Sunteți pe pagina 1din 6

Curs 4

Transferul de gene în celula eucariotă

Primele încercări privind transformarea genetică la organismele superioare


au fost efectuate în Franța de către J. Benoit și P. Leroy și C. Vendrely în 1959. Ei
au extras ADN din testicule și eritrocite de la masculi din rasa de rațe Khaki
Campbell și l-au introdus intraperitoneal la bobocii de rață din rasa Pekin. Rațele
Pekin supuse acestui tratament au prezentat modificări morfologice, mai ales
privind culoarea penajului, a ciocului, a picioarelor, mărimea taliei,
comportamentului, etc.
Experiențele de transformare au fost reluat la diferite specii de eucariote, la
animale s-a reușit transformarea în culturi de celule. Celule de hamster chinezesc s-
au tratat cu ADN extras din ascita tumorală Ehrlich, au dobândit caracteristici
specifice celulelor tumorale.
S-a reușit să se transfere gene de la E.coli la celule umane în cultură, adică
de la un procariot la o celulă eucariotă. S-a folosit în acest scop o cultură de
fibroblaste umane provenite de la un bolnav de galactozemie, care nu putea folosi
galactoza datorită unui blocaj genetic al enzimei galactozo-1-fosfat-uridil-
transferaza. Gena ce intervine în sinteza acestei enzime a fost transferată cu
ajutorulul unei sușe a fagului lambda de la bacteria E. Coli. Acest fag are
capacitatea de a prelua anumite gene de la bacteria gazdă și de a le transfera noilor
celule gazdă, adică poate realiza transducția specializată.
Fenomenul de transformare a fost evidențiat la Drosophila melanogaster,
Bombyx mori (fluturele de mătase), iar la plante Arabidopsis thaliana, la orz și la
petunii.
De exemplu, la Petunia hibrida, s-a reușit transformarea cu ajutorul ADN-
ului folosind ca gene marker, genele implicate în sinteza antocianului și cele care
intervin în tipul frunzei.
Transferul de gene la eucariotele superioare

În anul 1907 E.F. Smith a descoperit că bacteria Agrobacterium


tumenfacies determină formarea unor tumori cancerigene la plante. Au fost
identificate specii din 93 de famili de plante dicotiledonate care pot forma astfel de
tumori. Printre speciile mai cunoscute se pot aminti: mărul, piersicul, vița de vie,
zmeurul, coacăzul negru, etc.
G.M. Morel și colab. la I.N.R.A-Versailles, au descoperit că celule tumorale
sintetizează o clasă nouă de compuși chimici numită opine, care nu se găsesc în
celulele normale ale plantelor (octopină, nopalină). S-a constatat că o anumită sușă
bacterină este capabilă să crească pe un mediu cu octopină sau nopalină, dar nu pe
ambele.
Plasmida Ti( Tumor inducing) determină ca celula vegetală să sintetizeze o
substanță care nu-i este utilă, dar pe care bacteria (inclusiv plasmida) poate
prolifera. Cu ajutorul unor endonucleaze care secționează plasmida în numeroase
segmente s-a constatat că numia un segment de ADN al plasmidei este transferat în
celule tumorale (ADN-T).
Plasmida Ti descoperită la Agrobacterium tumefacies cauzează tumori la
plante prin transferul unui segment de ADN din plasmida în celule vegetale.
Un alt tip de plasmidă ce poate fi folosită este numită Ri (root inducing),
provine de la bacteria A. Rhizogenes, ce cauzează o proliferare a rădăcinilor.
Plasmidele Ti și Ri sunt singurele plasmide care pot fi folosite cu succes ca
vectori la plantele superioare, pentru transferul de gene.
Biotehnologia culturilor de celule și țesuturi vegetale „in vitro” și
implicațiile sale

Pe baza conceptului de totipotență celulară, conform căruia fiecare celulă


conține informația genetică necesară pentru obținerea unui organism vegetal
complet, s-a reușit la cartof și la alte specii regenerarea de plante pornind de la
celule izolate, cultivate „in vitro” pe medii suplimentare cu fitohormoni.
Cercetările s-au amplificat, astfel s-a reușit elaborarea unor metodologii
eficiente pentru micropropagarea plantelor, pentru obținerea de plante libere de
virusuri prin cultură de meristeme, pentru obținera de protoplaști prin tratamente
enzimatice, pentru cultură de antere, polen, ovule, ovare, în scopul obținerii de
haploizi, pentru hibridarea somatică în vederea obținerii de hibrizi celulari, pentru
obținerea de culturi de celule în suspensie etc.
Progresele în domeniul culturii de celule „in vitro” a dus la elaborarea unor
biotehnologii moderne care sunt aplicate în programele de ameliorarea a plantelor.

