UNIVERSITATEA DE MEDICINA ŞI FARMACIE “IULIU

HAȚIEGANU”

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Studiu privind profilaxia şi

tratamentul Borreliozei Lyme în
arealul Transilvaniei

Doctorand Violeta Tincuţa Briciu

Conducător de doctorat Prof. Dr. Dumitru Cârstina

Cluj-Napoca 2013

 
 CUPRINS  
 
INTRODUCERE   11  
   
STADIUL  ACTUAL  AL  CUNOAŞTERII    
1.  Etiopatogenia  şi  epidemiologia  Borreliozei  Lyme   15  
1.1.  Etiologia  Borreliozei  Lyme.  Complexul  Borrelia  burgdorferi  sensu  
15  
lato    
1.1.1.  Morfologie,  formă  şi  structura  membranei   15  
1.1.2.  Genomul  şi  organizarea  genomului   17  
1.1.3.  Complexul  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato   18  
1.2.  Epidemiologia  Borreliozei  Lyme   19  
1.2.1.  Terminologie   19  
1.2.2.  Vectori   20  
1.2.3  Gazde  rezervor   20  
1.3.  Interacţțiune  B.  burgdorferi  cu  gazda  şi  patogeneză   20  
1.3.1.  Interacţțiunea  B.  burgdorferi  cu  gazda     20  
1.3.2.  Patogeneza     21  
2.  Tabloul  clinic  şi  diagnosticul  Borreliozei  Lyme   23  
2.1.  Tabloul  clinic   23  
2.1.1.  Afectarea  cutanată   23  
2.1.2.  Afectarea  sistemului  nervos   24  
2.1.3.  Afectarea  articulară   25  
2.1.4.  Cardita  Lyme   25  
2.1.5.  Afectarea  oculară   26  
2.1.6.  Alte  potenţțiale  manifestări  ale  Borreliozei  Lyme   26  
2.1.7.  Borrelioza  Lyme  cronică   26  
2.1.8.  Borrelioza  Lyme  în  sarcină   27  
2.1.9.  Borrelioza  Lyme  la  pacientul  imunocompromis   27  
2.2.  Diagnosticul  Borreliozei  Lyme   27  
2.2.1.  Metode  directe  de  evidenţțiere  a  agentului  patogen     27  
2.2.2.  Metode  indirecte  de  diagnostic   28  
2.2.3.  Alte  examinări  de  laborator  în  BL   31  
2.2.4.  Teste  nerecomandate  a  se  utiliza  în  scop  diagnostic   32  
2.3.  Diagnostic  diferenţțial   32  
3.  Tratamentul  şi  profilaxia  Borreliozei  Lyme   33  
3.1.  Tratamentul  Borreliozei  Lyme   33  
3.1.1.  Terapia  recomandată  pacienţților  cu  Borrelioza  Lyme   33  
3.1.2.  Bazele  farmacologice  şi  microbiologice  ale  tratamentului   34  
3.1.3.  Ce  trebuie  făcut  în  cazul  persistenţței  simptomelor  după  
terapia  antibiotică  adecvată  BL?    
36  
3.1.4.  Terapia  pacienţților  asimptomatici  cu  serologie  pozitivă   37  
3.2.  Profilaxia  Borreliozei  Lyme   37  
3.2.1.  Măsuri  de  protecţție  individuală   37  
3.2.2.  Managementul  mediului  ambient  al  căpuşelor.   39  
CONTRIBUŢIA  PERSONALĂ    
1.  Ipoteza  de  lucru/obiective   43  
2.  Metodologie  generală     45  
3.  Studiul  1  -­  Etiologia  Borreliozei  Lyme  în  România:  
47  
Identificarea  genospeciilor  de  Borrelia  burgdorferi  sensu  
lato  în  căpuşele  colectate  de  la  subiecţii  umani  
3.1.  Introducere   47  
3.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   47  
3.3.  Material  şi  metodă   47  
3.4.  Rezultate   50  
3.5.  Discuţții   54  
3.6.  Concluzii     56  
4.  Studiul  2  -­  Studiu  prospectiv  privind  riscul  de  transmitere  
al  infecţiei  cu  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  de  la  căpuşele   57  
Ixodes  la  subiecţii  umani    
4.1.  Introducere   57  
4.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   57  
4.3.  Material  şi  metodă   57  
4.4.  Rezultate   58  
4.5.  Discuţții   61  
4.6.  Concluzii     64  

5.  Studiul  3  -­  Metode  de  diagnostic  pentru  detecţia  Borreliei  

burgdorferi  sensu  lato  în  căpuşele  colectate  de  la  subiecţii   65  
umani  
5.1.  Introducere   65  
5.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   65  
5.3.  Material  şi  metodă   65  
5.4.  Rezultate   69  
5.5.  Discuţții   72  
5.6.  Concluzii     76  
6.  Studiul  4.  Clinica  Borreliozei  Lyme  în  arealul  
 
Transilvaniei:  Eritemul  migrator  
6.1.  Introducere   77  
6.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   77  
6.3.  Material  şi  metodă   77  
6.4.  Rezultate   78  
6.5.  Discuţții   83  
6.6.  Concluzii     86  
7.  Studiu  5  -­  Clinica  Borreliozei  Lyme  in  arealul  
87  
Transilvaniei:  Neuroborrelioza  Lyme  
7.1.  Introducere   87  
7.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   87  
7.3.  Material  şi  metodă   87  
7.4.  Rezultate   89  
7.5.  Discuţții   97  
7.6.  Concluzii     99  
8.  Studiul  6  -­  Alte  manifestări  ale  Borreliozei  Lyme  în  arealul  
101  
Transilvaniei  
8.1.  Introducere   101  
8.2.  Ipoteza  de  lucru/obiective   101  
8.3.  Material  şi  metodă   101  
8.4.  Rezultate   102  
8.5.  Discuţții   109  
8.6.  Concluzii     112  
 9.  Discuţii  generale     113  
10.  Concluzii  generale     115  
11.  Originalitatea  şi  contribuţiile  inovative  ale  tezei   119  
   
REFERINŢE   121  
ANEXA  1   141  
ANEXA  2   143  
 
Cuvinte   Cheie:   Borrelioza   Lyme,   Ixodes   ricinus,   Borrelia   burgdorferi,   Transilvania,   Real   Time  
PCR,  imunohistochimie,  lichid  cefalorahidian,  serologie,  ELISA,  Western  Blot  
 
Introducere    
Borrelioza   Lyme   (BL),   o   afecţțiune   multisistemică,   cea   mai   frecventă   boală   transmisă   de  
căpuşe  în  Europa  şi  America  de  Nord,  este  o  zoonoză,  agentul  etiologic  circulând  între  căpuşele  
din  complexul  Ixodes  ricinus  şi  o  mare  varietate  de  gazde  vertebrate.  Animalul  rezervor  cedează  
agentul   patogen   capușei   vector   care   îl   transmite   fie   altor   gazde   rezervor,   fie   omului,   care  
pătrunde   accidental   în   focarul   natural   şi   închide   ciclul   infecţției,   fără   a   deveni   la   rândul   său   gazda  
rezervor.  Complexul  Borrelia  (B.)  burgdorferi  sensu  lato,  agentul  etiologic  al  bolii,  este  împărţțit  în  
prezent  în  19  specii  genomice  cu  distribuţție  geografică  diferită.  Biroul  regional  pentru  Europa  al  
OMS,  în  raportul  din  2006  privind  BL,  menţționează  “nici  o  informaţție”  în  privinţța  României  [1].  
Riscul   de   infecţție   cu   B.   burgdorferi   depinde   de   interacţțiunea   omului   cu   mediul  
înconjurător.  Strategiile  pentru  prevenţția  BL  se  bazează  pe  cunoaşterea  datelor  epidemiologice,  
ecologice  şi  fiziopatologia  transmiterii  infecţției  la  om,  implicând  măsuri  de  protecţție  individuală  
şi   colectivă.   În   România   nu   există   până   în   prezent   nici   un   studiu   privind   prevalenţța   infecţției   cu   B.  
burgdorferi   în   căpuşele   colectate   de   pe   subiecţții   umani.   Deoarece   diversele   genospecii   au   un  
potenţțial  patogen  diferit  şi  par  să  fie  asociate  cu  tablouri  clinice  diferite,  în  această  cercetare  am  
dorit   să   evaluăm   prevalenţța   şi   diversitatea   B.   burgdorferi   în   căpuşele   vectori   colectate   de   pe  
subiecţții  umani  din  zona  Transilvaniei,  utilizând  metode  moderne  de  diagnostic  molecular.    
BL,   “boala   cu   1000   de   feţțe”,   poate   afecta   o   largă   varietate   de   organe,   iar   tabloul   clinic   şi  
evoluţția   sunt   foarte   diferite   de   la   un   pacient   la   altul.   În   prezent   nu   există   un   standard   de   aur  
pentru   diagnosticul   BL   iar   metodele   existente   trebuie   combinate   logic   pentru   a   obţține   cea   mai  
înaltă   eficienţță   posibilă.   În   practica   clinică   serologia   reprezintă   prima   şi   de   cele   mai   multe   ori  
unica   metodă   de   laborator   utilizată   în   diagnostic.   În   interpretarea   unui   rezultat   serologic   trebuie  
avut   însă   în   vedere   faptul   că   o   serologie   pozitivă   nu   poate   diferenţția   între   o   infecţție   activă   şi  
marca  imunologică  a  unei  infecţții  anteriare  simptomatice  sau  asimptomatice.  Prevalenţța  înaltă  a  
anticorpilor  specifici  în  populaţția  generală  în  zonele  endemice  pune  probleme  privind  relevanţța  
clinică   a   unei   serologii   pozitive.   În   plus   polimorfismul   manifestărilor   clinice   poate   ridica   reale  
probleme  de  diagnostic  diferenţțial.    
Publicitatea   privind   BL   a   crescut   adresabilitatea   pacienţților   spre   serviciile   de   boli  
infecţțioase  după  intepătura  de  capușa  sau  cu  suspiciunea  de  boală.  
 
Contributia  personala  
Ipoteza  de  lucru/obiective    
Aspectele   privind   profilaxia   sau   tratamentul   BL   nu   pot   fi   cercetate   atâta   timp   cât   nu   se  
cunosc   datele   locale   privind   infecţția   vectorului   cu   B.   burgdorferi.   Orice   informaţție   nouă   privind  
distribuţția  genospeciilor  de  B.  burgdorferi  în  căpuşele  detaşate  de  pe  gazda  umana  poate  oferi  noi  
perspective  în  înţțelegerea  ecologiei  complexe  a  BL.    
În  lucrarea  de  faţță  am  dorit  a  cerceta  diverse  aspecte  ale  BL  în  regiunea  noastră:  vectorii  şi  
prevalenţța   infecţției   cu   B.   burgdorferi,   genospeciile   existente   la   nivel   local,   riscul   de   transmitere   a  
infecţției  de  la  căpuşă  la  om  şi  rolul  examinării  căpuşei  detaşate,  a  antibioticelor  şi  a  monitorizării  
serologice   în   profilaxia   bolii.   În   plus,   deoarece   în   prezent   nu   există   un   standard   de   aur   în  
diagnostic,  am  comparat  diferite  metode  de  detecţție  a  B.  burgdorferi  în  căpuşe,  în  scopul  stabilirii  
rolului  lor  în  practica  clinică.  
Un   alt   obiectiv   al   studiului   a   fost   reprezentat   de   descrierea   aspectelor   epidemiologice,  
clinice   si   serologice   ale   pacienţților   diagnosticaţți   cu   BL   în   regiunea   noastră,   urmat   de   evaluarea  
răspunsului  la  tratament  şi  a  prognosticului  pacienţților.  Datorită  polimorfismului  manifestărilor  
şi   absenţței   unui   tablou   clinic   specific,   afectarea   neurologică   din   cadrul   BL   poate   mima   alte  
afecţțiuni   neurologice.   Ghidurile   europene   de   diagnostic   recomandă   stabilirea   diagnosticului   de  
neuroborrelioza   Lyme   (NBL)   prin   analiza   lichidului   cefalorahidian.   Până   în   prezent   această  
recomandare   nu   a   fost   utilizată   în   practica   noastră   clinică,   având   ca   şi   consecinţță   posibila  
supradiagnosticarea   NBL   la   pacienţți   cu   alte   afecţțiuni   neurologice   şi   lipsa   de   răspuns   la   terapia  
antibiotică.  Un  obiectiv  al  studiului  a  fost  reprezentat  de  implementarea  noilor  recomandări  de  
diagnostic  și  evalurea  răspunsului  la  tratament  a  pacienţților.  
Metodologie  generală    
Studiul  a  primit  aprobarea  comisiei  de  etică  a  Universităţții  de  Medicină  şi  Farmacie  “Iuliu  
Haţțieganu”,   Cluj   Napoca,   România.   Fiecare   pacient   inclus   în   studiu   a   primit   informaţții   privind  
scopul  şi  protocolul  studiului  şi  şi-­‐a  dat  consimţțământul  scris  informat.  
Două   chestionare   pentru   monitorizarea   pacienţților   au   fost   utilizate.   Chestionarul   pentru  
monitorizarea   înţțepăturii   de   căpuşă   a   fost   completat   pentru   fiecare   subiect   la   momentul  
înţțepăturii,   urmărind   activităţțile   recreaţționale   şi   ocupaţționale   cu   risc   pentru   înţțepături   de  
căpuşe,  numărul   de   căpuşe  detaşate,   durata   de   ataşare   a   căpuşei,  locul  ataşării,  alergii  cunoscute,  
antecedente  patologice,  prezenţța  sarcinii.    Chestionarul  pentru  monitorizarea  BL  a  fost  aplicat  la  
diferite   momente   în   funcţție   de   design-­‐ul   studiilor.   S-­‐a   notat   ocupaţția,   antecedente   personale  
patologice,  înţțepături  de  căpuşă  sau  eritem  migrator  în  antecedente,  prezenţța  unor  simptome  şi  
semne  neurologice,  articulare,  cutanate,  oculare,  cardiace.  
Testele   serologice   pentru   determinarea   anticorpilor   anti   B.   burgdorferi   s-­‐au   efectuat   în  
diferite   momente,   în   funcţție   de   design-­‐ul   studiilor.   Au   fost   utilizate   trusele   ELISA:   Borrelia   afzelii  
IgM   ELISA,   Borrelia   afzelii   +   VlsE   IgG   ELISA   (Genzyme   Virotech   GmbH,   Germania)   şi   IgM,   IgG  
anti-­‐Borrelia   ELISA   (Euroimmun   AG,   Germania),   respectiv   trusa   Western   Blot   IgM,   IgG   Anti-­‐
Borrelia  EUROLINE-­‐RN-­‐AT  (Euroimmun  AG,  Germania).    
 
