I.

PREGĂTIREA MATERIALULUI BIOLOGIC (SÂNGE, URINĂ,

LCR) ÎN VEDEREA ANALIZELOR DE LABORATOR

A. Sângele - este constituit din plasmă şi elemente figurate. El realizează legătura

între toate celulele organismului, astfel că orice modificare a compoziţiei sale
este rezultatul unei stări patologice.

Plasma
• reprezintă 55-60% din volumul sanguin;
• se obţine prin centrifugarea unui eşantion de sânge recoltat pe un anticoagulant
(deci conţine fibrinogen);
• este un lichid transparent, uşor gălbui, alcătuit din apă, substanţe anorganice
(ioni de sodiu, potasiu, calciu, magneziu, fosfat, clorură, zinc, fier, bicarbonat
ş.a.), substanţe organice azotate (proteine, enzime, uree, acid uric, creatinină,
bilirubină, hemoglobină ş.a.) şi substanţe organice neazotate (glucoză,
colesterol, trigliceride, acizi graşi liberi, fosfolipide, ş.a.);
• dacă sângele este recoltat fără anticoagulant, lichidul care se va separa de
cheagul format este reprezentat de ser (lichid transparent, galben-auriu, care
nu conţine fibrinogen).

Elementele figurate

• reprezintă 40-45% din volumul sanguin;

• sunt reprezentate de hematii, leucocite şi trombocite.

Sângele este materialul biologic cel mai utilizat pentru efectuarea diferitelor tipuri de
analize biochimice. Pentru determinările biochimice se foloseşte sânge venos (cel mai frecvent)
şi capilar (mai rar).

Recoltarea sângelui
Sângele venos se recoltează din venele plicii cotului (la adult), venele jugulare (la copii
mici) sau fontanele (la sugar).

Sângele capilar se recoltează din pulpa degetului, lobul urechii sau, la sugar, din călcâi.

Priza de sânge se recoltează dimineaţa pe nemâncate, după un post alimentar de 10-12

ore.

Micul dejun influenţează valorile glicemiei, lipidelor serice, aminoacidemiei, a fosforului

anorganic. Determinările comparative între sângele capilar şi cel venos au dovedit că nu există
diferenţe semnificative legate de modul de prelevare pentru majoritatea componenţilor organici
sau anorganici. Se remarcă glucoza, care are valori mai mici în sângele venos faţă de cel
arterial, iar piruvatul şi lactatul au valori mai mari în sângele venos faţă de cel arterial.

Tehnica recoltării sângelui cu seringa prin puncţia venelor de la plica cotului:

- se aşează pacientul pe un scaun cu spetează sau culcat pe o canapea;
- se aplică garoul deasupra cotului iar pacientul strânge pumnul pentru a produce staza
venoasă;
- se dezinfectează tegumentul plicii cotului cu o compresă umezită cu alcool;
- se puncţionează vena şi se recoltează o cantitate de sânge corespunzătoare analizelor
solicitate (cantitatea de sânge recoltată variază între 2 şi 5 ml);
- se va spune pacientului să deschidă pumnul, se va desface garoul şi se va scoate acul
din venă, aplicându-se la locul puncţiei venoase, timp de câteva minute, o compresă
umezită cu alcool;
- sângele astfel recoltat se va trece încet în eprubete etichetate corespunzător (numele
bolnavului, vârsta, salon, etc.) astfel încât să nu facă spumă, să nu hemolizeze şi să se
omogenizeze cu anticoagulantul;
- sângele recoltat se transportă imediat la laborator.

Sistemul vidat de recoltare a sângelui

Acest sistem înlocuieşte seringa şi acul de recoltare, cât şi eprubeta de analiză. Raportul
sânge/reactiv fiind standardizat, se elimină erorile de laborator şi hemoliza.

Acest sistem este compus din:

• tub de sticlă sau plastic cu un dop de cauciuc şi cu vid în interior, cu sau fără substanţă
anticoagulantă, numit “vacutainer”;
• un ac cu două extremităţi, una protejată cu un manşon de cauciuc (va penetra dopul de
cauciuc al vacutainerului) şi alta pentru puncţionarea venei;
• un dispozitiv numit “holder“ care face legătura între extremitatea protejată a acului şi
tubul pentru recoltare.

Tehnica recoltării sângelui cu sistemul vidat

- se aşează pacientul pe un scaun cu spetează sau culcat pe o canapea;

- se înfiletează extremitatea protejată a acului de puncţie venoasă în holder;
- se aplică garoul deasupra cotului, iar pacientul strânge pumnul pentru a produce staza
venoasă;
- se dezinfectează tegumentul plicii cotului cu o compresă umezită cu alcool;
- se puncţionează vena cu cealaltă extremitate a acului adaptat la holder, sângele nu
poate să curgă prin cealaltă extremitate a acului, deoarece aceasta este protejată de
manşonul de cauciuc;
- se va spune pacientului să desfacă pumnul şi se va desface garoul;
- se va introduce tubul vidat în holder cu o mână, exercitând în acelaşi timp o
contrapresiune cu cealaltă mână pentru a nu perfora vena; dopul tubului vidat va
împinge manşonul de cauciuc, iar din venă va fi aspirată o cantitate de sânge direct
proporţională cu vidul din tubul de recoltare;
 - când tubul s-a umplut cu sânge până la semnul indicat pe eticheta sa (cantitatea de
sânge recoltată variază între 2 şi 5 ml), se va retrage tubul de recoltare din holder, iar
manşonul de cauciuc va acoperi extremitatea acului şi nu va mai curge sânge din venă;
- se poate introduce în holder un alt tub de recoltare dacă este nevoie;
- ordinea prelevării sângelui cu ajutorul sistemelor vidate este: flacoane pentru hemocultură,
tuburi simple fără anticoagulant, tuburi pentru studiul coagulării (cu citrat de sodiu), tuburi
pentru hemogramă (cu EDTA de potasiu), alte tuburi;
- la terminarea recoltării se retrage acul, montat la holder, din venă şi se aplică la locul
puncţiei venoase o compresă cu alcool până la oprirea sângerării.

