Sunteți pe pagina 1din 6

Curs 7

Protoplastele și hibridarea somatică

Hibridarea între celule vegetale a devenit posibilă numai după elaborarea


unor metode eficente de obținere a unor celule lipsite de perete celular, care au fost
numite protoplaste.
În periada anilor 1960 s-a elaborat metoda enzimatică de producere a
protoplastelor, se bazează pe folosirea de enzime care digeră peretele rigid al
celulelor vegetale.
Metoda a fost elaborată de către Cocking în Anglia (1960), de către Otsuki și
Takabe (1969) în Japonia.
Protoplastele pot fi izolate din mezofilul frunzelor, țesuturi epidermale,
petale, rădăcini și nodozități ale rădăcinilor, grăuncioare de polen în curs de
germinare, fructe și din țesuturi cultivate „in vitro”.
Materialul cel mai folosit sunt frunzele de la care se ia epiderma inferioară
prin jupuire sau prin tratament enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot
obține circa un milion de protoplaste.
Protoplastele se obțin prin tratarea țesuturilor în condiții aseptice cu un
amestec de enzime capabile să degradeze peretele celular în soluții care conțin
stabilizatori osmotici necesari pentru a păstra structura și viabilitatea
protoplastelor. Pentru izolarea protoplastelor se folosesc trei categorii de enzime:
celulaze, pectinaze și hemicelulaze.
Tratamentul cu enzime se realizeză timp de 4-18 ore la 25-27 oC, după care
protoplastele sunt colectate prin centrifugare și spălate cu grijă pentru eliminarea
enzimelor.
La unele specii protoplastele regenerează în 2-3 zile peretele celular și
concomitent intră în diviziune. În circa 3 săptămâni se formează o colonie celulară
din care derivă un calus. Din acesta pot regenera plante mature în 4-6 luni.
De la multe specii au fost regenerate plante din calusul provenit din protoplaste.
Printre speciile la care au fost regenerate plante din protoplaste putem aminti:
Nicotina, Solanum, tomatele, morcovul, rapița, porumbul, orezul, etc.
Protoplastele pot fi folosite pentru fuzionare și hibridare somatică, pentru
transformarea cu ADN exogen, pentru transferul de cromozomi, nuclee și diverse
organite celulare, pentru studiul virozelor vegetale, pentru elucidarea modului de
acțiune al agenților patogeni bacterieni și fungici, etc.
Hibridarea celulară realizată prin fuzionarea protoplastelor este o alternativă
la hibridarea sexuată, are importanță deosebită în ameliorarea plantelor.
Primul hibrid somatic a fost obținut în 1972 de către Carlson și colab. prin
fuzionarea între protoplastele de la două specii de tutun: Nicotina glauca (2n=24)
și N.langsdorfii (2n=18) prin folosirea nitratului de sodiu ca agent inductor.
Protoplastele celor două specii nu regenerau calus în mediul folosit, în timp ce
hibridul dă naștere la calus.
Din 33 calusuri izolate ei au obținut trei plante amfiploide (2n=42) care
înglobau cromozomii celor două specii.
S-au obținut fuzionări celulare între specii destul de îndepăratate filogenetic,
cum este orzul și soia.
În ameliorarea plantelor se pot folosi atât amfidiploizii rezultați din
fuzionarea genomurilor celor două specii, cât și celulele hibride la care s-a realizat
transferul unui mic segment cromozomial pe care se găsesc anumite gene, cum
sunt cele care determină rezistență la anumite boli. Se încearcă realizarea de hibrizi
somatici între porumb și sorg sau între orz și secară. Se urmărește transferul
rezistenței la boli și la ger de la secară la orz. La grâu se urmărește transferul unui
mic segment cromozomial de la speciile sălbatice înrudite, pe care se găsesc gene
pentru rezistență la boli.
Când hibridarea sexuată între speciile respective este imposibilă, se va putea
realiza hibridarea somatică.
Hibridarea somatică va putea fi folosită și pentru încrucișarea unor specii ce
se înmulțesc vegetativ, cum este cartoful. Se vor putea produce cartofi tetraploizi
din linii diploide.
Melchers și colab. (1978), în Olanda, au fuzionat protoplaste din mezofilul
unei mutante de culoare galbenă de la tomate (Lycopersicon esculentum) cu
protoplaste din culturi celulare de cartof (Solanum tuberosum).
Plantele rezultate aveau tuberculi ușor îngroșați,flori filiforme și frunze
diferite atât de la tomate, cât și de cartof.
Metoda hibridării somatice prin fuzionarea protoplastelor este un mijloc
pentru hibridarea între specii îndepărtate filogenetic, incapabile cu hibridarea pe
cale sexuată.
Această metodă permite obținerea unor hibrizi interspecifici cu importanță în
programele de ameliorare a plantelor.

