor apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în formare, este
detaşat după o prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai bun moment pentru
inoculare este perioada de creştere intensă a lăstarilor.
Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În acest caz însă, gradul de
infectare a materialului este ridicat.
O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la forţare a
unor ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se parafinează la
vârf şi eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se pun apoi în vase cu
apă la temperatură ridicată (în camera de culturi) urmând ca în 10-14 zile mugurii să se deschidă
şi să se formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea apexurilor.

Cultura de fragmente uninodale

Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată de

cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură.
Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp vor fi
secţionaţi din nou.
Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi
înrădăcinarea acestora au fost efectuate de Galston 1947, 1948 şi Gorter 1965, la asparagus.
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de
lăstari (apexuri), muguri aflaţi la subsuoara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum şi
alte organe capabile să genereze lăstari in vitro.

Cultura de lăstari axilari

Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea

creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără stimularea alungirii
lăstarului mamă. Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale
a mugurelui. Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru prima
dată de către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus (1973;
1974) la căpşun şi de Pierik (1973; 1974; 1975a) şi Murashige (1974) la gerbera.
După descoperirea kinetinei, eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea
acesteia şi apoi a altor citochinine.

3
 Frecvent această metodă de microînmulţire este folosită în tandem cu cultura de
fragmente uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar, apoi
acest lăstar este trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este stimulată formarea
lăstarilor axilari.
Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje:
- este simplă;
- rata de multiplicare este relativ ridicată;
- stabilitatea genetică este asigurată;
- este unica metodă de multiplicare eficientă la plantele care cresc în rozetă: căpşun,
gerbera, bromelia etc.).
Necesarul de citochinine este variabil cu specia. Astfel, plantele de Bromelia obţinute din
seminţe au generat lăstari axilari fără citochinine. La multe specii s-a observat scăderea
necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită acumulării acestora
dar, mai ales datorită juvenilizării lăstarilor.
Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al materialului
biologic. Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de citochinine decât cel
provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi
concentraţii ridicate de citochinine. Raportul citochinine: auxine cel mai recomandat este de
10:1.

4
Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro

Agenţi sterilizanţi

Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro se realizează prin folosirea unor mijloace fizice
şi chimice. Mijloacele chimice sunt reprezentate de un număr mare de agenţi sterilizanţi cu
origine şi compoziţie diversă.
Alcoolul etilic este folosit de regulă în concentraţie de 70%, deoarece alcoolul absolut
(96%) determină deshidratarea rapidă a materialul vegetal. În general, timpul de sterilizare în
alcool este scurt (30-60 de secunde) însă se poate prelungi atunci când explantele sunt protejate
de solzi, catafile etc. După introducerea în alcool, explantul se va spăla rapid prin plonjare în apa
distilată.
Sterilizarea în alcool este urmată frecvent de o sterilizare cu hipoclorit de sodiu sau
calciu.
Pentru fructe uscate, sâmburii, seminţele de orhidee sau unele plante puternic contaminate
(muşcată), sterilizarea se face prin introducerea explantelor în alcool de 96%.
Hipocloritul de sodiu (NaClO, apa de Javel) este folosit ca agent înălbitor pentru rufe.
Majoritatea produselor comerciale conţin 10-20% substanţă activă. Pentru sterilizare se foloseşte
însă o soluţie cu o concentraţie de 1,0-2,0%. Rareori concentraţia ajunge la 8,0%.
Hipocloritul de sodiu se descompune uşor şi nu poate fi păstrat o perioadă îndelungată.
Hipocloritul de calciu (Ca(ClO)2) se foloseşte în situaţiile în care hipocloritul de sodiu
se dovedeşte a fi toxic. Hipocloritul de calciu este condiţionat sub formă de pudră care se dizolvă
destul de dificil în apă.
Timpul de sterilizare variază între 5 şi 30 de minute, în funcţie de tipul de explant
Clorura mercurică (sublimatul, HgCl2) este o otravă puternică care se foloseşte sub
formă de soluţie în concentraţie de (0,01-0,1%) timp de 2-15 minute. Concentraţia şi timpul de
sterilizare se vor reduce în cazul organelor şi ţesuturilor tinere. Efectul sterilizant este puternic şi
după folosire, sunt necesare 2-3 clătiri cu apă distilată sterilă.
Apa oxigenată (perhidrolul) se poate folosi cu succes la sterilizarea materialului vegetal
în concentraţie de 10-12%. De regulă, este folosită pentru prima sterilizare timp de 5-15 minute.
Are avantajul că pătrunde în profunzime şi curăţă materialul vegetal prin efervescenţa pe
care o produce. Apa oxigenată nu se recomandă să fie folosită la dezinfectarea explantelor
provenite de la speciile cu conţinut ridicat de polifenoli deoarece determină oxidarea rapidă a
acestora şi deci, brunificarea ţesuturilor.