Vacutainerul poate conţine diferiţi anticoagulanţi, existând tipuri diferite în funcţie de tipul
analizei ce urmează a fi efectuată din sângele recoltat. Pentru manipularea uşoară a acestor
tipuri diferite de recoltoare, capacele tuburilor sunt de culori diferite.

Pentru analizele biochimice există următoarele tipuri de vacutainere:

A. Fără anticoagulant:

- dop roşu - tub de sticlă (activează coagularea în mod natural);

- dop roşu - tub de plastic - conţine siliciu ca activator al coagulării;
- dop cafeniu - conţine activator al coagulării + gel de acril (separă serul de cheag);
- dop portocaliu - conţine trombină, care reduce procesul de coagulare la 5 min.
B. Cu anticoagulant:

- dop verde - conţine heparinat de litiu.

- dop verde deschis - conţine heparinat de litiu + gel care separă plasma de elementele
figurate.
- dop gri - conţine KF + Na2 EDTA - utilizat la determinarea glucozei.

Pentru analizele hematologice şi de coagulare există următoarele tipuri:

- dop mov - cu anticoagulant K3 EDTA - pentru analizele hematologice din

sânge integral.
- dop albastru deschis - cu anticoagulant citrat de Na - pentru teste de
coagulare.
- dop negru - cu citrat de Na - pentru VSH.

Pentru stocarea sângelui de la donatori:

- dop galben - cu anticoagulant ACD

Surse de erori în determinările biochimice efectuate pe plasmă şi ser

1. prerecoltare
- alimentaţia pacientului (recoltarea se face după un post alimentar de cel puţin 10 ore,
cafeina creşte glucoza şi scade timpul Quick);
- medicaţia administrată (acidul ascorbic interferă cu determinarea glucozei);
 - felul sângelui recoltat (glucoza are valori mai mici în sângele venos decât în sângele
arterial, piruvatul şi lactatul au valori mai mari în sângele venos faţă de cel arterial);
- recoltarea de pe cateter este interzisă;
- anticoagulantul folosit (vezi mai jos).

2. postrecoltare
- timpul prelungit scurs de la recoltare şi până la efectuarea determinării;
- conservarea necorespunzătoare a serului sau a plasmei (vezi mai jos);
- neefectuarea deproteinizării atunci când condiţiile o impun;
- hemoliza (liza hematiilor), importantă pentru determinările acelor componente a căror
concentraţie diferă în ser faţă de eritrocite (lactat dehidrogenaza, fosfataza acidă, ALAT,
ASAT, potasiu). Pe de altă parte, culoarea hemoglobinei poate produce interferenţe în
cazul unor determinări colorimetrice (bilirubină, colesterol). Hemoliza poate apărea în:
stări patologice, recoltare defectuoasă a sângelui, separarea defectuoasă a elementelor
figurate de ser sau plasmă;
- plasma sau serul icteric. Culoarea caracteristică acestora interferă semnificativ în
determinările colorimetrice care se efectuează în domeniul 400-500 nm (se face o
probă martor a serului de a cărei extincţie se ţine seama la determinare);
- plasma sau serul lipemic. Când concentraţia lipidelor neutre din ser depăşeşte valoarea
de 700 mg%, serul apare opalescent sau lactescent. Dacă opalescenţa nu dispare în
cursul determinării, citirea extincţiei la spectrofotometru va fi eronată. În acest caz se vor
evita determinările turbidimetrice (timol), iar pentru restul determinărilor se va se face o
probă martor a serului de a cărei extincţie se ţine seama la determinare.

Conservarea serului sau a plasmei sanguine

- se recomandă ca analizele biochimice să se efectueze pe ser sau plasmă provenite din

sânge proaspăt recoltat;
- la temperatura laboratorului, timp de 4-6 ore de la recoltare, nu se produc modificări
notabile ale concentraţiei metaboliţilor şi ale activităţii enzimelor;
- serul sau plasma se pot conserva la +4°C timp de 24-36 ore, fără să se producă
modificări semnificative;
- pentru o conservare mai îndelungată serul şi plasma se congelează sau se liofilizează.

Anticoagulante

Anticoagulantele sunt substanţe ce se opun procesului de coagulare al sângelui. Ele sunt

utilizate la recoltarea sângelui în vederea obţinerii plasmei.

Oxalatul de sodiu, potasiu, litiu: împiedică coagularea prin legarea calciului. Se

utilizează 0,01 ml soluţie oxalat 20% la 1 ml sânge. Este indicat în determinarea fibrinogenului
şi a unor metaboliţi. Se contraindică la determinarea electroliţilor sodiu, potasiu, calciu, a unor
enzime (LDH), a pH-ului. În concentraţii mari, oxalatul produce hemoliză.