Studiu   1.     Etiologia   Borreliozei   Lyme   în   România:   Identificarea   genospeciilor   de  
Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  în  căpuşele  colectate  de  la  subiecţii  umani  
Introducere    
Complexul   B.   burgdorferi   s.l.   include   19   genospecii   diferite   din   care   10   raportate   în  
Europa:   B.   burgdorferi   s.s.,   B.   garinii,   B.   afzelii,   B.   valaisiana,   B.   lusitaniae,   B.   bavariense,   B.bissettii,  
B.   spielmanii,   B.   kurtenbachii   şi   B.   finlandensis.   Prevalenţța   infecţției   cu   B.   burgdorferi   în   căpuşele  
colectate  de  pe  subiecţții  umani  poate  fi  diferită  de  cea  în  căpuşele  colectate  de  pe  vegetaţție  din  
aceeaşi  zona  geografică.    
Obiective  
Identificarea   speciilor   de   căpuşe   care   atacă   omul   în   regiunea   noastra   şi   a   prevalenţței  
infecţției  cu  diferite  genospecii  de  B.  burgdorferi  în  aceste  căpuşe.    
Material  si  metoda  
Toate  căpuşele  colectate  de  la  pacienţții  care  s-­‐au  prezentat  în  Clinica  Boli  Infecţțioase  Cluj  
Napoca   în   perioada   01.04.2010-­‐07.09.2010   au   fost   studiate   prospectiv.   Căpuşele   au   fost  
identificate  privind  specia,  stadiul  de  dezvoltare  şi  sexul.  Identificarea  speciilor  de  B.  burgdorferi  
2
in  capușele  colectate  a  utilizat  o  metodă  de  real  time  (RT)  PCR  având  ca  ţțintă  gena  hbb  [ ].  
Rezultate  
Au  fost  colectate  şi  examinate  morfologic  532  căpuşe,  de  la  386  pacienţți.  Vârful  maxim  al  
prezentărilor   după   înţțepătura   de   căpuşă   a   fost   în   luna   mai.   Majoritatea   căpuşelor   au   aparţținut  
speciei   Ixodes   ricinus   (97.3%),   vectorul   BL   în   Europa.   Alte   specii   de   căpuşe   identificate   au   fost  
Dermacentor   marginatus,   Haemaphysalis   concinna   şi   Haemaphysalis   punctata;   acestea   nu  
prezintă   risc   de   transmiterea   a   BL,   dar   sunt   vectori   pentru   alte   boli   bacteriene,   virale   sau  
parazitare.    
Prevalenţța   infecţției   cu   B.  burgdorferi   sensu   lato   în   căpuşele   Ixodes  examinate  a   fost   11,1%.  
Un   procent   mai   mare   al   infecţției   a   fost   descris   in   adulţții   Ixodes   decat   in   nimfe   (12,9%   versus  
10,7%),   dar   nu   semnificativ   statistic   (p=0,55).   Pe   baza   rezultatelor   regiunea   noastră   poate   fi  
încadrată  în  zonele  europene  cu  prevalenţță  joasă  a  infecţției  căpuşelor  cu  B.  burgdorferi.  
Genospeciile   identificate   au   fost   reprezentate   de   B.   afzelii   (62,7%),   B.   garinii   (16,2%),   B.  
burgdorferi   sensu   stricto   (6,9%),   B.   lusitaniae   (2,3%),   B.   valaisiana   (2,3%)   şi   B.  
spielmanii/valaisiana  (9,3%).  Hbb  RT-­‐PCR  nu  a  putut  diferenţția  între  B.  spielmanii  şi  B.  valaisiana,  
fiind  necesar  a  se  efectua  tehnici  de  secvenţțiere  post  PCR.  Aceasta  este  prima  documentare  a  B.  
burgdorferi   sensu   stricto   în   căpuşele   colectate   din   România.   Studiul   dovedeşte   că   principalele  
genospeciile  uman  patogene  sunt  prezente  în  căpuşele  din  regiunea  noastră,  constituind  astfel  un  
risc  de  infecţție  pentru  om.      
 
Studiu   2.   Studiu   prospectiv   privind   riscul   de   transmitere   al   infecţiei   cu   Borrelia  
burgdorferi  sensu  lato  de  la  căpuşele  Ixodes  la  subiecţii  umani  în  România    
Introducere    
Riscul   de   dezvoltare   a   BL   după   înţțepătura   de   căpuşă   infectată   cu   B.   burgdorferi   şi   eficienţța  
chimioprofilaxiei  postexpunere  în  România  este  necunoscut.    
Obiective  
Deoarece   diferitele   genospecii   de   B.   burgdorferi   sunt   asociate   cu   diverse   manifestări  
clinice   şi   nu   toate   speciile   sunt   uman   patogene,   în   acest   studiu   am   dorit   sa   evaluăm   evoluţția  
clinică  a  subiecţților  umani  în  funcţție  de  genospeciile  identificate  în  căpuşa  detaşată  şi  atitudinea  
profilactică  urmată.  
Material  şi  metodă    
Toţți  pacienţții  înţțepaţți  de  căpuşe  pozitive  pentru  B.  burgdorferi  prin  hbb  RT-­‐PCR  şi  un  grup  
de  control  (studiu  caz-­‐martor)  au  fost  chemaţți  la  control  după  un  an  (mai-­‐august  2011).  Grupul  
de   control   a   inclus   indivizi   comparabili   (vârstă,   sex,   reşedinţță)   înţțepaţți   în   2010   de   căpuşe   B.  
burgdorferi   negative   şi   seronegativi   pentru   B.   burgdorferi   (utilizând   testul   ELISA)   la   momentul  
înţțepăturii.   Chestionar   de   monitorizare   a   fost   completat   pentru   fiecare   subiect   (la   momentul  
inţțepaturii  si  la  control).  
La   momentul   înţțepăturii   de   căpuşă   s-­‐a   efectuat   un   test   ELISA   (pentru   a   determina  
anticorpi   IgM   sau   IgG   anti   B.   burgdorferi   datoraţți   unor   înţțepături   de   căpuşă   anterioare)   utilizând  
kitul   Genzyme   Virotech.   La   control,   un   test   în   două   trepte   a   fost   efectuat,   pentru   investigarea  
anticorpilor   IgM   şi   IgG   anti   B.   burgdorferi   utilizând   kitul   ELISA   Genzyme   Virotech   ca   screening,  
urmat  de  kitul  Western  Blot  Euroimmun  pentru  confirmare.  
Rezultate    
Seroprevalenţța   pentru   infecţția   cu   B.   burgdorferi   a   fost   9,1%   la   263   pacienţți   examinaţți   la  
momentul   înţțepăturii,  rezultate   care   confirmă   nivelul   relativ   înalt   al   seropozitivităţții   în   populaţția  
asimptomatică   din   zone   endemice.   20   persoane   din   cele   39   înţțepate   de   căpuşe   pozitive   pentru   B.  
burgdorferi   prin   hbb   RT-­‐PCR   şi   un   grup   de   control   format   din   20   pacienţți   înţțepaţți   de   căpuşe  
negative  pentru  B.  burgdorferi,  s-­‐au  prezentat  la  controlul  clinic  şi  serologic.  Două  din  persoanele  
investigate   au   dezvoltat   manifestări   de   BL   acută   (eritem   migrator)   şi   5   persoane   au   făcut  
seroconversie  de  la  momentul  înţțepăturii  până  la  evaluarea  de  1  an.  Nu  au  fost  găsite  diferenţțe  
semnificative   statistic,   în   ceea   ce   priveşte   prezenţța   simptomelor   clinice   sau   evoluţția   serologică,  
între  grupul  persoanelor  înţțepate  de  căpuşe  B.  burgdorferi  pozitive  versus  grupul  de  control,  deşi  
ambele   cazuri   de   eritem   migrator   (EM)   au   apărut   în   grupul   cu   căpuşe   pozitive.   B.   afzelii,  
principala   genospecie   patogenă   în   zona   noastră   geografică,   a   fost   identificată   în   căpuşele  
colectate  de  la  persoanele  cu  EM.  Sunt  aduse  dovezi  privind  existenţța  unor  simptome  nespecifice  
în   populaţția   generală,   care   ar   putea   fi   interpretate   greşit   drep   BL   cronică.   Deşi   numărul   mic   al  
cazurilor   nu   ne   permite   să   calculăm   eficienţța   sau   eşecul   antibioticelor   în   prevenţția   BL,   ambele  
cazuri   de   EM   s-­‐au   dezvoltat   în   ciuda   chimioprofilaxiei,   iar   persoanele   fără   chimioprofilaxie   nu   au  
prezentat  seroconversie  sau  simptome  clinice  de  BL.  Studiul  nu  a  dovedit  existenţța  unei  legături  
între   statusul   infectant   al   căpuşei,   rezultatul   monitorizării   serologice   şi   manifestările   clinice   ale  
pacienţților.   Aceste   rezultate   susţțin   recomandările   conform   cărora   investigarea   infecţției   cu   B.  
burgdorferi   în   căpuşa   detaşată   şi   monitorizarea   serologică   nu   sunt   indicate   în   scopul   predicţției  
infecţției  la  subiecţții  umani.  
 
Studiu   3.   Metode   de   diagnostic   pentru   detecţia   Borreliei   burgdorferi   sensu   lato   în  
căpuşele  colectate  de  la  subiecţii  umani  
Introducere    
Deși   în   prezent   nu   există   un   standard   de   aur   în   diagnosticul   infecţției   cu   B.   burgdorferi,    
pacienţții   se   prezintă   adeseori   în   serviciul   nostru,   solicitând   examinarea   căpuşei   în   scopul  
aprecierii  riscului  de  transmitere  al  infecţției.    
Obiective  
Scopul   studiului   a   fost   compararea   a   3   metode   de   diagnostic   utilizate   pentru   detecţția   B.  
burgdorferi  în  căpuşe,  evaluând  avantajele  şi  dezavantajele  acestor  metode  şi  rolul  lor  în  practica  
clinică.  
Material  şi  metodă  
Un  număr  reprezentativ  din  căpuşele  colectate  de  la  pacienţții  care  s-­‐au  prezentat  în  Clinica  
Boli  Infecţțioase,  Cluj  Napoca,  în  perioada  01.04.2010-­‐07.09.  2010  au  fost  testate  prin  trei  metode  
de  diagnostic:  o  metodă  imunohistochimică  și  2  metode  de  RT-­‐PCR  (hbb  RT-­‐PCR  şi  ospA  RT-­‐PCR)  
[3,  2,  4].    
Duplex   ospA   RT-­‐PCR   este   o   metodă   descrisă   pentru   prima   dată   în   cadrul   prezentei  
cercetări.  Pe  lângă  sistemul  de  detecţție  al  genei  ospA  a  B.  burgdorferi  [3],  un  al  doilea  sistem  PCR  a  
fost  implementat  ca  şi  control  intern  al  amplificării  (IAC).  Având  în  vedere  că  am  lucrat  cu  piese  
stocate  în  formol  şi  fixate  în  parafină,  acest  IAC  a  avut  scopul  de  a  exclude  inhibiţția  PCR-­‐ului,  care  
ar  putea  duce  la  rezultate  fals  negative.  Pentru  determinarea  specificităţții  metodei,  22  tulpini  de  
referinţță   ale   B.   burgdorferi   s.l.   au   fost   testate   pentru   inclusivitate,   în   timp   ce   18   tulpini   de  
Leptospira  (incluzând  genospeciile  interrogans,  borgpetersenii,  kirschneri  şi  biflexa),  precum  şi  o  
tulpină   de   Borrelia   miyamotoi   şi     una   de   Treponema   phagedenis,   au   fost   testate   pentru  
exclusivitate.  
Rezultate  
Duplex   ospA   RT-­‐PCR   a   prezentat   o   sensibilitate   între   1-­‐10   copii   ADN/PCR,   o   eficienţță   de  
99,85%,  exclusivitate  de  100%  şi  inclusivitate  de  86,36%  (nedetectate  B.  lusitaniae,  tulpinile  Poti  
B2  si  Poti  B3  şi  B.  japonica).  
Din   cele   136   căpuşe   analizate   prin   toate   trei   metodele   de   diagnostic,   16   (11,8%)   au   fost  
pozitive  prin  imunohistochimie  (IH),  12  (8,8%)  au  fost  pozitive  prin  hbb  RT-­‐PCR  și  26  (9,11%)  au  
fost   pozitive   prin   ospA   RT-­‐PCR.   În   nici   una   din   probe   nu   a   fost   detectata   inhibitie   prin   IAC.  
Concordanţța   de   86,7%,   a   celor   două   tehnici   de   RT-­‐PCR   din   studiul   nostru   susţține   existenţța  
sensibilităţților  diferite  a  tehnicilor  PCR  având  ca  ţțintă  gene  diferite.  Valoarea  lui  p  (p<0,0001)  a  
fost   sub   valoarea   limită   a   semnificaţției   statistice,   arătând   existenta   unei   legaturi   intre   rezultatele  
celor  2  teste  de  diagnostic  molecular.  Comparând  IH  cu  ospA  RT-­‐PCR  şi  hbb  RT-­‐PCR,  am  găsit  o  
concordanţță  a  rezultatelor  de  76,4%  respectiv  83,8%,  fără  a  exista  însă  o  semnificaţție  statistică  
(p=0,19  respectiv  p=0,15).  O  sensibilitate  joasă  a  IH  a  fost  descrisă  comparativ  cu  ospA  RT-­‐PCR  şi  
hbb   RT-­‐PCR   (19,23%   şi   respectiv   25%),   dar   o   specificitate   bună   (90%   şi   respectiv   89,5%).  
Variaţția  rezultatelor  obţținute  prin  cele  trei  metode  de  diagnostic  subliniază  existenţța  rezultatelor  
discordante  a  diferitelor  metode  utilizate  pentru  detecţția  B.  burgdorferi  în  căpuşe.  Atât  timp  cât  
nu   există   un   standard   de   aur   în   diagnostic,   beneficiile   la   nivel   de   individ,   prin   testarea   căpuşei  
detaşate,   sunt   limitate   de   rezultatele   fals   pozitive   şi   fals   negative.   În   aceste   condiţții,   testarea  
pentru  B.  burgdorferi  în  căpuşele  detaşate  de  pe  subiecţții  umani  pentru  predicţția  infecţției  la  om  
nu  se  recomandă.  
 
