Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană

Note de curs şi tehnici de laborator

CAP. 1-3-1CONJUGAREA BACTERIANĂ

Conjugarea bacteriană reprezintă procesul de transfer de material genetic de la o bacterie
“donor” la o bacterie “receptor”, prin intermediul unei legături intercelulare directe, şi condiţionat de
prezenţa în bacteria donor a unui element genetic specializat, denumit CONJUGON. Acesta este, de
regulă, localizat pe un plasmid şi nu pe cromosomul bacterian.
Alături de transformarea bacteriana şi de transducţie, conjugarea bacteriană reprezintă unul
dintre cele trei modalităţi principale de transfer de material genetic pe orizontală (între indivizi
aparţinând aceleiaşi generaţii) în lumea bacteriană, contribuind semnificativ la extrem de intensul flux
genetic ce caracterizează organismele procariote.
Conjugarea constituie un fenomen foarte larg răspândit la bacteriile Gram-negative şi mai rar
întâlnit la cele Gram-pozitive. Asemenea fenomene de transfer de material genetic prin conjugare au
fost descrise şi între specii şi genuri bacteriene diferite, şi chiar între Gram-negative şi Gram-pozitive,
între Gram-negative şi drojdii, între Gram-negative şi plante.
Procesul de conjugare bacteriană a fost descoperit de Lederberg şi Tatum în 1946, care l-au
descris că un fenomen de para- (proto) sexualitate bacteriană, discriminarea aşa-numitelor “sexe”
bacteriene făcându-se pe criteriul prezenţei/absenţei factorului F. Astfel, celulele bacteriene cu factor
F erau denumite bacterii mascule şi notate F+, iar celulele bacteriene fără factor F – bacterii femele
(F−). Cercetările efectuate ulterior au demonstrat că “factorul F” este un plasmid bacterian şi procesul
de conjugare bacteriană nu mai este asimilat fenomenului de sexualitate, ci este considerat ca fiind
una din multiplele modalităţi de circulaţie pe orizontală a informaţiei genetice în lumea bacteriană.

A. Sistemul genetic implicat în conjugare

Primul plasmid conjugativ descris a fost denumit factor F, şi, de altfel, a fost primul sistem plasmid -
bacterie gazdă descris. Acest plasmid este format dintr-o moleculă de ADN d.c. circular (CCC) cu o
dimensiune de 94.5 kpb (dintre care, 49% mol GC) şi este prezent în 1-2 copii per celulă bacteriană.
Pe plasmidul F au fost cartate până în prezent peste 70 de gene şi ORF-uri, ce ocupă aproximativ
75% din plasmid. Circa o treime din F reprezintă regiunea tra (33.3 kpb) care include gene implicate
în transferul conjugativ al plasmidului (Fig.1.22).

Fig.1.22. Structura plasmidului F (după

Frost, 1994).
.
Studiile efectuate în ultimii
ani au demonstrat că, în general,
procesul de conjugare bacteriană
este controlat de gene de tip tra, şi
ca urmare, regiuni tra sau tra-like
au fost identificate şi la alte
plasmide conjugative (Tab.1.1).

Tab.1.1. Principalele tipuri de plasmide conjugative (ce prezintă regiuni tra) şi apartenenţa la grupuri de
incompatibilitate. Regiunile tra ale acestor plasmide prezintă grad ridicat de omologie, între ele şi cu regiunea tra a
plasmidului F.
Plasmide Grup de incompatibilitate

R1, R100, R500, Col B Inc F II

pSU316 Inc F III
R124 Inc F IV
pED200 Inc F V
pSU233 Inc F VII
RP1, RP4 Inc P

Cu excepţia plasmidului F, celelalte plasmide conjugative descrise pot include şi gene cu diverse alte
funcţii în afară de procesul de conjugare : rezistenţă la antibiotice, toleranţă la metale grele, virulenţă,