Citratul de sodiu, potasiu: acţionează prin legarea calciului; în concentraţie de

5 mg/ml sânge se foloseşte la determinarea fibrinogenului. În concentraţie de 3,8% este utilizat
la determinarea VSH (viteza sedimentare hematii). Are aceleaşi dezavantaje ca şi oxalatul.
 Fluorura de sodiu, potasiu: împiedică coagularea prin legarea calciului. Se utilizează în
concentraţie de 10 mg/ml sânge. Inhibă glicoliza eritrocitară, fiind utilizată la determinarea
glicemiei. De asemenea, inhibă acţiunea ureazei asupra ureei. Este contraindicată la
determinarea unor electroliţi, datorită eliberării anumitor componente intracelulare din eritrocite.

Na2EDTA (sare disodică a acidului etilendiaminotetracetic): are acelaşi mecanism

anticoagulant prin complexarea calciului. Se utilizează 1 mg/ml sânge. Nu afectează volumul
eritrocitar. Se foloseşte la determinarea fibrinogenului şi a unor metaboliţi. Se contraindică la
determinarea calciului, electroliţilor, azotului rezidual. Inhibă ceruloplasmina, fosfataza alcalină
şi activează fosfataza acidă.

Soluţia ACD conţine: acid citric .............................4,7 g

citrat trisodic.......................16,0 g

glucoză...............................25,0 g

apă bidistilată. .............ad 1000 ml

Se utilizează 1 ml soluţie la 4 ml sânge. Se foloseşte la conservarea sângelui de la

donatori. Eritrocitele din sângele recoltat pe soluţia de ACD pot fi conservate până la câteva
săptămâni la 4°C, fără a-şi pierde activitatea enzimatică. Se utilizează şi pentru izolarea
enzimelor eritrocitare şi a fosfatazei acide. Este contraindicată în condiţii nesterile.

Heparina: este anticoagulantul fiziologic ideal al organismului, deoarece nu modifică

starea fizico-chimică a sângelui. Se foloseşte sub formă de heparinat de sodiu, potasiu, litiu sau
amoniu. Se utilizează 75 unităţi/ml sânge (1 mg heparinat corespunde la 100 unităţi). Prin
dizolvarea a 300 mg heparinat de amoniu în 20 ml apă bidistilată se obţine o soluţie care
conţine 75 unităţi în 0,05 ml. Se recomandă introducerea soluţiei în eprubete şi apoi evaporarea
apei la 90-100˚C, stare în care se poate păstra timp nelimitat. Cu heparina se pot determina, cu
excepţia amoniacului sanguin şi a fosfatazei acide, toţi metaboliţii, electroliţii, toate enzimele.

În următorul tabel sunt prezentate unele interferenţe ale anticoagulanţilor în analizele

biochimice ale sângelui.

Anticoagulantul Analiza Reacţia

Fluoruri Ureea Inhibă ureaza

Fosfataza alcalină Inhibiţie

EDTA Creatin fosfokinaza Inhibiţie

Calciu Reducere

Heparinat de litiu Fosfataza acidă Inhibiţie

 Timol Reducere

Tiroxina Reducere

Triiodotironina Creştere

Insulina Reducere

Amilaza Inhibiţie

Oxalaţi Lactat dehidrogenaza Inhibiţie

Fosfataza acidă Inhibiţie

Fosfatul anorganic reducere

Deproteinizarea

Se poate realiza deproteinizarea sângelui total, plasmei, serului prin precipitarea

proteinelor sub formă de săruri insolubile. Proteinele sunt ioni polivalenţi, la pH<pHi se comportă
ca şi cationi, reacţionând cu anionii, iar la pH>pHi se află sub formă de anioni, reacţionând cu
cationii. Deproteinizarea plasmei sau a serului la pH acid <pHi se poate realiza cu acid
tricloroacetic (TCA), acid percloric, wolframat. La pH bazic >pHi, deproteinizarea se poate face
cu cationi ai metalelor grele: zinc, bariu, mercur,
obţinându-se în ambele cazuri compuşi insolubili. După deproteinizare se obţine filtratul sau
supernatantul, care poate fi: acid, bazic sau neutru, în care se determină metaboliţii.

Filtratul acid se poate obţine prin deproteinizarea sângelui total, a plasmei sau a serului
cu acid tricloracetic (TCA) 10-20%. Se foloseşte pentru determinări de fosfor, insulină, sodiu,
PAH, azot restant.

Filtratul alcalin după Somogy se obţine prin deproteinizarea sângelui total, a plasmei
sau a serului cu sulfat de zinc alcalin (hidroxid de zinc). Se foloseşte pentru determinarea
glicemiei.

Filtratul neutru, după Folin-Wu, se obţine prin deproteinizarea sângelui total, a plasmei
sau a serului cu acid wolframic. Se foloseşte pentru determinări de uree, acid uric, creatinină,
glucoză, aminoacizi, clor, azot restant.

Filtratul obţinut prin deproteinizarea cu alcool-eter se utilizează în special pentru

determinările de lipide : acizi graşi, colesterol, lecitine, cefaline.
 Aplicaţie practică

Analizele biochimice se determină pe: - sânge total;

- ser;

- plasmă.

a. Obţinerea plasmei
Plasma este un lichid de culoare alb-gălbui care se obţine prin centrifugarea
sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant.

sânge = plasmă + elemente figurate

plasma = sânge - elemente figurate

Mod de lucru

Într-o eprubetă de centrifugă se pipetează 3 ml sânge recoltat pe anticoagulant, se

centrifughează 10 minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din elementele
figurate, iar supernatantul este reprezentat de plasma sanguină.

b. Obţinerea serului sanguin

Serul sanguin este un lichid limpede de culoare galben aurie. Spre deosebire de
plasma sanguină, acesta nu conţine fibrinogen.
 Ser sanguin = plasmă sanguină – fibrinogen

Serul sanguin se obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat fara

anticoagulant.