Aspectele   clinice   ale   BL   au   fost   urmărite   în   3   studii   diferite,   efectuate   asupra   pacienţților  
care   s-­‐au   prezentat   în   perioda   ianuarie   2011-­‐octombrie   2012   cu   diagnosticul   de   EM,   suspiciunea  
de  NBL  sau  alte  manifestări  clinice  ale  BL.    
 
Studiul  4.  Clinica  Borreliozei  Lyme  în  arealul  Transilvaniei:  Eritemul  migrator  
Introducere  
Eritemul  migrator  este  cea  mai  frecventă  şi  specifică  manifestare  clinică  a  BL.  Prognosticul  
pe  termen  lung  al  pacienţților  trataţți  cu  diagnosticul  de  EM  este  considerat  bun,  deşi  puţține  studii  
au  evaluat  acest  aspect  în  Europa  şi  până  în  prezent  nu  a  fost  studiat  în  România.  
Obiective  
În   studiul   1   am   dovedit   infecţția   căpuşelor   I.   ricinus   colectate   de   pe   subiecţții   umani   cu  
principalele   genospecii   de   B.   burgdorferi   implicate   în   dezvoltarea   leziunilor   de   EM.   Astfel,   am  
considerat   oportună   evaluarea   profilului   epidemiologic,   clinic   şi   serologic   al   pacienţților   cu   EM  
din  arealul  nostru  geografic  şi  compararea  cu  rezultatele  altor  studii.    
Material  şi  metoda  
În  studiu  au  fost  incluşi  prospectiv  pacienţți  care  s-­‐au  prezentat  în  Clinica  Boli  Infecţțioase,  
Cluj  Napoca,  în  perioada  iunie  2011-­‐  august  2012  cu  diagnosticul  de  EM.  Pacienţților  li  s-­‐a  instituit  
terapie  conform  recomandărilor  existente  [5,   6,   7].  Evoluţția  clinică  si  serologica  a  fost  investigata  
comparând   2   grupuri   de   pacienţți:   pacienţți   cu   o   perioadă   scurtă   de   monitorizare   de   3   luni   si  
pacienti   o   perioada   de   monitorizare   mai   lunga,   de   9   luni-­‐   1   an.   Au   fost   urmarite   profilele   cineticii  
anticorpilor  specifici  de  tip  IgM  si  IgG  la  initierea  terapiei  si  la  control.  
Rezultate    
Sunt   comparate   rezultatele   obţținute   prin   monitorizarea   a   40   pacienţți   cu   EM   cu   rezultatele  
altor   studii   similare   din   Europa   şi   America   de   Nord.   Diametrul   mediu   al   leziunii   de   EM   la  
prezentare  a  fost  mai  mic  comparativ  cu  alte  studii,  sugerând  o  bună  informare  a  pacienţților  şi  
medicilor   de   alte   specialităţți   privind   monitorizarea   înţțepăturii   de   căpuşă,   urmată   de   prezentarea  
precoce  a  pacienţților  în  serviciul  de  Boli  Infecţțioase.    
Cinci  din  34  pacienţți  care  au  recunoscut  înţțepătura  de  căpuşă  din  studiul  nostru  (14,7%)  
au  dezvoltat  leziunea  de  EM  în  ciuda  chimioprofilaxiei  postînţțepătură  de  căpuşă,  demonstrând  că  
antibioticele  administrate  profilactic  nu  conferă  protecţție.  Din  cei  40  pacienţți  luaţți  în  studiu,  15  
au  fost  monitorizaţți  pe  o  perioadă  scurtă  (grup  A),  iar  23  pacienţți  pe  o  perioadă  medie  (grup  B).  
Doi   pacienţți   nu   s-­‐au   prezentat   la   control.   Un   singur   pacient   care   a   urmat   terapie   incompletă  
pentru  EM  a  fost  diagnosticat  ca  BL  tardivă  cu  manifestări  articulare,  dar  16  pacienti  au  prezentat  
simptome   nespecifice   la   reevaluare,   in   lipsa   unor   semne   obiective,   fără   a   exista   diferenţțe  
semnificative   statistic   în   ceea   ce   priveşte   răspunsul   la   terapie   între   cele   2   grupuri   (p=1).  
Rezultatele   au   arătat   absenta   unei   legaturi   intre   profilul   serologic   si   evolutia   clinica,   susţținând  
recomandările  recente,  conform  cărora  repetarea  serologiei  nu  se  indică  în  urmărirea  pacienţților  
cu  EM.  

Studiu  5.  Clinica  Borreliozei  Lyme  în  arealul  Transilvaniei:  Neuroborrelioza  Lyme  
Introducere    
Neuroborrelioza   Lyme   (NBL)   poate   mima   orice   afecţțiune   neurologică   şi   vice-­‐versa,  
pacienţții   suferind   de   alte   afecţțiuni   neurologice,   precum   scleroza   multiplă,   scleroza   laterală  
amiotrofică   (SLA),   polineuropatie,   parkinsonism,   boala   Alzheimer,   putând   fi   greşit   diagnosticaţți  
ca   BL. Criteriile   europene   de   diagnostic,   spre   deosebire   de   cele   americane,   includ   analiza  
8
lichidului  cefalorahidian  şi  determinarea  producţției  intratecale  de  anticorpi  specifici  [ ].  
Obiective  
Studiul   a   introdus   pentru   prima   dată   în   practica   noastră   clinică   criteriile   europene   de  
diagnostic  ale  NBL.    
 Material  şi  metodă    
Au   fost   incluşi   în   studiu   pacienţți   internaţți   în   Clinica   Boli   Infecţțioase,   Cluj   Napoca,   în  
perioada   ianuarie   2011-­‐   octombrie   2012   cu   suspiciunea   de   NBL   cu   afectare   a   SNC.   Criterii   de  
includere:   pacienţții   prezentau   manifestări   de   afectare   a   SNC,   Atc   anti   B.   burgdorferi   în   ser,   au  
acceptat  efectuarea  puncţției  lombare  (PL)  în  scop  de  diagnostic  şi  nu  au  primit  terapie  anterioară  
parenterală  pentru  suspiciunea  de  NBL.    
Toţți   pacienţții   incluşi   în   studiu   au   fost   trataţți   ca   NBL   cu   afectare   SNC   [8],   indiferent   şi  
necunoscând   rezultatul   de   laborator   al   Atc   specifici   produşi   intratecal.   Simptomele   incluse   în  
chestionarul  de  monitorizare  au  fost  urmărite  la  începutul,  la  sfârşitul  terapiei  şi  la  controlul  de  3  
luni  utilizând  un  scor  simptomatic.    
S-­‐au   realizat   două   modele   de   regresie   binomială   negativă   mixtă,   cu   măsurători   repetate,  
având   ca   variabilă   dependentă   numărul   de   simptome,   respectiv   scorul   simptomatic.   Timpul  
(corespunzător  observaţțiilor  făcute),  măsurat  în  săptămâni,  a  fost  luat  ca  variabilă  aleatoare.    
Pentru   determinarea   anticorpilor   IgM  şi   IgG   Borrelia   din   LCR   şi   ser   (ELISA)   s-­‐au   utilizat  în  
anul   2011   un   kit   Genzyme   Virotech   GmbH,   Germania   iar   in   2012   un   kit   Euroimmun   AG,  
Germania.  La  prezentare  s-­‐a  efectuat  testare  în  două  trepte  pentru  investigarea  atc  IgM  şi  IgG  anti  
B.   burgdorferi,   utilizând   ca   screening   un   kit   ELISA,   iar   ca   test   de   confirmare   Western   Blot   kitul  
Euroimmun.  La  reevaluare  de  3  luni  s-­‐a  repetat  testarea  ELISA.  
Rezultate    
Conform  definiţției  de  caz  europene  am  clasificat  7  cazuri  ca  NBL  posibilă,  33  cazuri  ca  NBL  
infirmată,  iar  2  cazuri  nu  au  putut  fi  clasificate  datorită  cantităţții  insuficiente  de  LCR.  Nici  un  caz  
nu   a   îndeplinit   criteriile   de   NBL   definită.   Acest   studiu   aduce   evidenţțe   asupra   supradiagnosticului  
NBL  în  regiunea  noastră.  
Deşi   evoluţția   pacienţților   a   fost   spre   ameliorare,   un   număr   de   simptome   a   persistat.  
Pacienţții  cu  NBL  infirmată  au  prezentat  mai  multe  simptome  pe  parcursul  monitorizării  decât  cei  
cu   NBL   posibilă   –   statistic   semnificativ   (p=0,03)   și   un   scor   simptomatic   mai   mare,   aproape   de  
limita  semnificaţției  statistice  (p=0,055).  Astfel  rezultatele  arata  o  evoluţție  mai  bună  sub  terapia  
antibiotica  în  grupul  pacienţților  cu  NBL  posibilă  decât  în  grupul  celor  cu  NBL  infirmată.  
Nu  s-­‐au  identificat  simptome  care  să  apară  mai  frecvent  (semnificativ  statistic)  în  grupul  
pacienţților  cu  NBL  posibilă.  Toţți  pacienţții  au  fost  abordaţți  interdisciplinar,  astfel  22  din  pacienţți  
au   prezentat   un   diagnostic   neurologic,   iar   la   restul   cazurilor   nu   s-­‐au   găsit   modificări   în   urma  
consultului  neurologic,  deși  existau  simptome.  Terapia  specifică  indicată  s-­‐a  asociat  sau  a  urmat  
terapiei   antibiotice.   Nu   am   dovedit   existenţța   unei   legături   între   diagnosticul   de   NBL  
posibilă/infirmată  şi  prezenţța  unor  leziuni  de  demielinizare  pe  RMN  craniu  (p>0,05).    
Afecţțiuni  reumatologice  au  fost  descrise  la  9  din  pacienţți.  Monitorizarea  serologică  a  arătat  
o  variabilitate  a  profilelor  cineticii  anticorpilor.  13  pacienţți  (30,9%)  au  prezentat  reacţții  adverse  
la  terapia  antibiotică,  incluzând  un  caz  de  entrocolită  cu  Clostridium  difficile.    
Discuţii    
Având   în   vedere   prevalenţța   crescută   a   serologiei   pozitive   pentru   B.   burgdorferi   în  
populaţția   generală,   aspect   descris   în   studiul   2   al   tezei   şi   în   regiunea   noastră,   apariţția   unor  
simptome  neurologice  la  aceşti  pacienţți  pune  reale  probleme  de  diagnostic  pozitiv  şi  diferenţțial.  
În  studiul  nostru,  un  pacient  din  grupul  cu  NBL  infirmată  a  fost  confirmat  ca  SM  şi  alţți  2  ca  SLA  pe  
parcursul   monitorizării.   Nici   unul   din   aceste   cazuri   nu   a   prezentat   ameliorare   sub   terapia  
antibiotică.   Rezultatele   susţțin   afirmaţția   lui   Puéchal   și   Sibilia   (2009)   [9],   conform   căreia  
persistenţța   unor   simptome   se   datorează   mai   degrabă   unui   diagnostic   incorect,   decât   eșecului  
terapiei.   Datele   prezentate   constituie   prima   dovadă   necesară   întreruperii   utilizării   nejustificate   a  
antibioticelor  la  pacienţții  neconfirmaţți  cu  NBL.  
 