1
 Cap. 1-3-1 Conjugarea bacteriană

patogenitate, biodegradare a unor substanţe xenobiotice (prin capacităţi catabolice speciale). Deşi
între regiunile tra ale unor diverse plasmide conjugative există omologie de secvenţă (şi regiunea tra
are un grad înalt de conservare), totuşi se pot distinge numeroase sisteme de conjugare (distincte din
punct de vedere genetic). Deşi regiunea tra este definită ca fiind cuprinsă între ori T şi fin O, totuşi
genele adiacente regiunii tra sunt conservate la toate plasmidele din grupul de incompatibilitate Inc F.
S-a constatat că există o corelaţie între grupul de incompatibilitate şi grupul de conjugare: de
regulă, plasmidele cu un anumit sistem de conjugare aparţinând aceluiaşi grup de incompatibilitate
(sau la 2 grupuri înrudite). Este deci, foarte probabil să fi avut loc o co-evoluţie a celor 2 sisteme
genetice.

Funcţie de prezenţa/absenţa, localizarea şi structura plasmidului F, celulele bacteriene pot fi

de mai multe tipuri:
celule de tip F+ - sunt celule bacteriene ce prezintă un plasmid F (în 1-2 copii per celulă) în formă
extracromozomală
celule de tip F− - sunt celule bacteriene ce nu prezintă plasmid F, nici extracromozomal, nici integrat
în cromozomul bacterian
celule de tip Hfr (High frequency of recombination) - sunt celule bacteriene ce prezintă un plasmid F
integrat în cromozomul bacterian; poartă denumirea de celule Hfr pentru că
plasmidul F inegrat în cromozomul bacterian facilitează procesele de
recombinare între gene cromozomale aparţinând la celule bacteriene diferite.
celule de tip F′- sunt celule bacteriene ce prezintă în citoplasmă un plasmid F′ (plasmid F care, în
urma unui proces de excizie incorectă din cromozomul bacterian, a achiziţionat
şi gene cromozomale; aceste gene cromozomale se găsesc într-un singur
exemplar – cel de pe plasmidul F′)
celule de tip F′′ - sunt celule bacteriene ce prezintă în citoplasmă un plasmid F′ şi care sunt diploide
pentru genele cromozomale prezente pe F′; acest tip de celule rezultă dintr-o
celulă F−, în urma unui proces de conjugare iniţiat de o bacterie de tip F′

Regiunea leader
In procesul de conjugare materialul genetic transferat este transferat sub forma unei
monocatene de ADN, în urma exciziei unei legături fosfodiesterice (“nick”). In conjugarea generată de
un plasmid F, nickarea se realizează în regiunea ori T. Prima secvenţă de ADN ce pătrunde în celula
receptor este zona cuprinsă între ori T şi secvenţa rep-inc şi poartă numele de regiune leader (L).
Această zonă din plasmidul F cuprinde 13 kpb cu secvenţă înalt conservată şi care codifică cel puţin 8
polipeptide, dintre care cele mai importante sunt :
gena ssb – codifică o proteină de tip Ssb şi are omologie cu gena ssb din cromosomul bacterian;
genele psi A - psi B – codifică proteine care inhibă activitatea proteazică a enzimei Rec A;
genele flm A, flm B, flm C – codifică proteine implicate în menţinerea stabilităţii plasmidei în
populaţia bacteriană şi este asemănător cu sistemul hok-sok (sistem de eliminare a
descendenţilor plasmid-free – fără copii plasmidiale); acest sistem genetic este activ în
perioada post-conjugativă, asigurând predominanţa celulelor care au primit plasmidul în
populaţia receptor;

Regiunea L prezintă şi un situs de recunoaştere pentru asamblarea primosomului. Acest situs

devine activ după intrarea monocatenei în celula receptor, la declanşarea procesului de sinteză a
catenei complementare.

Regiunea tra cuprinde regiunea ori T şi operonul tra.