Mod de lucru

Într-un vacutainer care conţine accelerator de coagulare se pipetează 3 ml sânge şi se

centrifughează 10 minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din cheag (format din
reţeaua de fibrină şi elementele figurate), iar supernatantul este reprezentat de serul sanguin. În
unele situaţii, când intervalul de timp dintre momentul recoltării în prezenţa acceleratorului de
coagulare şi cel al efectuării analizelor din serul sanguin este mare, realizându-se o separare
perfectă a cheagului de ser, nu mai este necesară efectuarea centrifugării.

În general, determinările biochimice efectuate pe ser sau plasmă sunt asemănătoare, cu

excepţia unor enzime (fosfataza acidă, LDH, aldolaza, GOT, GPT) şi a unor ioni (Mg2+, Ca2+, K+,
Cl-) care se eliberează în timpul coagulării din elementele figurate.

c. Deproteinizarea cu acid tricloracetic (TCA) 1%

Principiu

Proteinele din sânge, ser sau plasmă precipită cu TCA.

Reactivi : soluţie acid tricloracetic TCA 1%.

Mod de lucru

Într-o eprubetă de centrifugă se pipetează: 3 ml plasmă şi 0,5 ml soluţie TCA 1%, se

agită, se lasă în repaus 5 minute după care se centrifughează 10 minute la 2500 rpm.
Supernatantul obţinut se trece în eprubete de 160/16 mm prin aspirare cu pipeta sau prin
decantare. Se foloseşte la determinări de fosfor, insulină, sodiu, PAH, azot restant.

Urina

În decursul a 24 de ore compoziţia urinei se modifică, astfel încât există mai multe
modalităţi de recoltare a probelor de urină, în funcţie de examenul solicitat:

a. Prima urină de dimineaţă

• se foloseşte pentru determinările calitative (pH, albumină, glucoză, pigmenţi biliari,

urobilinogen, corpi cetonici, sediment urinar), acestea alcătuind examenul sumar de
urină;
• este lipsită de influenţele determinate de alimentaţie şi de eforturile fizice;
• este mult mai concentrată decât urina din timpul zilei, astfel încât unele elemente
anormale din urină care sunt prezente în concentraţie redusă nu vor fi omise;
• nu se recoltează probe de urină de la pacienţii cu tratament diuretic intensiv datorită
diluţiei masive;
• se recomandă înaintea recoltării spălarea mâinilor şi a organelor genitale externe cu
apă şi săpun, evitând substanţele dezinfectante care pot liza elemente ale
sedimentului urinar;
• se recomandă recoltarea jetului mijlociu urinar, prima parte a jetului urinar poate fi
contaminată cu elemente celulare şi bacteriene de la nivelul tractului urinar extern şi
de la nivelul organelor genitale externe (primul jet este important pentru diagnosticul
unor afecţiuni uretrale);
• pacientul urinează direct într-un recipient special pentru examenul urinar, de unică
folosinţă;
• se recoltează o cantitate de cca. 50 ml;
• în perioada menstruală, la femei, se recomandă folosirea tampoanelor intravaginale
pentru a evita contaminarea probelor de urină cu eritrocite;
• la copii recoltarea probelor de urină se face în pungi de plastic, de unică folosinţă,
prevăzute cu un dispozitiv adeziv.

b. Urina recoltată într-un interval prelungit de timp (de exemplu 24 h)

• se foloseşte pentru determinările cantitative (proteine totale urinare, glucide,
electroliţi, ş.a) pentru că substanţele excretate sau secretate de rinichi nu au acelaşi
ritm de producere în cursul zilei, iar analiza unei probe de urină proaspătă nu este
concludentă;
• se începe recoltarea la ora 6 dimineaţa şi se termină a doua zi la ora 6 dimineaţa,
aruncându-se prima urină recoltată;
• întreaga cantitate de urină se colectează într-un recipient de volum mare, din
polietilenă;
• pentru a evita alterarea urinei se pot utiliza conservanţi (ex. 5 ml soluţie timol în
izopropanol 10 %);
• vasul se etichetează cu numele pacientului, ora la care a început şi s-a terminat
recoltarea, analizele solicitate, volumul de urină/24h;
• din volumul total de urină se ia aproximativ 50 ml şi se predă separat laboratorului.

c. Urina recoltată prin cateterizarea vezicii urinare

• este necesară clamparea cateterului timp de aproximativ 15 minute înainte de

recoltare, folosind un ac şi o seringă;
• obligatoriu se curăţă şi se dezinfectează cateterul înainte de recoltare;
• se recoltează o cantitate de cca. 50 ml.

Recoltarea sterilă a urinei pentru urocultură

• se colectează urina de dimineaţă după o toaletă riguroasă vaginală sau de meat

urinar;
• într-o eprubetă sterilă prevăzută cu dop se colectează jetul mijlociu, aproximativ 20
ml;
• nu se folosesc conservanţi.
 Conservarea probelor de urină

• se recomandă analiza eşantionului de urină în max. 2-3 ore de la recoltare, pentru a

evita contaminarea bacteriană, distrugerea cilindrilor şi a elementelor sedimentului
urinar;
• dacă nu se poate analiza în acest interval de timp, probele se pot păstra la +4°C
timp de 24-36 ore (se poate produce precipitarea fosfaţilor şi a uraţilor) sau se pot
congela imediat la -20°C, păstrându-se timp mai îndelungat;
• substanţele conservante (ex. timol (1-2 g), toluen, xilen, cloroform (5-10 ml), soluţie
timol 10% în cloroform (5-10 ml), formaldehida, glutaraldehida) pot conserva probele
de urină timp de câteva săptămâni sau chiar luni de zile. Ele se introduc în vasele în
care se colectează urina. Nu se foloseşte cloroformul dacă se determină glicozuria
sau acetonuria;
• urina de 24h se poate depozita la frigider sau într-un container cu gheaţă sau se pot
utiliza conservanţi.

