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2017/2018
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
UTILISANT UN MARQUEUR
People hate what they dont understand.
-Martha Kent-
Plan du cours
I. INTRODUCTION .....................................................................................................................2
Classification des méthodes d’immunomarquage……………………………………………… 2
II. IMMUNOFLUORESCENCE (IF) ................................................................................................2
-Définition ............................................................................................................................................2
-Intérêt de l’immunofluorescence………………………………………………………………… 3
-Deux méthodes d’immunofluorescence : ……………………………………………………………………………….3
1. IF directe (IFD)………………………………………………………………………………..4
2. IF indirecte (IFI)……………………………………………………………………………….4
-Méthode de double marquage…………………………………………………………………...6
III. ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA) ...............................................................6
-Définitions………………………………………………………………………………………….7
-Dosage des antigènes :………………………………………………………………………….8
1. ELISA sandwich………………………………………………………………………………8
2. ELISA directe………………………………………………………………………………… 8
3. ELISA par compétition……………………………………………………………………….9
Dosage des anticorps : ………………………………………………………………………….10
1. ELISA indirecte…………………………………………………………………………….. 11
2. ELISA par compétition…………………………………………………………………… 11
IV. DOSAGE RADIO IMMUNOLOGIQUE………………………………………………………11
-Définition………………………………………………………………………………………11
-Deux méthodes : ………………………………………………………………………………12
1. Radio Immuno Assay (RIA)………………………………………………………………12
2. Immuno Radio Metric Assay (IRMA)……………………………………………………12
V. BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………………………………………………12
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Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen
2017/2018
I. INTRODUCTION :
Lorsqu’un antigène est son anticorps spécifique sont mis en contact, des complexes
immuns se forment. Ceux-ci peuvent être quantifier à des techniques qui se basent
sur l’utilisation d’un marqueur (traceur) qui peut être fluorescent, enzymatique,
radioactif ou luminescent.
Faut préciser que les techniques d’immunodosage sont divisées en deux types :
•Techniques homogènes : effectuées sur phase liquide et ne nécessitant
pas un lavage.
• Techniques hétérogènes : effectués sur une phase solide (pour la
fixation) et nécessite un lavage pour éliminer les éléments qu’on voulait
fixer ou combiner mais qu’ils ne le seront pas. Toutes les techniques qu’on
verra dans ce cours sont hétérogène.
Classification des méthodes d’immunomarquage :
Techniques Traceur
Immunofluorescence (IF) Fluorescent
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Enzymatique
Assay)
RIA (Radioimmunoassay) Radioactif
IRMA (immunoradiometric assay)
Chimiluminescence Luminescent
II. IMMUNOFLUORESCENCE :
Définition : L’immunofluorescence est une méthode d’immunodosage utilisée
pour localiser les antigènes en se servant d’anticorps et de marqueurs
fluorescents. Un composé fluorescent (FLUOROCHROME = FLUOROPHORE)
est un composé qui a la
propriété d’émettre de la lumière
(à une certaine longueur d’onde
λ) quand il est exposé à une
autre lumière dont la λ est plus
courte.
Petite explication : Une lumière
est un rayonnement possédant
une énergie et une longueur
d’onde λ. λ est inversement
proportionnel à l’énergie du
rayonnement càd moins une
lumière possède de l’énergie
plus sa λ est grande.
Quand un composé fluorescent est exposé à une lumière (λ1 E1), il absorbe une
partie de l’énergie de cette lumière de sorte que la partie restante (E2) peut être
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émise avec une énergie plus faible évidement mais avec une plus grande
longueur d’onde λ2, c’est pour ça qu’on a dit qu’un fluorochrome est existé par
une lumière avec une plus faible λ que la sienne.
La procédure a été décrite par Coombs et consiste à marquer des anticorps avec
des fluorochromes aboutissant ainsi à un anticorps conjugué sans qu’il y’ait
changement remarquable dans l’activité de l’anticorps.
Le marquage se fait par un couplage facile entre le fluorochrome er le
groupement amine libre de l’anticorps grâce à la grande affinité que possèdent
ces marqueurs pour les protéines (c’est pour ça qu’il est facile)
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Application de l’IFD :
• En Anatomopathologie : Recherche de dépôts d’immunoglobulines, de
composants du
complément ou d’immuns complexes dans des biopsies tissulaires.
• Phénotypage des populations lymphocytaires B et T et des sous-
populations de lymphocytes TCD4+ et TCD8+
• Diagnostic direct en : bactériologie (ex : Chlamydiae…), parasitologie (ex :
toxoplasmose…)
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Avantage : Elle est utilisée plus communément car elle est 4 à 10 fois plus
sensible que la méthode directe. L’explication de cette grande sensibilité dépend
de ce qu’on cherche par cette méthode :
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La méthode de double marquage est plus souvent utilisée lorsque la lecture est
effectuée en cytométrie en flux qui est une technologie permettant la mesure
simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d'une particule (cellule) en
suspension. C’est une technique extrêmement rapide et précise dans ces résultats.
Elle nous fournit plusieurs beaucoup d’information sur les cellules étudiées, on citera
par exemple : la taille relative, la granularité ou sa complexité interne relative et son
intensité relative de fluorescence.
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techniques qui utilisent le même principe de l’RIA, qui soient plus sécurisés
et souvent moins couteux, ce qui a amené au développement de l’ELISA.
L’ELISA et l’RIA ont donc le même principe sauf que la première utilise des
enzymes comme marqueurs, et la seconde des isotopes radioactifs. Cette
dernière est alors de moins en moins utilisée.
Deux méthodes d’RIA :
1. RIA (Radio Immuno Assay) : Méthode par compétition : en quantité
limitée d’Ac. Elle est similaire à l’ELISA par compétition qui dose les
antigènes sauf que l’RIA utilise la radio activité.
La radioactivité liée est inversement proportionnelle à la
concentration de la molécule à doser.
2. 2-IRMA (Immunoradiometric Assay) : Méthode sandwich. En excès
d’Ac, similaire à l’ELISA sandwich sauf que celle-ci utilise la radio
activité au lieu de la coloration enzymatique.
La radioactivité liée est directement proportionnelle à la
concentration de la molécule à doser.
V. BIBLIOGRAPHIE :
➢ Cour Officiel De la Faculté De Médecine D’Alger 2017/2018.
➢ Immunology & Serology in Laboratory Medicine, 5th Edition
By : MARRY LOUISE TURGEON.
➢ JANEWAY’S IMMUNOBIOLOGY, 9TH EDITION By : KENNETH
MURPHY & CASEY WEAVER.
➢ Atlas de poche d’immunologie par : Gerd-Riidiger Bunnester
et Antonio Pezzutto.
➢ Immunology A SHORT COURSE, 7TH EDITION By : Richard
Coico and Geoffrey Sunshiine.
➢ Biochimie clinique 2ème édition coordonné par :Pierre
Valdiguié
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