Sunteți pe pagina 1din 8

Determinarea cantitativă a acetaminofenului şi

acidului ascorbic ı̂n amestec prin spectrometrie


derivată

Acetaminofenul (AAP - N-acetil-p-aminofenol, cunoscut şi ca paracetamol) şi acidul L-ascorbic


(ASA-vitamina C) sunt doi compuşi organici cu activităţi biologice importante. AAP este un antipiretic
şi un analgezic larg utilizat, ı̂n timp ce ASA este o vitamină hidrosolubilă esenţială pentru sănătatea
fiinţei umane iar datorită proprietăţilor sale antioxidante prezintă activitate anticancerigenă.

Figura 1.1 (a): AAP - Paracetamol (M=151,169 g/mol) Acetaminofen, para-acetil-amino-fenol sau 4-
(Acetilamino)fenol; (b): ASA – vitamina C (M = 176,124 g/mol) 2-oxo-L-treo-hexono-1,4-lacton-2,3-enediol
sau (R)-3,4-dihidroxi-5-((S)-1,2-dihidroxietil)furan-2(5H)-ona.

ASA şi AAP se găsesc ı̂mpreună ı̂n preparate farmaceutice administrate ı̂mpotriva durerilor şi febrei şi
sunt comercializate pe piaţa românească sub denumirea de Eferalgan, Coldrex sau Fervex. O modalitate
convenabilă pentru analiza produselor farmaceutice de acest tip, conţinând două sau mai multe substant, e
active, este spectrometria derivată.
Un studiu legat de influenţa pH-ului asupra spectrului de absorbţie al fiecăruia dintre analiţii discutaţi
aici a dus la următoarele concluzii:
- ı̂n mediu alcalin ASA este instabil
- spectrele de absorbţie moleculară atât ale ASA cât şi ale AAP, ı̂nregistrate ı̂n mediu neutru şi acid
rămân neschimbate mai mult de 2 ore şi deci măsurările trebuie efectuate doar ı̂n mediu acid sau neutru.
Ambii analiţi absorb la lungimi de undă mai mici de 300 nm, forma spectrelor depinzând puternic de
pH. Mai mult, benzile de absorbţie ale celor doi compuşi sunt puternic suprapuse. În mediu acid (0,1
M HCl), ASA şi AAP au maximele de absorbţie situate la 230 şi respectiv 240 nm, separarea dintre
acestea fiind astfel doar de 10 nm. Crescând pH-ul soluţiei, maximele de absorbţie ale ambilor analiţi
se deplasează spre lungimi de undă mai mari. Separarea maximă ı̂ntre benzile de absorbţie ale celor doi
analiţi se obţine la pH = 7,00, ı̂n acest caz fiind de ≈ 23 nm. Prin urmare, ı̂n continuare pentru măsurări
s-au utilizat soluţii ı̂n tampon fosfat pH = 7,00.
În figura 1.2 sunt prezentate comparativ spectrele de ordin zero pentru soluţii de AAP 56 µM, ASA 48
µM şi, respectiv, Eferalgan. Chiar şi la pH = 7,00, ales ca fiind optim, există o suprapunere semnificativă
a benzilor de absorbţie ale AAP şi ASA. Astfel, ı̂n acest caz, maximele de absorbţie sunt situate la
243 nm pentru AAP (ε= 100000 L·mol−1 ·cm−1 ) şi, respectiv, la 266 nm pentru ASA (ε = 110080
L·mol−1 ·cm−1 ). De asemenea, benzile de absorbţie ale AAP şi ASA nu se pot diferent, ia ı̂n spectrul de
absorbţie al soluţiei de Eferalgan sau Fervex.

1
Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

Figura 1.2 Spectrele de absorbţie moleculară ı̂n UV ale unor soluţii de: AAP (56 µM); ASA (48 µM); tablete de
Eferalgan (amestec AAP + ASA).

1.1 Spectrometria derivată


Pentru rezolvarea celor două maxime de absorbţie suprapuse se apelează la spectrometria derivată,
care utilizează spectre derivate de diferite ordine. Un spectru derivat este reprezentarea grafică a funcţiei
dA/dλ = f(λ ), unde (dA/dλ ) este derivata absorbanţei ı̂n funcţie de lungimea de undă. În mod
normal, spectrele derivate sunt calculate printr-o metodă matematică implementată ı̂n noua generaţie a
spectro-fotometrelor sau prin programe originale de calcul. Una dintre tehnicile de evaluare a mărimii
semnalului derivat ı̂nregistrat este tehnica de zero-crossing. Ea este aproape mereu utilizată pentru
procesarea datelor, independent de modul de achiziţionare a spectrului derivat.
În figura 1.3 sunt prezentate spectrele derivate de ordin 1 calculate de computerul instrumentului din
spectrele de absorbţie moleculară ale AAP şi ASA prezentate ı̂n figura 1.2. Pentru AAP spectrul derivat
intersectează abscisa ı̂ntre 243 şi 244 nm. La aceste două lungimi de undă absorbanţa derivată are valori
aproape identice dar cu semne opuse. În consecinţă, lungimea de undă de zero-crossing este considerată
a fi la λzero−crossing,AAP = 243 nm. Similar, lungimea de undă de zero-crossing ı̂n spectrul derivat al ASA
este considerată λzero−crossing,ASA = 266 nm.