Transferul de material genetic în protoplaste

Elaborarea unor metode eficente de obținere a unor cantități mari de


protoplaste a făcut posibilă folosirea acestora în vederea unor manipulări genetice
la plante.
Includerea în protoplaste a unor microorganisme, virusuri, organite, se poate
realiza pe trei căi:
 prin endocitoză;
 prin fuzionarea membranelor;
 cu ajutorul lipozomilor.
Prin endocitoză au putut fi incluse în protoplaste, virusuri, bacterii, alge
albastre-verzi, protoplaste de drojdii, cloroplaste.
Lipozomii sunt vezicule artificiale de fosfolipide care pot include diverse
materiale, inclusiv ADN, pe care-l pot transfera în protoplaste sau în celulele
animale, prin fuzionarea acestor tipuri de celule.
De exemplu plasmide bacteriene au putut fi incluse în lipozomi și transferate
astfel în protoplaste.
Organitele celulare de tipul cloroplastelor și mitocondriilor care au genom
propriu sunt folosite pentru a fi transferate în protoplaste.
În genomul organitelor pot fi incluse gene străine și în felul acesta ele
servesc ca vectori pentru materialul genetic exogen.
Protoplastele constituie un sistem biologic ideal pentru transferul de virusuri,
care se pot replica în celula gazdă.
Pe baza posibilității includerii unor virusuri în protoplaste se caută folosirea
lor ca vectori pentru transferul de gene în celula vegetală.
Virusurile plantelor de tip ADN care pot fi folosite ca vectori în ingineria
genetică sunt de două tipuri: caulino virusuri în care sunt grupate cele cu ADN
dublu catenar cum este virusul mozaicului conopidei și germinivirusuri care
posedă ADN monocatenar și la care forma replicativă (RF) poate fi utilizată pentru
includerea unor gene străine.
S-au reușit să se transfere două tipuri de plasmide (pBB313 și Col.El.) de la
E. Coli și plasmida pCR1 de la Agrobacterium tumefaciens în protoplaste de
morcov, ridichie, măzăriche. În plasmide pot fi incluse gene străine, care pot fi
transferate în celula vegetală.
Plasmidele Ti și Ri pot fi folosite ca vectori pentru transferul de gene în
celula vegetală de către unele bacterii.
Variabilitatea genetică în cultura de celule „in vitro”

În cultura de celule și țesuturi vegetale este generată o mare variabilitate


genetică. Aceste modificări genetice sunt trasmise la plantele regenerate și la
descendenții lor, putând fi utilizate în programele de ameliorare a plantelor și
pentru crearea de linii celulare cultivate în suspensie.
O cale de a genera variații somaclonale este regenerarea de plante din
cultură de calus. Includerea în cultura „in vitro” a unei faze de calus mărește
frecvența somaclonelor.
Cercetările au arătat că din calus regenerează în majoritate plante care
prezintă o mare variabilitate acumulată în cursul creșterii celulelor diferențiate.
Regenerarea de plante din cultura de protoplaste dă posibilitatea obțineriii
unei mari variații somaclonale.
Din plantele regenerate din protoplaste s-au izolat numeroase variații
somaclonale, ce afectează numeroase caractere morfologice, fiziologice și
biochimice ale plantelor și care prezintă importanță în programele de ameliorare.
O altă cale de inducere a variațiilor somaclonale este cultura „in vitro” a
unui tip de țesut. Variațiile somaclonale pot apărea prin cultura orcărui tip de țesut,
însă frecvența lor este extrem de variată.
S-a studiat la Solanum tuberosum posibilitatea măririi frecvenței variațiilor
somaclonale prin folosirea explantelor de origini diferite. În cazxul explantelor de
frunze, variațiile somaclonale ce afectează fenotipul plantelor regenerate reprezintă
12% în timp ce exaplantele din calus și pețiol produc calusuri din care regenerează
plante cu o frecvență de 50%.
Utilizarea hibrizilor interspecifici ca sursă de explante mărește frecvența
variațiilor somoclonale, dă posibilitatea realizării unor genotipuri noi, realizate prin
transfer de gene.
Printre factorii care influențează frecvența variațiilor somaclonale pot fi:
mediul de cultură și în special hormonii, utilizarea unor medii selective cu diverse
toxine sau cu diferite substanțe mutagene precum și tratamente cu radiații
ionizante.
Prin utilizarea unor culturi succesive pe medii selective, se poate mări treptat
rezistența la unele maladii ale plantelor.