Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LAC
Datorită eficienței metabolice, glucoza reprezintă sursa de carbon preferată pentru
majoritatea celulelor, inclusiv cele bacteriene. În afară de glucoză însă, multe specii bacteriene au
capacitatea de a folosi o serie de alte zaharuri ca sursă de carbon, atunci când în mediu nu există,
sau nu mai există, glucoză. Altfel spus, atunci când o populație de celule bacteriene sunt crescute
într‐un mediu ce conține mai multe tipuri de zaharuri printre care şi glucoză, bacteriile vor epuiza
întâi glucoza şi abia apoi vor trece la metabolizarea altor zaharuri (Santillan, 2008).
O astfel de sursă alternativă de carbon este reprezentată de lactoză. Ca şi în alte situații,
genele implicate în metabolizarea lactozei sunt grupate în cromozomul bacterian într‐o structură
de tip operonic pe o întindere de aproximativ 6000 pb, denumită operonul LAC (prescurtare de la
lactoză).
Studiul sistemului LAC a început la sfârşitul deceniului patru al secolului trecut la Institutul
Pasteur din Paris, de către Jacques Monod şi colaboratorii săi. Încă de la începutul secolului XX se
ştia faptul că anumite enzime microbiene se formau numai în prezența substratului specific. Acest
fenomen, denumit atunci ”adaptare enzimatică”, a fost ulterior redefinit şi redenumit „inducție
enzimatică”. Trebuie ănsă subliniat faptul că în perioada respectivă nu era incă cunoscută
structura acidului deoxiribonucleic, se ştia puțin despre structura proteinelor şi mai nimic despre
biosinteza lor.
Structura şi funcționarea genelor din operonul LAC din cromozomul de Escherichia coli
Operonul LAC de la E.coli este format din următoarele gene:
- trei gene structurale (lac Z, lac Y, lac A), transcrise policistronic de la un promotor denumit Plac;
- o gena reglatoare lac I, transcrisă monocistronic de la promotorul PI
- secvenţe reglatoare
Cele trei genele structurale codifică pentru trei enzime implicate în metabolismul lactozei:
- gena lac Z codifică proteina ‐galactozidază (denumită şi proteina Lac Z), al cărui monomer are
o greutate moeculară de 125.000 dal; această enzimă funcționează însă sub formă de tetramer (~
500.000 dal) şi rupe legăturile galactozidice din interiorul moleculei de lactoză, conducând la
scindarea ei în glucoză şi galactoză (Fig.1), având ca reacție secundara scindarea lactozei în
alolactoza şi galactobioza.
- gena lac Y codifică proteina ‐galactozid‐permeaza (Lac Y)(30.000 dal); este o proteină ce se
localizează în membrana celulară şi este implicată în transportul activ al lactozei din mediu spre
celulă;
- gena lac A codifică proteina galactozid‐transacetilaza (Lac A)(30.000 dal); sub formă de
dimer, această enzimă este implicată in transferul grupării acetil de la la acetil‐coenzima A (acetil‐
CoA) la o legatură galactozidică.
1
+
Lac I
O3 O1 O2
PI lac I t Plac lac Z lac Y lac A t
1111 pb 3063 pb 800 pb 800 pb
cAMP~CAP
Fig.2 Reprezentarea schematizată a operonului LAC.
Expresia genelor structurale de la promotorul Plac este influențată major de un set de
secvențe reglatoare şi, respectiv, de ataşarea unor proteine, la aceste secvențe:
- trei secvențe de tip operator – O1, O2 şi O3 ‐ , centrate în pozițiile :
O1 are 21 pb, centrat în poziția +11
O2 localizat la 401 pb în aval de O1
O3 localizat la 92 pb în amonte de O1
- o secvență la care se ataşează proteina CAP, secvență localizată între 72 pb şi 50 pb
Proteina represor Lac I se ataşează ca dimer la oricare din cele trei secvențe operator.
Efectul de represie este însă diferit: ataşarea la O1 scade expresia genelor structurale de 18 ori, în
timp ce ataşarea la O2 sau O3 afectează nesemnificativ expresia.
Pe de altă parte însă, dimerii de Lac I au o afinitate chimică crescută ridicată unul pentru
celălalt, conducând la formarea unui tetramer de Lac I. În această situație, formarea unui
tetramer Lac I între O1 şi O2 scade inițierea transcrierii de la Plac de 700 de ori şi între O1 şi O3, de
440 de ori.
2
Expresia celor trei gene structurale
Expresia celor trei gene structurale din operonul LAC este reglată atât pozitiv, cât şi negativ.
Există două mecanisme metabolice care se desfăşoară simultan şi care sunt implicate atât în
reglajul pozitiv, cât şi în cel negativ.
Astfel, atunci când în mediu există glucoză, experesia celor trei gene structurale este
represată prin două mecanisme de reglaj negativ ce acționează simultan:
a) Represie bazată pe represor
Câte un dimer de proteină Lac I se leagă la secvențele operator O şi, respectiv, OI (Fig.); cei doi
dimeri se atrag prin afinitate chimică, determinând formarea unui tetramer şi, implicit,
formarea unei bucle în molecula de ADN; formarea acestei bucle determină imposibilitatea
legării ARN polimerazei la secvența promotor Plac; ca urmare, această buclă a fost denumită
“buclă de represie” (Fig.3).