Figura 1.3 Spectrele derivate de ordin 1 obţinute pentru soluţii de: AAP (56 µM); ASA (48 µM); tablete de
Eferalgan (amestec AAP + ASA).

Deoarece excipienţii folosiţi uzual ı̂n produsele farmaceutice alături de substanţele active nu absorb

Dept. Chimie Analitică 2 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

la lungimi de undă mai mari de 200 nm, valorile semnalelor găsite ı̂n spectrele derivate de ordin 1
ale soluţiilor de Eferalgan la valorile lungimilor de undă de zero-crossing de 243 nm şi 266 mn sunt
adecvate pentru determinarea ASA şi respectiv AAP. În consecinţă se pot ı̂ntocmi drepte de etalonare
lucrând cu soluţii etalon conţinând doar unul dintre cei doi analiţi la un moment dat şi se obţin ecuaţii
de tipul următor:

dA
(266nm) = a2 ·CAAP + b2 (1.1)

dA
(243nm) = a1 ·CASA + b1 (1.2)

dA dA
unde dλ (266nm) şi dλ (243nm) sunt valorile absorbanţei derivate măsurate la 266 nm şi respectiv la
243 nm şi CAAP , CASA sunt concentraţiile de AAP şi ASA, exprimate ı̂n µM.

1.2 Aparatură, materiale şi reactivi


- spectrofotometru dublu-fascicul Jasco (Japonia) Model V-530, celule de cuarţ cu grosimea stratului
absorbant de 1,00 cm
- balant, ă analitică
- pipete gradate, baloane cotate de 25 mL şi de 100 mL
- pâlnie de sticlă, hârtie de filtru
- soluţie tampon fosfat pH = 7,00 (KH2 PO4 + Na2 HPO4 )
- apă distilată, paracetamol si acid ascorbic p.a.
- preparat farmaceutic FERVEX / COLDREX / EFERALGAN.

1.3 Mod de lucru


1.3.1 Prepararea solut, iilor stoc
1. Soluţie stoc AAP – 1 mM - se prepară cântărind la balanta analitica 0,0151 g AAP care se dizolvă
cantitativ ı̂ntr-un balon cotat de 100 mL, prin aducere la semn cu apă distilată.
2. Soluţie stoc ASA – 1 mM - se prepară proaspătă ı̂naintea pregătirii soluţiilor etalon. Se cântăresc
0,0176 g ASA şi se dizolvă cantitativ ı̂ntr-un balon cotat de 100 mL care se aduce la semn cu apă
distilată.

1.3.2 Prepararea soluţiilor de lucru


3. Soluţia martor: se prepară prin diluarea de 10 ori cu apă distilată a unui volum corespunzător de
soluţie tampon fosfat pH = 7,00 (KH2 PO4 + Na2 HPO4 )
4. Soluţiile etalon: ı̂n baloane cotate de Vbc1 = 25 mL ı̂n care s-au pipetat deja 2,5 mL soluţie tampon
fosfat pH = 7,00 se adaugă următoarele volume de solut, ie stoc: Vstoc,i = 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; 2,4 şi 2,8
mL, de concetrat, ie Cstoc = 1 mM de AAP şi respectiv ASA.
Valorile concentatiilor solutiilor etalon se calculeaza folosind legea echivalentilor:

Vstoc,i (mL)
Cetalon,i (µM) = Cstoc (µM) (1.3)
Vbc1 (mL)

si se trec in tabelul 1.1.

Dept. Chimie Analitică 3 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

1.3.3 Prepararea soluţiei de probă


Se cântăreşte conţinutul unui pliculeţ de FERVEX / COLDREX / EFERALGAN” şi se notează masa

sa, m1 . Alternativ, m1 se poate considera masa declarată de producător, ı̂nscrisă pe pliculet, . Se notează,
de asemenea, s, i cantităt, ile de substant, a activă declarate de producător, care vor fi considerate mase
teoretice.
În această lucrare s-a analizat preparatul FERVEX pentru care producătorul declară: m1 = 13,1 g s, i
cont, inut de substant, e active: mAAP,t = 500 mg, mASA,t = 200 mg .
5. Se cântăreşte la balant, a analitică ≈1 g de probă s, i se notează masa exactă luată spre analiză, ı̂n
cazul nostru m2 = 1,0034 g .
6. Proba cântărită se trece cantitativ ı̂ntr-un balon cotat cu volum Vbc2 = 100 mL , ce se aduce la semn
cu apă distilată. Din această solut, ie se filtrează un volum de ≈ 10mL (a se vedea figura 1.4).