Regiunea ori T
Regiunea ori T reprezintă originea transferului conjugativ şi are o conservare înaltă, la foatr
multe plasmide conjugative. Această regiune este cuprinsă între un situs pentru endonucleaza de
restricţie Bgl II şi începutul genei tra M (Fig.). Secvenţa ori T conţine situsul unde se produce nickarea
(incizia unei catene ADN) şi unde este iniţiat transferul unei monocatene în direcţia 5′→ 3′, în celula
receptor.
Din punct de vedere funcţional, regiunea ori T prezintă 2 zone (Fig.1.25.):
- o zonă esenţială pentru nickare , ce cuprinde situsul A la care se ataşează într-o manieră situs-
specifică molecule ale proteinei IHF (Integration Host Factor), ceea ce determină o curbură a
moleculei ADN la 140o; şi o parte din situsul sby A la carea se ataşează (tot situs-specific) proteina
Tra Y, fapt ce determină o curbură a ADN la 50o. Proteinele IHF şi Tra Y au rol activator al unor
procese genrtice – rol pe care şi-l manifestă producând curburi foarte puternice ale moleculelor de
ADN la situsul de ataşare;

2
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

- o zonă esenţială pentru transfer ; aceasta cuprinde o parte din situsul sby A (leagă molecule de Tra
Y) şi cele 3 situsuri sbm A, B, C, (dintre care cel mai important este sbm C), la care se ataşează
situs-specific molecule ale proteinei Tra M.
Astfel, regiunea ori T reprezintă o zonă cu multiple puncte de curbare a ADN : în afară de
zonele ce se curbează ca urmare a ataşării unor proteine (IHF, Tra Y), oriT include şi zone de curbură
intrinsecă (bogate în A-T).
Plasmidul F, spre deosebire de multe alte plasmide conjugative, nu codifică o primază, ci se
bazează pe primaza codificată în cromozomul celulei gazdă. In plasmidul F au fost identificate până în
prezent peste 40 de gene, dintre care însă foarte puţine prezintă promotor propriu. De altfel,
complexul genelor tra este denumit de obicei, operonul tra, deşi are o structură şi un reglaj genetic
mult mai complex decât mulţi din operonii bacterieni.

Cei mai importanţi promotori ai regiunii tra

PM – promotorul genei tra M; proteina Tra M reprezintă un important semnal chimic de împerechere
celulară în procesul de conjugare bacteriană;
PD – promotorul genei tra D ; proteina Tra D are rol în transportul activ al plasmidului F (sub forma
unei monocatene) în celula receptor;
PS şi PT – promotorii genelor tra S şi, respectiv, tra T; produşii acestor gene (proteinele Tra S şi Tra
T) sunt implicate în procesul de excludere de suprafaţă ce întrerupe conjugarea între două celule de
tip donor;
PJ – promotorul genei tra J, al cărei produs (proteina Tra J) este o proteină reglatoare care activează
transcrierea de la promotorul central PY.
PfinP – promotorul genei fin P al cărei produs (Fin P) nu este o proteină ci o moleculă de ARN ce are
rol inhibitor asupra transcrierii de la promotorul PJ;
PY – promotorul genei tra Y , al cărei produs (proteina Tra Y) se leagă ca dimer la situsul sby A din
ori T determinând curbarea ADN cu 50o; pe de altă parte, proteina Tra Y îşi reglează transcrierea
propriei gene. Promotorul PY reprezintă promotorul major al operonului tra de la care are loc
transcrierea policistronică a foarte multor gene tra.
Cu excepţia genei fin P (şi a genei art A), toate genele regiunii tra sunt transcrise în aceeaşi
direcţie.

