Sunteți pe pagina 1din 6

Curs 6

Inducerea și selecția mutațiilor în culturi „in vitro” de celule vegetale

Elaborarea unor metode eficente pentru cultura de celule și țesuturi vegetale


a făcut posibilă dezvoltarea cercetărilor privind genetica celulelor somatice,
folosirea de celule vegetale „in vitro” pentru producerea artificială de mutațiii și
selecția lor în diferite scopuri. Din acest punct de vedere cultura de celule vegetale
se comportă similar ca o cultură de microorganisme.
Utilizarea tehnicilor ”in vitro” prezintă următoarele avantaje:
 face posibilă aplicarea cu ușurință a tratamentelor cu agenți mutageni asupra
unui număr foarte mare de celule;
 oferă posibilitatea de a supune celulele tratate unor procedee de selecție în
condiții de mediu controlate;
 permite izolarea rapidă a unor mutante recesive de condițiile cultivarii unor
celule haploide. Mutațiile sunt considerate „reale” numai dacă din liniile
celulare selecționate pot fi regenerate plante capabile să transmită la
descendenți caracterul mutant.
Materialul care trebuie tratat cu agenți mutageni poate fi reprezentat de
populații omogene de celule vegetale, de calus, de plante sau organe de plante de la
care se prelevează materialul pentru cultura „in vitro” precum și de antere,
grăuncior de polen sau embrioizi, în care se găsesc celule haploide.
Mutațiile naturale sau induse artificial sunt în general de trei tipuri:
 mutante auxotrofe care necesită pentru creșterea lor „in vitro”
suplimentarea mediului de cultură cu diferite componente chimice, pe care
celulele nu le pot sintetiza singure, cum sunt diferiți aminoacizi și baze
azotate purinice sau pirimidinice, diverși fitohormoni, etc.;
 mutante autotrofe care sunt capabile să trăiască în medii deficiente în
diverse componente chimice, pe care ele le pot sintetiza singure. Tipul
normal „sălbatic„ nu poate sintetiza aceste componente și de aceea ele
trebuie să intre în compoziția chimică mediului de cultură;
 mutante rezistente la diferite substanțe chimice (sau) ca și la diverse
condiții nefavorabile de mediu. Au fost selecționate mutante rezistente la
diferite antibiotice, pesticide, toxine, produse de ciuperci, derivați ai
bazelor azotate purinice și pirimidinice, etc.

Agenți mutageni

Creștera variabilității genetice poate fi indusă prin expunerea plantelor


înainte de prelevarea unor explante la acțiunea unor agenți mutageni fizici sau
chimici.
Agenții fizici folosiți pot fi: radiațiile electromagnetice (razele ultraviolete,
X, gamma) sau corpusculare (electroni, neutroni, particule alpha si beta).
Frecvența mutațiilor depinde de cantitatea de radiații, care trebuie
determinată cu precizie și de condițiile de temperatură, lumină, oxigenare,
umiditate, înainte, în timpul și după tratament.
Dozele pentru iradiere se aleg pe baza unor experiențe anterioare pentru
determinarea radiosensibilității materialului.
S-au obținut rezultate bune în iradierea plantelor haploide de tutun cu 1500-
2500 rad, la Petunia hybrida cu 500-3000rad, demonstrând că celulele haploide
sunt mai sensibile decât cele diploide.
Agenții mutageni chimici utilizați pentru creșterea frecvenței mutațiilor sunt:
etil sau metilmetansulfonatul care aparțin grupei agenților alkilanți, 5-
bromodeoxiuridina și 5-bromuracilul analogi ai bazelor azotate, precum și compuși
nitroși cum sunt: N-metil, N-etil--nitrosourcea, etc.
Agenți mutageni chimici se pot folosi în diverse concentrații, adăugându-se
după o sterilizare prealabilă, în mediul de cultură al celulelor sau țesuturilor
vegetale. După expirarea timpului de tratament mediul de cultură suplimentat cu
agenți mutagenii chimici este înlocuit cu mediu de cultură proaspăt și fără agenți
mutageni.
Selecția mutantelor este realizată prin cultivarea celulelor tratate în condițiii
speciale: concentrații ridicate de metaboliți, absența unor nutrienți existenți sau
hormoni, prezența unor agenți stresanți, etc.