Figura 1.4 Solut, ia de probă obt, inută s, i filtrarea acesteia pentru eliminarea component, ilor insolubili (excipient, i).

7. Din solut, ia finală de la punctul 6. se iau două probe alicote de V p1 = 0,8 mL şi respectiv V p2 = 1
mL, care se adaugă fiecare ı̂ntr-un balon cotat de Vbc3 = 25 mL, ı̂n care anterior s-au adăugat şi 2,5 mL
tampon fosfat pH = 7,00. Cele două baloane cotate conţinând probele de analizat se aduc la semn cu
apă distilată.

1.3.4 Înregistrarea spectrelor


8. Se setează la spectrometrul UV-VIZ dublu-fascicul următorii parametri: mod de măsurare -
achizit, ie spectre, interval de lungimi de undă: 230 - 300 nm, rezolut, ie spectrală: 1 nm, viteză de
ı̂nregistrare: 400 nm/min, fereastră spectrală: 2 nm.
9. Se aduce la zero spectrometrul folosind două cuve de cuart, umplute cu solut, ie martor (solut, ia
preparată la punctul 3.).
10. Se inregistrează spectrele de absorbt, ie pentru toate solut, iile etalon de AAP s, i ASA preparate la
punctul 4.1 .
11. Se ı̂nregistreaza spectrele de absorbt, ie pentru solut, iile de probă preparate la punctul 7.

1 Pentrusolut, iile etalon de AAP, spectrele se ı̂nregistrează după maxim 30 minute de la prepararea acestora, pentru soluţiile
etalon de ASA, spectrele se ı̂nregistrează imediat după prepararea fiecărei soluţii.

Dept. Chimie Analitică 4 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

Figura 1.5 Spectrele de ordinul zero s, i unu ale solut, iilor etalon de paracetamol.

Figura 1.6 Spectrele de ordinul zero s, i unu ale solut, iilor etalon de acid ascorbic.

Dept. Chimie Analitică 5 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

Figura 1.7 Curbele de calibrare obt, inute din spectrele derivate ale solut, iilor etalon prezentate ı̂n figurile 1.5 s, i 1.6.

1.4 Prelucrarea rezultatelor


12. Toate spectrele (de ordinul zero) ı̂nregistrate pentru solutiile etalon se derivează ı̂n raport cu
lungimea de undă folosind programul Spectra Analysis al spectrometrului Jasco. În acest scop, se ı̂ncarca
fiecare spectru, se selectează din menu [Processing] → [Operation] → [Derivatives]. În fereastra care
se deschide se selectează [Order] = [1st order] s, i [Interval] = [2] s, i apoi se apasă Apply si OK. Spectrele
de ordinul zero s, i unu obt, inute sunt prezentate ı̂n figurile 1.5 s, i 1.6.
13. Din spectrele derivate ale solut, iilor etalon se extrag valorile de derivată a absorbant, ei ı̂n funct, ie
de lungimea de undă, la valorile λ = 266nm, 243nm s, i se trec apoi ı̂n tabelul 1.1.
14. Cu valorile obt, inute la punctul 13. s, i valorile corespunzatoare de concentrat, ie ale solut, iilor etalon
se trasează curbele de etalonare pentru ambii compus, i. Curbele de etalonare obt, inute sunt prezentate ı̂n
figura 1.7 iar ecuat, iile dreptelor de regresie liniară corespunzătoare acestora sunt:

dA
(266nm) = −0, 0002747 ·CAAP + 0, 0016681 R2 = 0, 99892 (1.4)

dA
(243nm) = 0, 0003066 ·CASA + 0, 0002614 R2 = 0, 99955 (1.5)

15. Spectrele solut, iilor de probă se procesează folosind aceeas, i succesiune de operat, ii de la punctul
12. aceleas, i operat, ii de la punctul 12. Din spectrele derivate de ordinul unu ale acestora, prezentate in
figura 1.8, se preiau valorile de absorbant, a derivată de la λ = 266 nm si 243 nm s, i se trec ı̂n tabelul 1.1,
pe ultimele două râduri.
dA dA
Nr. crt. Vstoc (mL) ASA sau AAP Cstd (µM) dλ (266nm) - AAP dλ (243nm) - ASA
1 0,4 16 -0,003270 0,004950
2 0,8 32 -0,006877 0,010300
3 1,2 48 -0,011210 0,015100
4 1,6 64 -0,015661 0,020000
5 2,0 80 -0,020221 0,024390
6 2,4 96 -0,024837 0,029820
7 2,8 112 -0,029315 0,034625
Proba 1 V p1 =0,8 mL - -0,021095 0,009855
Proba 2 V p2 =1,0 mL - -0,025555 0,010940
Tabela 1.1 Rezultate obţinute le determinarea AAP şi ASA prin spectrometrie derivată.