Studiu  6.  Alte  manifestări  ale  Borreliozei  Lyme  în  arealul  Transilvaniei    
Introducere  
 Investigarea,   tratamentul   şi   monitorizarea   unui   pacient   care   se   prezintă   cu   suspiciunea   de  
BL,  reprezintă  o  provocare  pentru  medicul  infecţționist.  În  prezent  nu  există  un  standard  de  aur  
pentru  diagnosticul  BL.  Cu  excepţția  EM,  diagnosticat  clinic  pe  baza  leziunii  caracteristice  şi  a  NBL,  
când  se  indică  evaluarea  LCR,  multiple  alte  manifestări  pot  fi  întâlnite  în  tabloul  clinic  al  BL,  mai  
mult   sau   mai   puţțin   specifice.   Un   rol   important   în   diagnosticul   acestor   pacienţți   îl   reprezintă  
cunoaştere   aspectelor   epidemiologice   (înţțepături   de   căpuşă,   EM   în   antecedente),   asociat  
manifestărilor   clinice   şi   serologiei   pozitive   pentru   B.   burgdorferi.   Serologia,   principala   metodă  
utilizată   în   diagnosticul   de   laborator,   trebuie   interpretată   cu   prudenţță   datorită   limitelor  
cunoscute,   în   principal   reacţții   fals   pozitive.   În   evaluarea   acestor   pacienţți,   un   rol   important   revine  
diagnosticului  diferenţțial.    
Material  şi  metodă  
Au  fost  incluşi  în  studiu  pacienţți  care  s-­‐au  prezentat  în  Clinica  Boli  Infecţțioase  în  perioada  
ianuarie   2011-­‐   octombrie   2012   cu   suspiciunea   de   BL.   Criterii   de   includere:   pacienţții   prezentau  
diverse   manifestări   de   organ   din   tabloul   clinic   al   BL   şi   serologie   pozitivă   pentru   B.   burgdorferi.  
Criterii   de   excludere:   pacienţții   cu   EM   şi   cei   cu   suspiciunea   clinică   de   NBL   care   au   acceptat  
efectuarea  puncţției  lombare,  incluși  în  studiile  anterioare,  sau  cei  pierduţți  din  urmărire.  
Chestionarul  de  monitorizare  a  BL  a  fost  aplicat  la  momentul  includerii,  la  sfârşitul  terapiei  
și  la  reevaluare  de  3  luni.  Pacienţții  au  fost  împărţțiţți  în  grupuri,  în  funcţție  de  probabilitatea  de  a  
avea   BL   după   un   scor   deja   publicat   de   Clarissou   et   al.   [10].   La   prima   prezentare   s-­‐a   efectuat  
testare   în   două   trepte,   utilizând   ca   screening   în   anul   2011   kitul   ELISA   Virotech,   pentru   ca   în   anul  
2012   să   se   utilizeze   kitul   Euroimmun;   ca   test   de   confirmare   Western   Blot   s-­‐a   utilizat   kitul  
Euroimmun.   La   reevaluare   de   3   luni   s-­‐a   repetat   testarea   ELISA.   Terapia   antibiotică   a   respectat  
indicaţțiile  ghidurilor  în  funcţție  de  afectarea  de  organ,  vârstă,  comorbidităţți  [5,  6,  7].  
Rezultate  
În  studiu  au  fost  incluşi  prospectiv  64  pacienţți.  57    din  pacienţții  incluşi  (89%)  au  prezentat  
testul  în  două  trepte  (TTT)  pozitiv,  restul  de  7  pacienţți  prezentând  testul  ELISA  sau  Western  Blot  
pozitiv.    
BL  a  fost  descrisă  mai  frecvent  la  pacienţți  provenind  din  mediul  urban,  la  sexul  feminin  şi  
în   grupa   de   vârstă   50-­‐64   ani.   58   pacienţți   (90,6%)   au   prezentat   afectări   multiple   de   organ.  
Utilizând   scorul   de   probabilitate,   44   pacienţți   au   fost   clasificaţți   ca   BL   foarte   probabilă,   18   ca   BL  
probabilă   şi   2   pacienţți   ca   BL   puţțin   probabilă.   Nu   au   fost   descrise   diferenţțe   semnificative   statistic  
ale  evoluţției  în  timp  a  numărului  de  simptome  sau  scorului  simptomatic  intre  cele  3  grupuri  de  
pacienţți.  Pornind  de  la  premisa  că  lipsa  de  răspuns  la  tratament  se  poate  datora  unui  diagnostic  
greşit,   rezultatele   obţținute   sugerează   că   utilizarea   scorului   de   probabilitate   prezentat   de  
Clarissou  et  al.  [10]  nu  aduce  beneficii  în  stabilirea  diagnosticului  de  boală.    
Răspunsul  la  terapia  antibiotică  a  fost  mai  bun  în  grupul  pacienţților  care  au  prezentat  TTT  
pozitiv,   comparativ   cu   grupul   celor   care   au   prezentat   TTT   negativ.   Utilizarea   testului   Western  
Blot   ca   screening,   sau   testarea   sa   la   pacienţții   cu   testul   ELISA   negativ   scade   valoarea   clinică   a  
rezultatului   şi   poate   duce   la   un   diagnostic   greşit,   urmat   de   lipsa   de   răspuns   la   terapia   antibiotică.  
Aceste  rezultate  susţțin  indicaţția  de  testare  a  anticorpilor  anti  B.  burgdorferi  prin  metoda  Western  
Blot  doar  la  pacienţții  cu  test  ELISA  pozitiv.    
Evaluarea  pacientilor  cu  BL  în  studii  terapeutice  este  dificilă,  deoarece  intervin  factori  de  
eroare   precum   existenţța   unor   comorbidităţți.   Din   cei   64   pacienţți   investigaţți,   24   au   prezentat   un  
diagnostic  secundar  neurologic,  33  un  diagnostic  secundar  reumatologic,  8  au  prezentat  afecţțiuni  
tiroidiene,  10  afecţțiuni  psihice,  3  afecţțiuni  cutanate,  2  serologie  pozitiva  pentru  infectia  cu  virusul  
hepatitic  C,  unul  cu  virusul  hepatitic  B,  2  serologie  pozitiva  pentru  Mycoplasma  pneumoniae.  
Monitorizarea   serologică   la   trei   luni   după   terapie   a   arătat   o   variabilitate   a   profilelor  
cineticii  anticorpilor,  subliniind  lipsa  utilităţții  acesteia  în  practica  clinică.  
 
 
 
 Discuţii  generale  
Din   perspectiva   BL,   medicii   pot   fi   supuşi   la   două   greşeli:   subdiagnosticul   şi  
supradiagnosticul   BL.   Este   o   greşeală   să   nu   ne   gândim   la   această   afecţțiune,   atâta   timp   cât   ne  
aflăm  într-­‐o  zonă  endemică,  având  căpuşe  infectate  cu  principalele  specii  patogene  umane  de  B.  
burgdorferi  în  imediata  vecinătate,  dar  este  o  greşeală  şi  să  ignorăm  alte  afecţțiuni,  la  un  pacient  
cu  serologie  pozitivă  pentru  B.  burgdorferi.  Polimorfismul  manifestărilor  clinice  ale  BL  este  într-­‐
adevăr   un   aspect   cunoscut,   dar   îndepărtarea   de   orice   alt   diagnostic,   atâta   timp   cât   serologia  
persistă  pozitivă,  poate  priva  pacientul  de  terapie  specifică  pentru  altă  boală  tratabilă.  Astfel,  la  
pacienţții  cu  simptome  cronice,  lipsa  de  răspuns  la  terapia  antibiotică  sugerează  posibilitatea  unui  
diagnostic   iniţțial   greşit   şi   nevoia   unei   reevaluări   clinice   decât   a   unei   noi   cure   antibiotice.   În  
contextul  informaţțiilor  eronate  sau  contradictorii  pe  care  le  primesc  prin  mass-­‐media,  pacienţții  
solicită   adeseori   repetarea   curelor   antibiotice   datorită   persistenţței   serologiei   pozitive   şi/sau   a  
unor   acuze   simptomatice.  Pacientul   trebuie   informat   pe   baza   unui   dialog   deschis   de   riscul   unei  
terapii   antibiotice   prelungite,   fără   eficienţța   dovedită   şi   cu   posibile   reacţții   adverse.   Prezentarea  
publică  a  unor  pacienţți  cu  afecţțiuni  neurologice  degenerative  precum  SLA  sau  SM  ca  fiind  BL,  nu  
face   decât   să   crească   confuzia   şi   temerile   pacienţților   care   ni   se   adresează.   Deoarece   anticorpii  
anti   B.   burgdorferi   pot   persista   10-­‐20   ani   după   primoinfecţție,   iar   seroprevalenţța   în   cadrul  
populaţției   generale   este   crescută,   în   evaluarea   acestor   pacienţți   trebuie   să   ţținem   cont   de  
îmbătrânirea  fiziologică,  stres,  publicitatea  privind  BL,  dar  in  primul  rând  comorbidităţți.  
 
Concluzii  generale  
1.   Cercetarea  de  faţța  prezintă  primul  studiu  efectuat  in  România  asupra  capuşelor  
colectate  de  la  subiecţții  umani.  
2.   Majoritatea  căpuşelor  examinate  (97.3%)  aparţțin  genului  Ixodes,  vectorul  BL.  
3.   Utilizând   in   scop   diagnostic   o   metodă   de   RT-­‐PCR   avand   ca   ţțintă   gena   hbb   a   B.  
burgdorferi,  prevalenţța  infecţției  cu  B.  burgdorferi  s.l.  in  capuşele  Ixodes  examinate  a  fost  11,1%.    
4.   Pe   baza   rezultatelor   obtinute,   regiunea   noastră   poate   fi   incadrată   in   zonele  
europene  cu  prevalenţța  joasă  a  infecţției  capuşelor  cu  B.  burgdorferi.  
5.   Studiul   dovedeşte   ca   principalele   genospecii   uman   patogene   sunt   prezente   in  
capuşele  din  România,  constituind  un  risc  de  infecţție  pentru  om.    
6.   Seroprevalenţța   pentru   infecţția   cu   B.   burgdorferi   a   fost   9,1%   la   263   pacienţți  
examinaţți  la  momentul  înţțepaturii,  rezultate  care  confirmă  nivelul  relativ  inalt  al  seropozitivităţții  
in  populaţția  asimpomatică  din  zone  endemice.    
7.   Studiul   nu   a   dovedit   existenţța   unei   legături   intre   statusul   infectant   al   capuşei,  
rezultatul  monitorizării  serologice  şi  manifestările  clinice  ale  pacienţților.    
8.   Aceste   rezultate   susţțin   recomandările   conform   cărora   investigarea   infecţției   cu  
B.  burgdorferi  in  capuşa  detaşată  si  monitorizarea  serologica  nu  sunt  indicate  in  scopul  predicţției  
infecţției  la  subiecţții  umani.  
9.   Beneficiile   chimioprofilaxiei   postînţțepătură   de   căpuşă   nu   au   putut   fi   dovedite.  
Eritemul  migrator  s-­‐a  dezvoltat  în  ciuda  chimioprofilaxiei,  iar  pacienţții  fără  chimioprofilaxie  nu  
au  dezvoltat  manifestări  de  boală  sau  seroconversie.  
10. Duplex   ospA   RT-­‐PCR,   o   metodă   de   RT-­‐PCR   descrisă   pentru   prima   dată   în  
prezentul  studiu,  s-­‐a  dovedit  a  fi  o  metodă  eficientă  de  screening  al  complexului  B.  burgdorferi  s.l.,  
utilă  pentru  studii  pe  un  număr  mare  de  probe.  
11. Variaţția  rezultatelor  obţținute  prin  imunohistochimie  si  cele  doua  metode  de  RT-­‐
PCR   subliniază   existenta   rezultatelor   discordante   a   diferitelor   metode   utilizate   pentru   detecţția   B.  
burgdorferi  in  capuşe.    
12. Atât   timp   cât   nu   există   un   standard   de   aur   în   diagnostic,   beneficiile   la   nivel   de  
individ,  prin  testarea  căpuşei  detaşate,  sunt  limitate  de  rezultatele  fals  pozitive  şi  fals  negative.    
 13. Un   singur   pacient   cu   terapie   incompletă   pentru   EM   a   fost   diagnosticat   ca   BL  
tardivă   cu   manifestări   articulare,   sugerând   un   prognostic   bun   al   pacienţților   cu   EM   in   regiunea  
noastră.  
14. Nici  un  pacient  din  studiu  nu  a  indeplinit  criteriile  de  NBL  definită  si  doar  16,6%  
din  cazuri  au  fost  clasificate  ca  NBL  posibila.  
15. Acest   studiu   aduce   evidente   asupra   supradiagnosticarii   NBL   in   regiunea  
noastra.  
16. Datele   prezentate   constituie   prima   dovada   necesara   intreruperii   utilizarii  
nejustificate  a  antibioticelor  la  pacientii  neconfirmati  cu  NBL.    
17. Pacientul  care  se  prezintă  cu  suspiciunea  de  BL  poate  prezenta  un  tablou  clinic  
cu  afectări  multiple  de  organ  si  numeroase  comorbiditaţți.  
18. Răspunsul     pacienţților   la   terapia   antibiotică   depinde   de   corectitudinea  
diagnosticului   şi   respectarea   indicaţției   de   testare   serologică   în   două   trepte   (screening   ELISA   şi  
confirmare  Western  Blot).  
19.  Nu   s-­‐a   dovedit   existenţța   unei   legături   între   răspunsul   la   terapie   al   pacienţților   şi  
încadrarea  acestora  în  diverse  scoruri  de  probabilitate.  
20. Datele  obţținute  susţțin  discordanţța  între  rezultatele  serologice  si  clinice,  care  nu  
permit  aprecierea  eficienţței  terapiei  prin  testarea  post  terapeutică  a  anticorpilor  specifici.  
21. Datorită  variabilitaţții  cineticii  anticorpilor  si  persistenţței  acestora  dupa  terapie  
la   un   numar   important   din   pacienţți,   monitorizarea   posterapeutică   a   pacienţților   cu   BL   se  
recomanadă  a  fi  o  monitorizare  clinică.    
   
