EXTRACŢIA ENZIMELOR

Este evident că pentru a putea înţelege în detaliu comportarea unei enzime într-un sistem
complex în care există ea în mod obişnuit - aşa cum sunt organitele celulare (mitocondrii,
lizozomi, ribozomi etc.), celule, tesuturi, organe parti sau întregul organism – este necesar să
încercăm în primul rând să-i înţelegem proprietăţile în cel mai simplu sistem posibil. În cele
mai multe cazuri, când enzima este exocelulară, sistemul simplu este constituit dintr-o soluţie
enzimatică care conţine şi mici cantităţi de ioni, molecule tampon, cofactori, etc. În alte cazuri,
însă, cum sunt cele în care enzimele sunt endocelulare, componente a unor organite celulare
sau sunt legate de membranele celulare izolarea enzimei este un proces mai complicat,
deoarece enzima poate fi inactivată dacă în mediu nu există unii componenţi adiţionali
specifici.

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice ale unei enzime trebuie aleasa
sursa care raspunde cel mai bine cerintelor de izolare cu o
 activitate catalitică maximă adică enzima prezentă sa nu fie degradată sau inactivată şi
să fie de
 puritate maximă posibilă adică nu trebuie să conţină alte enzime sau molecule mari.
Daca se urmareste si purificarea enzimei, scopul purificarii trebuie sa fie obtinerea unui
preparat cu un
 randament maxim posibil rezultat din procentul de activitate recuperată comparativ cu
activitatea extractului original.
Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in
diferite scopuri sau pentru studiul ei este necesar să se ţină cont de o serie de factori cum
sunt:
 abundenţa enzime;
 disponibilitatea şi preţul de cost;
 localizarea intracelulara;
 caracterizarea sursei;

1
  studii comparative.
In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere si stabilitatea enzimei si
posibilele dificultăţi în manipularea sursei.

1. Abundenţa enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare sau aplicare este
necesar să se obţină extracte proteice totale cu concentraţii ridicate ale enzimei de interes
trebuie alese surse biologice bogate în enzima dorită.
Astfel rădăcinile de hrean sunt surse extrem de bogate de peroxidaze, muşchiul inimiii este
bogat în lactatdehidrogenaze, glandele mamare în periada lactaţiei sunt o sursă bună de
acetil CoA carboxilază şi rinichii sunt bogaţi în hidrolaze.

Microorganismele sunt surse de obţinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate în

diverse domenii cum sunt agricultura, industria alimentară, industria farmaceutică, pielărie
etc. De exemplu un microorganism cunoscut de toată lumea, drojdia de bere
(Saccharomyces cerevisiae), care este utilizată în special în panificaţie şi industria berii, se
obţine uşor în cantităţi mari şi este foarte bogată în enzime glicolitice. Avantajul utilizării
microorganismelor ca surse de enzime constă în faptul că prin modificări ale mediului de
cultură sau modificări genetice se poate creşte nivelul de producţie a enzimei de interes.
Astfel sinteza β -D-galactozidazei poate fi indusă la E. coli prin creşterea bacteriei într-un
mediu care conţine lactoză (substratul enzimei) ca unică sursă de carbon.
Dezvoltarea tehnicilor de clonare moleculară, a ADN-ului recombinant, a determinat apariţia
unor noi metode de realizare a unor tulpini de microorganisme înalt producătoare de enzime.
În această tehnică, gena care codifică o enzimă este izolată de la organismul parental şi
expresată la un nivel ridicat într-un organism de creştere convenabil cum sunt E. coli şi
drojdiile. Prin această tehnică o tulpină de E. coli a produs de 100 până la 200 de ori mai
multă glutation reductază decât tulpina sălbatică.

Trebuie să subliniem că deşi aceste tehnici reprezintă posibilităţi reale de creştere a

capacităţii de biosinteză a unei enzime pot apărea probleme considerabile la exprimarea unor
gene eucariote în celule procariote, astfel încât, în unele cazuri proteinele supra exprimate
pot forma agregate insolubile şi recuperarea activităţii enzimatice din acestea nu a fost
totdeauna posibilă.

2
 2. Disponibilitatea sursei si pretul de cost. Sursa biologică trebuie să fie accesibilă
atat din punct de vedere geografic cat şi economic. În acest sens nu se recomandă utilizarea
unor surse scumpe, ca de exmplu muşchiul de homar, sau a unor surse care se găsesc în
regiuni îndepărtate, „exotice”, ale globului (specii bioluminiscente).
Ţesuturile umane sunt surse greu de procurat în multe ţări si in cele mai multe cazuri cad sub
incidenta unor legi protective fata de etica de obtinere a acestora.