Regiunea reglatorie a operonului tra cuprinde 3 componente: gena tra J, gena fin P şi promotorul
P-Y.
Gena tra J codifică proteina Tra J care este o proteină reglatoare, activând transcrierea de la
promotorul central PY.
Fin P nu este o proteină, ci o moleculă ARN de 75b (transcriptul genei fin P), a cărui structură
este stabilizată de proteina Fin O (codificată de gena fin O, aflată la unul din capetele operonului tra).
Gena fin P se suprapune parţial peste gena tra J şi, ca urmare, molecula Fin P poate fi considerată un
ARN antisens ce inhibă transcrierea de la promotorul PJ, probabil printr-un mecanism similar cu
interacţiunea dintre ARN I - ARN II în reglarea replicării plasmidului Col E1.
{n plasmidul F, gena fin O este întreruptă de IS3, astfel încât are loc exprimarea constitutivă a
lui tra J. Totuşi, în prezenţa proteinei Fin O active în celula gazdă, sistemul de represie fin O-P scade
transcrierea genei tra J şi, ca urmare, operonul tra este represat.
Promotorul PY este un promotor complex, fiind considerat promotorul major al operonului tra,
datorită faptului că de la el, în afară de gena tra Y, mai sunt transcrise foarte multe alte gene din
operonul tra. Procesul de transcriere de la promotorul central PY este controlat de :
- proteine codificate cromosomal: Sfr A (efect inhibitor), IHF (efect activator)
- proteine tra : Tra J (efect activator), Tra Y (efect inhibitor)

B. Etapele conjugării (Fig.1.24.)

Principalele etape ale procesului de conjugare bacteriană sunt :
1. formarea agregatelor celulare de conjugare
In general, agregatele de conjugare sunt formate din perechi de două celule – donor şi receptor. In
această etapă rolul esenţial este îndeplinit de pilii F. Pilul F este un element extracelular, prezent la
celulele de tip donor şi are următoarele roluri:
- recunoaşte suprafaţa celulelor de tip receptor;
- se ataşează la suprafaţa acestora;
- recunoaşte proteinele de excludere de suprafaţă;
- prezintă situsuri de ataşare pentru fagii pilus-specifici.
Pilul F este format din molecule de pilină aranjate helical (formând un filament de pilină);
lungimea pilului este cuprinsă între 1-20 m; pilii se pot depolimeriza, fie în celula donor, fie în celula
receptor.

3
 Cap. 1-3-1 Conjugarea bacteriană

Sinteza pilinei este controlată de 3 gene. Gena tra A codifică subunităţile de pilină, moleculele
de ARNm fiind stabilizate prin formarea de structuri de tip hair-pin. Gena tra Q codifică o proteină de
tip chaperone care “protejează” moleculele de pilină şi translocă pro-pilina prin membrana internă a
celulei donor. Gena tra X codifică o proteină ce acetilează moleculele de pilină.
Asamblarea pilului este controlată de 11 gene tra: tra L, E, K, B, V, C, W, U, F, H, G, dintre
care tra G este bifuncţională (are rol atât în asamblarea pilinei, cât şi în stabilizarea agregatelor
celulare). O celulă F+ are pili chiar când operonul tra nu este activat: represia nu este totală, iar ARNm
pentru subunităţile pilinei este stabilizat prin structuri de tip hair-pin.

2. Stabilizarea agregatelor de conjugare

In etapa următoare are loc stabilizarea agregatelor celulare de conjugare. Pilul F
interacţionează cu suprafaţa celulei receptor, mai exact cu proteina Omp A. In această etapă sunt
esenţiale proteinele Tra G şi Tra N. Tra G este bifuncţională, având rol în asamblarea pilinei şi în
stabilizarea agregatelor celulare de conjugare, în timp ce Tra N are rol doar în stabilizarea
agregatelor. Subunităţile de pilină ale pilului F se depolimerizează în peretele celular şi în membrana
celulei receptor. Ca urmare, cele două celule se apropie, formându-se în final comunicarea celulară
directă. La locul de contact intercelular se formează un canal structurat din molecule ale proteinei Tra
D (Fig.1.25.).

In aceasta etapă se manifestă şi fenomenele de excludere de suprafaţă, în cazul formării unor

agregate incorecte (între două celule de tip donor). Astfel, proteina Tra T (codificată de gena tra T)
este ancorată în membrana externă a celulelor de tip donor şi blochează fazele iniţiale ale agregării
celulare. Proteina Tra S (codificată de gena tra S) este ancorată în membrana plasmatică a celulelor
donor şi blochează transferul ADN după ce s-a format o pereche celulară “incorectă”. Este de
remarcat că genele tra S şi tra T au, fiecare, promotor propriu şi se exprimă constitutiv în celulele
donor, chiar fără activarea operonului tra de la promotorul central PY. Pe de altă parte, există şi
diferenţe de exprimare a celor două gene: tra T este exprimată constitutiv la un nivel ridicat, în timp ce
tra S este exprimată constitutiv la un nivel mult mai scăzut, fiind însă puternic activată după prima
etapă de formare a agregatelor celulare de conjugare.