Tehnologia de cultură „in vitro” a celulelor și țesuturilor vegetale

Cultura de celule și țesuturi vegetale „in vitro” se face în condiții de


sterilitate, similar cu tehnica de cultură a microorganismelor. Se folosesc medii de
cultură specializate capabile să inducă regenerarea plantelor.
Mediul de cultură conține componente esențiale: apă, săruri organice, o
sursă de carbon, vitamine, fitohormoni și componente opționale: azot organic,
acizi organici, extracte de diferite origini.
Apa –pentru prepararea mediilor este bine să se utilizeze apă distilată sau
deionizată.
Sărurile minerale – mediul trebuie să conțină macroelemente , neceasare
plantei întregi: azot, fosfor, sulf, potasiu, magneziu, calciu, sodiu, clor și
microelemente indisensabile: fier, brom, zinc, mangan, acestora li se adaugă
nichel, iod, aluminiu cu scopul de a ameliora creșterea „in vitro”.
Carbonul organic – țesuturile cultivate „in vitro” nu sunt total autotrofe
pentru carbon. Sursa de carbon este zaharoza sau glucoza. Zaharoza se folosește în
concentrație de 2-3%. Cele mai multe medii conțin mio-inositol care în cantitate de
100 mg/l, ameliorează creșterea celulelor.
Vitaminele – pentru creștere, celulele plantelor cultivate „in vitro” au nevoie
de tiamină. O ameliorarea a creșterii poate fi obținută prin adăugarea în mediu a
acidului nicotinic și piridoxinei. Unele medii mai conțin pantotenat de calciu,
biotina. Necesarul de vitamine depinde de natura țesutului cultivat.
Fitohormonii – hormonii sunt substanțe naturale produse de plante, fie
substanțe de sinteză cu efect similar. Aceste substanțe stimulează diviziunile
celulare și provoacă formarea de noi muguri în cadrul noilor țesuturi, sau asigură
dezvoltarea mugurilor neoformați. Principalii reglatori de creștere folosiți pentru
culturile „in vitro” sunt: auxinele, citochinele și giberelinele. Ei acționează în
echilibru unii cu ceilalți, induc efecte variabile în funcție de concentrațiile utilizate,
în doze mari devin inhibitori sau chiar toxici.
Auxinele cea naturală este acidul indolil-acetic (AIA), iar ca auxine
sintetice: acid 2-4 diclorfenoxiacetic ( 2,4 D), acidul naftil acetic (ANA), acidul
naftoxiacetic (ANO). Ele favorizează formarea de calus, organogeneză.
Citochininele pot fi compuși endogeni: zeatina, isopentoniladenina etc., sau
substanțe de sinteză: benziladenina (BA), kinetina, etc. Adăugate în mediul de
cultură stimulează metabolismul și diviziunea celulară, diferențierea mugurilor.
Componentele opținale
Azotul organic – pot fi folosiți aminoacizii (glutamina, asparagina) și
adenina.
Acizi organici – celulele plantelor nu pot utiliza acizi organici ca unică
sursă de carbon. Nu se știe exact dacă acizii organici sunt factori care limitează
creșterea.
Substanțele complexe - au fost testate o serie de extracte: de drojdie, malț,
din plante(din endosperm de nuci de cocos sau porumb, suc de portocale sau
tomate).

1. Pregătirea mediului de cultură


Soluțiile stoc - se prepară prin dizolvarea substantelor chimice în apă
distilată, se păstrează în sticle închise la întuneric la 5 oC. Se adaugă zaharoză,
cantitățile corespunzătoare din soluțiile - stoc și se aduce la volumul necesar cu
apă distilată. Se ajustează pH-ul mediului (5,5-5,8 )cu hidroxid de sodiu 0,1N, se
adaugă agarul (8-10 g/l). Se sterilizează la 121o C timp de 15-25 minute.
Repartizarea în vasele de cultură se face într-o cameră sterilă.
Au fost elaborate numerose medii de cultură, alegerea mediului depinde de
specia cu care se experimentează și de scopul cercetării cel mai folosit pentru
cultura celulelor vegetale este mediul( MS- Murashige-Skoog), mai ales pentru
morfogeneză, culturi de meristeme și regenerarea plantelor. Acest mediu are o
concentrație ridicată de săruri.
Mediul de inducere a calusului conține o concentrație mare de auxină și o
concentrație mică de citochinină.
Pentru obținerea plantelor calusul se trece pe mediul de regenerare în care
componenta de bază sunt fitohormonii. Dintre aceștia citochininele induc formarea
lăstarilor la speciile care au capacitate de organogeneză, pentru înrădăcinarea
lăstarilor se adaugă în mediu o auxină (ANA, AIA, AIB).

2 . Explantul
Explantul sau fragmentul de țesut vegetal ce urmează a fi cultivat „in vitro”
este prelevat de la planta mamă. Rezultate bune dau vârfurile de creștere,
embrionii, mugurii, nodurile și în cazul folosirii unor segmente de tulpină,
rădăcină, frunză, floare sau de fruct.
Se pot cultiva antere, polen, ovare, ovule și celule.
Explantele cultivate „in vitro” pot fi clasate în două categorii:
 dintr-o primă categorie fac parte explantele ce conțin celule
nediferențiate, al căror ritm de funcționare este de tip vegetativ, conduce
la formarea tulpinilor. Este cazul celulelor meristematice, (meristemele
radiculare nu sunt utilizate);
 a doua categorie sunt explantele constituite din țesuturi diferențiate, ale
căror celule sunt specializate.
Alegerea explantului reprezintă una dintre condițiile esențială ale reușitei
unei culturi „in vitro”.
Totipotența celulară, adică capacitatea oricărei celule vegetale de a
reproduce integral planta din care provine este cu atât mai eficientă cu cât plantele-
mamă sunt mai tinere.