Realizări în inducerea și selecția mutațiilor în culturi celulare „in vitro”

La Nicotina tabacum au fost izolate mutante auxotrofe care necesită


suplimentarea mediului de cultură cu biotină, arginină, lizină, prolină, etc.
Prin tratarea cu mutageni a unor suspensii de celule haploide de Datura
innoxia s-au izolat mutante auxotrofe pentru pantotenat sau adenină. La Zea mays
s-au izolat mutante auxotrofe pentru prolină.
Mutante autotrofe, au fost izolate la speciile de Acer pseudoplatanus și
Daucus carota, mutante care își sintetizează singure auxinele necesare plantelor
respective.
Mutante clorofiliene s-au obținut atât pe baza unor fenomene mutagene
naturale cât și prin inducerea lor experimentală.
Mutante de tip albino, la care calea metabolică a clorofilei este complet
blocată, s-au obținut la tutun, morcov, cartof, tomate, porumb, lucernă, etc.
Mutante rezistente s-au obținut la Nicotina tabacum celule din care au
regenerat plante rezistente la streptomicină, carcateristică transmisă pe linie
maternă fapt care indică existența unei mutații citoplasmatice. S-au obținut mutante
rezistente și la alte antibiotice, cum sunt kanamicina, neomicina, etc.
Au fost obținute linii celulare ce mainifestă o producție mărită de
aminoacizi, fapt care poate prezenta importanță practică. De exemplu la porumb, a
fost izolată o linie celulară cu o capacitate ridicată de sinteză a aminoacizilor
metionină, lizină, treonină și izoleucină.
Realizări asemănătoare au fost obținute la orez, orz, morcov, tutun, cartof,
etc.

Erbicide și pesticide

Un interes deosebit prezintă și selecția unor linii celulare și plante rezistente


sau tolerante față de erbicide, mai ales față de produsele biodegradabile care
nelăsând reziduuri active în sol și nefiind toxice pentru om și fauna sălbatică sunt
nepoluante.
Au fost regenerate din celule selecționate pe baza capacității de creștere pe
medii ce conțin erbicide, plante rezistente la concentrații relativ mari de picloram,
atrazin, 2,4 D anitrol care, în mod normal sunt inhibitoare.
Toxine – numeroși fungi și diferite bacterii sunt patogene pentru că secretă
toxine care sunt letale pentru celulele plantelor. Cea mai recentă tehnică utilizată în
vederea creării unor plante rezistente la diverse maladii implică selecția în culturi
de celule și țesuturi.
Această nouă tehnică este folosită pentru obținerea unor plante rezistente la
bolile determinate de toxinele microorganismelor patogene.
S-au obținut plante de tutun rezistente la atacul bacteriei Pseudomonas
tabaci, de cartof rezistente la Phytophtora infestans și Fusarium oxisporum.
Toate aceste plante au fost regenerate din linii celulare care au supraviețuit
în prezența toxinelor extrase de la respectivii agenți patogeni, toxine incluse în
mediile de cultură „in vitro”.
Cultura de celule vegetale în suspensii și producerea de linii celulare

Cultura de celule în suspensie devine o alternativă la cultura plantelor, în


special pentru producerea unor substanțe valoroase necesare în industria
farmaceutică , alimentară și chimică.
Suspensiile celulare sunt culturi de celule în mediu lichid, își dublează
numărul la fiecare 24-72 ore, fiind formate din celule mai mult sau mai puțin egale
ca mărime, care nu mai au capacitatea de a regenera plante, se înmulțesc rapid în
condițiile unui nivel crescut de CO2.
Pentru cultura de celule vegetale în suspensie au fost create aparate automate
cu diferite denumiri (agitatoare, bioreactoare, chemostate, fitostate, etc.) care
urmăresc realizarea unor condiții optime de mediu nutritiv, lumină, temperatură,
pH, aerisire, agitare, etc.
Pentru realizarea de culturi celulare în suspensie, eficiente din punct de
vedere economic, este necesară cultivarea unor linii celulare de mare productivitate
și stabile genetic,
Prin această metodă este ușor de tratat cu agenți mutageni fizici sau chimic,
un număr mare de celule în condiții perfect standardizate.
Prin selecția mutațiilor naturale sau artificiale s-au putut obține linii celulare
care manifestă o sinteză intensificată de aminoacizi. De exemplu la orez (Oryza
sativa) s-au obținut linii celulare care au capacitatea de a acumula o cantiate dublă
de lizină liberă, precum și de a sintetiza proteine cu un conținut ridicat de lizină, un
aminoacid cu mare valoare alimentară.
Această biotehnologie modernă are mari implicații aplicative în industria
farmaceutică, alimentară și chimică.
Pe această cale vor fi produși metaboliți mai scumpi care în mod normal,
sunt sintetizați în cantități foarte mici de către plante.
Liniile celulare selecționate vor putea produce „in vitro” o multitudine de
substanțe necesare pentru fabricarea unor medicamente, în alimentația umană și
pentru furajarea animalelor, în industria chimică, etc.