C. Lichidul cefalorahidian (LCR)

LCR este un produs de secreţie al plexurilor coroide de la nivelul ventriculilor

cerebrali (ventriculii laterali, ventriculul II sau diencefalic şi ventriculul IV). Investigaţia prin
metode clasice sau moderne a LCR reprezintă un real sprijin dat clinicianului în stabilirea
diagnosticului şi prognosticului unui caz de îmbolnăvire a SNC. Nu toate bolile SNC provoacă
la nivel LCR modificări sensibile, care să fie utile diagnosticului clinic. De aceea, puncţia
rahidiană trebuie efectuată numai dacă analiza LCR este de un sprijin real diagnosticului.

Recoltarea LCR se face:

- prin puncţie lombară, suboccipitală sau ventriculară;

- în recipiente sterile;
- cu ajutorul unui ac de puncţie.
Compoziţia LCR: proteine, glucide, uree, acid uric, acizi organici, bilirubină, fosfat,
carbonat, sulfat, calciu, magneziu, sodiu, clor, potasiu.

Examenul LCR cuprinde: examenul fizic (culoare, transparenţă, densitate), examenul

chimic (determinarea proteinelor, glucidelor, clorului, ş.a), examenul citologic, examenul
serologic pentru lues, examenul virusologic.

Pipetarea lichidelor biologice se face numai cu pipete automate, utilizând vârfuri

de pipetă de unică folosinţă.

− Vacutainere pentru recoltarea probelor de sânge:

Nr. Tipul de Caracteristici Utilizare

crt. dop/culoare

1. ROŞU - fără substanţă anticoagulantă ± Ser - BIOCHIMIE (uree,

gel accelerator de fibrină creatinina, acid uric,
bilirubina, glucoza, colesterol,
 GALBEN - SE CENTRIFUGHEAZĂ: trigliceride, enzime, etc).

10 min / 2000 rpm sau Ser - IMUNOLOGIE (markeri

imunologici, tumorali,
5 min / 2500 rpm hormoni)

2. ALBASTRU - cu substanţă anticoagulantă Plasma bogată în

trombocite - FACTORI AI
Citrat de Na 3.2% COAGULARII (fibrinogen,
- SE CENTRIFUGHEAZĂ ÎNCET: TQ, INR, APTT, PT)
15 min / 1500 rpm

3. VERDE - cu substanţă anticoagulantă Plasma - BIOCHIMIE

Heparinat de Litiu (75mUI/ml) URGENŢĂ (toţi metaboliţii,
electroliţii şi toate enzimele
- SE CENTRIFUGHEAZĂ: 10 cu exceptia amoniacului
min / 2000 rpm sau 5 min / sânguin şi a fosfatazei acide)
2500 rpm

4. MOV - cu substanţă anticoagulantă Sânge - HEMATOLOGIE

EDTA-K/Na (HLG)

- NU SE CENTRIFUGHEAZĂ (Hb, formula

hemoleucocitară, HbA1c-
glicozilată)

5. NEGRU - cu substanţă anticoagulantă Citrat Sânge - VSH

de Na 3.2%

- NU SE CENTRIFUGHEAZĂ

6. GRI - cu substanţă anticoagulantă Plasma - BIOCHIMIE

Florura Na 1%
(det. Glicemiei în ± DZ)
- SE CENTRIFUGHEAZĂ: 10
min / 2000 rpm sau 5 min /
2500rpm

Raportul anticoagulant/sânge recoltat în vacuteiner este = 1/9

 II. CENTRIFUGAREA
Centrifugarea este o operaţie care permite separarea rapidă a componentelor cu
densităţi diferite, aflate în amestec sub forma unei suspensii într-o fază lichidă.

Aspecte teoretice
Asupra particulelor aflate în suspensie într-un lichid (sistem dispers) acţionează simultan
mai multe forţe: interacţiuni moleculare, capacitate de plutire, forţa gravitaţională.
Ecuaţia matematică care redă viteza de sedimentare a unei particule în câmp centrifugal
este descrisă de relaţia (1):

dr 2rp (ρ p − ρ m )ω r
2 2

= (1)
9η f 
dt
 f0 
unde :
dr/dt = viteza de sedimentare a particulei;
ρm = densitatea mediului;
ρp = densitatea particulei;
rp = raza particulei;
r = distanţa dintre particulă şi axul de rotaţie;
ω = viteza unghiulară exprimată în radiani/sec;
η = vâscozitatea mediului;
f/f0 = coeficientul de frecare relativ.