În multe situaţii sursele clasice pentru anumite enzime au fost înlocuite de surse alternative:
 De exemplu creierul porcului de guinea, sursa clasică pentru extracţia şi purificarea
histamin-metiltransferazei, poate fi înlocuit cu rinichiul de porc, sursă mai ieftină şi mai
accesibilă;
 În studiul structurii subunitare a ceruloplasminei umane, o problemă a fost
sensibilitatea mare a acestei proteine la atacul enzimelor proteolitice. Când s-a
descoperit că ceruloplasmina umană este aproape similară cu cea porcină, studiile au
fost orientate spre această sursă în care proteina se găseşte în cantităţi mult mai mari
şi este mai stabilă la atacul enzimelor proteolitice;
 Enzimele pectolitice necesare obtinerii sucurilor limpezi din fructe sau legume se obtin
cu ajutorul microorganismelor. Obtinerea lor din fructe le-ar ridica pretul foarte mult
ceea ce ar duce la indisponibilitatea lor pentru industria de sucuri.
Sursele animale sau microbiene tradiţionale pentru anumite enzime pot fi înlocuite la ora
actuală de microorganisme obţinute prin inginerie genetică sau de culturi de celule eucariote.
Proteinele de origine eucariotă, produse prin clonare şi expresare în bacterii de tipul E. coli,
pot fi localizate în citoplasmă sau pot fi secretate prin membrana celulară. În al doilea caz, ele
se pot acumula în interiorul spaţiului periplasmatic, sau pot fi secretate în mediul de cultură. O
enzimă care se acumulează în interiorul spaţiului periplasmatic poate fi şi ea secretată în
mediul de cultură prin schimbarea condiţiilor de creştere. Această metodă conduce la
obţinerea unui grad avansat de purificare pentru enzimele secretate, pentru că, majoritatea
proteinelor biosintetizate rămân în interiorul celulelor.

În alegrea sursei de izolare şi purificare a unei enzime trebuie să se facă un compromis între
abundenţa şi accesibilitatea acesteia.

3
 3. Localizarea intracelulară a unei enzime este esenţial de cunoscut pentru a se putea
stabili cea mai convenabilă metodă de extracţie. Astfel dacă o enzimă are o singură localizare
în celulă (cum sunt de exemplu succinat dehidrogenaza şi alte enzime din ciclul acizilor
tricarboxilici care se găsesc exclusiv în mitocondrii) se poate utiliza pentru purificare şi studiu
un omogenat obţinut din întregul ţesut.
În cazul unor enzime similare ca functionalitate si structura, localizate în mai multe formaţiuni
intracelulare, este necesară o fracţionare subcelulară înainte de a începe purificarea enzimei
de interes. Astfel, în cazul purificării adenozintrifosfatazei mitocondriale, enzimă implicată în
transportul H+, este necesară obţinerea unui preparat mitocondrial cu puritate rezonabilă,
pentru a se evita contaminarea cu alte adenozintrifosfataze implicate de exemplu în
transportul Na+ şi K+ prin membrana celulară.

Fracţionarea subcelulară se realizează prin procese de centrifugare, deoarece organitele

celulare sedimentează la diferite valori ale forţelor centrifugale

4. Caracterizarea sursei. Sursa aleasă trebuie să fie perfect caracterizată.

Când sursa aleasă este vegetală, este necesară cunoaşterea genului, speciei şi varietăţii
acesteia. Adeseori este necesara si cunoasterea zonei, climei in care s-a dezvoltat sursa
vegetala precum si perioada de recoltare.

În cazul microorganismelor este necesară unei tulpini bine caracterizate, crescută pe medii de
cultură cu compoziţie bine determinată.

Pentru surse animale, este necesară prelevarea de ţesuturi sau organe de la animale
normale, având acelaşi sex, aceiaşi greutate şi vârstă, care au fost supuse unui regim
alimentar identic. În cazul surselor animale este necesară cunoaşterea aproximativă a
compoziţiei sursei pentru a înlătura unele interferenţe care pot apărea pe parcursul extracţiei
şi purificării. De exemplu, ficatul conţine o cantitate mare de glicogen care interferă în multe
dozări. Pentru a limita aceste interferenţe, animalele de laborator trebuie supuse unui regim
de inaniţie înainte de sacrificare. Partea endocrină a pancreasului este bogată în lipide care
interferă în extracţia enzimelor. Pentru a limita acest neajuns se recomandă îndepărtarea
mecanică a acesti părţi a pancreasului înainte de extracţia enzimelor.

