MICROBIOLOGIA ŞI

DIAGNOSTICUL DE
LABORATOR AL
INFECŢIILOR ANAEROBE
Particularităţi ale bacteriilor anaerobe:
 Oxigenul este toxic (lipsa superoxid
dismutazei/catalazei, peroxidazei)
 Cresc în lipsa oxigenului/potenţial
redox scăzut
 Energia este obţinută prin
fermentare
 Hipoxii tisulare (ateroscleroză,
necroză, tumoare malignă, corp
străin...)
 Tratament prelungit cu aminozide
 Stări de imunosupresie sau
imunodepresie
A. Bacterii telurice (sporogene)
Prezente în sol, supravieţuesc graţie sporilor
termorezistenţi
Familia Bacillaceae
Genul Clostridium
Specii:
 C. perfringens, C.septicum, C.novyi
(oedematiens), C.histolyticum – agenţii
gangrenei gazoase
 C.tetani – agentul tetanosului
 C.botulinum – agentul botulismului
 C.difficile – agentul colitei
pseudomembranoase
 Sunt bacterii Gram-pozitivi, de dimensiuni mari,
aşezaţi în perechi sau lanţuri, mobili cu cili
peritrichi (excepţie C.perfringens sau
C. butyricum)

 Multe dintre specii sintetizează exotoxine.

În cele ce urmează vom discuta despre speciile
care produc tetanosul, botulismul şi gangrena
gazoasă.
B. Bacterii anaerobe nesporogene (flora Veillon)
Reprezintă flora comensală şi saprofită a omului
(floră endogenă).
 Coci gram+ (Peptococcus, Peptostreptococcus)
 Coci gram- (Veillonella)
 Bastonaşe gram+ (Eubacterium, Actinomyces,
Bifidobacterium, Propionibacterium,
Lactobacillus)
 Bastonaşe gram- (Fusobacterium, Bacteroides)
 Spirochete
Condiţionat patogene, pot cauza infecţii supurative,
septicemii la persoane cu rezistenţa scăzută sau
în asociaţii cu alte mi/organisme
Agenţii cauzali:

 C.perfringens (serotipuri A, B, C, D, E)
 C.novyi (oedematiens)
 C.septicum
 C.histolyticum
 Sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, de
dimensiuni mari 1µm / 6-10µm.
 C. perfringens este încapsulat şi imobil;
celelalte specii menţionate includ bacili care în
forma vegetativă sunt mobili, cu cili peritrichi.
În condiţii de anaerobioză formează spori mai
mari decât diametrul bacililor, localizaţi central
sau terminal.
 Se pot multiplica pe medii simple, în
condiţii de anaerobioză.
 C. perfringens creşte mai repede (în
câteva ore) la 45°C, formând colonii de
tip S sau R. Pe geloză sânge produce
hemoliză.
 Celelalte clostridii formează colonii mai
întinse, cu aspect de „grenadă
explodată” (datorită mobilităţii).
 Toţi aceşti germeni elaborează enzime cu
caracter de toxine care prezintă histotropism şi
pot distruge orice tip de ţesut, cu producere de
gaz.
 Exemple de astfel de toxine sunt: lecitinaza,
care acţionează asupra lecitinei din ţesutul
nervos, diferite proteaze, hialuronidaze,
colagenaze etc.
 Singura structură care are numai un caracter
enzimatic este a-toxina (lecitinazaC).
 Pe geloză glucozată cu gălbenuş de ou,
tulpinile producătoare de a-toxină descompun
lecitina şi conduc la opacifierea mediului.
 Formele vegetative sunt distruse de menţinerea
timp de 15-20 minute la 55-60°C şi de acţiunea
dezinfectantelor uzuale.
 Sporii rezistă la temperatura de 100°C, fiind
distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm. timp
de 30 de minute, precum şi la pupinel, timp de
1 oră la 180°C.
 În mediu, pe sol, sporii rezistă timp îndelungat.
Bacilii genului Clostridium au
 antigene somatice,
 antigene capsulare de tip K(la C.perfringens),
 antigene flagelare de tip H (la C. novyi,
C. septicum, C. histolyticum şi C. sporogenes)
 antigene solubile, reprezentate de exotoxine.
Spre exemplu, C. perfringens poate elabora
mai multe tipuri de toxine.
 Toxina α (lecitinaza) – mionecroză, hemoliză,
trombocitoliză, dereglări de coagulare, creşterea
permeabilităţii vasculare, inactivarea ATPazei
musculare, hipotensiune, bradicardie, şoc
 Toxina θ (teta) – necrozantă, hemolitică
 Toxina β – necroza epiteliului intestinal
 Enterotoxina – perturbă transportul apei, ionilor şi a
glucozei prin membrana enterocitelor
ENZIME DE PATOGENITATE – colagenaza (toxina
κ - kappa), proteinaza (toxina λ - lambda), elastaza,
hialuronidaza (toxina µ), ADN-aza (toxina ν), etc.