Originalitatea  şi  contribuţiile  inovative  ale  tezei    
Originalitatea   tezei   constă   în   abordarea   multidisciplinară   a   unei   afectiuni   complexe,    
Borrelioza   Lyme,   din   perspectiva   entomologului,   epidemiologului,   clinicianului   şi   medicului   de  
laborator.  Este  prezentat  primul  studiu  efectuat  asupra  căpuşelor  colectate  de  la  subiecţții  umani  
din   România,   evaluând   riscul   de   transmitere   al   infecţției   cu   B.   burgdorferi   la   om.   Pe   baza  
rezultatelor  obţținute  s-­‐a  efectuat  un  protocol  local  privind  atitudinea  postînţțepătură  de  căpuşă.  
Examinarea  statusului  infectant  al  căpuşei,  monitorizarea  serologică  şi  chimioprofilaxia  nu  sunt  
recomandate,  monitorizarea  pacienţților  după  înţțepătura  de  căpuşă  fiind  una  clinică.    
O   dată   cu   proiectul   acestei   teze,   au   fost   introduse   în   practica   noastră   clinică   criteriile  
europene   de   diagnostic   ale   NBL.   Pe   lângă   datele   ştiinţțifice   furnizate,   acest   studiu   are   ca   prim  
beneficiu   crearea   unui   protocol   de   abordare   a   pacienţților   care   se   adresează   serviciului   nostru   cu  
suspiciunea  de  BL,  urmând  o  conduită  diagnostică  şi  terapeutică  conform  indicaţțiilor  ghidurilor,  
cu  ajutorul  unei  echipe  multidisciplinare.  
Toţți  pacienţții  incluşi  în  studiu  au  fost  internaţți  sau  consultaţți  ambulator  în  Spitalul  Clinic  
de   Boli   Infecţțioase,   Cluj   Napoca.   Analiza   morfologică   a   căpuşelor   colectate   a   fost   realizată   în  
cadrul   Departamentului   de   Parazitologie   și   Boli   Parazitare   al   Facultăţții   de   Medicină   Veterinară  
USAMV,   Cluj   Napoca.   Diagnosticul   imunohistochimic   al   infecţției   cu   B.   burgdorferi   în   căpuşe   s-­‐a  
efectuat  în  cadrul  Laboratorului  de  Anatomopatologie  al  Spitalului  Clinic  de  Boli  Infecţțioase,  Cluj  
Napoca.   Studiile   de   diagnostic   molecular   au   fost   realizate   în   cadrul   mobilităţții   transnaţționale  
efectuate  la  Centrul  Naţțional  de  Referinţță  pentru  Borrelia,  Institutul  Bavarez  pentru  Sănătate  şi  
Siguranţța   Alimentului,   Oberschleissheim,   Germania.   Diagnosticul   serologic   al   infecţției   cu   B.  
burgdorferi   s-­‐a   efectuat   în   cadrul   Laboratorului   Clinic   al   Spitalului   de   Boli   Infecţțioase,   Cluj  
Napoca.      
Toate   aceste   realizări   au   fost   posibile   prin   colaborarea   realizată   cu   Departamentul   de  
Parazitologie  și  Boli  Parazitare  al  Facultăţții  de  Medicină  Veterinară,  USAMV  Cluj  Napoca  în  cadrul  
proiectului  IDEI-­‐PCCE  CNCSIS  84,  7/2010  “Studii  fundamentale  şi  aplicate  de  ecoepidemiologie,  
biologie  şi  genetica  moleculară  ale  vectorilor  bolii  Lyme”  şi  prin  proiectul  UMF  “Iuliu  Haţțieganu”  
Cluj  Napoca  co-­‐finanţțat  E.S.F  POSDRU  88/1.5/S/56949.  

 
 „IULIU HAŢIEGANU” UNIVERSITY OF MEDICINE AND
PHARMACY, CLUJ-NAPOCA

Study regarding prophylaxis and

treatment of Lyme Borreliosis in
Transylvania

ABSTRACT OF THE DOCTORAL THESIS

Doctoral Candidate Violeta Tincuța Briciu

Scientific Coordinator Prof. Dr. Dumitru Cârstina

Cluj-Napoca 2013
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 TABLE  OF  CONTENTS  
INTRODUCTION     11  
CURRENT  STAGE  OF  KNOWLEDGE      
1.  Etiology,  pathogenesis  and  epidemiology  of  Lyme  
15  
borreliosis  
1.1.  Etiology  of  Lyme  borreliosis.  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  
15  
complex  
1.1.1.  Morphology,  Shape  and  Membrane  Structure   15  
1.1.2.  Genome  and  Genome  Organization   17  
1.1.3.  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  complex   18  
1.2.  Epidemiology  of  Lyme  borreliosis   19  
1.2.1.  Terminology   19  
1.2.2.  Vectors   20  
1.2.3  Reservoir  hosts   20  
1.3.  B.  burgdorferi  host  interaction  and  pathogenesis   20  
1.3.1.  B.  burgdorferi  -­‐  host  interaction   20  
1.3.2.  Pathogenesis   21  
2.  Clinical  manifestations  and  diagnosis  of  Lyme  borreliosis   23  
2.1.  Clinical  manifestations   23  
2.1.1.  Skin  Involvement   23  
2.1.2.  Nervous  System  Involvement   24  
2.1.3.  Joint  Involvement   25  
2.1.4.  Cardiac  Involvement   25  
2.1.5.  Eye  Involvement   26  
2.1.6.  Other  Potential  Manifestations  of  Lyme  borreliosis   26  
2.1.7.  Chronic  Lyme  borreliosis   26  
2.1.8.  Lyme  borreliosis  in  pregnancy   27  
2.1.9.  Lyme  borreliosis  in  immunocompromised  host   27  
2.2.  Lyme  borreliosis  diagnosis   27  
2.2.1.  Direct  Detection  of  B.  burgdorferi   27  
2.2.2.  Immunologic  Diagnosis  of  B.  burgdorferi  Infection   28  
2.2.3.  Other  laboratory  assays  in  LB   31  
2.2.4.  Tests  nor  recommended  to  be  used  for  diagnosis   32  
2.3.  Differential  diagnosis   32  
3.  Treatment  and  prophylaxis  of  Lyme  borreliosis   33  
3.1.  Treatment  of  Lyme  borreliosis   33  
3.1.1.  Treatment  recommended  for  Lyme  borreliosis     33  
3.1.2.  Pharmacologic  and  microbiologic  bases  of  the  treatment     34  
3.1.3.  What  should  be  done  in  case  of  persistent  symptoms  after  
36  
adequate  antibiotic  treatment  for  Lyme  borreliosis?  
3.1.4.  Therapy  in  asymptomatic  patients  with  positive  serology   37  
3.2.  Prophylaxis  of  Lyme  borreliosis   37  
3.2.1.  Personal  protection   37  
3.2.2.  Integrated  tick  management   39  
PERSONAL  CONTRIBUTION      
1.  Hypothesis  /  objectives     43  
2.  Methods     45  
3.  Study  1  -­  Lyme  Borreliosis  etiology  in  Romania:  Borrelia  
burgdorferi  sensu  lato  species  in  ticks  collected  from   47  
humans  
 3.1.  Introduction     47  
3.2.  Hypothesis  /  objectives     47  
3.3.  Material  and  methods     47  
3.4.  Results     50  
3.5.  Discussion   54  
3.6.  Conclusions     56  
4.  Study  2  -­  Prospective  study  on  the  transmission  risk  of  
Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  from  Ixodes  ricinus  ticks  to   57  
humans    
4.1.  Introduction   57  
4.2.  Hypothesis  /  objectives   57  
4.3.  Material  and  methods   57  
4.4.  Results   58  
4.5.  Discussion   61  
4.6.  Conclusions   64  

5.  Study  3  -­  Diagnostic  assays  used  for  Borrelia  burgdorferi   65  

sensu  lato  detection  in  ticks  collected  from  humans  
5.1.  Introduction   65  
5.2.  Hypothesis  /  objectives   65  
5.3.  Material  and  methods   65  
5.4.  Results   69  
5.5.  Discussion   72  
5.6.  Conclusions   76  
6.  Study  4  -­  Clinical  manifestations  of  Lyme  Borreliosis  in  
 
Transylvania:  Erythema  migrans    
6.1.  Introduction   77  
4.2.  Hypothesis  /  objectives   77  
6.3.  Material  and  methods   77  
6.4.  Results   78  
6.5.  Discussion   83  
6.6.  Conclusions   86  
7.  Study  5  -­  Clinical  manifestations  of  Lyme  Borreliosis  in  
87  
Transylvania:  Lyme  Neuroborreliosis  
7.1.  Introduction   87  
7.2.  Hypothesis  /  objectives   87  
7.3.  Material  and  methods   87  
7.4.  Results   89  
7.5.  Discussion   97  
7.6.  Conclusions   99  
8.  Study  6  –  Other  clinical  manifestations  of  Lyme  
101  
Borreliosis  in  Transylvania    
8.1.  Introduction   101  
8.2.  Hypothesis  /  objectives   101  
8.3.  Material  and  methods   101  
8.4.  Results   102  
8.5.  Discussion   109  
8.6.  Conclusions   112  
9.  General  discussion   113  
10.  General  conclusions   115  
 11.  The  originality  and  innovative  contributions  of  the  
119  
thesis    
   
REFERENCES   121  
ANNEX  1   141  
ANNEX  2   143  
 
Key  words:  Lyme  Borreliosis,  Ixodes  ricinus,  Borrelia  burgdorferi,  Transylvania,  Real  Time  PCR,  
imunohistochemistry,  cerebrospinal  fluid,  serology,  ELISA,  Western  Blot.  
 
Introduction  
Lyme   Borreliosis   (LB),   a   multisystemic   disorder,   the   most   frequent   tick   borne   disease   in  
Europe   and   North   America,   is   a   zoonosis,   the   etiological   agent   being   transmitted   between   a   large  
variety  of  reservoir  hosts  by  the  hard  ticks  belonging  to  the  Ixodes  ricinus  complex.  The  reservoir  
host  passes  the  pathogen  to  the  vector  tick  that  transmits  it  to  another  reservoir  host  or  to  the  
human,  that  incidentally  enters  the  cycle  of  evolution  and  closes  the  infectious  cycle.  Borrelia  (B.)  
burgdorferi   sensu   lato   complex,   the   etiological   agent   of   the   disease,   is   currently   divided   in   19  
genospecies   with   different   geografical   distribution.   WHO   regional   office   for   Europe   mentiones   in  
2006  „no  data”  for  Romania  regarding  LB  [1].    
The  risk  of  infection  with  B.  burgdorferi  depends  on  the  human  interaction  with  nature.  LB  
prevention   strategies   are   based   on   epidemiological,   ecological   and   phisiopathological   data,  
involving   personal   and   general   protective   measures.   Till   now,   no   study   is   available   in   Romania  
on   the   infection   rate   of   ticks   collected   from   human   patients.   As   different   B.   burgdorferi  
genospecies  appear  to  be  associated  with  different  clinical  pictures,  our  aim  was  to  evaluate  the  
prevalence   and   diversity   of   the   Lyme   disease   spirochetes   in   vector   ticks   collected   from   human  
patients  in  central  Transylvania,  using  modern  molecular  diagnostic  tools.  
LB,   “the   disease   with   1000   faces”,   may   affect   a   large   variety   of   organs   and   the   clinical  
manifestations  and  evolution  may  be  different  from  one  patient  to  another.  Nowadays  there  is  no  
golden   standard   for   diagnostic   and   the   assays   available   have   to   be   combined   to   obtain   the  
highest   sensitivity   and   specificity.   A   positive   serology   can   not   differentiate   between   an   active  
infection  and  the  immunological  hallmark  of  a  previous  symptomatic  or  asymptomatic  infection.  
The   high   prevalence   of   positive   serology   in   the   general   population   in   endemic   areas   raises  
problems   in   interpreting   the   clinical   relevance   of   a   positive   serology   while   the   polymorphic  
clinical  manifestations  complicate  the  differential  diagnosis.  
Due  to  publicity  and  the  general  information  on  LB,  the  number  of  patients  that  present  to  
the   infectious   diseases   department   after   tick   bites   or   with   the   suspicion   of   LB   increased   in   the  
last  years.    
 