Dimerul represorului Lac I
atasat la cei doi operatori
Promotorul Plac
Fig.3 Formarea buclei de represie prin ataşarea dimerului represorului Lac I la cele două secvențe de tip
operator O1 şi O3; se blochează astfel accesul ARN polimerazei la promotorul Plac.
b) Proteina activator este inactivă
La majoritatea operonilor implicați în utilizarea unor surse alternative de carbon, fixarea
subunității CTD a ARN polimerazei la secvența promotor necesită intervenția proteinei CAP
(Catabolite Activator Protein; mai este cunoscută şi sub numele de CRP = Catabolite
Regulation Protein,). În prealabil însă, această proteină trebuie să fie activată prin ataşarea
unei molecule de adenozin‐monofosfat ciclic (AMPc, cAMP).
Atâta timp însă cât în celulă concentrația de glucoză este suficient de mare, concentrația AMP
(şi, deci, şi a formei ciclice) este mică, în favoarea adenozin‐trifosfatului (ATP).
Ca atare, proteina CAP nu este activată, transcrierea de la promotorul Plac nu poate fi inițiată.
Mult timp s‐a discutat despre un aşa‐numit “paradox al inducției” în cazul operonului LAC,
datorită faptului că nu se putea explica intrarea moleculelor de lactoză în celulă atunci când
3
operonul era în stare represată (nu era sintetizată nici proteina Lac A care are funcție de
galactozid‐permează).
Experimente ulterioare au dovedit că şi operonul LAC, ca de altfel foarte mulți operoni
bacterieni, nu este represat total: chiar şi în stare represată, operonul LAC este exprimat la un
nivel bazal, ce reprezintă a 70‐a parte din nivelul normal de expresie. Este însă important de
subliniat faptul că moleculele de glucoză aflate în mediul extracelular se ataşează la ‐galactozid‐
permează, blocând accesul lactozei la acest receptor trans‐membranar.
Atunci când se termină glucoza din mediul extracelular, dar rămâne disponibilă lactoza ca
sursă de carbon, operonul LAC este activat tot prin două mecanisme de reglaj simultane, dar
reglaj pozitiv; de fapt, aceste două mecanisme reprezintă reversul celor două mecanisme de
represie.
a) Activare prin represia represorului
Nivelul bazal de expresie a operonului LAC asigură totuşi câteva molecule din proteinele
codificate de cele trei gene structurale – Lac Z, Lac Y, Lac A. Atunci când substratul, respectiv,
lactoza, se găseşte într‐o concentrație foarte scăzută, galactozidaza (Lac Z) desfăşoară o
aşa‐numită reacție secundară, scindând substratul în allo‐lactoză şi galactobioză (Fig.).
Alolactoza este inductorul principal pentru operonul LAC, deoarece are afinitate ridicată
pentru dimerul represorului Lac I, la care se ataşează determinând desfacerea tetramerului de
Lac I şi deschiderea buclei de represie. Acest fapt permite ataşarea ARN polimerazei la
promotorul Plac şi inițierea transcrierii.
b) Activarea proteinei activator
Cel de‐al doilea mecanism implică activarea proteinei CAP prin legarea cAMP. Astfel, atunci
când scade concentrația celulară de glucoză, scade şi concentrația de ATP, în favoarea AMP,
respectiv cAMP. Creşterea concentrației de cAMP determină activarea proteinei CAP (cu
formarea complexelor cAMP~CAP) care se ataşează la molecula de ADN şi fixează şi
subunitatea a‐CTD a ARN polimerazei. Astfel este activată inițierea transcrierii de la
promotorul Plac a celor trei gene structurale lac Z, lac Y şi lac A (Fig.4).
Studii moleculare mai recente indică prezența a patru promotori ce controlează transcrierea
regiunii lacZYA, dintre care unul pare să aibă funcție de promotor central – P1‐, iar ceilalți trei sunt
mai slabi – P2, P3 şi P4 (Xiong XF,1991. Eschenlauer AC,1991).
4
-CTD
CAP (-45)
A. (-62)
miezul ARN pol
(-40......+20)
-CTD
(-63)
B.
CAP miezul ARN pol
(-42) (-40......+20)
Fig.4 Activarea trasncrierii prin ataşarea proteinei CAP.
Vezi explicația pentru A. şi B. în text.
Complexe de activare a transcrierii de catre CAP~ARN pol la promotori de clasă I şi II.
Operonii activați de CAP se împart în două grupe :
A. la acei operoni la care situsul de ataşare a proteinei CAP este situat în amonte față de
situsul de ataşare a ARN pol (clasa I), activarea are loc atunci când proteina CAP ataşează
cele două subunități CTD ;
B. la a doua categorie (clasa II) situsul de ataşare a proteinei CAP este centrat în poziția ‐42,
iar proteina CAP interacționează fie cu NTD, fie cu subunitatea sigma a ARN pol
(regiunea 4 a subunității sigma, regiune care se ataşează la hexamerul ‐35) ; la aceşti
promotori subunitatea CTD poate interacționa singură cu regiunea specifică din ADN
care de data aceasta este situată mai în amonte (‐63)