Dept. Chimie Analitică 6 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

Figura 1.8 Spectrele de ordinul zero s, i cele de ordinul unu ale solut, iilor de probă de Fervex.

1.4.1 Calcularea regăsirii pentru AAP


16. Pe baza ecuat, iei de regresie liniară 1.4 a curbei de etalonare pentru AAP, se calculează concentrat, ia
AAP din solut, iile de probă de Fervex interpolând valorile de absorbant, a derivată măsurate la λ = 266
nm. Pentru exemplificare, calculele sunt prezentate pentru proba 1, V p1 =0,8mL:

− 0, 021095 = −0, 0002747 ·CAAP + 0, 0016681 (1.6)


−0, 021095 − 0, 0016681 −0, 0227631
CAAP = = = 82, 865µM (1.7)
−0, 0002747 −0, 0002747
Folosind legea echivalent, ilor, se calculează concentrat, ia solut, iei de probă din balonul cotat de Vbc2 =100
mL, ı̂nainte de diluare:

0 CAAP ·Vbc3 82, 865µM · 25mL


CAAP = = = 2589, 24µM = 2, 58924mM (1.8)
Vp1 0, 8mL

Masa de AAP din balonul cotat de 100 mL, ı̂n care s-a dizolvat cantitatea de probă m2 , este:
0
mAAP = CAAP ·Vbc2 · MAAP = 2, 58924mM · 0, 100L · 151, 169g/mol = 39, 145mg (1.9)

Masa totală de AAP determinată practic, ce corespunde ı̂ntregii cantităt, i de preparat dintr-un plic de
Fervex va fi:
m1 13, 1g
mAAP,total = mAAP = 39, 145mg = 511, 073mg (1.10)
m2 1, 0034g

Dept. Chimie Analitică 7 Universitatea din Bucureşti


Metode spectrometice de analiză Determiarea AAP s, i ASA ı̂n amestec prin spectrometrie derivată

Pe baza cantităt, ii totale de AAP determinată practic s, i a cantităt, ii de AAP declarate de producător, se
calculează regăsirea:
mp mAAP,total 511, 073mg
RAAP % = 100 = 100 = 100 = 102, 214% (1.11)
mt mAAP,t 500mg

1.4.2 Calcularea regăsirii pentru ASA


16. Pe baza ecuat, iei de regresie liniară 1.5 a curbei de etalonare pentru ASA, se calculează concentrat, ia
ASA din solut, iile de probă de Fervex interpolând valorile de absorbant, a derivată măsurate la λ = 243
nm. Pentru exemplificare, calculele sunt prezentate tot pentru proba 1, V p1 =0,8mL:

0, 009855 = 0, 0003066 ·CAAP + 0, 0002614 (1.12)


0, 009855 − 0, 0002614
CASA = = 31, 290µM (1.13)
0, 0003066
Folosind legea echivalent, ilor, se calculează concentrat, ia solut, iei de probă din balonul cotat de Vbc2 =100
mL, ı̂nainte de diluare:

0 CASA ·Vbc3 31, 290µM · 25mL


CASA = = = 977, 821µM (1.14)
Vp1 0, 8mL

Masa de ASA din balonul cotat de 100 mL, ı̂n care s-a dizolvat cantitatea de probă m2 , este:
0
mASA = CAAP ·Vbc2 · MASA = 977, 821µM · 0, 100L · 176, 124g/mol = 17, 222mg (1.15)

Masa totală de ASA determinată practic, ce corespunde ı̂ntregii cantităt, i de preparat dintr-un plic de
Fervex va fi:
m1 13, 1g
mASA,total = mASA = 17, 222mg = 224, 84mg (1.16)
m2 1, 0034g
Pe baza cantităt, ii totale de ASA determinată practic s, i a cantităt, ii de AAP declarate de producător, se
calculează regăsirea:
mp mASA,total 224, 84mg
RAAP % = 100 = 100 = 100 = 112, 42% (1.17)
mt mASA,t 200mg

Dept. Chimie Analitică 8 Universitatea din Bucureşti