3. Transferul ADN conjugativ (Fig.1.25)

Urmare formării comunicării inter-celulare directe şi a canalului constituit din proteina Tra D, în
celula donor apare un semnal molecular sesizat de proteina Tra M. Ca atare, se declanşează o
cascadă de evenimente moleculare de reglaj, care conduce în final la transferul prorpiu-zis de
material genetic.
Astfel, la situsurile din ori T se ataşază, în următoarea ordine, proteinele: Tra M se ataşază la
situsurile sbm C, B, A; apoi, ca urmare, Tra Y se ataşează la sby A şi apoi IHF la situsul A. Ataşarea
acestor molecule proteice la regiunea ori T determină o curbare extremă a moleculei ADN şi, ca
urmare, o modificare semnificativă a densităţii helicale a ADN în această zonă. Acest lucru
favorizează trecerea proteinei Tra I din activitate nickază / ligază, în activitate nickază / helicază.
După ce produce ruptura monocatenară, proteina Tra I se leagă covalent de capul 5′ al catenei pe
care a nickat-o.
Tra I, denumită şi helicaza I, are de fapt 2 funcţii catalitice:
1) nickare la oriT – în acest caz, proteina Tra I funcţionează ca o fosfodiestertransferază, iar capul
5′ al catenei tăiate se leagă covalent de Tra I
2) helicază - în acest caz, Tra I pătrunde în dublul helix ADN pe care-l desface progresiv rupând
legăturile de hidrogen între cele două catene
Inainte de declanşarea conjugării (adică înainte de activarea regiunii ori T), proteina Tra I
funcţionează ca o enzimă de nickare/religare, iar după iniţierea conjugării, Tra I funcţionează ca o
nickază/helicază.

Prin transferul conjugativ al unei monocatene a plasmidului F, în fiecare din cele două celule vor
exista câte o monocatenă, pe care apoi va fi sintetizată catena complementară, prin proces de
replicare.

4
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

+
Fig.1.24. Principalele etape ale procesului de conjugare bacteriană între o tulpină F şi una F−.

Fig.1.25. Pătrunderea monocatenei ADN, din

celula donor în celula receptor, în timpul
procesului de conjugare bacteriană.

Transferul de material genetic generat de tulpini Hfr

In afară de forma episomală (plasmid liber în citoplasma celulei gazdă), plasmidul F poate
exista şi în formă integrată în cromosomul bacterian. In această situaţie, o moleculă a plasmidului F
se integrează în cromosomul bacterian prin recombinare genetică între una din cele 4 secvenţe de
inserţie (IS) de pe F şi o secvenţă de inserţie de pe cromosom. Asemenea tulpini bacteriene ce
prezintă plasmidul F integrat în cromosmul bacterian poartă numele de tulpini Hfr (High frequency of
recombination) pentru că cresc frecvenţa evenimentelor de recombinare genetică între gene
cromosomale. Din acest motiv, cele 4 IS de pe F mai poartă şi numele de situsuri Hfr.
In tulpinile de tip Hfr pot avea loc 2 tipuri de evenimente :
1. un tip de eveniment este cel în care are loc excizia plasmidului F din cromosomul bacterian
(Fig.1.26.); de cele mai multe ori însă, excizia are loc incorect astfel încât molecula excizată este
formată din F şi din câteva gene cromosomale “furate”. Un astfel de plasmid F ce are şi câteva