CAPSULA – rol antifagocitar

 Clostridiile gangrenei gazoase sunt
patogene prin multiplicare, invazivitate şi
toxinogeneză.
 Germenii se multiplică la poarta de intrare.
Au proprietăţi invazive, înaintând din
aproape în aproape, prin distrugerea
ţesuturilor (efecte necrolitice, hemolitice şi
letale).
 Enzimele produse contribuie la invazivitate
şi alterarea gravă a stării generale.
 Infecţia cu aceşti germeni determină
gangrena gazoasă, caracterizată prin edeme
dure, crepitante (cu apariţia de gaz, în urma
fermentării zaharurilor), necroză şi gangrenă.
 Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin
contaminarea unor leziuni (traume).
 În condiţii de anaerobioză sporii germinează,
formele vegetative se multiplică, în cursul
metabolismului fermentează zaharuri şi apare
gaz.
 Distensia tisulară, obstruarea mecanică a
structurilor vasculare (scade aportul sanguin) în
asociere cu sinteza de toxine cu efect
necrotizant şi sinteza de hialuronidază,
favorizează diseminarea infecţiei.
 Necroza tisulară se extinde, multiplicarea
bacteriană se amplifică, apare anemie
hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80% din
cazuri) către deces.
 De regulă gangrena gazoasă apare printr-o
infecţie concomitentă cu 2 sau mai multe dintre
speciile clostridiene menţionate.
1. Gangrena gazoasă (post-traumatică, post-
operatorie)
2. Mionecroze
3. Celulite, fasciite
4. Septicemii
5. Toxiinfecţii alimentare
6. Enterita necrozantă
Porţi de intrare – tegumentul sau mucoasele
lezate
Omul se contaminează:
Exogen - bacteria sau sporul pătrunde în plaga
contaminată cu sol, apă, praf (accidente rutiere,
de muncă, etc.) – gangrena gazoasă post-
traumatică; gangrena gazoasă uterină
(urmare a avortului septic)
Endogen – flora internă a bolnavului
contaminează plaga (chirurgie septică viscerală,
chirurgia ortopedică, etc) - gangrena gazoasă
post-operatorie
Gangrena spontană – in cancer intestinal
Condiţii suplimentare pentru apariţia
infecţiei:
 Traumatisme cu necroză tisulară, hematom,
corpuri străine
 Penetrare profundă a germenului
 Potenţial rH2 scăzut (- 0,5 V)
 Multiplicarea bacteriilor aerobe asociate
(enterobacterii, enterococi, stafilococi)
 Imunitate deficitară (radioterapie,
imunosupresori, antibioticoterapie
neadecvată, etc)
 Injecţia substanţelor vasoconstrictive
Se face pe baza aspectelor clinice şi a
istoricului bolii.
Diagnosticul poate fi bacteriologic
cu recoltarea şi transportul produsului
patologic (ţesuturi devitalizate, puroi), care
trebuie examinat microscopic, cultivat şi
coloniile izolate în condiţii de strictă
anaerobioză trebuie identificate.
Prelevate: puroi, sânge, lichid seros, bioptate
Precauţii la prelevare: excluderea
contactului cu aerul, transportare imediată
sau utilizarea mediilor de transport lipsite de
oxigen.
 Privind diagnosticul bacteriologic în infecţiile
produse de microorganismele din
genul Clostridium, facem următoarele precizări.
 1. Etapa de recoltare şi transport a
p.p. este esenţială; trebuie menţinute condiţiile
de anaerobioză .
 2. Din punct de vedere macroscopic am putea
menţiona mirosul fetid al p.p., prezenţa
unor fragmente de ţesut necrotic, a unor secreţii
de culoare închisă, existenţa de sânge şi puroi în
plagă etc.
Examenul microscopic are rol orientativ. Pentru
majoritatea laboratoarelor este unica activitate
care poate fi realizată atunci când agentul
etiologic este un microorganism anaerob. În
rezumat, examenul microscopic direct trebuie să
fie realizat, iar observaţiile se vor interpreta în
context.
 C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 mm /
1,5-19 mm şi poate prezenta un spor oval
localizat subterminal sau central.
 Examenul microscopic poate permite în acelaşi
timp un control al calităţii p.p. (evidenţiind
prezenţa celulelor inflamatorii şi a
celulelor lezate) şi ar putea servi la alegerea
terapiei antimicrobiene (de ex. „disocierea” între
ceea ce vedem la examenul microscopic şi lipsa
apariţiei culturii, ne permite să alegem pentru
tratamentul „de primă intenţie” medicamente cu
eficacitate asupra acestor microorganisme).
Examenul bacteriologic – condiţii anaerobe
(anaerostat, gaz-pachete, medii
anaerobe), metode clasice (Zeissler,
Weinberg)