În afară de forţele de plutire şi cele de sedimentare, asupra particulei acţionează şi

interacţiuni moleculare, care sunt cu atât mai semnificative cu cât particula este mai mică,
sedimentarea necesitând o forţă mai mare.
Din ecuaţia (1) se poate caracteriza comportamentul unei particule în câmp centrifugal
prin constanta sa de sedimentare, s, definită prin relaţia (2):

dr
s= dt (2)
2
ω r

Deoarece pentru macromoleculele biologice valoarea lui s este în jurul valorii de 10-13
secunde, s-a definit ca unitate de sedimentare Svedberg-ul, egal cu 10-13 sec.
Exprimarea forţei centrifugale se face comparativ cu câmpul gravitaţional terestru şi se
calculează cu relaţia:
ω 2r
FCR = (3)
g
unde :
FCR = forţa centrifugă relativă (exprimată prin numărul de g, ng);
r = distanţa dintre particulă şi axul de rotaţie;
ω = viteza unghiulară exprimată în radiani/sec;
g = 9,81m/sec2 (acceleraţia gravitaţională).
 Deoarece exprimarea vitezei unghiulare în radiani/sec nu este comodă, se utilizează în
practică numărul de rotaţii/min (turaţia, N) şi se obţine:

2
 N 
ng = FCR = 1,18 ⋅ r ⋅   (4)
 1000 
Uzual, forţa centrifugă relativă se exprimă în termeni de g şi se scrie ca multipli de g (ng).
Timpul de centrifugare, necesar sedimentării particulei, depinde de:
1. ng (invers proporţional);
2. dimensiunea particulelor (invers proporţional);
3. vâscozitatea mediului (direct proporţional);
4. diferenţa de densitate particulă - lichid (invers proporţional).

Produsul dintre timpul de sedimentare şi multiplii de acceleraţie (ng) este constant:

t x ng = constant (5)

deci, crescând de un anumit număr de ori acceleraţia, timpul de sedimentare se

scurtează de acelaşi număr de ori.
Performanţa unei centrifugi se exprimă prin multiplii de acceleraţie realizaţi (ng). Relaţia
dintre ng şi numărul de rotaţii/minut (vechiul parametru de caracterizare) este dată de ecuaţia
(4) sau se poate determina utilizând nomograma Dixon din figura 1.
 Figura 1. Nomograma Dixon

Aparatură
Centrifugarea se realizează cu ajutorul unor aparate numite centrifugi.
Oricare centrifugă are un dispozitiv în care se aşează probele de centrifugat şi căruia i se
imprimă o mişcare de rotaţie în jurul unui ax, numită rotor. Din punct de vedere constructiv,
rotorul poate să fie orizontal, unghiular sau vertical.
Rotoarele, în funcţie de performanţele care trebuiesc atinse, se confecţionează din
material plastic, aliaje de aluminiu sau titan. În rotor există un număr par de locaşuri, prevăzute
cu locuri în care se introduc tuburile (eprubetele) de centrifugă.
Tuburile de centrifugă (uzual eprubete) sunt confecţionate din materiale plastice, sticlă
(obişnuită sau specială) sau inox şi trebuie să suporte presiunea exercitată în timpul centrifugării.
Indiferent de tipul rotorului, acesta trebuie să fie perfect echilibrat de constructor, iar
tuburile de centrifugă echilibrate, câte două, se introduc în cupe diametral opuse.
Rotorul este acţionat de un motor electric a cărui turaţie poate fi reglată. În funcţie de
turaţia maximă realizată, centrifugile se pot clasifica în: centrifugi cu viteză joasă, cu viteză
înaltă şi ultracentrifugi. Particularităţile fiecărui tip de centrifugă sunt redate în tabelul 1.

Tabelul 1. Particularităţile tipurilor de centrifugi

Centrifugi cu Centrifugi cu Ultra-
Caracteristici
viteză joasă viteză înaltă centrifugi
Turaţia (r.p.m.) 2 - 6 x 103 18 - 25 x 103 40 -80 x 103
3
ng 6 x 10 60 x 103 600 x 103
Refrigerare unele da da
Sistem de vacuum nu unele da
Control accelerare şi frânare unele variabil variabil
Aplicabilitate pentru sedimentare de:
celule da da da
nuclei da da da
organite celulare unele da da
fracţiuni membranare unele unele da
ribozomi - - da
macromolecule - - da

Centrifugile cu rotoare orizontale se caracterizează prin ataşarea la rotor a suporturilor pentru

tuburi, prin intermediul unei articulaţii care permite pendularea acestora în plan vertical. Urmarea este că
în timpul centrifugării, sub acţiunea forţei centrifuge, suporturile vor lua o poziţie orizontală,
perpendiculară pe axul de rotaţie (figura 2).
Utilizând rotoare orizontale apar o serie de inconveniente:
• Particulele din suspensie, pentru a sedimenta, trebuie să traverseze întreaga coloană de lichid,
cea ce face ca distanţa de parcurs să fie mare, iar aglomerarea particulelor în vecinătatea
fundului vasului de centrifugă să stânjenească procesul de sedimentare.
• Frecarea internă între particule este mai mare.
• Rotorul are o formă mai puţin aerodinamică.
 Corectarea acestor inconveniente se face prin utilizarea unor turaţii mai mari şi
prelungirea timpului de centrifugare.
Avantajul acestui tip de centrifugă constă în posibilitatea măsurării înălţimii sedimentului în
vasul de centrifugă (de exemplu la hematocrit).
(a) (b)
forţa centrifugă

. . .
. .. .. . . .. ....
. .. . . ..
. ..
. .
. .
. .
. . ..
. (d)
. . .
... .. . .
.. ....

(c)
..
.
. ..
.. . . . .. ...
.
.. . . ..
. .
.
. .
.. . .
....
Figura 2. Schema unui rotor orizontal şi modul de depunere a sedimentului

Centrifugile cu rotor unghiular se caracterizează prin faptul că suporturile pentru probe

se află înclinate faţă de axul de rotaţie cu un unghi fix de 14°-40° (figura 3).