5
 Dezinfectarea materialului vegetal

Înaintea folosirii pentru culturile in vitro, materialul vegetal trebuie pregătit cu

minuţiozitate. Această pregătire diferă în funcţie de provenienţa materialului respectiv: câmp sau
spaţii protejate.
Materialul vegetal provenit din câmp are un grad de infecţie sporit, motiv pentru care
înainte de a fi folosit trebuie supus unor operaţii suplimentare de pregătire:
- mugurii se vor folosi înainte de a se deschide şi când sunt încă protejaţi de catafile;
- dacă materialul este reprezentat de ramuri cu muguri acestea se vor parafina la vârf şi
vor fi puse în vase cu apă pentru forţare. În prealabil, se recomandă îmbăierea lor într-o soluţie de
fungicid (Topsin 0,1%; Ronilan, Rovral, Benlate);
- dintre lăstari se vor alege întotdeauna lăstarii cei mai tineri şi porţiunile finale ale
lăstarilor;
- dacă este posibil, plantele se vor transfera din câmp în containere, în sere sau camere de
creştere şi se vor folosi numai părţile crescute ulterior.
Reducerea gradului de infecţie a materialului iniţial provenit din spaţii închise (sere,
solarii) se poate face prin:
- reducerea atacului de insecte vectoare care pot transporta agenţi patogeni;
- prevenirea atacului de bacterii şi ciuperci prin aplicarea tratamentului cu fungicide
sistemice şi de contact;
- irigarea plantelor folosind sisteme de udare la sol: picurare, scurgerea la suprafaţă etc.
- păstrarea la valori scăzute a umidităţii în sere;
- zvântarea plantelor înainte de dezinfectare.
Tipul de organ folosit pentru inoculare este de asemenea determinant pentru alegerea
modului de dezinfectare şi a agentului sterilizant. În general, bulbii, tuberculii, rădăcinile
tuberizate şi alte organe subterane, au un grad ridicat de infecţie. Dacă este posibil, aceste organe
vor fi puse în prealabil la forţare pentru a obţine noi creşteri (lăstari) care vor fi folosite apoi
pentru inoculare. Dacă însă se urmăreşte inocularea unor muguri, fragmente de disc, catafile etc.,
se va spăla foarte bine materialul şi se vor lua măsuri suplimentare de dezinfectare.
Mugurii pubescenţi, ramurile cu lentile numeroase, tulpinile, lăstarii sau frunzele
pubescente se dezinfectează greu datorită fixării germenilor pe formaţiunile respective şi datorită
dificultăţii cu care agentul sterilizant pătrunde la suprafaţa organului respectiv.
Reducerea tensiunii superficiale a lichidului dezinfectant se face prin adăugarea câtorva
picături de detergent lichid (Tween 20 sau 80).

6
 Pentru a favoriza pătrunderea dezinfectantului în profunzime, sub solzi sau printre
perişori, se poate face şi dezinfectarea sub vid folosind un vas ataşat la o pompă de vid.
Metoda de dezinfectare folosită va ţine seama întotdeauna de natura suprafeţelor care
urmează să fie dezinfectate. Se va lua în calcul de asemenea, permeabilitatea epidermelor sau
învelişurilor pentru agentul sterilizant şi se va ţine cont de modul în care acesta poate afecta
viabilitatea ţesutului ţintă.
La dezinfectarea unor explante aflate în organe de rezervă, rizomi, bulbi, tuberculi, a unor
muguri (atunci când se urmăreşte prelevarea meristemelor, a unor sâmburi şi seminţe protejate de
endocarp sau tegumente puternice, a unor fructe uscate etc., se pot folosi concentraţii ridicate şi
timpi de dezinfecţie mari. Pentru îmbunătăţirea efectului dezinfectant se recomandă câteva
măsuri:
- înlăturarea părţilor exterioare ale organelor: solzi protectori, catafile, etc.

- spălarea intensă cu apă a materialului vegetal înainte de dezinfectare;

- scufundarea explantelor pentru câteva secunde în alcool de 70% înaintea dezinfectării

chimice. Operaţia are ca scop eliminarea bulelor de aer de la suprafaţa explantului şi uşurarea
pătrunderii agentului chimic;
- adăugarea unor detergenţi (Tween 20 sau 80) în soluţia de dezinfectat în concentraţie de
0,08-0,12% pentru reducerea tensiunii superficiale a acesteia;
- agitarea în timpul dezinfectării, manual, sau cu un agitator magnetic;
- folosirea dezinfectării sub vid pentru o mai bună impregnare a explantului cu agentul
dezinfectant.