Personal  contribution  
Hypothesis  /  objectives  
Prophylaxis   or   treatment   of   LB   can   not   be   evaluated   as   long   as   we   have   no   data   regarding  
the   vector   infection   with   B.   burgdorferi.   Any   new   data   regarding   genospecies   distribution   in  
questing  ticks  or  in  ticks  removed  from  humans  may  provide  new  insights  in  the  complex  ecology  
of  LB.  
The   objectives   of   the   present   thesis   were   to   investigate   different   aspects   of   LB   in   our  
region:  the  vectors  and  the  prevalence  of  infection  with  B.  burgdorferi,  the  local  genospecies,  the  
risk  of  B.  burgdorferi  transmission  from  ticks  to  human  and  the  importance  of  testing  infection  in  
the  detached  tick,  antibiotics  use  and  serological  follow  up  in  LB  prophylaxis.  
Another  objective  of  the  thesis  was  to  describe  the  epidemiological,  clinical  and  serological  
data  of  the  patients  diagnosed  with  LB,  evaluating  the  response  to  treatment  and  the  prognosis.  
Due   to   the   various   clinical   manifestations   and   the   absence   of   specific   symptomatology,   the  
neurological   manifestations   in   LB   may   mimic   other   neurological   diseases.   The   European  
guidelines   recommend   the   diagnosis   of   Lyme   neuroborreliosis   (LNB)   based   on   the   cerebrospinal  
fluid  (CSF)  analysis.  Until  the  present  study  the  former  recommendation  has  not  been  followed  in  
our   clinical   practice,   causing   overdiagnosis   of   LNB   in   patients   with   other   neurological   diseases  
followed  by  lack  of  response  to  antibiotic  therapy.  The  aim  of  our  study  was  to  introduce  the  new  
diagnostic  recommendations  and    to  evaluate  the  response  to  treatment  of  the  patients.  
 Methods  
The   study   was   approved   by   the   Ethics   Committee   of   the   University   of   Medicine   and  
Pharmacy  “Iuliu  Hatieganu”  Cluj-­‐Napoca,  Romania.  Each  patient  was  included  in  the  study  after  
an  informed  consent  and  received  information  on  the  aims  and  protocol  of  the  study.    
Two   questionnaires   were   used   for   patients   monitoring.   The   questionnaire   for   tick   bite  
monitoring   was   completed   for   each   patient   at   the   moment   of   tick   bite,   regarding   occupational  
and   recreational   risk   for   tick   bites,   site   of   tick   attachment,   number   of   ticks   detached,   known  
allergies   to   antibiotics,   pathological   antecedents,   pregnancy   (if   present).   The   questionnaire   for  
LB   monitoring   was   completed   at   different   moments,   depending   on   the   design   of   the   study,  
regarding   profession,   personal   antecedents,   known   tick   bites   or   erythema   migrans,   cutaneous,  
musculoskeletal,  neurological,  cardiac,  ocular  symptoms  and  signs.  
The   serological   tests   for   anti   B.   burgdorferi   antibodies   detection   were   used   at   different  
moments,  depending  on  the  design  of  the  study.  The  ELISA  tests  used  were:  Borrelia  afzelii  IgM  
ELISA,  Borrelia  afzelii  +  VlsE  IgG  ELISA  (Genzyme  Virotech  GmbH,  Germany)  and  IgM,  IgG  anti-­‐
Borrelia  ELISA  (Euroimmun  AG,  Germany)  and  the  Western  Blot  tests  used  were:  IgM,  IgG  Anti-­‐
Borrelia  EUROLINE-­‐RN-­‐AT  (Euroimmun  AG,  Germany).  
 
Study   1   -­   Lyme   Borreliosis   etiology   in   Romania:   Borrelia   burgdorferi   sensu   lato  
species  in  ticks  collected  from  humans.  
Introduction  
The   B.  burgdorferi  sensu  lato  (s.l.)  complex  currently  includes  19  different  genospecies,  10  
of  which  have  been  reported  from   Europe:  B.   burgdorferi   s.s.,  B.   garinii,   B.   afzelii,   B.   valaisiana,   B.  
lusitaniae,  B.  bavariense,  B.  bissettii,  B.  spielmanii,  B.  kurtenbachii  and  B.  finlandensis.   Prevalence  
of   infection   with   B.   burgdorferi   s.l.   in   ticks   collected   from   humans   may   be   different   than   in  
questing  ticks  from  closely  related  geographical  areas.  
Objectives  
The  aims  of  the  study  were  to  determine  which  tick  species  bite  humans  in  Romania  and  
the  prevalence  of  B.  burgdorferi  genospecies  in  these  ticks.  
Material  and  methods  
All   ticks   collected   from   patients   who   presented   to   the   Clinic   of   Infectious   Diseases,   Cluj  
Napoca,   between   01.04.2010-­‐07.09.2010   were   prospectively   studied.   Ticks   were   identified  
regarding   species,   sex   and   developmental   stage.   B.   burgdorferi   genospecies   identification   in  
collected  ticks  used  a  real-­‐time  PCR  assay  targeting  the  hbb  gene  [2].  
Results  
A   total   number   of   532   ticks   were   collected   from   386   human   patients.   The   maximum  
number  of  presentations  was  in  the  month  of  May.  The  majority  (97.3%)  of  the  ticks  examined  
belong  to  the  species   Ixodes  ricinus,  the  vector  of  LB  in  Europe.  Other  tick  species  identified  were  
Dermacentor  marginatus,  Haemaphysalis  concinna  and  Haemaphysalis  punctata;  these  species  do  
not  transmit  LB,  but  are  vectors  for  other  bacterial,  viral  or  parasitic  diseases.  
In   Ixodes   ticks   the   prevalence   of   infection   with   B.   burgdorferi   s.l.   was   11.1%.   A   higher  
prevalence  of  infection  was  found  in  adult  Ixodes  (12.9%)  than  in  Ixodes  nymphs  (10.7%),  but  not  
statistically   significant   (p=0,55).   Based   on   our   results,   our   region   might   be   included   in   the  
European  low  infection  rates  regions.  
Species   identification   revealed   mainly   B.   afzelii   (62.7%),   but   also   B.   garinii   (16.2%),   B.  
burgdorferi   sensu   stricto   (6.9%),   B.   valaisiana   (2,3%),   B.   spielmanii/valaisiana   (9,3%)   and   B.  
lusitaniae  (2.3%).  Hbb  real-­‐time  PCR  was  not  able  to  distinguish  B.  spielmanii  from  B.  valaisiana,  
needing   post   PCR   assays   for   differentiation.   This   was   the   first   report   of   B.   burgdorferi   sensu  
stricto   in   ticks   collected   from   Romania.   All   relevant   human   pathogenic   genospecies   of   B.  
burgdorferi  are  present  in  ticks  from  our  region,  thus  posing  a  risk  of  infection  for  human.  
 
 Study   2   -­   Prospective   study   on   the   transmission   risk   of   Borrelia   burgdorferi   sensu  
lato  from  Ixodes  ricinus  ticks  to  humans  
Introduction  
The   risk   of   developing   LB   after   B.   burgdorferi   infected   tick   bite   and   the   benefit   of  
chemoprophylaxis  in  Romania  is  unknown.  
Objectives  
As   different   B.   burgdorferi   genospecies   are   associated   with   different   clinical  
manifestations   and   not   all   the   genospecies   are   human   pathogenic,   the   aim   of   the   study   was   to  
evaluate   the   clinical   and   serological   outcome   of   patients   bitten   by   Borrelia   infected   ticks   with  
regard  to  different  genospecies  and  the  prophylaxis  followed.  
Material  and  Methods  
All  patients  bitten  by  B.  burgdorferi  positive  ticks  in  hbb  RT-­‐PCR  and  a  control  group  (case-­‐
control   study)   were   asked   for   follow   up   one   year   later   (May-­‐August   2011).   The   control   group  
included   age,   sex   and   residence   (urban/rural)   matched   individuals   bitten   by   B.   burgdorferi  
negative  ticks  and  seronegative  for  B.  burgdorferi  (using  an  ELISA  test)  at  the  moment  of  tick  bite.  
The  questionnaire  was  completed  for  each  individual  at  the  moment  of  tick  bite  and  at  the  follow  
up.  
At   the   moment   of   tick   bite   an   ELISA   assay   was   performed   (to   determine   present   IgM   or  
IgG  B.  burgdorferi  antibodies  due  to  previous  tick  bites)  using   the  Genzyme  Virotech  kit.  At  the  
follow   up   a   two-­‐tiered   test   (TTT)   was   performed   to   determine   IgM   and   IgG   antibodies   anti   B.  
burgdorferi  using  the  Virotech  ELISA  kit  as  screening  followed  by  Euroimmun  Western  Blot  kit  as  
confirmation.  
Results  
The   seroprevalence   for   B.   burgdorferi   infection   was   9.1   %   in   263   persons   tested   at   the  
moment   of   tick   bite,   results   that   confirm   the   high   level   of   seropositivity   in   asymptomatic  
population  in  endemic  area.  20  persons  out  of  the  39  persons  bitten  by  the  B.  burgdorferi  positive  
ticks  and  20  matching  persons  bitten  by  negative  ticks  presented  themselves  for  the  follow  up.  
Two   of   the   investigated   persons   developed   acute   LB   (erythema   migrans)   and   5   persons  
seroconverted  at  the  one  year  follow  up.  No  difference  was  found  regarding  presence  of  clinical  
symptoms  or  seroconversion  between  the  group  bitten  by  B.  burgdorferi  positive  ticks  versus  the  
group   bitten   by   B.   burgdorferi   negative   ticks,   though   both   cases   of   erythema   migrans   (EM)  
occurred  in  the  group  bitten  by  positive  ticks.  B.  afzelii,  the  main  pathogenic  genospecies  in  our  
region,  was  identified  in  ticks  collected  from  persons  with  EM.  The  study  provides  evidence  for  
unexplained   symptoms   in   the   general   population,   that   could   be   interpreted   as   chronic   LB.  
Though  the  small  number  of  patients  investigated  did  not  enable  us  to  assess  the  efficacy  or  the  
failure   of   antimicrobial   prophylaxis   for   the   prevention   of   LB,   both   cases   of   EM   developed   in   spite  
of   chemoprophylaxis   and   patients   without   chemoprophylaxis   did   nor   seroconvert   or   develop  
symptoms   of   LB.   Our   study   did   not   show   a   statistical   significant   relationship   between   the  
infective  status  of  the  tick,  the  serological  follow  up  and  the  clinical  follow  up  of  the  patients.  The  
results   underline   the   lack   of   benefit   for   testing   B.   burgdorferi   in   detached   tick   or   serological  
follow  up  for  predicting  infection  in  humans.  
 
Study  3.  Diagnostic  assays  used  for  Borrelia  burgdorferi  sensu  lato  detection  in  ticks  
collected  from  humans  
Introduction  
Although   there   is   no   golden   standard   for   B.   burgdorferi   detection   in   ticks,   patients   present  
in  our  department  asking  for  the  investigation  of  the  detached  tick,  to  predict  the  transmission  
risk  of  infection.    
Objectives  
The   objective   of   this   study   was   to   compare   3   different   assays   used   for   detection   of   B.  
burgdorferi   in   ticks,   evaluating   their   advantages   or   disadvantages   and   their   role   in   clinical  
practice.  
Material  and  methods  
A   representative   number   of   ticks   collected   from   patients   who   presented   in   the   Clinic   of  
Infectious   Diseases,   Cluj   Napoca,   between   01.04.2010-­‐07.09.2010   have   been   tested   by   3  
diagnostic   assays:   immunohistochemistry   and   two   RT-­‐PCR   assays   (hbb   RT-­‐   PCR   and   ospA   RT-­‐
PCR)  [3,  2,  4].  
Duplex  ospA  RT-­‐PCR  is  an  assay  first  described  in  our  study.  As  we  have  worked  with  ticks  
fixed   in   formalin   and   embedded   in   paraffin,   besides   the   already   described   system   for   the  
detection   of     the   ospA   gene   [3],   the   internal   amplification   control   (IAC)   used   excluded   the  
inhibition  of  the  PCR,  which  could  lead  to  false  negative  results.  For  determining  the  specificity  of  
the   duplex   ospA   RT-­‐PCR,   22   B.   burgdorferi   s.l.   strains   were   tested   for   inclusivity,   while   18  
Leptospira  strains  (including  the  genospecies  interrogans,  borgpetersenii,  kirschneri  and  biflexa),  
Borrelia  miyamotoi  and  Treponema  phagedenis  were  tested  for  exclusivity.  
Results  
 Sensitivity   of   the   duplex   ospA   RT-­‐PCR   was   1-­‐10   copies/PCR,   efficiency   99.85%,   the  
exclusivity   was   100%   and   the   inclusivity   was   86.36   %   (not   detected   B.   lusitaniae   strains   Poti   B2,  
Poti  B3  and  B.  japonica).  
Out  of  136  ticks  tested  by  all  the  three  assays,  16  (11.8  %)  were  found  to  be  positive  by  
immunohistochemistry  (IH),  12  (8.8%)  by  hbb  RT-­‐PCR,  and  26  (19.1%)  by  duplex  ospA  RT-­‐PCR.  
In  all  samples  no  inhibition  was  detected  by  the  IAC  system.  The  86.7%  concordance  of  the  two  
RT-­‐PCR  assays  underlines  the  different  sensitivities  of  PCR  techniques  targeting  different  genes.  
The   p-­‐value   below   the   statistical   significant   value   (p   <   0.0001),   proves   that   the   concordant  
results  of  the  two  molecular  assays  were  not  found  by  chance.  Comparing  the  IH  to  hbb  and  the  
optimized   ospA   RT-­‐PCR,   concordance   was   83.8%   and   76.4%,   respectively.   Comparing   the   results  
of   the   IH   to   ospA   RT-­‐PCR   (p=   0.19)   and   hbb   RT-­‐PCR   (p=0.15),   no   statistical   significance   was  
found.   A   low   sensitivity   of   the   IH   was   found   compared   to   ospA   RT-­‐PCR   and   hbb   RT-­‐PCR   (19.23%  
and   25%   respectively)   but   a   good   specificity   (90%   and   89.5%   respectively).   The   results   of   the  
study  underline  the  discordant  results  of  the  assays  used  for  B.  burgdorferi  detection  in  ticks.  As  
long  as  no  golden  standard  exists,  the  patient’s  benefits  in  testing  B.  burgdorferi  infection  in  the  
detached  tick  are  limited  by  false  positive  or  false  negative  results.  Testing  for  B.  burgdorferi  in  
detached  ticks  to  predict  the  human  risk  of  infection  can  not  be  recommended.  
 