Important: bacterii aerobe sau facultative

asociate

Tehnici de amplificare genică

Diagnostic rapid – Mediul Kitt-Tarrozzi,

mediul cu lapte, mediul Wilson-Blair
 Tratamentul trebuie instituit de urgenţă şi
include în primul rând:
 toaleta chirurgicală a plăgii (debridări
extinse, eliminarea ţesuturilor devitalizate)
 administrarea de penicilină
 administrare de oxigen hiperbar precum
 administrarea serului antitoxic polivalent
(anti-C.perfringens, C.novyi, C.septicum)
Profilaxia – prelucrarea minuţioasă a plăgilor,
eliminarea corpurilor străine şi a ţesuturilor
necrotice, seroterapie preventivă,
antibioterapie, supravegherea bolnavilor.
 Tetanosul este produs de C. tetani patogen prin
multiplicare la poarta de intrare şi toxinogeneză
(produce o exotoxină neurotropă).
 Tetanosul a fost cunoscut încă de pe vremea
lui Hipocrate, sau chiar şi înainte de menţiunile
făcute de acesta.
 Etiologia tetanosului a reprezentat un mister
până în anul 1884 (anul vizualizării la
microscop a C.tetani).
 în anul 1889 au fost obţinute primele culturi
de C. tetani.
Agentul cauzal – C.tetani
Caractere morfotinctoriale – bastonaş mobil,
cu flageli peritrichi, sporogen. Sporul rotund
este plasat terminal (bastonaş de tobă).
Gram+. Inert biochimic.
Rezistenţa – forma vegetativă este sensibilă,
sporul supravieţuieşte în sol decenii.
Toxina tetanică
 Tetanolizina – hemoliză
 Tetanospasmina – contracturi ai muşchilor
striaţi.
Compusă din 2 fragmente proteice: fragmentul
A (toxic, neimunogen) şi fragmentul B
(atoxic, imunogen)
C. tetani este o bacterie ne-invazivă,
multiplicându-se la poarta de intrare şi
elaborând toxina, care difuzează în
organism.
 Mecanismul de acţiune al toxinei:
 Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către
glicină şi acidul aminobutiric.
 Toxina blochează eliberarea acestor mediatori ceea
ce determină excitarea neuronilor motori spinali, cu
apariţia de spasme severe şi dureroase ale
musculaturii striate (paralizie spastică).
 Toxina poate ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin
propagare pe cale axonală de la poarta de intrare
sau pe cale sangvină.
 Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale
musculaturii din zona contaminată, apoi ale
muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura
nu se mai poate deschide) şi facies de tip risus
sardonicus (spasme ale musculaturii faciale).
 Orice stimul extern precipită un atac de tetanos.
Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea
este de circa 50%.
 Prezintă antigene flagelare de tip H,
 de perete (antigenul somatic O) şi
 o exotoxină cu structură proteică.
 Toţi bacilii tetanici elaborează un singur tip de toxină,
sub control plasmidic.
Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
 Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp
de 15-20 minute la temperaturi de 55-60°C şi de
substanţe dezinfectante.
 Sporii rezistă la temperatura de 100°C, dar sunt
distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm, timp de 30
de minute şi la pupinel timp de 1 oră la 180°C.
Habitat – sol, intestinul omului, animalelor