Figura 3. Schema unui rotor unghiular

Majoritatea centrifugilor actuale utilizează acest tip de rotor, care prezintă o serie de
avantaje:
• Forma rotorului este aerodinamică permiţând atingerea unor turaţii mari.
• Particulele din suspensie au un drum mai scurt de parcurs. Înclinaţia face ca particulele să
alunece pe pereţii vasului, cu frecare mai redusă (figura 4).
 Figura 4. Schema sedimentării particulelor în cazul rotorului unghiular

Centrifuga cu rotor vertical are suporturile aşezate paralel cu axul de rotaţie. Astfel de
rotoare se folosesc la centrifugi de viteză înaltă sau la ultracentrifugi (Figura 5), fiind prevăzute
în plus cu aparatură optică de urmărire a sedimentării.

Figura 5. Schema rotorului vertical şi a modului de sedimentare

Ultracentrifugarea
Ultracentrifugarea reprezintă o separare a unor particule mici (macromolecule,
componente subcelulare, virusuri, etc.) utilizând acceleraţii de ordinul sutelor de mii de g.
Ultracentrifugile sunt aparate de construcţie specială, rotorul fabricat din titan fiind
antrenat de o turbină la turaţii mari (60000 r.p.m.), în condiţii de vid şi refrigerare. După scopul
urmărit, utracentrifuga poate fi fie analitică (când procesul de sedimentare este urmărit şi
analizat prin metode optice, obţinând diagrame de sedimentare), fie preparativă (când
fracţiunile separate prin ultracentrifugare se extrag în vederea analizării).
Pe baza vitezei de sedimentare se calculează constanta de sedimentare, care
caracterizează comportamentul oricărei particule supuse ultracentrifugării (vezi mai sus).
Cunoscând constanta de sedimentare a unei particule se poate determina masa moleculară a
particulei:
R ·T·s
M=
D · (1 - Vρ )
unde : M = masa moleculară;
R = constanta universală a gazelor;
T = temperatura absolută;
s = constanta de sedimentare;
D = constanta de difuziune;
 V = volumul specific;
ρ = densitatea soluţiei.
Uzual, fracţiunile subcelulare şi macromoleculele sunt caracterizate prin valoarea
constantei de sedimentare (exprimată în unităţi Svedberg); de exemplu unităţi ribozomale –
30S; 40S; 60S; sau ARNr – 5S; 5,8S; 18S.

Ultracentrifugarea este utilizată curent în practica biochimică pentru:

- separarea organitelor celulare
- separare de lipoproteine plasmatice
- determinarea maselor moleculare a proteinelor, poliglucidelor, etc.
Aplicaţie practică

Modul de lucru cu centrifuga

1. Se branşează centrifuga la sursa de curent.
2. Se deschide capacul centrifugii şi se verifică rotorul şi suporturile (acestea trebuie să fie goale).
3. Se verifică dacă tuburile sau eprubetele de centrifugă pot fi introduse uşor în suport.
4. Se verifică balanţa de echilibrare, după care se trece la echilibrarea fiecărei eprubete conţinând
suspensie de centrifugat faţă de o altă eprubetă, de acelaşi fel, în care se adaugă apă.
Eprubetele nu trebuie să fie mai încărcate decât 3/4 din capacitatea lor.
5. Se introduc eprubetele de centrifugă echilibrate perechi în suporturile rotorului aflate în poziţii
diametral opuse.
6. Se închide capacul centrifugii şi se porneşte centrifuga mărind treptat turaţia acesteia până se
atinge valoarea dorită. În cazul unor centrifugi moderne, se face programarea turaţiei şi timpului
de centrifugare, după care centrifugarea se face în regim automat.
7. După terminarea timpului de centrifugare se opreşte centrifuga. Capacul centrifugii nu se
deschide decât la oprirea completă a rotorului.
8. Se scot atât eprubetele cu probele centrifugate cât şi cele care au servit la echilibrare.

A. Separarea organitelor celulare

Pentru studiul diferitelor organite celulare cel mai potrivit organ este ficatul, iar modul de
obţinere a acestora este centrifugarea fracţionată (Figura 6).

Tehnică
1. Obţinerea omogenatului celular:
- se anesteziază animalul de laborator (şoarece, şobolan, etc.) şi se prelevă ficatul;
- se cântăreşte ficatul pe o balanţă;
- ficatul respectiv se introduce în mediul de omogenizare (conţinând 0,25M zaharoză, 5mM Tris-
HCl, pH 7,4) rece (0-4°C) şi se mărunţeşte cu foarfeca.
- Dacă se doreşte preparare de nuclei, mediul va fi: 0,25M zaharoză, 50mM Tris-HCl, pH 7,5,
25mM KCl, 5mM MgCl2;
- pentru mitocondrii: 200mM manitol, 50mM zaharoză, 10mM HEPES-NaOH, 1mM EDTA;
- se schimbă de trei ori mediul, pentru a îndepărta sângele, ultima resuspendare făcându-se într-
un volum fix de mediu astfel încât să se obţină 0,25 g ficat/ml;
- se omogenizează într-un omogenizator cu pistil Potter-Elvehjem, realizând 4-5 treceri la 500
rpm.