Study   4   -­   Clinical   manifestations   of   Lyme   Borreliosis   in   Transylvania:   Erythema  
migrans  
Introduction  
Erythema   migrans   (EM)   is   the   most   common   and   specific   clinical   manifestation   of   LB.  
Long   time   prognosis   of   patients   treated   for   EM   is   considered   good,   though   not   many   European  
studies  have  addressed  this  question  and  until  now  it  has  not  been  studied  in  Romania.  
Objectives  
In   the   first   study   of   the   thesis   we   have   already   proved   that   ticks   collected   from   humans   in  
our  region  are  infected  with  the  human  pathogenic  genospecies  of  B.  burgdorferi  that  cause  EM.  
The   aim   of   the   present   study   was   to   evaluate   the   epidemiological,   clinical   and   serological   data   of  
patients  with  EM  from  our  region  and  compare  it  with  results  of  similar  studies.  
Material  and  methods  
In   this   prospective   observational   study   we   have   included   patients   who   presented   to   the  
Clinic   of   Infectious   Diseases,   Cluj-­‐Napoca,   Romania,   between   June   2011   and   August   2012,   with  
the   clinical   diagnosis   of   EM.   The   patients   were   treated   as   recommended   by   the   guidelines   [5,  6,   7].  
Clinical   and   serological   outcome   of   the   patients   was   investigated   comparing   two   groups   of  
patients:   patients   with   a   short   observation   period   of   3   months   and   patients   with   a   longer  
observation  (9  months  -­‐  1  year).  The  IgM  and  IgG  serological  profile  was  investigated  at  the  first  
presentation  and  at  the  follow  up.  
Results  
40   patients   with   EM   were   included   in   the   study   and   the   results   are   compared   with   the  
results  of  similar  studies  performed  in  Europe  and  USA.  The  median  diameter  of  the  solitary  EM  
in   our   study   was   smaller   than   in   other   European   or   American   studies,   suggesting   a   good   medical  
education  of  the  population  in  our  region  regarding  LB  and  tick  bites,  as  patients  present  early  in  
the  course  of  the  disease  to  the  Department  of  Infectious  Diseases.  
Five  out  of  the  34  patients  (14.7%)  that  recognized  the  tick  bite,  developed  EM  in  spite  of  
chemoprophylaxis,  showing  that  prophylactic  antibiotics  is  not  entirely  effective  for  LB.  From  the  
study  group,  15  patients  had  a  short  observation  period  (group  A),  while  23  had  a  medium  one  
(group   B).   Two   patients   did   not   return   for   the   follow   up.   Only   one   patient,   with   incomplete  
antibiotic   therapy,   was   diagnosed   at   the   follow-­‐up   with   late   LB   with   musculoskeletal  
manifestations,  but  a  number  of  unspecific  symptoms  with  no  objective  signs  were  described  in  
other   16   patients.   No   statistical   significance   was   found   regarding   response   to   therapy   between  
the   2   groups   (p=1).   The   results   showed   that   the   serological   profile   was   unpredictable   and  
uncorrelated   with   the   clinical   course,   and   sustain   the   recent   recommendation   of   avoiding  
repeated  serologic  testing  for  assessing  therapy  efficacy  in  EM  patients.  
 
Study   5   -­   Clinical   manifestations   of   Lyme   Borreliosis   in   Transylvania:   Lyme  
Neuroborreliosis  
Introduction  
Lyme  neuroborreliosis  (LNB)  may  mimic  any  neurological  disease  and  vice-­‐versa,  patients  
suffering   from   other   neurological   diseases   like   multiple   sclerosis   (MS),   amyotrophic   lateral  
sclerosis  (ALS),  polyneuropathy,  Parkinsonism,  Alzheimer’s  disease  may  be  misdiagnosed  as  LB.  
The  European  diagnostic  criteria,  unlike  the  American  ones,  recommend  the  cerebrospinal  fluid  
(CSF)  analysis  and  intrathecal  antibody  production  detection  [8].  
Objectives  
The   present   study   introduced   for   the   first   time   in   our   clinical   practice   the   European  
diagnostic  recommendations  for  LNB.  
Material  and  methods  
Patients   hospitalised   in   the   Clinic   of   Infectious   Diseases   between   January   2011-­‐   October  
2012  with  the  suspicion  of  LNB  with  central  nervous  system  manifestations  were  included  in  the  
study.   Inclusion   criteria   were:   central   nervous   system   manifestations,   positive   serology   for   B.  
burgdorferi,  lumbar  puncture,  and  no  previous  parenteral  antibiotic  treatment.    
Patients  were  treated  as  LNB  with  CNS  manifestations  [8],  indifferent  of  the  CSF  analysis  
results.   The   symptoms   included   in   the   questionnaire   were   followed   at   admission,   at   the   end   of  
treatment   and   3   month   later,   using   a     scoring   scale.   Two   negative   binominal   mixt   effects  
regression   models   were   used.   The   dependent   variable   was   the   number   of   symptoms   and   the  
symptomatic  score  respectively.  The  time  (corresponding  to  the  observations  made),  measured  
in  weeks,  was  used  as  an  random  variable.  
 The  intrathecal  antibody  index  (IAI)  was  calculated,  using  a  Genzyme  Virotech  kit  in  2011  
and   an   Euroimmun   kit   in   2012.   At   admission   the   TTT   used   for   screening   Genzyme   Virotech  
ELISA   kit   in   2011   and   Euroimmun   ELISA   kit   in   2012,   followed   by   an   Euroimmun   Western   Blot  
kit.  Clinical  and  serological  evaluation  (ELISA)  was  repeated  3  month  after  treatment.    
Results  
According   to   European   guidelines   no   case   fulfilled   the   criteria   for   definite   LNB,   7   cases  
were   possible   LNB   and   in   33   cases   LNB   was   infirmed.   2   cases   could   not   be   classified   due   to  
insufficient  amount  of  CSF.  This  study  brings  evidence  that  LNB  is  over  diagnosed  in  our  patients.  
Though   the   clinical   symptomatology   improved,   a   number   of   symptoms   persisted.   The  
patients   with   infirmed   LNB   presented   more   symptoms   during   the   follow   up   then   those   with  
possible   LNB,   statistically   significant   (p=0,03),   and   a   higher   symptomatic   score,   close   to   the   limit  
of   statistically   significance   (p=0,055).   These   results   show   a   better   evolution   under   antibiotic  
therapy   in   the   group   of   patients   with   possible   LNB   than   in   the   group   of   patients   with   infirmed  
LNB.   No   symptoms   were   described   more   frequent   (statistically   significant)   in   the   group   of  
patients   with   possible   LNB.   All   the   patients   were   evaluated   in   a   multidisciplinary   team.   22  
patients   presented   a   neurological   diagnosis   while   the   rest   of   the   patients   did   not   present   any  
changes   at   the   neurological   assessment,   though   presented   symptomatology.   The   specific   therapy  
was   added   or   followed   the   antibiotic   treatment.   No   association   has   been   proved   between   the  
diagnosis  of  possible/infirmed  LNB  and  demyelinating  lesions  on  the  brain  MRI  (p>0,05).  
Rheumatological   manifestations   were   described   in   9   patients.   The   serological   follow   up  
showed   a   very   diverse   profile   of   antibodies   kinetics.   Adverse   reactions   to   medication   were  
present  in  13  patients  (30.9%),  including  one  Clostridium  difficile  associated  disease.  
Discussion  
Due   to   the   high   prevalence   of   positive   serology   for   B.   burgdorferi   in   the   general  
population,   an   aspect   already   described   in   our   region   (study   2),   the   occurrence   of   neurological  
symptoms   in   these   patients   complicates   the   positive   and   differential   diagnosis.   In   our   study,   a  
patient  from  the  group  with  infirmed  LNB  was  confirmed  as  MS  and  two  patients  as  ALS  during  
the   3   months   follow   up.   None   of   these   patients   presented   any   improvement   after   antibiotic  
therapy.  The  results  confirm  the  statement  of  Puéchal  and  Sibilia  (2009)  [9],  that  persistence  of  
symptomatology   may   be   due   to   an   incorrect   diagnosis   than   to   treatment   failure.   The   study  
represents   the   first   proof   to   stop   the   antibiotics   overuse   in   not   confirmed   LNB   patients   in   our  
region.  
 
Study  6  –  Other  clinical  manifestations  of  Lyme  Borreliosis  in  Transylvania.  
Introduction  
The   investigation,   treatment   and   follow   up   of   the   patients   with   the   suspicion   of   LB   may  
pose  a  challenge  to  the  infectious  diseases  specialist.  No  golden  standard  for  LB  diagnosis  exists.  
Except   EM,   diagnosed   on   clinical   data,   and   LNB   that   has   the   recommendation   of   CSF   analysis,  
other   manifestations   may   be   described,   more   or   less   specific.   An   important   aspect   in   the  
diagnosis  is  represented  by  epidemiological  data  (known  tick  bites  or  EM),  associated  to  clinical  
manifestations  and  positive  serology  for  B.  burgdorferi.  The  serology  has  to  be  interpreted  with  
caution  due  to  known  limits  as  false  positivity.  An  important  aspect  in  the   assessment  of  these  
patients  is  represented  by  the  differential  diagnosis.  
Material  and  methods  
Patients  that  presented  in  the  Clinic  of  Infectious  Diseases  between  January  2011-­‐  October  
2012   with   the   suspicion   of   LB   were   included   in   the   study.   Inclusion   criteria   were:   clinical  
manifestations  of  LB  and  positive  serology  for  B.  burgdorferi.  Exclusion  criteria:  patients  with  EM  
and   patients   with   clinical   suspicion   of   LNB   that   accepted   the   lumbar   puncture  –included   in   the  
previous  studies  -­‐,  or  those  that  did  not  return  for  the  follow  up.  
The  questionnaire  was  completed  at  inclusion,  after  therapy  and  3  months  later.  Patients  
were   divided   in   groups   on   the   probability   of   having   LB   using   a   score   already   published   [10].   At  
inclusion   the   TTT   used   for   screening   in   2011   the   Virotech   ELISA   kit   and   in   2012   the   Euroimmun  
ELISA  kit;  as  confirmation  the  Euroimmun  Western  Blot  kit  was  used.  At  the  3  months  follow  up  
the   ELISA   test   was   repeated.   The   antibiotic   therapy   followed   the   guidelines   recommendations  
depending  on  clinical  manifestations,  age  and  comorbidities.  
Results  
64  patients  were  included  in  the  study.  Out  of  them  57  patients  (89%)  presented  the  TTT  
positive,  the  rest  of  the  7  patients  presenting  ELISA  or  Western  Blot  test  positive.  
LB  was  described  more  frequent  in  patients  from  urban  area,  female  gender  and  the  age  
group  50-­‐64  years  old.  58  patients  (90,6%)  presented  multiple  clinical  manifestations  involving  
different   organ   systems.   Using   the   probability   score,   44   patients   were   classified   as   very   probable  
LB,   18   as   probable   LB   and   2   patients   as   little   probable   LB.   Comparing   these   3   groups   of   patients,  
no   significant   statistical   difference   was   obtained   between   the   number   of   symptoms/  
symptomatic  score  evolution  under  treatment.  Accepting  that  that  lack  of  response  to  treatment  
may   be   caused   by   an   incorrect   diagnosis,   these   results   suggest   that     the   probability   score  
presented  by  Clarissou  et  al.  [10]  does  not  bring  any  benefit  for  LB  diagnosis.  
The   response   to   treatment   was   better   in   the   group   of   patients   that   presented   the   TTT  
positive,  compared  to  the  group  of  patients  that  had  a  negative  one.  Using  the  Western  Blot  test  
as   screening,   or   using   it   in   patients   with   a   negative   ELISA   screening   test,   decreases   the   clinical  
value  of  the  result  and  may  lead  to  a  false  positive  diagnosis,  followed  by  the  lack  of  response  to  
antibiotic   therapy.   Our   results   sustain   the   recommendation   of   testing   for   B.   burgdorferi  
antibodies  by  Western  Blot  only  in  patients  with  a  positive  screening  ELISA  test.    
Following   LB   patients   in   therapeutic   studies   is   difficult,   as   there   may   limits   due   to  
comorbidities.   Out   of   the   64   patients   investigated,   24   presented   a   neurological   diagnosis,   33   a  
rheumatologic   diagnosis,   8   presented   with   thyroid   disorders,   10   with   psychiatric   disorders,   3  
with   cutaneous   disorders,   2   with   positive   serology   for   hepatitis   C   virus,   one   with   positive  
serology  for  hepatitis  B  virus,  2  with  positive  serology  for  Mycoplasma  pneumoniae.  
The   serological   follow   up   3   months   after   therapy   showed   a   very   diverse   profile   of  
antibodies  kinetics,  underlining  the  lack  of  benefit  for  antibodies  follow  up  in  clinical  practice.    
 