Porţi de intrare – tegumentul, mucoasele lezate

(plăgi, arsuri, mucoasa uterină post-partum,
intervenţii chirurgicale, ulcere varicoase, focare
dentare, droguri intravenoase, etc.), cordonul
ombilical la nou-născuţi.
Incubaţia – 6-15 zile (3 zile-3 săptămâni)
Semne clinice – trismus (contractură
dureroasă a muşchilor masticatori),
facies sardonicus (contracţii ale muşchilor
feţei), anxietate, contracturi generalizate cu
paroxisme spontane sau declanşate de
stimuli externi (zgomot, lumină, etc), poziţia
corpului în formă de arc (opistotonus),
dereglări de vorbire. Febra lipseşte.
Diagnosticul este clinic, epidemiologic şi bacteriologic.
Se recoltează produsul patologic de la nivelul plăgii
(puroi) şi se realizează frotiuri care se colorează cu
albastru de metil sau prin coloraţia Gram.
Antibiograma nu este necesară; C. tetani este
sensibil la penicilină.
 Examenul microscopic (de orientare)
 Examenul bacteriologic (tardiv, de confirmare)
 Examenul biologic (depistarea toxinei prin infectarea
şoriceilor cu apariţia semnelor clinice ale maladiei
peste 24-48 ore), identificarea toxinei prin RN cu
anti-seruri
 Examenul serologic – dozarea antitoxinelor pentru
studierea imunităţii populaţiei (RP, RLA, RHAI,
ELISA)
Tratament:
 Ser imun antitetanic (gamma-globulină
specifică) intramuscular, intravenos
 Anatoxină tetanică
 Tratament simptomatic (sedative, miorelaxante,
antibioterapie, respiraţie asistată, etc)

Profilaxie:
 Imunizarea activă cu anatoxină tetanică
(conform calendarului vaccinării – ADTP, ADT,
AT)
 În caz de plagă: prelucrarea corectă, anatoxină,
ser imun antitoxic
 Botulismul apare de obicei prin ingestia de
alimente care conţin toxina produsă de
C. botulinum, fiind o toxiinfecţie alimentară de tip
toxic (toxină preformată în aliment).
 Cu toate că informaţii privind o boală cu
manifestări care puteau fi determinate de infecţia
cu C. botulinum au fost descrise şi înainte, despre
botulism se discută în mod clar începând cu anul
1817, în Germania, după ce 71 de persoane (din
174) au decedat datorită asfixiei, după ce au
consumat cârnaţi incomplet preparaţi termic („în
sânge”). În urma acestei izbucniri epidemice s-a
stabilit numele de botulinum (botulus = cârnat).
 Agentul cauzal – C.botulinum
Caractere morfotinctoriale – bastonaş mobil,
sporogen, Gram+. Sporul este ovoid,
subterminal (aspect de rachetă de tenis),
termorezistent, in prezenţa oxigenului
sporulează,
distrus la 120°C – 15 minute (autoclavare).
Scindează proteinele şi glucidele cu formare de
gaze şi acizi (acetic, butiric, lactic, etc).
Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză
şi formează colonii rotunde, netede, de tip S,
înconjurate de o zonă pufoasă.
 Factori de patogenitate
C. botulinum nu se multiplică în organism.
Se multiplică în alimente şi produce o exotoxină (dacă
este lizogenizat), care este distrusă prin fierbere la
100ºC, timp de 20 minute.
Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de
alimente care conţin toxina, putând fi considerat o
toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxina este
preformată în aliment).
Spre exemplu, unele conserve produse în gospodăria
proprie, în finalul prelucrării pot asigura condiţii de
anaerobioză, iar sporii care au contaminat respectivul
produs trec în formă vegetativă şi produc toxină
(conservele al căror capac „bombează” pot semnifica
multiplicarea şi producerea de gaz datorită unui
microorganism; nu trebuie consumate).
 Toxina botulinică serotipuri A,B,C,D,E,F,G. Este
de natură proteică, antigenică, specifică de tip,
transformabilă în anatoxină.
 Stabilă în mediu acid şi la acţiunea enzimelor
digestive. Poate fi distrusă prin încălzire 15 min la
80°C sau 10 min la 100°C.
 Toxina botulinică este cea mai puternică otravă
cunoscută; doza letală pentru om este de 1-2 mg.
 În prima formă de botulism (toxiinfectia alimentara),
după ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la
nivel intestinal, ajunge în circulaţie, iar pe această
cale la nivelul plăcilor neuromotorii (faţă de care are
afinitate).
 Aici împiedică eliberarea de acetilcolină,
determinând o paralizie flască. Paralizia începe la
extremitatea cefalică (de exemplu, paralizia
muşchilor globilor oculari, care apare la 18-24 ore
de la ingestie şi se manifestă prin diplopie-vedere
dublă sau paralizie bulbară, (manifestată prin
imposibilitate de înghiţire şi de vorbire) şi este
descendentă, ajungând până la paralizia
musculaturii respiratorii.
 Moartea poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei
muşchilor respiratori).
 Bolnavul rămâne conştient până aproape de exitus.
 Rata mortalităţii în această formă de botulism este
mare.
 Habitat mixt – sol, ape şi flora comensală a omului
şi animalelor
Transmiterea:
– Alimentar (alimente conservate în conditii casnice:
cârnaţi, şuncă, jambon, peşte sărat sau afumat,
conserve de fructe şi legume)
Condiţii favorabile toxigenezei:
-Salinitate insuficientă (mai mică de 10 %)
-Temperatura peste 16°C - anaerobioză (alimente
compacte sau ambalaje ermetice)
-Prezenţa glucidelor (conserve de fructe, legume)
-Timp suficient pentru producerea toxinei (cel puţin 8
zile)
Se recunosc următoarele forme de botulism:

Toxiinfecţia alimentară
Botulismul plăgilor
Botulismul intestinal (mai ales la sugari)
Botulismul prin inhalare de spori
Botulismul în care sursa este necunoscută
- Botulismul infantil apare la sugari sub 6 luni
(germinarea în intestin a sporilor vehiculaţi
prin alimente)
Perioada de incubaţie – 18-96 ore
 Paralizii în sfera nervilor cranieni: diplopie,
ptoză palpebrală, midriaz, disfagie, disartrie,
senzaţie de sete
 Paralizii descendente
 Dereglări digestive: nausee, vomă, constipaţie
 Lipsa febrei şi a dereglărilor cardiace
 Cauza decesului: paralizie flască a muşchilor
respiratori sau stop cardiac
 Diagnostic clinic
 Diagnostic microbiologic
Prelevate: ser sangvin, extract din alimente, mase
vomitive, mase fecale
A. Depistarea toxinei (RN pe şoareci, RP, RHAI,
RCoA, RLA, ELISA)
B. Tehnici de biologie moleculară
C. Examenul bacteriologic este suplimentar
Se administrează ser antibotulinic, preferabil
monovalent (dacă se cunoaşte tipul de toxină
implicată); dacă nu, se foloseşte ser polivalent.
Se poate administra ser trivalent (A, B, E) pe
cale i.v., cu precauţiile seroterapiei, în condiţii de
ventilaţie asistată.
PROFILAXIA
Este nespecifică şi constă în prelucrarea termică
adecvată a alimentelor conservate (preferabil
produse industrial), prevenirea contaminării
rănilor, prevenirea consumului de droguri pe cale
i.v. etc.
Parte componentă a microbiocenozelor rino-
faringiene, digestive şi genitale
Condiţii ce favorizează multiplicarea:
- Leziuni necrotice
- Diminuarea potenţialului redox
- Reducerea rezistenţei organismului
- Disbioze
 Septicemii
 Procese supurative
- Supuraţii abdominale (peritonite
apendiculare, supuraţii determinate de
cancer digestiv, supuraţii post-operatorii,
abcese)
- Supuraţii ale micului bazin (abces perirectal,
piosalpinx, supuraţii urinare)
- Supuraţii pleuro-pulmonare, bucale, ORL
(otite)
- Abces al creierului şi meningite purulente