2. Centrifugarea fracţionată:
- La prima centrifugare (C1) se folosesc eprubete din plastic conice şi o centrifugă cu rotor
orizontal de joasă viteză cu răcire: 10 minute la 1000 g. Sedimentul P1 va conţine: nuclei,
mitocondrii grele, membrane plasmatice, celule întregi.
- La a doua centrifugare (C2) se folosesc eprubete de policarbonat şi o centrifugă cu rotor
unghiular de înaltă viteză cu răcire: 10 minute la 3000 g. Sedimentul P2 va conţine: mitocondrii
grele, fragmente de membrane plasmatice.
- La a treia centrifugare (C3) eprubetele şi centrifuga sunt similare, dar se centrifughează 20
minute la 10000 g. Sedimentul P3 va conţine mitocondrii, lizozomi, peroxizomi, membrane Golgi,
unii reticuli endoplasmatici rugoşi.
- La a patra centrifugare (C4) se folosesc tuburi din policarbonat şi o ultracentrifugă: 40 minute la
100000 g. Sedimentul P4 va conţine microzomi (vezicule membranare ale reticulului
endoplasmatic neted şi rugos), membrane Golgi şi membrane plasmatice. Supernatantul S4 va
conţine toate componentele solubile ale citoplasmei.
- Supernatanţii S1 , S2 şi S3 se colectează prin aspirare cu o seringă cu ac.
- Utilizând mediile mai sus amintite, din P2 se pot obţine mitocondrii relativ pure, din P4 microzomi
relativ puri, iar din P1 membrane plasmatice (necesită şi un mediu de 1mM NaHCO3).

Omogenat

Centrifugare 10 minute la 1000 g (C1)

Sediment (P1) Supernatant(S1)

Centrifugare 10 minute la 3000 g (C2)

Sediment (P2) Supernatant(S2)

Centrifugare 20 minute la 10000g (C3)

Sediment (P3) Supernatant(S3)

Centrifugare 40 minute la 100000g (C4)

Sediment (P4) Supernatant(S4)

 Figura 6. Schema centrifugării fracţionate a omogenatului celular

C. Separarea fracţiunilor lipoproteice

Lipoproteinele plasmatice se caracterizează prin densitatea lor mai mică decât a
proteinelor plasmatice (0,980-1,150 faţă de 1,060-1,380 g/cm3). Datorită acestui fapt ele pot fi
separate prin ultracentrifugare analitică, obţinându-se diagrame de flotaţie. Din aceste diagrame
se pot deduce constantele de flotaţie sf.
Ultracentrifugarea preparativă presupune sedimentarea în soluţii saline cu densitate
cunoscută. Se pot obţine trei clase de lipoproteine: lipoproteine cu densitate mare (high density
lipoproteins, HDL), >1,063 g/cm3; lipoproteine cu densitate joasă (low density lipoproteins, LDL)
1,006-1,063 g/cm3 şi lipoproteine cu densitate foarte joasă (very low density lipoproteins, VLDL)
0,96-1,006 g/cm3.
Practic, se adaugă la fiecare mililitru de probă câte 0,32 g de bromură de sodiu până la
densitatea de 1,22 g/cm3 şi se supune ultracentrifugării la 95000 g timp de 120 minute şi la 4°C.

D. Clarifierea urinii tulburi

Principiu
În cazul unor concentraţii crescute de uraţi şi/sau fosfaţi în urină, aceştia vor forma un
sediment după 24 h. În cazul în care se efectuează determinarea unor analiţi din urină prin
metode spectrofotometrice este necesară clarifierea urinii, acest lucru realizându-se prin
centrifugarea acesteia.
Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 10 ml urină proaspată şi se centrifughează 10
minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din uraţi şi/sau fosfaţi, iar supernatantul
este reprezentat de urina limpede.

E. Separarea prin centrifugare a precipitatului de sulfat de bariu

Principiu
Clorura de bariu, în prezenţa acidului sulfuric, formează sulfat de bariu insolubil şi acid
clorhidric, conform reacţiei:
BaCl2 + H2SO4 → BaSO4 + 2HCl

Sulfatul de bariu rezultat se va separa de restul soluţiei prin centrifugare sau filtrare.
Reactivi
1. Soluţie BaCl2 6%: se cântăresc, la balanţa farmaceutică, 6 g BaCl2, se transvazează într-un
pahar Berzelius şi se adaugă 94 ml apă distilată. Se agită până la dizolvare.
2. Soluţie H2SO4 3%: 97 ml apă distilată se introduc într-un pahar Berzelius. Se adaugă în picături,
sub agitare, 1,7 ml (3,06 g) soluţie H2SO4 concentrat (98%, cu densitatea 1,84 g/ml).
Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 3 ml BaCl2 6% şi 3 ml H2SO4 3%. Se
centrifughează 5 minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din BaSO4.

Aplicaţie practică:
1. Vizualizarea vacuteinerelor cu sânge de la pacienţi (fără deschiderea dopurilor)!
2. Deproteinizarea plasmei cu TCA (acid tricloracetic 1%):
Scopul: determinarea aminoacizilor pentru diagnosticarea bolilor metabolice
congenitale:
 Tehnica de lucru:
- într-o eprubetă de centrifugare se pipetează: 3mL plasmă + 0.5mL TCA 1%;
- se omogenizează;
- apoi se echilibrează la balanţă cu o altă eprubetă de centrifugare cu apă;
- se centrifugează 10 min la 2000 rpm în echilibru;
- se obţine: sediment (lipoproteinele şi proteinele plasmatice precipitate) + supernatant =
plasma deproteinizată care va fi folosită în diagnosticarea unor boli metabolice
congenitale.