• Examinarile bacteriologice urmaresc

evidentierea si identificarea bacteriilor din

Studiul morfologiei bacteriene produse patologice.

Coloratia simpla • Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o
Coloratia Gram
etapa foarte importanta.

• Bacteriile avind dimensiuni de

ordinul µm, nu pot fi vazute cu
ochiul liber, de aceea examinarea
lor se efectueaza cu ajutorul
microscopului.

1
 Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a
studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

• Examenul microscopic se executa fie:

– direct din produsele patologice (examen
microscopic direct),
– din culturi pure.
• Preparatele microscopice sint de 2 feluri:
– preparat nativ, cu germeni vii
– frotiu sau preparat colorat, cu germeni omoriti

2

• Examenul microscopic da indicatii asupra
prezentei microorganismelor in preparat si
asupra proprietatilor morfotinctoriale:
– forma (bacili, coci, spirili)
– marimea
– mobilitatea ( in preparatul nativ )
– existenta eventuala a formatiunilor
neobligatorii ( cili, capsula, spori)
• asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-,
tetrade, etc)
• proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
Examenul microscopic direct din produsele
patologice permit in unele infectii stabilirea
diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos,
stafilococ ) si constituie o etapa esentiala
in identificarea bacteriana.
Preparatul nativ ( cu germeni vii )
• Ex. microscopic al preparatului nativ
– examinarea directa intre lama si lamela a unei
suspensii de germeni vii
intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu
de cultura lichid, precum si a produsului
patologic (singe, sediment urinar, lcr).
3

Preparatul nativ
• Examinarea prep. nativ
– are implicatii restrinse
– nu da informatii asupra tuturor
proprietatilor morfologice ale bacteriilor,
– este obligatorie completarea lui cu
examinarea preparatului colorat.
Timpii de executie a preparatului
colorat
• Timpi pregatitori:
– etalarea = intinderea frotiului
– uscarea
– fixarea ( procedee fizice - prin incalzire si
chimice: cu alcool metilic, etilic, alcool -eter,
acid acetic )
Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)
• Proprietatile morfotinctoriale ale
bacteriilor pot fi studiate mai detailat
pe preparate fixate si colorate, cu
germeni omoriti . Mai rar se folosesc
coloratii vitale, spre ex. in reactia de
umflare a capsulei .
Fixarea
• Scopul fixarii este multiplu:
– microorganismele sint omorite=preparat
neinfectios
– preparatul adera mai bine de lama
– prin omorirea microorganismelor se mareste
permeabilitatea peretelui celular si se produc
modificari ale citoplasmei, care cresc
afinitatea fata de coloranti = detalii fine de
strucura
4
 Coloratia
• Definitie:
– Procedeu fizico-chimic complex, in care colorantii se
combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la
microscop.
– Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeaza
in continutul celular , unde are loc formarea unei
combinatii stabile.
– Colorarea se executa de obicei prin acoperirea
suprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa sa
actioneze un timp limitat, la cald sau la rece.
Coloratia simpla
• - frotiul fixat
• - se acopera complet cu un singur
colorant: albastru de metilen sau fuxina,
timp de 1-2 min.
• se spala cu apa si se usuca
• in coloratia cu albastru de metilen toate
elementele se coloreaza in albastru
• in coloratia cu fuxina, toate elementele se
coloreaza in rosu
Tipuri de coloratii
• Coloratia simpla
– se executa cu un singur colorant
• Coloratia combinata
– se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a
mai multor coloranti, fiecare colorant actionind
independent si fixindu-se pe anumite elemente
• - coloratii speciale:
– pentru formatiuni morfologice celulare si
extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula
Coloratia simpla
• Permite stabilirea unor proprietati
morfotinctoriale ca:
– forma si marimea microorganismelor, precum
si existenta unor elemente celulare
• Este utila in diagnosticul prin ex.
microscopic direct din produsul patologic
in
– gonoree, meningita cerebrospinala epidemica
etc
5
 Hans Christian Gram (medic
Coloratii combinate: coloratia Gram
danez)
• Larg utilizata in microbiologie,
pentru ca deosebeste germenii
gram pozitivi de cei gram negativi,
orientind cercetarea in directia
identificarii lor.

Coloratia Gram
Tehnica de colorare
• Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2
min. (Se spală cu apă de la robinet ).
• Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2
min. (Se spală cu apă).
• Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu
se mai dizolva colorant. (Se spală cu apă).
• Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se
spala cu apa )
• Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

6
• Germenii gram +
– rezista la decolorare si isi mentin
culoarea violet initiala;
• Germenii gram –
– se decoloreaza si se recoloreaza in rosu
cu fuxina/safranina.

Coloratia Gram Principiul coloratiei Gram

• Diferenta de comportament in
coloratia Gram se explica prin
structura si compozitia chimica
diferita a peretelui celular la
bacteriile gram+ si gram -.

7
 Christian Gram recognized two different types of bacteria based on
reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea

urmatoarelor grupe de bacterii:
• coci gram + : • Bacili gram - :
– streptococi, stafilococi, pneumococi
– E. Coli ( bacilul coli ), Klebsiella,
• coci gram - :
Pseudomonas ( bacilul piocianic),
– meningococ, gonococ
Salmonella typhi ( bacilul tific )
• bacili gram + :
– bacillus antracis ( bacilul carbunos), corynebacterium • Cococbacili gram - :
diphteriae ( bacilul difteric), listeria monocitogenes,
clostridium botulinum ( bacilul botulinic), clostridium
– Haemophilus influenzae, Bordetella
tetani ( bacilul tetanic) pertusis, brucela

8
Coci Gram +, dispusi in gramezi Coci Gram+, dispusi in lanturi

Bacili Gram - Bacili Gram +

9
 Coci Gram +

Cocobacili Gram + Coci Gram + si Cocobacili Gram +

10
Frotiu lcr colorat Gram

Trusa comerciala pt coloratia Gram

11
12