General  discussion  
Two   errors   may   be   encountered   by   the   medical   doctors   with   respect   to   LB:  
underdiagnosis  and  overdiagnosis.  It  is  an  error  not  to  think  about  this  disease,  as  long  as  we  live  
in   an   endemic   area,   with   ticks   infected   with   the   main   pathogenic   genospecies   in   our  
neighbourhood,  as  well  as  it  is  an  error  to  ignore  other  diseases  in  patients  with   B.  burgdorferi  
positive   serology.   The   polymorphic   clinical   manifestations   of   LB   is   indeed   well   known,   but  
ignoring  any  other  differential  diagnosis,  as  long  as  the  serology  remains  positive,  may   deprive  
the   patient   of   a   specific   therapy   for   another   curable   disease.   Thus,   in   patients   with   chronic  
objective   complaints,   a   lack   of   response   to   therapy   suggests   above   all   the   possibility   of   initial  
misdiagnosis  and  the  need  for  prompt  reassessment  rather  than  retreatment.  Patients,  wrong  or  
contradictory   informed   by   mass-­‐media,   ask   very   often   for   antibiotic   retreatment,   due   to  
persistence   of   positive   serology   and/or   symptomatology.   The   patient   has   to   be   informed   in   an  
open   dialogue   of   the   risks   of   prolonged   antibiotic   therapy,   not   proved   to   be   efficient   but   possibly  
with  side  effects.  The  public  presentation  of  patients  with  neurological  diseases  like  ALS  or  MS  as  
being  LB  augmented  the  confusion  and  fear  of  patients  that  address  to  our  medical  department.  
As  antibodies  anti  B.  burgdorferi  may  persist  10-­‐20  years  after  infection  and  the  seroprevalence  
in   general   population   is   high,   when   evaluating   these   patients   the   medical   doctors   have   to  
consider  physiological  aging,  stress,  publicity  regarding  LB,  but  most  important  comorbidities.  
 
 
 General  conclusions  
 
1.   The  thesis  presents  the  first  study  on  ticks  collected  from  humans  in  Romania.  
2.   The  majority  of  examined  ticks  (97.3%)  belong  to  Ixodes  genus,  the  vector  of  LB.  
3.   Using   for   diagnosis   a   RT-­‐PCR   targeting   the   hbb   gene   of   B.   burgdorferi,   the  
prevalence  of  infections  with  B.  burgdorferi  in  examined  Ixodes  ticks  was  11.1%.  
4.   Based   on   the   thesis   results,   our   region   may   be   included   in   the   European   regions  
with  a  low  prevalence  of  infection  with  B.  burgdorferi  in  ticks.  
5.   The   study   provides   evidence   that   the   most   relevant   human   pathogenic  
genospecies  of  B.  burgdorferi  s.l.  are  present  in  ticks  from  Romania,  thus  posing  a  risk  of  infection  
to  humans.  
6.     The  seroprevalence  for  B.  burgdorferi  infection  was  9,1%  in  263  patients  tested  
at   the   moment   of   tick   bite,   results   that   confirm   the   high   prevalence   of   seropositivity   in  
asymptomatic  patients  in  endemic  areas.  
7.     Our   study   did   not   show   a   statistical   significant   relationship   between   the  
infective  status  of  the  tick,  the  serological  follow  up  and  the  clinical  follow  up  of  the  patients.  
8.     These   results   sustain   the   lack   of   benefit   for   testing   B.   burgdorferi   in   detached  
tick  or    serological  follow  up  for  predicting  infection  in  humans.    
9.     Benefits  of  chemoprophylaxis  after  tick  bite  could  not  be  proven.  EM  developed  
in   spite   of   chemoprophylaxis   and   patients   without   chemoprophylaxis   did   nor   seroconvert   or  
develop  symptoms  of  LB.  
10. Duplex  ospA  RT-­‐PCR,  a  RT-­‐PCR  assay  described  for  the  first  time  in  the  present  
study,  proved  to  be  an  efficient  method  for  screening  B.  burgdorferi  s.l.,  useful  for  studies  on  large  
number  of  samples.  
11. The   discordant   results   of   immunohistochemistry   and   the   two   RT-­‐PCR   assays  
underline  the  different  results  of  different  assays  used  for  B.  burgdorferi  detection  in  ticks.    
12. As  long  as  no  golden  standard  exists,  the  benefits  for  the  individual  in  testing  the  
detached  tick  are  limited  by  false  positive  and  false  negative  result.  
13. A   single   patient,   with   incomplete   therapy   for   EM,   was   diagnosed   with   late   LB  
with   musculoskeletal   manifestations,   suggesting   a   good   prognosis   of   patients   with   EM   in   our  
region.  
14. None  of  the  investigated  patients  fulfilled  the  criteria  for  definite  LNB  and  only  
16.6%  of  the  cases  were  classified  as  possible  LNB.  
15. This  study  brings  evidence  that  LNB  is  over  diagnosed  in  our  patients.  
16. The   results   represent   the   first   proof   to   stop   the   antibiotics   overuse   in   not  
confirmed  LNB  patients  in  our  region.  
17. The   patient   presenting   with   the   suspicion   of   LB   may   present   multiple   clinical  
manifestations  and  diverse  comorbidities.  
18. The   response   to   treatment   depends   on   a   correct   diagnosis   based   on   a   positive  
two-­‐tiered  test.  
19. No   association   was   proved   between   the   patients’   response   to   treatement   and  
the    different  probability  scores.  
20. Our  results  show  that  the  serological  profile  is  unpredictable  and  uncorrelated  
with  the  clinical  course,  and  sustain  the  recent  recommendation  of  avoiding  repeated  serologic  
testing  for  assessing  therapy  efficacy  in  LB  patients.  
21. Due  to  the  variability  of  antibodies  kinetics  and  their  persistence  after  therapy,  
the  assessment  of  patients  with  LB  in  the  follow-­‐up  rests  primarily  on  the  clinical  picture.  
 
The  originality  and  innovative  contributions  of  the  thesis    
The   original   contribution   of   the   thesis   consists   in   the   multidisciplinary   approach   of   a  
complex   disease,   Lyme   borreliosis,   from   the   entomological,   epidemiological,   clinical   and  
laboratory   perspective.   The   first   survey   on   ticks   collected   from   humans   in   Romania   is   presented,  
evaluating   the   transmission   risk   of   B.   burgdorferi   infection   to   humans.   Based   on   our   results,   a  
local   guideline   was   created   regarding   tick   bites.   Testing   for   B.   burgdorferi   in   the   detached   tick,  
serological  follow  up  and  antibiotic  prophylaxis  are  not  recommended.  The  patients  follow  up  is  
a  clinical  one.  
Along   with   the   project   of   the   thesis,   the   European   diagnostic   criteria   for   LNB   were  
implemented   in   the   clinical   practice.   Apart   from   the   scientific   data,   the   study   has   created   a  
protocol   for   evaluating   patients   that   present   in   our   department   with   the   suspicion   of   LB,  
following   the   diagnostic   and   therapeutic   recommendations   of   the   guidelines,   in   a  
multidisciplinary  team.  
All  the  patients  included  in  the  study  have  been  hospitalised  or  investigated  as  outpatients  
in   the   Clinic   of   Infectious   Diseases,   Cluj   Napoca.   The   morphological   characterisation   of   the  
collected   ticks   has   been   performed   in   the   Department   of   Parasitology  and   Parasitic   Diseases   of  
the  Faculty  of  Veterinary  Medicine,  University  of  Agricultural  Sciences  and  Veterinary  Medicine,  
Cluj   Napoca.   The   immunohistological   diagnosis   of   B.   burgdorferi   infection   in   ticks   has   been  
performed   in   the   Pathology   Laboratory   of   the   Clinic   of   Infectious   Diseases,   Cluj   Napoca.   The  
molecular   diagnostic   assays   have   been   performed   in   the   transnational   mobility   at   the   National  
Reference   Centre   for   Borrelia,   Bavarian   Health   and   Food   Safety   Authority,   Oberschleissheim,  
Germany.  The  serological  diagnostic  of  B.  burgdorferi  infection  has  been  performed  in  the  Clinical  
Laboratory  of  the  Clinic  of  Infectious  Diseases,  Cluj  Napoca.  
The   study   has   been   supported   by   the   project   IDEI-­‐PCCE   CNCSIS   84,   7/2010   “Fundamental  
and   applied   studies   of   eco-­‐epidemiology,   biology   and   molecular   genetics   of   the   Lyme   disease  
vector”  performed  in  collaboration  with  the  Department  of  Parasitology  and  Parasitic  Diseases  of  
the  Faculty  of  Veterinary  Medicine,  University  of  Agricultural  Sciences  and  Veterinary  Medicine,  
Cluj   Napoca   and   by   the   “Iuliu   Haţțieganu”     University   of   Medicine   and   Pharmacy   Cluj   Napoca  
project  co-­‐financed  by  E.S.F  POSDRU  88/1.5/S/56949.  
 
References  
                                                                                                               
1   Lindgren   E,   Jaenson   T.   Lyme   borreliosis   in   Europe:   influences   of   climate   and   climate   change,  

epidemiology,   ecology   and   adaptation   measures.   Copenhagen.   (Denmark):   WHO   Regional   Office   for   Europe.  
2006.  35p,  Report  No.:  EUR/04/5046250.    
2  Ferdin,  J.,  Cerar,  T.,  Strle,  F.,  Ruzić-­‐Sabljić,  E.,  2010.  Evaluation  of  real-­‐time  PCR  targeting  hbb  gene  

for  Borrelia  species  identification.  J.  Microbiol.  Methods.  82(2),  115-­‐9.  

3  Eisendle  K,  Grabner  T,  Zelger  B.  Focus  floating  microscopy:  "gold  standard"  for  cutaneous  

borreliosis?  Am  J  Clin  Pathol.  2007;127(2):213-­‐22.    

4  Ivacic  L,  Reed  K,  Mitchell  P,  Ghebranious  N.  A  LightCycler  TaqMan  assay  for  detection  of  Borrelia  

burgdorferi  sensu  lato  in  clinical  samples.  Diagn  Microbiol  Infect  Dis.  2007;57(2):137-­‐43.  
5  Wormser  GP,  Dattwyler  RJ,  Shapiro  ED,  Halperin  JJ,  Steere  AC,  Klempner  MS,  Krause  PJ,  Bakken  JS,  

Strle   F,   Stanek   G,   Bockenstedt   L,   Fish   D,   Dumler   S,   Nadelman   R:   The   clinical   assessment,   treatment,   and  
prevention  of  Lyme  disease,  human  granulocytic  anaplasmosis,  and  babesiosis:  clinical  practice  guidelines  
by  the  Infectious  Diseases  Society  of  America.  Clin  Infect  Dis  2006;  43:  1089–1134.  
6  Stanek  G,  Wormser  GP,  Gray  J,  Strle  F.  Lyme  borreliosis.  Lancet.  2012;379(9814):461-­‐73  

7  Hansmann  Y.  Treatment  and  prevention  of  Lyme  disease.  Curr  Probl  Dermatol2009;37:111-­‐29  
8   Mygland   A,   Ljøstad   U,   Fingerle   V,   Rupprecht   T,   Schmutzhard   E,   Steiner   I.   EFNS   guidelines   on   the  

diagnosis  and  management  of  European  Lyme  neuroborreliosis.  Eur  J  Neurol.  2010;17(1):8-­‐16  
9  Puéchal  X,  Sibilia  J.  What  should  be  done  in  case  of  persistent  symptoms  after  adequate  antibiotic  

treatment  for  Lyme  disease?  Curr  Probl  Dermatol.  2009;37:191-­‐9.  

10   Clarissou   J,   Song   A,   Bernede   C,   Guillemot   D,   Dinh   A,   Ader   F,   et   al.   Efficacy   of   a   long-­‐term  antibiotic  

treatment   in   patients   with   a   chronic   Tick   Associated   Poly-­‐organic   Syndrome   (TAPOS).   Med   Mal   Infect.  
2009;39(2):108-­‐15.