5
 Cap. 1-3-1 Conjugarea bacteriană

gene cromosomale, poartă numele de plasmid F’ (iar tulpina este denumită tot F’). Un plasmid F’
se comportă ca o celulă donor şi poate genera proces de conjugare bacteriană ca şi un plasmid
F. Celula receptor care primeşte un plasmid F’ este diploidă pentru genele aduse de F’ (o alelă a
genei se găseşte pe cromosomul bacterian şi cea de-a doua alelă este adusă pe plasmidul F’).
Celula rezultată poartă numele de tulpină bacteriană F ''.

cromosom

a2 a2
F’
cromosom
a1
excizie
incorecta transferul a1
F’

DONOR RECEPTOR

Fig.1.26. Transferul cunjugativ mediat de plasmide F’

Fig.1.27. Plasmidul F integrat în

cromosomul gazdă.

2. un alt doilea tip de eveniment este cel în care plasmidul F generează proces de conjugare
bacteriană chiar în formă integrată în cromozomul bacterian. In acest caz, monocatena
transferată începe cu o porţiune din plasmidul F (regiunea leader şi apoi regiunea rep-inc), urmată
apoi de gene cromosomale (Fig.1.27.). Pentru transferul întregului plasmid F este necesar a fi
transferat întâi tot cromosomul bacterian (în formă monocatenară). Un asemenea eveniment este
însă extrem de rar, necesitând ca cele două celule (donorul şi receptorul) să rămână în contact
direct un timp foarte îndelungat. Prin experimente de conjugare întreruptă a fost realizată harta
cromozomului circular tulpinilor de Escherichia coli (ca unităţi fizice de distanţă între gene au fost
definite “minutele” - timpul de conjugare bacteriană).
In cazul unei conjugări generate de un plasmid F integrat în cromosomul bacterian, pe
monocatena transferată nu va fi iniţiat proces de replicare şi, respectiv, nu se va forma un plasmid
d.c. CCC. In schimb însă, monocatena intrată în celula receptor va “invada” dublul helix al
cromosomului gazdă în zona în care va găsi omologie de secvenţă. Prin procese de recombinare
genetică, monocatena genei nou-intrate va înlocui gena rezidentă.
Asemenea procese reprezintă de fapt recombinare între gene cromosomale – fenomen amintit şi
în denumirea de Hfr a tulpinii donor.

C. Structura altor plasmide conjugative : plasmidul RP4

Plasmidul RP4 face parte din familia de plasmide RP: RP1 (Fig.1.28.), RP2, RP3, RP4. Această
familie de plasmide aparţine grupului de incompatibilitate Inc P şi toţi membrii acestei familii au gene
de rezistenţă la ampicilină, tetraciclină şi kanamicină. Aceste plasmide au fost identificate iniţial la
Pseudomonas aeruginosa, dar ulterior s-a costatat că prezintă un spectru foarte larg de gazde,
putând conjuga la foarte multe specii de bacterii Gram-negative.
Plasmidul RP4 (Fig.1.29.) determină sinteza de pili de conjugare rigizi, fapt pentru care
transferul conjugativ este eficient numai dacă amestecul de conjugare este trecut pe un suport solid
(în contrast, plasmidele conjugative ce codifică pili flexibili transferă eficient şi dacă amestecul este
ţinut în mediu lichid). In afară de genele de rezistenţă, plasmidul RP4 mai conţine: gene tra, regiune
ori T, gena pri (codifică primaza) şi o regiune ori V.
Plasmidul RP4 are aproximativ 40 Mdal, 60% mol GC în 4-7 copii per celulă.

6
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

Fig.1.28. Harta circulară a plasmidului RP1 (după Sobecky, 1996).

r r r
Ap , Tc , Km - gene de rezistenţă la antibiotice (ampicilina, tetraciclina,
kanamicina); trfA , trfB - gene cu funcţii în replicarea plasmidului; tra1 , tra2 ,
tra3 - regiuni implicate în controlul transferului; oriT - originea transferului
(transfer replicativ); oriV - originea replicării plasmidului; pri - primaza -->
sinteza primerului ARN folosit in replicarea plasmidului; IS8 - secvenţa de
inserţie.

Fig.1.29. Harta circulară a plasmidului RP4 (după Gerlitz, 1990).