4
 5. Studii comparative.
Unele enzime au fost studiate in unele specii sau in diferite tesuturi ale unor specii. In
asemenea cazuri este de mare importanta sa se studieze enzimele respective si in diferite
alte specii sau tesuturi in vederea evaluarii evolutiei enzimei, proprietatile ei comparativ cu
altele similare, structura primara, tertiara, diferitele izoenzime etc.

Metode de extracţie

Există numeroase metode de extracţie a enzimelor extracelulare (medii în care acestea se

află in afara celulelor) cât şi endocelulare (enzimele se afla in interiorul celulelor) In ultimul
caz sunt necesare metode speciale de spargere a celulelor. Alegerea metodei de extracţie
este dependentă de natura ţesutului, organismului sau mediului utilizat ca sursă enzimatică.

Astfel unele materiale biologice permit obţinerea de soluţii clare sau aproape clare de
proteine, enzime, prin simple procedee de filtrare sau centrifugare deoarece enzimele sunt, în
aceste cazuri, libere în solventul (in majoritatea cazurilor apa) materialului biologic respectiv.
În această categorie putem aminti ca exemple următoarele: urina, laptele, serul sanguin,
sucul unor fructe, veninul de şarpe, mediile extracelulare rezultate după cultivarea
microorganismelor sau a celulelor animale sau vegetale. Alegerea unei astfel de surse
prezintă avantajul că materialul de la care se porneşte procedeul de extracţie conţine un
număr relativ mic de componente, iar proteinele extracelulare sunt relativ stabile. Unele dintre
aceste surse, cum este urina sau supernatantele culturilor de celule, datorita dilutiei existente,
trebuie supuse unor operaţii de concentrare înainte de începerea purificării efective.

În cazul unor surse este, însă, necesară extracţia proteinei cu o anumită activitate enzimatică
dintr-un ţesut sau dintr-un anumit tip de celulă. În aceste cazuri, alături de proteina de interes
sunt eliberate un număr mare de alte molecule contaminante, printre care şi enzime
proteolitice, enzime care fac destul de dificilă purificarea proteinei de interes. Astfel, extracţia
şi purificarea unei proteine particulare dintr-o sursă solidă implică cel mai adesea un
compromis între gradul de recuperare (randament) şi puritatea acesteia (factor de purificare).

Dezintegrarea celulelor sau ţesuturilor şi eliberarea conţinutului acestora în mediul de

extracţie se poate realiza printr-o serie de metode specifice. În anumite cazuri se preferă sau
5
este necesara dezintegrarea ţesuturilor şi prepararea unor populaţii omogene de celule
intacte înainte de ruperea membranelor celulare.
Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa si de tipul de ţesut sau organ utilizat ca
sursă de izolare a enzimei. În urma dezintegrării celulare se obţin omogenate celulare care
conţin componentele celulare suspendate în mediul de extracţie. Principalele metode utilizate
pentru dezintegrarea celulelor sunt :
Metoda Principiul de bază
Metode blânde
Liza celulară Ruperea osmotică a membranei celulare
Digestia enzimatică Ruperea pereţilor celulari; eliberarea conţinutului
celular în mediu.
Omogenizator Potter- Celulele sunt dezintegrate într-un spaţiu îngust
existent între pistil şi pereţii de sticlă; membranele
Elvehjem
celulare sunt rupte datorită forţelor care apar;
Metode moderate
Omogenizator cu cuţite Membranele sunt tăiate cu ajutorul unor lame care
se rotesc
(Warning blendor)
Mojarare în prezenţă de Membranele sunt îndepărtate prin acţiunea
abrazivă a particulelor de nisip sau alumină
nisip, alumină sau perle
de sticlă
Metode severe
Presare Celulele sunt forţate să treacă prin orificii mici la
presiuni foarte mari astfel incat forţele de rupere
(French press)
afectează integritatea membranelor
Decompresiune Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune
mare, ceea ce determină ruperea membranelor şi
explozivă
eliberarea conţinutului celular
Măcinare cu bile Vibraţiile rapide realizate cu ajutorul perlelor de
sticlă conduc la îndepărtarea pereţilor celulari
(bead mill)
Ultrasonicare Tratarea suspensiilor celulare cu frecvenţe sonice
determină ruperea membranelor
Îngheţ-dezgheţ repetat Ruperea legăturilor de hidrogen şi a celor hidrofobe
realizate între enzime şi alte componente precum si
a membranelor ca urmare a inghetarii apei.
Se recomandă pe cât posibil utilizarea unor metode de dezintegrare blânde, care să nu
afecteze enzima de interes şi să nu determine eliberarea enzimelor degradative din organite
celulare de tipul vacuolelor sau/si a lizozomilor.